Полипептид лиганда flt3 (варианты), полинуклеотид(варианты), экспрессирующий вектор(варианты), линия клеток сно (варианты), способ продуцирования полипептида лиганда flt3 (варианты), фармацевтическая композиция (варианты)

Полипептид лиганда flt3 (варианты), полинуклеотид(варианты), экспрессирующий вектор(варианты), линия клеток сно (варианты), способ продуцирования полипептида лиганда flt3 (варианты), фармацевтическая композиция (варианты)

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения flt3 лиганда. Полинуклеотид, кодирующий полипептид лиганда flt3, клонируют в экспрессирующий вектор, функциональный в клетках млекопитающих. Полипептид лиганда flt3 получают путем культивирования линии клеток СНО, трансфицированных вектором. Фармацевтическая композиция, способная стимулировать пролиферацию и дифференцировку клеток-предшественников и стволовых клеток, содержит полипептид flt3 в эффективном количестве. Изобретение позволяет разрабатывать средства для лечения больных анемией, СПИД и раковыми заболеваниями. 16 с. и 2 з.п. ф-лы, 4 табл.

Это частично продолжающаяся заявка U.S.Application, 08/209502, поданная 7 марта 1994 г., которая является частично продолжающейся заявкой U.S.Application 08/162 407, поданной 3 декабря 1993 г., которая является частично продолжающейся заявкой U.S.Application 08/111758, поданной 25 августа 1993 г. , которая является частично продолжающейся заявкой U. S.Application 08/106463, поданной 12 августа 1993 г., которая в свою очередь является частично продолжающейся заявкой U.S.Application 08/068394, поданной 24 мая 1993 г., рассмотрение которой прекращено.

Область изобретения Данное изобретение относится к flt 3-лигандам млекопитающих, нуклеиновым кислотам, кодирующим такие лиганды, способам получения рекомбинатных flt 3-лигандов, фармацевтическим композициям, содержащим такие лиганды, и их применению в различных терапиях.

Предпосылки изобретения Клетки крови, гемоциты, происходят из гемопоэтических стволовых клеток, дифференцирующихся в определенных направлениях дифференцировки, т. е. в эритроидном, мегакариоцитарном, гранулоцитарном, моноцитарном и лимфоцитарном направлениях дифференцировки. Цитокины, стимулирующие пролиферацию и созревание клеток-предшественников, называют колониестимулирующими факторами ("CSF"). Некоторые CSF продуцируются Т-лимфоцитами, в том числе интерлейкин-3 ("1L-3"), гранулоцитарно-моноцитарный CSF (CM-CSF), гранулоцитарный СSF (G-CSF) и моноцитарный CSF (М-CSF). Эти CSF воздействуют как на зрелые клетки, так и на стволовые клетки. До сих пор не были обнаружены факторы, способные действовать преимущественно на стволовые клетки.

Тирозинкиназные рецепторы ("ТКR") представляют собой рецепторы факторов роста, которые регулируют пролиферацию и дифференцировку многих клеток (Yarden, Y.8.Ulrich, A.Annu. Rev. Biochem 57, 443-478, 1988, и Cadena, D.L.& Gill, G. N. FASEB J. , 6, 2332-2337, 1992). Некоторые ТКР действуют внутри гемопоэтической (кроветворной) системы. Например, передача сигнала через колониестимулирующий фактор 1 ("CSF-1"), рецептор c-fms регулирует выживание, рост и дифференцировку моноцитов (Stanley et al., J. Cell Biochem, 21, 151-159, 1983). Фактор стила SF, также известный как фактор роста мастоцитов, фактор самоподдержания стволовых клеток или kit-лиганд, действующий через-kit, стимулирует пролиферацию клеток как в миелоидном, так и в лимфоидном компартментах.

flt 3 (Rosnet et аl., Оnсоgеnе, 6, 1641-1650, 1991) и flk-2 (Mathhews et al. , Cell, 65, 1143-1152, 1991) являются разновидностями ТКР, который относится к c-fms и с-kit рецепторам. Продукт гена flk-2 экспрессируется на гемопоэтических и недифференцированных клетках (клетках-предшественниках), тогда как продукт гена flt 3 имеет более общее тканевое распространение. Белки рецепторов flt 3 и flk-2 сходны по аминокислотной последовательности и отличаются по двум аминокислотным остаткам во внеклеточном домене и различаются в сегменте из 31 аминокислоты, расположенном вблизи С-концов (Lyman et al., Oncogene, 8, 815-822, 1993).

