Новые аналоги жирных кислот для лечения диабета

Новые аналоги жирных кислот для лечения диабета

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к диабетологии, и касается лечения и предупреждения диабета I и II типа, а также состояний гипергликемии, гиперинсулинемии, пониженной чувствительности к инсулину. Для этого в организм животного в виде фармацевтической композиции или в виде питательной композиции вводят аналоги жирных кислот общей формулы CH₃-[CH₂] _m-[x_i-CH₂] _n-COOR. Изобретение обеспечивает эффективное воздействие на патогенез заболевания за счет коррекции обмена липидов. 8 с. и 23 з.п. ф-лы, 11 табл., 8 ил.

Настоящее изобретение относится к новым аналогам жирных кислот, которые могут быть использованы для лечения и/или предупреждения диабета. Кроме того, данное изобретение относится к питательной композиции, содержащей такие аналоги жирных кислот.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ В настоящее время полагают, что сахарный диабет и его последствия являются третьей ведущей причиной смертности в Канаде и Соединенных Штатах, уступая только раку и сердечно-сосудистым заболеваниям.

Лечение с помощью модифицированных жирных кислот представляет собой новый способ лечения таких заболеваний.

В ЕР 345.038 и PCT/NO95/00195 описано применение аналогов жирных кислот, не подвергающихся -окислению.

В настоящее время обнаружено, что они имеют более широкую область применений.

Кроме того, в настоящее время авторы изобретения синтезировали и охарактеризовали новые аналоги жирных кислот, которые оказывают значительный эффект на диабет.

Результаты экспериментов по питанию аналогами жирных кислот показывают, что эти соединения уменьшают массу жировой ткани и массу тела и, таким образом, представляют собой эффективные лекарственные средства для лечения ожирения и избыточной массы тела.

Кроме того, авторы изобретения обнаружили, что данные аналоги жирных кислот представляют собой эффективные антидиабетические соединения с глубоким эффектом на уровни глюкозы и инсулина.

Кроме того, оказалось, что данные соединения обладают благоприятным эффектом на рестеноз и демонстрируют хорошие антиокислительные свойства.

ДИАБЕТ В настоящее время полагают, что сахарный диабет и его последствия являются третьей ведущей причиной смертности в Канаде и в Соединенных Штатах, уступая только раку и сердечно-сосудистым заболеваниям. Несмотря на то, что острые и зачастую летальные симптомы диабета можно контролировать с помощью инсулинотерапии, длительные последствия уменьшают среднюю продолжительность жизни не менее чем на одну треть. По сравнению с людьми, не страдающими диабетом, пациенты, страдающие диабетом, демонстрируют в 25 раз большую заболеваемость, связанную с потерей зрения, в 17 раз - почек, в 5 раз - гангреной и в 2 раза - болезнью сердца.

Существуют две главные формы сахарного диабета. Одна форма представляет собой диабет I типа, который также известен как инсулино-зависимый сахарный диабет (ИЗД), а другая форма представляет собой диабет II типа, который также известен как инсулино-независимый сахарный диабет (ИНСД). Большинство пациентов с ИЗД имеют общую картину патологии: почти полное исчезновение продуцирующих инсулин бета-клеток поджелудочной железы, которое приводит к гипергликемии.

Собраны существенные доказательства, показывающие, что в большинстве случаев ИЗД представляет собой результат постепенной деструкции бета-клеток в течение бессимптомного периода, часто длящегося многие годы. Преддиабетический период можно распознать путем определения циркулирующих в кровотоке аутоантител к клеткам островков и аутоантител к инсулину.

Существует необходимость в соединении, которое было бы нетоксичным и не имело бы никаких побочных эффектов, но предупреждало бы клинический ИЗД и ИНЗД.

Диабет I типа: тяжелая форма сахарного диабета, обычно развивающаяся от острого начала до последней стадии, характеризующаяся пониженными уровнями инсулина в плазме, полидипсией, полиурией, повышенным аппетитом, потерей массы и эпизодическим кетоацидозом; также обозначается как ИЗД.

Диабет II типа: как правило, легкая форма сахарного диабета, часто, с постепенным началом, обычно у взрослых, характеризующаяся нормальными или повышенными абсолютными уровнями инсулина в плазме, которые относительно низки в сравнении с уровнями глюкозы в плазме; также обозначается как ИНСД.

В соответствии с этиологической классификацией диабет I и II типов рассматривается как "первичный" диабет, соответственно.

