Ген l-аспарагиназы erwinia carotovora и штамм escherichia coli вкпм № в-8174 - продуцент l-аспарагиназы erwinia carotovora

Ген l-аспарагиназы erwinia carotovora и штамм escherichia coli вкпм № в-8174 - продуцент l-аспарагиназы erwinia carotovora

Реферат

 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано в медицинской практике. Выделен и охарактеризован фрагмент ДНК, кодирующий полную аминокислотную последовательность L-аспарагиназы Erwinia carotovora (ECAR-LANS). Сконструирована плазмидная ДНК рBADLANS, в которой кодирующий фермент фрагмент ДНК находится под контролем регулируемого промотора рBAD. В результате трансформации штамма Е. coli предложенной рекомбинантной плазмидой и селекции трансформированных клонов получен новый штамм - продуцент ECAR - LANS (Е.coli ВКПМ B-8174), обеспечивающий высокий выход рекомбинантного фермента, основным назначением которого является применение в качестве основного компонента при получении известных и создании новых противоопухолевых препаратов. 2 с.п. ф-лы, 7 ил., 4 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и, в частности, к генетической инженерии и представляет собой фрагмент ДНК, кодирующий полную аминокислотную последовательность L-аспарагиназы Erwinia carotovora, и рекомбинантную плазмидную ДНК pBADLANS, обуславливающую синтез L-аспарагиназы Erwinia carotovora (ECAR-LANS) в клетках Escherichia coli.

Изобретение может найти применение в микробиологической промышленности и медицине, в частности для создания новых противоопухолевых средств.

Бактериальные аспарагиназы - хорошо известные ферментные препараты, которые на протяжении более 30 лет используются в противоопухолевой терапии для лечения острых лимфобластных лейкозов /1/. Эффективность применения аспарагиназ в противоопухолевой терапии ограничена развитием иммунного ответа на вводимые препараты /2/. В этой связи, для проведения необходимых курсов комбинированной химио- и энзимотерапии лейкозов целесообразно располагать набором L-аспарагиназ, обладающих высокой ферментативной активностью, но отличающихся по своим антигенным свойствам. Дополнительные возможности для направленного изменения ферментативных и иммунологических свойств L-аспаргиназ открываются с применением методов генетической инженерии /3/. Этими обстоятельствами определяется интерес к клонированию новых генов бактериальных L-аспарагиназ и их модификации путем сайт-направленного мутагенеза и гетерологичной экспресии.

К настоящему времени известны первичные структуры генов бактериальных Erwinia chryzantemi /4/, Escherichia coli /5/, Wolinella succinogenes /6/ и ряда других микроорганизмов, а также описаны рекомбинантные плазмидные ДНК, обеспечивающие синтез L-аспарагиназ в клетках бактерий Escherichia coli /7/ и Erwinia carotovora /8/. Первичная структура гена L-аспарагиназы Erwinia carotovora ранее не была известна, равно как и не описано получение рекомбинантных штаммов, обуславливающих синтез этого фермента.

Целью предлагаемого изобретения является клонирование гена ECAR-LANS и получение рекомбинантного штамма бактерий, продуцирующего биологически активную ECAR-LANS с высоким выходом. Поставленная цель достигается тем, что осуществлено выделение фрагмента ДНК штамма Erwinia carotovora, кодирующего полную аминокислотную последовательность гена ECAR-LANS, а также тем, что сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pBADLANS, обеспечивающая синтез ECAR-LANS в клетках кишечной палочки.

Сущность модифицированного гена ECAR-LANS состоит в том, что он имеет нуклеотидную последовательность, указанную на фиг.1, которая кодирует синтез белка ECAR-LANS с аминокислотной последовательностью, указанной на той же фигуре.

Сущность рекомбинантной плазмиды pBADLANS, чья рестрикционная и генетическая карта представлена на фиг.2, состоит в том, что она содержит фрагмент природного гена ECAR-LANS, встроенный в состав экспрессионного дрожжевого вектора pBAD24. Плазмида pBADLANS состоит из следующих элементов: - фрагмента EcoRI размером 4,5 тпн плазмиды pBAD24 /9/, - фрагмента EcoRI размером 1,1 тпн, несущего ген ECAR-LANS.

Молекулярный вес плазмиды pBADLANS составляет 3,5 Мд, что соответствует размеру в 5,6 тпн.

Число копий полученной плазмиды составляет 50-100 на клетку кишечной палочки.