Было обнаружено, что flt 3-лиганд ("flt 3-L") регулирует рост и дифференцировку клеток-предшественников и стволовых клеток и, по-видимому, полезен в клинике в лечении нарушений кроветворения, в частности гипопластической (апластической) анемии и миелодиспластических синдромов. Кроме того, flt 3-L должен быть полезным в аллогенных, сингенных или аутогенных трансплантантах костного мозга у больных, подвергающихся цитовосстановительной терапии, а также в развитии клеток.

Flt 3-L будет также полезным в генной терапии и в системах мобилизации клеток-предшественников и стволовых клеток.

Рак лечат при помощи цитовосстановительной терапии, предусматривающей применение ионизирующей радиации или введение химических токсинов, убивающих быстро делящиеся клетки. Побочные действия обычно возникают вследствие цитотоксического действия на нормальные клетки и они могут ограничивать применение цитовосстановительных терапий. Частым побочным эффектом является миелосупрессия, или повреждение клеток костного мозга, увеличивающих количество лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов. В результате миелосупрессии больные развивают цитопению или недостаток клеток крови, что увеличивает опасность инфекции и нарушения, связанные с кровотечением.

Цитопении увеличивают болезненность, смертность и ведут к заниженным дозам в лечении рака. Многие клинические исследователи манипулировали цитовосстановительной терапией, дозируя лекарственные средства и изменяя схемы применения лекарственных средств для увеличения дозирования для раковой терапии при одновременном ограничении повреждения костного мозга. Один из подходов использует трансплантанты костного мозга или клеток периферической крови, при которых костный мозг или циркулирующие гемопоэтические клетки-предшественники или стволовые клетки удаляют перед цитовосстановительной терапией и затем повторно вводят инфузией после терапии для восстановления гемопоэтической функции. U.S.Patent 5199942, включенный здесь в виде ссылки, описывает способ применения GM-CSF, 1L-3, SF, GM-CSF/1L-3-слитых белков, эритропоэтина ("ЕРО") и их комбинаций в аутогенных трансплантационных программах лечения.

Химиотерапия с высокими дозами терапевтически выгодна, поскольку она дает увеличенную частоту целевой ответной реакции у больных с метастатическим раком, в частности с раком грудной железы, по сравнению с терапией со стандартными дозами. Это может приводить к более продолжительной ремиссии с отсутствием признаков болезни для некоторых больных, даже с плохим прогнозом. Тем не менее химиотерапия высоких доз токсична и может приводить ко многим клиническим осложнениям, таким как инфекции, нарушения с кровотечением и другие эффекты, связанные с пролонгированными периодами миелосупрессии.

Миелодиспластические синдромы представляют собой нарушения стволовых клеток, характеризующиеся нарушенным созреванием клеток, прогрессивной панцитопенией и функциональными отклонениями от нормы зрелых клеток. Они также характеризуются вариабельными степенями цитопении, неэффективным эритропоэзом и миелопоэзом с клетками костного мозга, которые являются нормальными или увеличенными в числе и имеют необычную морфологию. Benet et al. (Вr.J. Haematol 1982; 51: 180-199) разделили эти нарушения на 5 подтипов: рефрактерная (стойкая) анемия, рефрактерная анемия с кольцеобразными сидеробластами, рефрактерная анемия с избытком бластных клеток, рефрактерная анемия с избытком бластных клеток в процессе перерождения и хронический миеломоноцитарный лейкоз. Хотя значительный процент этих больных развивает острый лейкоз, большинство из них умирают от инфекционных или геморрагических осложнений. Лечение этих синдромов ретиноидами, витамином и цитарабином не было успешным. Большинство больных, страдающих от этих синдромов, являются пожилыми и не являются возможными кандидатами для пересадки костного мозга или агрессивной противолейкозной химиотерапии.

Апластическая анемия представляет собой другую форму заболевания, характеризующегося нарушением костного мозга и тяжелой панцитопенией. В отличие от миелодиспластического синдрома при этом нарушении костный мозг не содержит клеток или содержит мало клеток. Существующие способы лечения предусматривают пересадку костного мозга из тканесовместимого донора или иммуносупрессивное лечение противотимоцитным глобулином (ATG). Так же, как и в случае миелодиспластического синдрома, большинство больных, страдающих от этого синдрома, являются пожилыми и для них неприемлемы пересадка костного мозга или агрессивная противолейкозная химиотерапия. У этих больных чрезвычайно высока смертность от инфекционных и геморрагических осложнений.