Вторичный диабет включает в себя панкреатический, экстрапанкреатический/эндокринный или индуцированный лекарствами диабет. Кроме того, некоторые типы диабета классифицируются как необычные формы. Они включают в себя липоатрофический, миатонический диабет и тип диабета, вызываемый повреждением инсулиновых рецепторов.

Вследствие широкой распространенности диабета в нашем обществе и связанных с ним серьезных последствий, которые обсуждались выше, любое терапевтическое лекарство, потенциально полезное для лечения и предупреждения этого заболевания, могло бы обладать глубоким целебным эффектом на их здоровье. Существует необходимость в создании лекарства, которое будет уменьшать концентрацию глюкозы в крови субъектов, страдающих диабетом, без значительных неблагоприятных побочных эффектов.

Следовательно, задачей настоящего изобретения является предложение схемы лечения, которая является полезной для уменьшения глюкозы в крови и для лечения диабетического состояния.

В задачу также входит предложение схемы лечения, которая является полезной для уменьшения концентрации инсулина в крови и для усиления эффекта остающегося инсулина.

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ Незначительные модификации природных жирных кислот представляют собой замену одного или более чем одного углерода в цепи жирной кислоты серой, селеном или кислородом. Соединения, охарактеризованные формулой I, обладают свойствами, которые придают им уникальную комбинацию биологических эффектов.

Наиболее полно изученной является тетрадецилтиоуксусная кислота (tetradecylthioacetic acid, TTA), и авторы изобретения продемонстрировали несколько полезных эффектов на различных подопытных животных.

Исследования показали, что по своим свойствам ТТА очень близка к природным жирным кислотам, главное отличие заключается в том, что ТТА не окисляется митохондриальной системой -окисления. Однако показано, что в присутствии соединений по настоящему изобретению усиливается -окисление других (незамещенных) жирных кислот.

При введении ТТА крысам в течение 12 недель приблизительно в два раза возрастает содержание в печени и плазме мононенасыщенных жирных кислот (главным образом олеиновой кислоты), в то время как содержание полиненасыщенных жирных кислот (главным образом линолевой кислоты и DHA) уменьшается. Таким образом, соединение по настоящему изобретению изменяет состав липидов в различных тканях. Кроме того, показано, что настоящие соединения изменяют содержание жиров, и ожидается, что настоящие соединения также будут изменять распределение жиров.

Средние дозы ТТА для питания животных типа крыс, мышей, кроликов и собак уменьшают уровни как холестерина, так и триацилглицерина в плазме в пределах продолжительности лечения. Кроме того, авторы изобретения продемонстрировали такой же эффект для TSA и показали, что соединения по настоящему изобретению с замещением серой по положению 5 или 7 усиливают -окисление, и таким образом ожидается, что эти аналоги жирных кислот также будут уменьшать уровни триглицеридов и холестерина в плазме. ТТА и TSA являются гораздо более эффективными средствами в этом отношении, нежели полиненасыщенные жирные кислоты типа ЕРА.

Как упоминалось выше, важный механизм действия 3-тио-жирных кислот заключается в значительном увеличении митохондриального окисления жирных кислот, уменьшающего доступность жирных кислот для этерификации. Синтез триацилглицерина и холестерина понижается, и секреция липопротеинов очень низкой плотности (ЛОНП) из печени уменьшается (10). Это приводит к эффекту уменьшения продуцирования липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). По-видимому, все эти эффекты по меньшей мере частично опосредованы рецепторами, активированными пролифератором пероксисом (peroxisome proliferator activated receptors, PPAR), присутствующими повсеместно факторами транскрипции, вовлеченными в регуляцию метаболизма липидов. Авторы изобретения обнаружили, что ТТА является мощным лигандом к PPAR, фактору транскрипции, регулирующему катаболизм жирных кислот и эйкозаноидов, и менее мощным лигандом к PPAR, который вовлечен в регуляцию дифференциации адипоцитов.

Ожирение является общим признаком инсулино-независимого сахарного диабета (ИНСД) и фактором риска для его развития. ИНСД часто связан гипертензией, дислипидемией, повышенными уровнями содержания в плазме свободных жирных кислот и повышенным риском сердечно-сосудистого заболевания. Пациенты с ИНСД характеризуются резистентностью к действию инсулина на усвоение глюкозы в периферических тканях и нарушенной регуляцией секреции инсулина.

Авторы изобретения показали, что ТТА уменьшает гиперинсулинемию и заметно улучшает действие инсулина на утилизацию глюкозы. Кроме того, ТТА действительно предотвращает индуцированную пищей резистентность к инсулину. В отличие от известных ранее антидиабетических глитазонов (glitazones) ТТА не увеличивает прибавления в массе тела.

Эти эффекты по меньшей мере частично могут быть объяснены увеличенным притоком жирных кислот и усиленным окислением жирных кислот в печени. Таким образом, эти данные говорят о роли ТТА в гомеостазе in vivo как липидов, так и глюкозы.

Как ясно продемонстрировано в экспериментальном разделе, соединения по настоящему изобретению ингибируют увеличение массы тела и массы жировой ткани у животных, получающих либо пищу с высоким содержанием жиров, либо пищу с высоким содержанием сахарозы. Это делает соединения по настоящему изобретению весьма подходящими в качестве фармацевтических и/или питательных агентов для лечения ожирения, то есть данные соединения могут быть использованы в качестве средства для похудения с целью уменьшения массы тела или массы жировой ткани.

Кроме того, соединения по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве антидиабетического лекарственного средства посредством уменьшения концентрации глюкозы в крови. Авторы изобретения также показали, что соединения по настоящему изобретению уменьшают концентрацию инсулина в плазме животных с гиперинсулинемией. В отношении животных с пониженной чувствительностью к инсулину было показано, что соединения по настоящему изобретению усиливают эффект эндогенного инсулина.

Термин "метаболический синдром" используется для описания множественного метаболического синдрома, который, в частности, характеризуется гиперинсулинемией, резистентностью к инсулину, ожирением, непереносимостью глюкозы, сахарным диабетом II типа, дислипидемией или гипертензией.

Выше отмечено, что для соединений по настоящему изобретению показано, что они оказывают положительный эффект на все вышеупомянутые состояния, то есть посредством регулирования гомеостаза как глюкозы, так и липидов, и таким образом ожидается, что соединения по настоящему изобретению будут являться подходящими агентами для регулирования определенной выше болезни обмена веществ (иногда называемой синдромом X).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ В настоящем изобретении описаны аналоги модифицированных жирных кислот, которые в нецитотоксичных концентрациях могут быть использованы для лечения и/или предупреждения ожирения, гипертензии и жировой инфильтрации печени.

Настоящее изобретение относится к применению аналогов жирных кислот общей формулы (I) СН₃-[СН₂]m-[х_i-CH₂]_n-COOR - где n представляет собой целое число от 1 до 12, и - где m представляет собой целое число от 0 до 23, и - где i представляет собой нечетное число и указывает положение относительно COOR, и - где X_i независимо друг от друга выбраны из группы, содержащей О, S, SO, SO₂, Se и СН₂, и - где R представляет собой водород или С₁-С₄алкил, - при условии, что по меньшей мере один из X_i не представляет собой CH₂, или их соли, пролекарства и комплекса для приготовления фармацевтической композиции для лечения и/или предупреждения диабета.

В частности, данное изобретение относится к применению соединения общей формулы (I), где диабет представляет собой диабет I типа.

Предпочтительное воплощение данного изобретения относится к применению соединения общей формулы (I), где диабет представляет собой диабет II типа.

Другие воплощения относятся к типам диабета, выбранным из группы, содержащей вторичный диабет, такой как панкреатический, экстрапанкреатический/эндокринный или индуцированный лекарствами диабет либо необычные формы диабета, такие как липоатрофический, миатонический диабет или диабет, вызываемый повреждением инсулиновых рецепторов.

Одно из воплощений данного изобретения относится к применению соединения формулы (I), где m равно или превышает 13.

В настоящее время предпочтительное воплощение данного изобретения представляет собой применение соединения формулы I, где Х_i=3 выбран из группы, состоящей из О, S, SO, SO₂ и Se, и где X_i=5-25 представляет собой CH₂.

Тетрадецилтиоуксусная кислота (ТТА) и тетрадецилселеноуксусная кислота (tetradecylselenoacetic acid, TSA), то есть Х_i=3 представляет собой серу и селен, соответственно, являются предпочтительными в настоящее время соединениями.

Еще один аспект данного изобретения относится к применению соединения формулы (I) для приготовления фармацевтической композиции для лечения и/или предупреждения множественного метаболического синдрома, обозначенного термином "метаболический синдром", который, в частности, характеризуется гиперинсулинемией, резистентностью к инсулину, ожирением, непереносимостью глюкозы, сахарным диабетом II типа, дислипидемией и/или гипертензией.