Анемия обычно бывает у больных с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД). Эта анемия обычно является более тяжелой у больных, подвергающихся лечению зидовудином. Многие важные ретровирусные агенты, противоинфекционные и противоопухолевые средства подавляют эритропоэз. Было показано, что рекомбинантный ЕРО нормализует гематокритное число и уровни гемоглобина, однако, обычно для этого требуются очень высокие дозы. Фактор роста, стимулирующий пролиферацию при эритроидном направлении дифференцировки, мог бы быть использован один или в комбинации с ЕРО или другими факторами роста для лечения таких больных и снижения количества требуемых переливаний крови. Фактор роста, который мог бы также увеличивать количество Т-клеток, нашел бы конкретное применение в лечении больных СПИД.

Краткое изложение существа изобретения Данное изобретение относится к биологически активному flt 3-лиганду (flt 3-L) в виде выделенного или гомогенного белка. Кроме того, изобретение относится к выделенным ДНК, кодирующим flt 3-L и к экспрессирующим векторам, содержащим кДНК, кодирующую flt 3-L. Внутри сферы этого изобретения находятся клетки-хозяева, которые были трансфицированы или трансформированы экспрессирующими векторами, содержащими кДНК, кодирующую flt 3-L, и способы получения flt 3-L путем культивирования таких клеток-хозяев при условиях, способствующих экспрессии flt 3-L.

Flt 3-L можно применять для приготовления фрмацевтических композиций для применения в способах аллогенной, сингенной и аутогенной трансплантации. Фармацевтические композиции могут содержать только flt 3-L или flt 3-L в комбинации с другими факторами роста, такими как интерлейкины, колониестимулирующие факторы, протеинтирозинкиназы и цитокины.

Это изобретение включает в себя способы применения композиций flt 3-L в генной терапии и в лечении больных, страдающих от миелодиспластического синдрома, апластической анемии, инфекции ВИЧ (СПИД) и раковых заболеваний, таких как рак молочной железы, лимфома, мелкоклеточный рак легкого, множественная миелома (болезнь Калера), нейробластома, острый лейкоз, тестикулярные опухоли и рак яичников.

Данное изобретение относится также к антителам, в частности моноклональным антителам, иммунореактивным с flt-3-L. Слитые белки, содержащие растворимую часть flt 3-L и константный домен иммуноглобулина, также включены в это изобретение.

Данное изобретение также направлено на применение flt 3-L в способах трансплантации клеток-предшественников периферической крови или стволовых клеток. В типичном случае клетки-предшественники периферической крови или стволовые клетки удаляют из больного перед миелосупрессивной цитовосстановительной тепарией и затем вновь вводят больному совместно с цитовосстановительной терапией или после нее для нейтрализации миелосупрессивных эффектов такой терапии. Данное изобретение обеспечивает применение эффективного количества flt 3-L по меньшей мере одним из следующих способов: (i) flt 3-L вводят больному перед сбором клеток-предшественников или стволовых клеток для увеличения или мобилизации количества таких циркулярующих в кровотоке клеток; (ii) после сбора клеток-предшественников или стволовых клеток больного, flt 3-L используют для увеличения в объеме таких клеток ex vivo и (iii) flt 3-L вводят больному после трансплантации собранных клеток-предшественников или стволовых клеток для облегчения и приживления. Способ трансплантации этого изобретения может дополнительно предусматривать применение эффективного количества цитокина в последовательной или конкуретной комбинации с flt-3-L. Такие цитокины включают, но не ограничены ими, интерлейкины ("1L") 1L-1, 1L-2, 1L-3, 1L-4, 1L-5, 1L-6, 1L-7, 1L-8, 1L-9, 1L-10, 1L-11, 1L-12, 1L-13, 1L-14 или 1L-15, СSF, выбранный из группы, состоящей из G-CSF, GM-СSF, М-СSF или GM-CSF/1L-3-слитые белки, или другие факторы роста, такие как СSF-1, SF, ЕРО, ингибирующий лейкоз фактор ("1 1F") или фактор роста фибробластов ("FGF"). Flt 3-L также применим таким же образом для сингенной или аллогенной трансплантации.

Изобретение включает в себя далее среды для роста клеток-предшественников и стволовых клеток, содержащие среды для роста клеток, аутологичную сыворотку и flt 3-L один или в комбинации с цитокином из перечисленной выше группы.

Кроме того, изобретение предусматривает применение flt 3-L для увеличения в объеме клеток-предшественников или стволовых клеток, собранных из крови пупочной вены. Это растяжение клеток можно проводить с одним flt 3-L или в последовательной или конкурентной комбинации его с цитокином из описанной выше группы.

Кроме того, изобретение предусматрвиает применение flt 3-L в генной терапии. Flt 3-L делает возможными пролиферацию и культивирование ранних (недифференцированных) гемопоэтических клеток-предшественников или стволовых клеток, которые должны быть трансфицированы экзогенной ДНК для использования в генной терапии. Альтернативно кДНК, кодирующая flt 3-L, может быть трансфицирована в клетки, чтобы в конечном счете доставить продукт ее гена в клетке- или ткани-мишени.