Еще один аспект данного изобретения относится к способу лечения или предупреждения диабетического состояния, при котором осуществляют стадию введения нуждающемуся в этом животному эффективного количества аналогов жирных кислот общей формулы (I) СН₃-[СН₂]m-[х_i-СН₂]_n-СООR - где n представляет собой целое число от 1 до 12, и - где m представляет собой целое число от 0 до 23, и - где i представляет собой нечетное число и указывает положение относительно COOR, и - где X_i независимо друг от друга выбраны из группы, содержащей О, S, SO, SO₂, Se и СН₂, и - где R представляет собой водород или С₁-С₄алкил, - при условии, что по меньшей мере один из X_i не представляет собой СН₂, или их соли, пролекарства либо комплекса.

В соответствии с указанным выше способом предпочтительные воплощения представляют собой следующие: - указанное животное представляет собой человека; - указанное животное представляет собой сельскохозяйственное животное, такое как куриные, млекопитающие: коровы, овцы, козы или свиньи; - указанное животное представляет собой домашнее или любимое животное, такое как собака или кошка.

Лечение включает в себя введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективной концентрации, которая по существу непрерывно поддерживается в крови животного в течение периода ее введения.

Кроме того, изобретение относится к фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения диабетического состояния. Данная композиция предпочтительно содержит в смеси с аналогами жирных кислот фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

Кроме того, изобретение относится к способам лечения и/или предупреждения гипергликемии, гиперинсулинемии или пониженной чувствительности к инсулину, при которых осуществляют стадию введения нуждающемуся в этом животному эффективного количества аналогов жирных кислот общей формулы (I).

Изобретение также относится к питательной композиции, содержащей количество аналогов жирных кислот общей формулы (I), эффективное для уменьшения или предупреждения увеличения концентрации глюкозы в крови человека или животного, отличного от человека.

Изобретение также относится к новым аналогам жирных кислот формулы (I): СН₂-[СН₂]m-[х_i-CH₂]_n-COOR - где n представляет собой целое число от 1 до 12, и - где m представляет собой целое число от 0 до 23, и - где i представляет собой нечетное число и указывает положение относительно COOR, и - где X_i независимо друг от друга выбраны из группы, содержащей О, S, SO, SO₂, Se и СН₃, и - где R представляет собой водород или С₁-C₄алкил, - при условии, что по меньшей мере один из X_i не представляет собой СН₂, или их соли, пролекарству либо комплексу.

ПОДПИСИ К ГРАФИЧЕСКИМ МАТЕРИАЛАМ На Фиг. 1 показано влияние ТТА на прибавление в массе у крыс, у которых был рацион с высоким содержанием жиров.

На Фиг. 2 показано влияние ТТА на прибавление в массе у крыс, у которых был рацион с высоким содержанием сахарозы.

На Фиг. 3 показано, что лечение с помощью ТТА предупреждает гиперинсулинемию, индуцируемую рационом с высоким содержанием жиров.

На Фиг. 4 показано, что лечение с помощью ТТА предупреждает резистентность к инсулину, индуцируемую рационом с высоким содержанием жиров.

На Фиг. 5 показано, что лечение с помощью ТТА уменьшает концентрации инсулина и глюкозы в крови у крыс Zucker (fa/fa) в возрасте 5 недель.

На Фиг. 6 показано, что лечение с помощью ТТА уменьшает концентрации инсулина и глюкозы в крови у крыс Zucker (fa/fa) в возрасте 4 месяцев (Фиг. 5Б).

На Фиг. 7 показано, что лечение с помощью ТТА уменьшает ответ инсулина плазмы на глюкозу.

На Фиг. 8 показано, что ТТА усиливает митохондриальное -окисление.

ВВЕДЕНИЕ СОЕДИНЕНИЙ ПО НАСТОЯЩЕМУ ИЗОБРЕТЕНИЮ В качестве фармацевтического лекарственного средства соединения по настоящему изобретению могут быть непосредственно введены животному любым подходящим способом, включая парентеральный, интраназальный, пероральный или путем поглощения через кожу. Они могут быть введены местно или системно. Специфический способ введения каждого агента будет определяться, например, на основании истории болезни животного.

Примеры парентерального введения включают в себя подкожное, внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное и внутрибрюшинное введение.

Согласно общепринятому предложению общее фармацевтически эффективное количество каждого из соединений, вводимых парентерально, на дозу, предпочтительно будет лежать в интервале от приблизительно 5 мг/кг/сутки до 1000 мг/кг массы тела пациента/сутки, хотя, как отмечено выше, оно будет сильно зависеть от проницательности терапевта. Ожидается, что для ТТА доза 100-500 мг/кг/сутки является предпочтительной, а дозировка для TSA может быть, вероятно, в интервале от 10 до 100 мг/кг/сутки.

Для осуществления непрерывного введения каждое из соединений по настоящему изобретению обычно вводят посредством 1-4 инъекций в сутки или путем непрерывных подкожных инфузий, например с использованием мининасоса. Также может быть использован раствор для внутривенного введения в упаковке. Решающим фактором при выборе подходящей дозы является полученный результат, который оценивается по уменьшениям общей массы тела или отношения массы жира к массе без жира либо с помощью других критериев для оценки контроля или предупреждения ожирения либо предупреждения связанных с ожирением состояний, которые практикующим врачом считаются подходящими.

В одном воплощении, для парентерального введения из соединений по настоящему изобретению изготавливают препараты в виде стандартной, пригодной для инъекций лекарственной формы (раствор, суспензия или эмульсия), обычно путем смешивания каждого соединения с желаемой степенью чистоты с фармацевтически приемлемым носителем, то есть носителем, не токсичным для реципиентов при используемых дозировках и концентрациях и совместимым с другими ингредиентами препарата.

Обычно данные препараты получают посредством равномерного и близкого объединения каждого из соединений по настоящему изобретению с жидкими носителями, или тонкоизмельченными твердыми носителями либо с обоими. Затем при необходимости этому продукту придают форму желаемого препарата. Носитель предпочтительно представляет собой парентеральный носитель, более предпочтительно раствор, который изотоничен с кровью реципиента. Примеры таких носителей-наполнителей включают в себя воду, физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, полезными для данного изобретения являются неводные наполнители, такие как нелетучие масла и этилолеат, а также липосомы.

Соответственно, носитель может содержать незначительные количества добавок, таких как вещества, которые улучшают изотоничность и химическую стабильность. Такие материалы не токсичны для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают в себя буферы, такие как фосфат, цитрат, сукцинат, уксусная кислота и другие органические кислоты или их соли; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота; иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота или аргинин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая целлюлозу или ее производные, глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; противоионы, такие как натрий; и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты, полоксамеры (poloxamers) или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Для пероральных фармакологических композиций может быть использован такой носитель, как, например, вода, желатин, камеди, лактоза, крахмалы, стеарат магния, тальк, масла, полиалкенгликоль, вазелин и им подобное. Такой фармацевтический препарат может быть в виде стандартной лекарственной формы и может дополнительно содержать другие терапевтически значимые вещества или традиционные фармацевтические адъюванты, такие как консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, буферы и им подобное. Фармацевтические препараты могут быть в виде традиционных жидких форм, таких как таблетки, капсулы, драже, ампулы и им подобное, в виде традиционных лекарственных форм, таких как сухие ампулы, и в виде суппозиториев и им подобных.

Лечение с помощью настоящих соединений может осуществляться без ограничения приема пищи или с его ограничением, таким как ограничение суточного потребления пищи или калорий, как желательно для конкретного пациента.

Вдобавок, соединения по настоящему изобретению соответственно назначают в комбинации с другими видами лечения для борьбы с ожирением или для его предупреждения.

Данное изобретение можно более основательно понять с помощью ссылки на нижеследующие примеры. Их не следует, однако, истолковывать как ограничивающие объем изобретения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ РАЗДЕЛ МЕТОДЫ Крысы Zucker (fa/fa), страдающие ожирением Крысы Zucker (fa/fa), страдающие ожирением, используемые в этом исследовании, выведены в фирме по обслуживанию животных U 465 INSERM из пар, первоначально поставляемых Harriet G. Bird Laboratory (Stow, MA, США). Если не оговорено особо, животных содержат в условиях постоянного цикла свет-темнота (свет с 7:00 утра до 7:00 вечера) при 211^oС со свободным доступом к пище и воде. В каждую клетку помещают по три крысы. Прибавление в массе регистрируют ежедневно.

Крысы Wistar Самцов крыс Wistar Charles River массой 280-358 г приобретают в AnLab Ltd. (Прага, Республика Чехия) и помещают в проволочные клетки в комнате с контролируемыми температурой (221^oС) и освещением (свет с 7:00 утра до 7:00 вечера). Им предоставляют свободный доступ к пище и воде. В каждую клетку помещают по три крысы. Прибавление в массе и потребление пищи регистрируют ежедневно.

Рационы (даны в мас.%), используемые в экспериментах по питанию Стандартный рацион Крыс кормят стандартным лабораторным кормом для крыс ST1 от Velaz (Прага, Республика Чехия).

Рацион с высоким содержанием сахарозы (HS): 50,3% сахарозы, 4,8% желатина, 3,2% сена, 2,3% витаминов и минералов, 8,7% дрожжей, 8,7% сухого молока, 12,3% казеина, 9% говяжьего жира, 1% подсолнечного масла.