Кроме того, изобретение предусматривает применение flt 3-L для стимуляции образования эритроидных клеток in vivo для лечения анемии. Такое применение предусматривает введение flt 3-L больному, нуждающемуся в таком стимулировании эритроидных клеток, в сочетании с цитовосстановительной терапией или после нее. Это лечение может предусматривать одновременное введение другого фактора роста, выбранного из цитокинов из перечисленной выше группы. Предпочтительными цитокинами для применения в этом лечении являются ЕРО, 1L-3, G-CSF и GM-CSF. Такое лечение, в частности, применимо для больных СПИД, в частности для больных СПИД, получающих лечение АZТ (азидодезокситимидином).

Поскольку flt 3-L стимулирует образование стволовых клеток, flt 3-L данного изобретения может влиять на другие не-гемопоэтические стволовые клетки, несущие рецепторы flt-3. Flt 3-L применим в способах оплодотворения in vitro и может быть применен in vivo в лечении бесплодия. В кишечнике flt 3-лиганд применим в лечении повреждения кишечника, вызываемого облучением или химиотерапией. Flt 3-L можно также применять для лечения больных, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (H1V, ВИЧ). Такое лечение предусматривает введение flt 3-L для стимуляции in vivo образования, а также увеличения в объеме ex vivo Т-клеток и эритроидных клеток. Такое лечение может предотвратить недостаточность Т-клеток, в частности СD 4-положительных Т-клеток, и может повышать иммунный ответ больного против этого вируса, улучшая тем самым качество жизни больного. Flt 3-L можно применять для стимуляции стволовых клеток, что приводит к развитию волосяных фолликулов, усиливая рост волос.

Кроме того, flt 3-L может быть связан с твердофазным матриксом и использован для аффинной очистки или отделения клеток, экспрессирующих flt 3 на их поверхности. Изобретение предусматривает отделение клеток, имеющих flt 3-рецептор на их поверхности, от смеси клеток в растворе посредством контактирования этих клеток в смеси с поверхностью для контакта, имеющей на ней flt 3-связывающие молекулы, и отделения этой поверхности и раствора. После отделения эти клетки могут выращиваться ex vivo с применением flt 3-L и вводиться больному.

Подробное описание изобретения Кодирующая мышиный flt 3-L кДНК была выделена и была описана в SEQ ID 1. Кодирующая человеческий flt 3-L кДНК была выделена и описана в SEQ ID 5. Это раскрытие кДНК, кодирующих мышиный и человеческий flt 3-L, делает возможным конструирование экспрессирующих векторов, содержащих кДНК, кодирующих flt 3-L; клеток-хозяев, трансфицированных или трансформированных этими экспрессирующими векторами; получение биологически активных мышиных и человеческих flt 3-L в виде гомогенных белков; антител, иммунореактивных с мышиным и человеческим flt 3-L.

Flt 3-L применим в усилении, стимуляции пролиферации или роста клеток, экспрессирующих flt 3-рецептор, в том числе клеток, не являющихся гомопоэтическими. Поскольку flt 3-рецептор обнаружен в мозгу, плаценте и тканях, происходящих из нервной системы, или тканях гемопоэтического происхождения и распределен в яичниках, яичниках, лимфатических узлах, селезенке, вилочковой железе и печени эмбриона, возможно лечение множества состояний, ассоциированных с повреждениями их тканей. Конкретные применения flt 3-L описаны ниже, хотя изобретение и не ограничивается только ими.

В применении здесь термин "flt 3-L" относится к роду полипетидов, которые связываются и образуют комплекс независимо с рецептором flt 3, обнаруженным на клетках-предшественниках (недифференцированных клетках) и стволовых клетках. Термин "flt 3-L" включает в себя белки, имеющие аминокислотную последовательность 1-231 SEQ ID 2: или аминокислотную последовательность 1-235 SEQ ID :6, а также те белки, которые имеют высокую степень сходства или высокую степень идентичности с аминокислотной последовательностью 1-231 SEQ ID :2 или с аминокислотной последовательностью 1-235 SЕQ ID :6 и являются биологически активными и связывают рецептор flt 3. Кроме того, этот термин относится к биологически активным генным продуктам ДНК SEQ ID :1 или SEQ ID : 5. Кроме того, термин "flt 3-L" относится к мембранно-связанным белкам (которые включают в себя внеклеточный район, мембранный район и внутриклеточный район) и растворимым или укороченным белкам, которые содержат исходно внеклеточную часть такого белка, сохраняют биологическую активность и способны секретироваться. Характерными примерами таких растворимых белков являются белки, содержащие последовательность аминокислот 28-163 SEQ ID :2 и последовательность аминокислот 28-160 SEQ ID :6.

Термин "биологически активный" по отношению к flt 3-L означает, что flt 3-L способен связываться с flt 3. Альтернативно термин "биологически активный" означает flt 3-L, который способен к трансдукции стимулирующего сигнала к клетке через мембранно-связанный flt 3.

"Выделенный" означает, что flt 3-L не связан с другими белками или полипептидами, например, в виде очищенного продукта культуры рекомбинантной клетки-хозяина или в виде очищенного экстракта.

В применении здесь "flt 3-L-разновидность" означает полипептид, по существу гомологичный нативному flt 3-L, но имеющий аминокислотную последовательность, отличающуюся от последовательности нативного flt 3-L (человека, мыши или других видов млекопитающих) вследствие одной или нескольких делеций, инсерций или замещений. Такая вариантная аминокислотная последовательность предпочтительно по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности нативного flt 3-L, наиболее предпочтительно идентична по меньшей мере на 90%. Процент идентичности может быть, например, определен путем сравнения информации последовательности с применением компьютерной программы GАР, версия 6,0, описанной Devereux et al. (Nucl. Acids. Res. 12: 387, 1984) и доступна из University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGСG).

Программа GAP использует способ сравнительного анализа первичной структуры Nееdleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), переработанный Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1981). Предпочтительными параметрами "по умолчанию" для программы GАР являются: (1) унарная матрица сравнения (содержащая величину 1 для идентичностей и О для отрицания идентичности) для нуклеотидов и матрица сравнения веса Gribskov and Burgess, Nucl. Acids. Res. 14:6745, 1986, как описано Schartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.353-358, 1979; (2) наказание 3,0 для каждого пропуска и дополнительное наказание 0,10 за каждый символ в каждом пропуске и (3) отсутствие наказания за концевые пропуски. Разновидности могут содержать консервативно замещенные последовательности, т.е. данный аминокислотный остаток заменен остатком, имеющим сходные физико-химические свойства. Примерами консервативных замещений являются замена одного алифатического остатка на другой, например замены 1le, Val, Leu или Аlа друг на друга, или замены одного полярного остатка другим, например замены между LyS и Arg; Glu и Asp или Gln и Asn. Другие такие консервативные замещения, например замены целых районов, имеющих сходные характеристики гидрофобности, хорошо известны. Природно встречающиеся разновидности flt 3-L также включены в это изобретение. Примерами таких разновидностей являются белки, происходящие из событий перемещающегося сплайсинга мРНК или из протеолитического расщепления белка flt 3-L, при которых сохраняется связывающая способность fLt 3-L. Перемежающийся сплайсинг мРНК может давать укороченный, но биологически активный белок flt 3-L, такой как природно встречающаяся растворимая форма этого белка, например. Вариации, приписываемые протеолизу, включают, например, разилчия в N- или С-концах при экспрессии в разных типах клеток-хозяев, вызываемые протеолитическим удалением одной или нескольких концевых аминокислот из белка flt 3-L (в основном из 1-5 концевых аминокислот).

Термин "аутологичная или аутогенная трансплантация" описан в U.S.Patent 5199242, включенном здесь в виде ссылки. Вкратце, термин означает способ проведения трансплантации гемопоэтических аутогенных клеток-предшественников или стволовых клеток, предусматривающий: (1) сбор гемопоэтических клеток-предшественников или стволовых клеток из больного перед цитовосстановительной терапией; (2) увеличение в объеме (развитие) этих недифференцированных гемопоэтических клеток или стволовых клеток ex vivo с flt 3-L для обеспечения клеточного препарата, содержащего увеличенные количества гемопоэтических клеток-предшественников или стволовых клеток, и (3) введение этого клеточного препарата больному вместе с цитовосстановительной терапией или после нее. Клетки-предшественники и стволовые клетки могут быть получены из собранной периферической крови или эксплантатов костного мозга. Иногда один или более цитокинов, выбранных из описанной выше группы, могут комбинироваться с flt 3-L для содействия пролиферации определенных типов гемопоэтических клеток или для воздействия на клеточную функцию полученной размноженной популяции гемопоэтических клеток. Из описанных выше предпочтительны SF, 1L-1, 1L-3, ЕРО, G-CSF, GM-CSF и GM-CSF/1L-3-слитые белки, а особенно предпочтительны G-CSF, GM-CSF и GM-CSF/1L-3-слитые белки. Термин "аллогенная трансплантация" означает способ, в котором клетки костного мозга или клетки-предшественники периферической крови или стволовые клетки удаляют из млекопитающего и вводят другому млекопитающему того же самого вида. Термин "сингенная трансплантация" означает трансплантацию костного мозга генетически идентичными млекопитающими.