HS+ТТА: то же самое, что и HS+0,3% ТТА, растворенной в говяжьем жире.

HS+рыбий жир (FO): говяжий жир и подсолнечное масло заменяют на 10%-ный Triomar. Triomar приобретают в Pronova Biocare, Норвегия; он содержит 33,4% ЕРА, 3,1% DPA и 20,2% DHA.

Рацион с высоким содержанием жиров (HF): 1,9% желатина, 5,7% пшеничных отрубей, 7,7% витаминов и минералов, 25,4% кукурузного крахмала, 25,7% казеина, 26,8% говяжьего жира и 7,1% подсолнечного масла.

HF+ТТА: то же самое+0,4% ТТА, растворенной в говяжьем жире.

HF+FO: 10% говяжьего жира заменяют на 10%-ный Triomar.

Тесты на толерантность к внутривенной глюкозе Самцов крыс Zucker (fa/fa) (в возрасте 5 недель) после 5-часового голодания подвергают анестезии путем внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала натрия (50 мг/кг). Крысам в подкожную вену задней лапы делают инъекцию глюкозы (0,55 г/кг) и из хвостовой вены отбирают образцы крови в гепаринизированные пробирки через 0, 5, 10, 15, 20 и 30 минут после введения глюкозы. Образцы хранят во льду, центрифугируют и плазму до проведения анализа хранят при -20^oС.

Гиперинсулинемический эугликемический "клэмп"-тест Через 21 день соответствующего кормления (см. выше) крыс подвергают анестезии путем инъекции гидрохлорида ксилазина (xylazine) (Rometar SPOFA, Прага, Республика Чехия; 10 мг/мл) и гидрохлорида кетамина (Narkamon SPOFA, Прага, Республика Чехия; 75 мг/мл) и им устанавливают постоянные канюли в сонную артерию и яремную вену, как описано Koopmans et al. (Koopmans S.J., et al., Biochim. Biophys. Acta, 1115, 2130-2138, 1992). Снабженным канюлями крысам позволяют восстановиться в течение двух дней после операции перед тем, как проводить "клэмп"-исследования, согласно Kraegen et al. (Kraegen E. W. , et al., Am. J.Physiol., 248, Е353-Е362, 1983). Таким образом, на третий день после операции находящимся в сознании подвижным крысам делают непрерывную инфузию инсулина свиньи (Actrapid, Novo Nordisk, Дания) в дозе 6,4 мЕд на кг в минуту до достижения уровней инсулина в плазме в пределах высшего физиологического значения. Концентрацию глюкозы в артериальной крови фиксируют на главном уровне голодания посредством переменной инфузии 30%-ного (мас. /об. ) раствора глюкозы (Leciva, Прага, Республика Чехия). Каждые 15 минут, начиная с момента инфузии глюкозы, для определения концентраций глюкозы и инсулина в плазме отбирают образцы крови. Через 90 минут крыс отсоединяют от инфузионных систем и немедленно обезглавливают, собирают кровь для отделения плазмы, препарируют и взвешивают печень и эпидидимальную жировую ткань.

Измерение параметров плазмы Концентрации глюкозы (GLU, Boehringer Mannheim, Германия), свободных жирных кислот (NEFA, набор С ACS-ACOD; Wako Chemicals, Dalton, США) и b-гидроксибутирата (набор 310-А; Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, США) измеряют с помощью ферментных методов. Концентрации инсулина измеряют с помощью радиоиммуноанализа (CIS bio International, Gif sur Yvette, Франция), используя инсулин крысы в качестве стандарта для крыс Zucker. Для крыс Wistar Charles River концентрации глюкозы в плазме измеряют с помощью анализатора глюкозы фирмы Beckman (Fullerton, CA, США). Уровни инсулина в плазме измеряют с помощью набора для РИА (радиоиммуноанализа) от фирмы Linco Research Inc. (St. Charles, МО, США). Фосфолипиды измеряют с помощью ферментного метода bioMerieux, Marcy-1 Etoile, Франция, триацилглицерин - методом Technicon SA4-0324L90, США, а холестерин - методом Technicon SA4-0305L90, США.