Описанный выше способ трансплантации данного изобретения предусматривает предварительную процедуру in vivo, включающую введение flt 3-L одного или в последовательной или в совместной комбинации с пополняющим фактором роста больному для пополнения гемопоэтических клеток в периферической крови перед их сбором. Пригодные пополняющие количество гемопоэтических клеток факторы перечислены выше и предпочтительными из них являются flt 3-L, SF, 1L-1 и 1L-3.

Описанный выше способ данного изобретения иногда включает в себя процедуру, предусматривающую введение 3-1 одного или в последовательной или совместной комбинации с приживляющим фактором роста больному после трансплантации клеточного препарата для облегчения приживления и усиления пролиферации приживленных гемопоэтических клеток-предшественников или стволовых клеток из клеточного препарата. Пригодные способствующие приживлению факторы перечислены выше и предпочтительными из них являются GМ-СSF, G-CSF, 1L-3, 1L-1, EPO и слитые GM-CSF/1L-3.

Изобретение включает в себя далее среды для выращивания клеток-предшественников или стволовых клеток, содержащие среды для выращивания клеток, аутологичную сыворотку и flt 3-L один или в комбинации с цитокиновым фактором роста из перечисленных выше цитокинов. Предпочтительными факторами роста являются SF, GM-CSF, 1L-3, 1L-1, G-CSF, EPO и слитые белки GM-СSF/1L-3.

В частности, flt 3-L можно применять для стимуляции пролиферации гемопоэтических и не-гемопоэтических стволовых клеток. Такая стимуляция выгодна, когда происходит повреждение специфической ткани. Как таковой flt 3-L можно применять в лечении нейрологического повреждения и он может быть фактором роста для нервных клеток. Вероятно, flt 3-L можно было бы применять в способах оплодотворения in vitro и в лечении in vivo состояний бесплодия. Flt 3-L мог бы быть полезным в лечении кишечного повреждения, вызываемого облучением или химиотерапией. Поскольку рецептор flt 3 присутствует на стволовых клетках, ведущих к развитию волосяных фолликулов, flt 3-L, вероятно, можно было бы применять для усиления роста волос.

Поскольку показано, что flt 3-L стимулирует пролиферацию Т-клеток, а также эритроцитов (см. Примеры, infra), flt 3-L находит применение в лечении больных, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (H1V, ВИЧ). Такое лечение должно включать введение flt 3-L для стимуляции образования in vivo, а также ex vivo размножения Т-клеток. Кроме того, flt 3-L может предотвращать недостаточность СD 4⁺T-клeтoк. Такое лечение может увеличивать или поддерживать иммунную ответную реакцию больного против этого вируса, улучшая тем самым или поддерживая качество жизни больного. Кроме того, такое лечение in vivo стимулировало бы клетки эритроидного направления дифференцировки, улучшая гематокритное число и уровни гемоглобина. Flt 3-L можно вводить в этом случае один или в последовательной или одновременной комбинации с цитокинами, выбранными из описанной группы.

Flt 3-L применим в генной терапии благодаря его специфичности для клеток-предшественников и стволовых клеток. Генная терапия предусматривает введение трансфицированных экзогенной ДНК клеток хозяину, которым дают прижиться в нем. См. , например, Boggs, International J. Cell Cloning, 8:80-96 (1990); Kohn et al. , Cancer Invest. , 7(2): 179-192; Lehn, Bоnе Marrow Тrarspl. 5: 287-293 (1990); Verma, Scientific American, pp.68-84 (1990). С применением способов генной терапии, известных в этой области, способ переноса гена млекопитающему предусматривает стадии: (а) культивирования ранних гемопоэтических клеток в средах, содержащих один flt 3-L или в последовательной или одновременной комбинации с цитокином, выбранным из описанной выше группы; (b) трансфекции культивируемых клеток стадии (а) экзогенным геном и (с) введение трансфицированных клеток млекопитающему. В рамках этого способа находится новый способ трансфекции клеток-предшественников или стволовых клеток геном, предусматривающий описанные стадии (а) и (b). Кроме того, при помощи тех же или сходных способов кДНК, кодирующая flt 3-L, может быть трансфицирована в такие доставляющие клетки для доставки продукта гена flt 3-L к тканям-мишеням.

Пример 1 описывает конструирование нового слитого белка flt 3:Fс, применимого в скрининге на flt 3-L. Другие Fс районы антитела могут быть заменены на Fс район человеческого IgGl, описанный в Примере 1. Другими подходящими Рс районами являются те, которые могут связываться с высокой аффинностью с белком А или белком G и включают в себя Fс район человеческого IgGl или фрагменты Fс района и человеческого или мышиного IgGl, например фрагменты, содержащие по меньшей мере шарнирную область, так что будут образовываться межцепочечные дисульфидные связи. Слитый белок flt 3:Fc имеет преимущество, заключающееся в том, что его легко очистить. Кроме того, дисульфидные связи образуются между Fс районами двух отдельных цепей слитого белка, создавая димеры. Димерный рецептор flt 3:Fс был выбран для потенциального преимущества высокоаффинного связывания flt 3-L ввиду возможности того, что этот лиганд мог бы быть мультимерным.

Как описано supra, аспектом этого изобретения являются растворимые полипептиды flt 3-L. Растворимые полипептиды flt 3-1 содержат весь внеклеточный домен или его часть нативного flt 3-L, но не содержат трансмембранного района, который удерживал бы этот полипептид на клеточной мембране. Преимуществом растворимых полипептидов flt 3-L является то, что они содержат нативный (или гетерологичный) сигнальный пептид, который синтезируется первоначально для усиления секреции, но этот сигнальный пептид отщепляется при секреции flt 3-L из клетки. Растворимые полипептиды flt 3-L, включенные в это изобретение, сохраняют способность связывать рецептор flt 3. В самом деле растворимый flt 3-L может содержать также часть трансмембранного района или часть цитоплазметического домена или другие последовательности при условии, что растворимый белок flt 3-L может секретироваться.

Растворимый flt 3-L может быть идентифицирован (и его можно отличить от его мембранно-связанных копий) путем определения интактных клеток, экспрессирующих этот целевой белок, от культуральной среды, например, центрифугированием и анализом этой среды (супернатанта) на присутствие целевого белка. Присутствие flt 3-L в среде свидетельствует о том, что этот белок секретировался из клеток и, следовательно, представляет собой растворимую форму целевого белка.

Растворимые формы flt 3-L обладают многими преимуществами по сравнению с нативным связанным белком flt 3-L. Возможна очистка таких белков из рекомбинантных клеток-хозяев, т.к. растворимые белки секретируются из этих клеток. Кроме того, растворимые белки обычно более пригодны для внутривенного введения.

Примерами растворимых полипептидов flt 3-L являются полипептиды, содержащие значительную часть внеклеточного домена нативного белка flt 3-L. Такие растворимые белки flt 3-L млекопитающих содержат аминокислоты 28-188 SEQ ID :2 или аминокислоты 28-182 SEQ ID :6. Кроме того, в изобретение также включены укороченные растворимые белки flt 3-L, содержащие неполный внеклеточный домен. Такие укороченные ратворимые белки последовательностью аминокислот 28-163 SEQ ID : 2 и аминокислотами 28-160 SEQ ID :6. При первоначальной экспрессии внутри клетки-хозяина растворимый flt 3-L может дополнительно содержать один из гетерологичных сигнальных пептидов, описанных ниже, который функционален в клетках-хозяевах. Альтернативно белок может содержать нативный сигнальный пептид, так что flt 3-L млекопитающего содержит аминокислоты 1-188 SEQ ID :2 или аминокислоты 1-182 SEQ ID :6. В одном варианте изобретения растворимый flt 3-L экспрессировался в виде слитого белка, содержащего (от N- к С-концу) сигнальный пептид -фактора дрожжей, FLAG пептид, описанный ниже и в U.S.Patent 5011912, и растворимый flt 3-L, состоящий из аминокислот 28-188 SЕQ ID :2. Этот рекомбинатный слитый белок экспрессируется в дрожжевых клетках и секретируется на них. FLAG пептид облегчает очистку этого белка и затем может быть отщеплен от растворимого flt 3-L при помощи энтерокиназы бычьей слизистой оболочки. Выделенные последовательности ДНК, кодирующие растворимые белки flt 3-L, включены в данное изобретение.

Укороченный flt 3-L, в том числе растворимые полипептиды, могут быть получены любым из многих стандартных способов. Целевая последовательность ДНК может быть химически синтезирована при помощи известных реr se способов. Фрагменты ДНК также могут быть получены расщеплением рестриктазами полноразмерной последовательности клонированной ДНК и выделены электрофорезом на агарозных гелях. Могут быть применены линкеры, содержащие сайт (сайты) расщепления рестриктаз, для инсерции целевого фрагмента ДНК в экспрессирующий вектор или фрагмент может быть расщеплен в сайтах расщепления, природно присутствующих в нем. Для амплификации последовательности ДНК, кодирующей целевой белковый фрагмент, может быть также применена хорошо известная процедура полимеразной цепной реакции. В качестве дальнейшей альтернативы известные способы мутагенеза могут быть также использованы для инсерции стоп-кодона в желаемой точке, например непосредственно справа (в направлении 5'-3') от кодона для последней аминокислоты внеклеточного домена.