Получение пост-ядерных и митохондриальных фракций и измерение ферментативных активностей Свежевыделенные печени отдельных старых крыс Zucker гомогенизируют в ледяном сахарозном буфере (0,25 М сахароза, 10 мМ HEPES (рН 7,4) и 2 мМ ЭДТА). Пост-ядерные и митохондриальные фракции получают с помощью препаративного дифференциального центрифугирования в соответствии с DeDuve et al. (DeDuve С., et al., Biochem. J., 60, 604-617, 1955). Модификации, чистота и выход такие, как описаны ранее (Garras A., et al., Biochem. Biophys. Acta, 1255, 154-160, 1995). Содержание кислоторастворимых продуктов в обогащенных пост-ядерных и митохондриальных фракциях измеряют, используя [1-¹⁴С]-пальмитоил-КоА и [1-¹⁴C]пальмитоил-L-карнитин (Радиохимический центр (Radiochemical Centre), Amersham, Англия) в качестве субстратов, как описано ранее (Willumsen N. , et al., J. Lipid Res., 34, 13-22, 1993). Активности карнитин-пальмитоилтрансферазы-I и -II в пост-ядерных и митохондриальных фракциях измеряют по существу так, как описано Bremer (Bremer J., Biochim. Biophys. Acta, 665, 628-631, 1981), а 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА-синтазу в митохондриальных фракциях измеряют в соответствии с Clinkenbeard et al. (Clinkenbeard К. D., et al., J. Biol. Chem., 250, 3108-3116, 1975).

Анализ РНК Экстракцию РНК (Chomczynski P. et al., Anal. Biochem., 162, 156-159, 1987), нозерн-блоттинг и слот-блоттинг РНК на нейлоновые фильтры и гибридизацию с иммобилизованной РНК проводят так, как описано ранее (Vaagenes H., et al., Biochem. Pharmacol., 56, 1571-1582, 1998). В качестве зондов используют следующие фрагменты кДНК: CPT-I (Esser V., et al., J. Biol. Chem., 268, 5817-5822, 1993), CPT-II (Woeltj-e К. F., et al., J. Biol. Chem., 265, 10720-10725, 1990), 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА-синтазу (Ayte J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87, 3874-3878, 1990) и гормон-чувствительную липазу (Holm С., et al., Biochem. Biophys. Acta, 1006, 193-197, 1989). Относительные уровни экспрессии РНК оценивают как количество радиоактивного зонда, гибридизованного с соответствующими уровнями 28S рРНК.

РЕЗУЛЬТАТЫ Пример 1.

Получение и характеристика соединения а) Синтез новых соединений Жирные кислоты с гетероатомом в переменных положениях синтезируют в соответствии с общим описанием для замещенных по 3-му положению аналогов (см. ниже) со следующими модификациями: Алкил-Галоген заменяют на Алканоик-Галоген, a HS-CHCOOR заменяют на алкил-SH.

Получены и охарактеризованы аналоги жирных кислот, приведенные в таблице А.

Очистка продуктов описана ниже. Чистота более 95%. Структура подтверждена с помощью масс-спектрометрии.

б) Синтез аналогов жирных кислот, замещенных по 3-му положению Соединения по настоящему изобретению, где заместитель Х_i=3 представляет собой атом серы или селена, могут быть получены в соответствии со следующей общей методикой: Х представляет собой атом серы: Тио-замещенное соединение по настоящему изобретению может быть получено в соответствии со следующей приведенной ниже общей методикой: Алкил-Галоген+HS-CH₂Алкил-S-CH₂-COOR.

Серусодержащее соединение, а именно тетрадецилтиоуксусную кислоту (ТТА), (СН₃-(СН₂)₁₃-S-СН₂-СООН) получают, как описано в ЕР-345.038.

Х представляет собой атом селена: Селено-замещенное соединение по настоящему изобретению может быть получено в соответствии со следующей общей методикой: 1. Алкил-Галоген+KSeCNАлкил-SeCN...

2. Алкил-SeCN+ВН₄ ^-Алкил-Se^- 3. Алкил-Se+O₂Алкил-Se-Se-Алкил Это соединение очищают, с осторожностью кристаллизуя из этанола или метанола.

4. Алкил-Se-Se-Алкил2 Алкил-Se^- 5. Алкил-Se+Галоген-СН₂-СООНАлкил-Se-СН₂-СООН.

Конечное соединение, например когда алкил представляет собой тетрадецил (СН₃-(СН₂)₁₃-Se-СН₂-СООН) (тетрадецилселеноуксусная кислота (ТSА)), может быть очищено кристаллизацией из диэтилового эфира и гексана. Этот продукт может быть полностью охарактеризован с помощью ЯМР, ИК-спектроскопии и посредством определения молекулярной массы.

Способы синтеза и выделения этих содержащих серу и селен соединений, а также соединения, в котором Х в формуле (I) представляет собой кислород (О), оксид серы (30) и диоксид серы (302), описаны в европейском патенте 345.038 и в международной патентной заявке WO 97/03663.