В другом подходе может быть применена ферментативная обработка (например, экзонуклеазой Bal31) для делении концевых нуклеотидов из фрагмента ДНК для получения фрагмента, имеющего определенный целевой конец. Среди коммерчески доступных линкеров находятся линкеры, которые могут быть лигированы с тупыми концами, образуемыми при расщеплении Bal31, и которые содержат сайт (сайты) расщепления рестриктазами. Альтернативно олигонуклеотиды, реконструирующие N- или С-конец фрагмента ДНК до желаемой точки, могут быть синтезированы и лигированы с этим фрагментом ДНК. Синтезированный олигонуклеотид может содержать сайт расщепления рестриктазой слева (в направлении 3'-5') от желаемой кодирующей последовательности и положения инициирующего кодона (ATG) при N-конце кодирующей последовательности.

Как утверждалось выше, это изобретение обеспечивает выделенные или гомогенные полипептиды 3-1, как рекомбинантные, так и нерекомбинантные. Разновидности и производные нативных 3-1 белков, сохраняющие желаемую биологическую активность (например, способность связывать flt 3), могут быть получены при помощи мутаций нуклеотидных последовательностей, кодирующих нативные flt 3-L полипептиды. Изменения нативной аминокислотной последовательности могут быть достигнуты любым из ряда стандартных способов. Мутации могут быть введены при определенных локусах путем синтеза олигонуклеотидов, содержащих мутантную последовательность, фланкированную сайтами рестрикции, позволяющими лигирование с фрагментами нативной последовательности. После лигирования полученная реконструированная последовательность кодирует аналог, имеющий целевые инсерцию аминокислот, замену или делецию.

Альтернативно способы олигонуклеотид-направленного сайт-специфического мутагенеза могут быть использованы для обеспечения измененного гена, в котором заданные кодоны могут быть изменены посредством замены, делеции или инсерции. Примеры способов обеспечения таких изменений, изложенных выше, описаны Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987) и U.S.Patent 4518584 и 4737462, включенных здесь в виде ссылок.

Flt 3-L может быть модифицирован для получения производных flt 3-L путем образования ковалентных или агрегатных конъюгатов с другими химическими частями молекул, такими как гликозильные группы, липиды, фосфатные, ацетильные группы и т.п. Ковалентные производные flt 3-L могут быть получены соединением этих химических частей молекул с функциональными группами на боковых аминокислотных цепях flt 3-L или при N-конце или С-конце полипептида flt-3-L или его внеклеточного домена. Другие производные flt 3-L в сфере действия этого изобретения включают ковалентные или агрегатные конъюгаты flt 3-L или его фрагментов с другими белками или полипептидами, например, при помощи синтеза в рекомбинантной культуре в виде N-концевых или С-концевых слитых белков. Например, такой конъюгат может содержать последовательность сигнального или лидерного полипептида (например, лидерную последовательность -фактора Saccharomyces) при N-конце полипептида flt 3-L. Сигнальный или лидерный пептид ко-трансляционно или пост-трансляционно направляет транспорт конъюгата из места его синтеза к месту внутри или снаружи клеточной мембраны или клеточной стенки.

Слитые flt 3-L полипептиды могут содержать пептиды, добавленные для облегчения очистки и идентификации flt 3-L. Такие пептиды включают, например, поли-Нis или антигенные идентификационные пептиды, описанные в U.S.Раtеnt 5011912 и в Норр et al., Bio/Tесhnology 6:1204, 1988.

Кроме того, изобретение включает в себя flt 3-L полипептиды с ассоциированным природным распределением гликозилирования или без него. Flt 3-L, экспрессируемыe в дрожжевых системах экспрессии или в системах экспрессии млекопитающих (например, в СOS-7 клетках), могут быть подобными нативному полипептиду flt 3-L или значительно отличаться от него по мол. массе и распределению гликозилирования в зависимости от выбора системы экспрессии. Экспрессия flt 3-L полипептидов в бактериальных системах экспрессии, таких как Е.соli, обеспечивает негликозилированные молекулы.

В это изобретение включены эквивалентные конструкции ДНК, кодирующие различные добавления или замещения аминокислотных остатков или последовательностей или делеции концевых или внутренних остатков или последовательностей, не требующихся для биологической активности или связывания. Например, сайты N-гликозилирования во внеклеточном домене flt 3-L могут быть модифи