Пример 2 Исследование токсичности ТТА 28-дневное исследование на токсичность на собаках в соответствии с нормами GLP (Свода международных требований к лабораторным исследованиям) проведено Corning Hazleton (Европа), Англия. Пероральное введение ТТА в уровнях доз до 500 мг/кг/сутки в целом переносится хорошо. Некоторые параметры, связанные с липидами, занижены у животных, получавших высокие дозы. Это согласуется с фармакологической активностью ТТА.

Уровень дозы 500 мг/кг/сутки также вызывает потерю массы тела. Не получено никаких доказательств токсичности при уровнях доз 50 или 500 мг/кг/сутки.

Тесты на мутагенную активность проведены Covance Laboratories Limited, Англия. Сделано заключение о том, что ТТА и TSA не индуцируют мутации в штаммах Salmonella typhimurium и Escherichia coli. Более того, ТТА не является мутагенной по результатам тестирования на клетках лимфомы мыши и L5178Y.

Концентрация соединений, протестированных на S. typhimurium и Е. coli, составляет 3-1000 мг/чашка (ТТА) и 2-5000 мг/чашка (TSA). В случае клеток лимфомы мыши L5178Y концентрация составляет 2,5-50 мг/мл.

Установлено, что в этих тестах TSA и ТТА не являются мутагенными. TSA и ТТА протестированы на хромосомные аберрации в культивируемых клетках яичников китайского хомячка, и не обнаружено никаких аберраций, индуцированных протестированными дозами (12-140 мг/мл).

Следовательно, соединения по настоящему изобретению в этом отношении являются потенциально полезными в качестве фармацевтических соединений.

Пример 3 ТТА индуцирует эффект уменьшения содержания липидов у животных, страдающих ожирением Самцов крыс Zucker fa/fa, страдающих ожирением, массой 100 г в начале эксперимента помещают попарно в металлические проволочные клетки в комнате с поддержанием циклов свет-темнота продолжительностью по 12 ч и постоянной температуры 203^oС. Перед началом эксперимента животным дают акклиматизироваться в этих условиях в течение по меньшей мере одной недели.

ТТА (тетрадецилтиоуксусную кислоту), полученную в соответствии с описанной ранее методикой, и пальмитиновую кислоту (контроль) суспендируют в 0,5%-ной (мас./об.) карбоксиметилцеллюлозе (КМЦ). В каждой группе используют по шесть животных. ТТА (тетрадецилтиоуксусную кислоту) и пальмитиновую кислоту вводят в дозе 300 мг/сутки/кг массы тела путем желудочной интубации (кормления через желудочный зонд) один раз в сутки в течение 10 суток. Перед окончанием эксперимента крысам не дают пищи в течение 2 часов. Собирают кровь и органы. Концентрации липидов в плазме определяют с помощью автоматического анализатора, как описано в методическом разделе. Полученные результаты приведены в Таблице 1.

Результаты с очевидностью демонстрируют, что ТТА уменьшает уровни триглицеридов, холестерина и фосфолипидов в плазме.

Пример 4 ТТА и TSA индуцируют эффект уменьшения содержания липидов у нормальных животных (крыс Wistar) Самцов крыс Wistar массой 180-200 г в начале эксперимента помещают индивидуально в металлические проволочные клетки в комнате с поддержанием циклов свет-темнота продолжительностью по 12 ч и постоянной температуры 203^oС. Перед началом экспериментов животным дают акклиматизироваться в этих условиях в течение одной недели.

ТТА, TSA и эйкозапентаеновую кислоту (ЕРА) суспендируют в 0,5%-ной (мас. /об. ) карбоксиметилцеллюлозе (КМЦ). В каждом эксперименте используют по шесть животных, а в качестве контроля крысам вводят 0,5%-ный раствор КМЦ. После введения тестируемого соединения животных не кормят в течение 12 часов, затем подвергают анестезии с помощью галогеноэтана. ЕРА и производные жирных кислот вводят путем желудочной интубации (кормления через желудочный зонд) один раз в сутки в течение 7 суток. Образцы крови отбирают посредством сердечной пункции и концентрации липидов в плазме определяют, как описано в методическом разделе. Полученные результаты приведены в Таблице 2.

Из Таблицы 2 видно, что ТТА демонстрирует хороший эффект уменьшения уровня липидов в крови у крыс. Очевидно, что для получения того же самого уменьшения концентрации липидов в плазме требуется в 100 раз большая доза ЕРА по сравнению с TSA. Более того, соединения по настоящему изобретению, представляющие собой замещенные жирные кислоты, значительно более эффекти