Плазмида pBADLANS реплицируется в клетках E. coli за счет репликона pUC18. Синтез ECAR-LANS в клетках в трансформированных плазмидой pBADLANS штаммах E. coli осуществляется под контролем регулируемого промотора pBAD и терминатора rrnBTIT Escherichia coli и достигается при культивировании трансформированного штамма на обычных селективных средах при добавлении L-арабинозы до концентрации 0,2%.

Плазмида PBADLANS содержит гены: - модифицированный природный ген ECAR-LANS, который кодирует синтез этого белка в бактериальной клетке. Этот ген, введенный по месту расщепления EcoRI, имеет нуклеотидную последовательность, показанную на фиг.2. Эта последовательность кодирует полноразмерный предшественник ECAR-LANS с собственным сигнальным пептидом для экспорта белка в периплазму и последующего процессинга; - blа-ген, обеспечивающий синтез b-лактамазы и влияющий на устойчивость штаммов E.coli, несущих плазмиду, к ампициллину; - аrаС-ген, являющийся регулятором промотора pBAD.

Штамм-продуцент ECAR-LANS получают трансформацией клеток Escherichia coli BL21(DE3) /10/ [F-, ompT, hsdS_B (r_в-, m_в-), dcm, gal, (DE3), Amp^R] предложенной рекомбинантной плазмидной ДНК. Выбор штамма обусловлен тем, что он несет, а также тем, что он дефектен по синтезу протеаз, что существенно влияет на выход синтезируемых гетерологичных белков.

Полученный после селекции трансформированный клон BL21/pBADLANS способен при культивировании продуцировать ECAR-LANS. Уровень синтеза ECAR-LANS в сконструированном штамме составляет мг/л при титре культуры 1х10⁹ кл/мл, что следует из данных определения ECAR-LANS в образцах биомассы штамма-продуцента с помощью специфической ферментативной реакции.

Полученный штамм бактерий, несущий плазмиду PBADLANS, характеризуется следующими общими признаками.

Морфологические признаки: Клетки имеют продолговатую палосковидную форму, при делении не почкуются.

Культуральные признаки: Клетки хорошо растут на обычно используемых питательных средах. Время генерации около 30 мин в жидкой LB-среде. На 2-2,5% питательном агаре "Difco" образуются круглые, гладкие, желтоватые колонии с ровными краями. При выращивании на жидких LB- и YT-средах образуется интенсивная ровная мутность.

Физиолого-биохимические признаки: Оптимальная температура культивирования - от 35 до 37^oС, оптимум рН 7,6.

Источником азота служат органические соединения (в виде триптона, дрожжевого экстракта).

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ.

Способ клонирования гена ECAR-LANS и получения рекомбинантной плазмиды pBADLANS иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выделение центрального фрагмента гена ECAR-LANS Для клонирования гена ECAR-LANS использовали стратегию, основанную на методе инвертированной полимеразной цепной реакции" ("инвертированной ПЦР, 1) и схематически приведенную на фиг.3.

На первом этапе проводили сравнение аминокислотных и нуклеотидных последовательностей бактериальных L-аспарагиназ с использованием информации, доступной с помощью Интернет на сайте Сэнгер Центра в Великобритании /11/, а также на сайте Национального Центра Биотехнологической Информации США /12/. С помощью программы CLUSTAL Х /13/ были выявлены наиболее консервативные участки L-аспарагиназ бактериального происхождения (фиг.4) и синтезированы два синтетических олигонуклеотида Mot3 и Mot4, структура и свойства которых приведены в таблице 1. Эти олигонуклеотиды использовали в качестве праймеров в ПЦР с образцами геномной ДНК, выделенными общепринятым способом /14/ из различных штаммов ервиний, находившихся в лабораторной коллекции. ПЦР проводили с помощью Taq-ДНК полимеразы производства Fermentas (Вильнюс) в соответствии с инструкциями фирмы-изготовителя на приборе MJ-Research в следующих условиях: первоначальный прогрев - 2 мин, 94, затем 25 циклов амплификации - 94, 40". 50, 40". 72, 40". Объем реакционной смеси составлял 50 мкл, концентрация праймеров - 0,5 мкм, концентрация ДНК - 20 нг/мкл. В образцах ДНК, выделенных из штаммов ервиний, условно обозначенных 1А, 2А, 204, идентифицировали продукт реакции размером около 300 пн. ПЦР фрагмент, полученный на ДНК штамма 204, использовали в дальнейшей работе. Фрагмент был клонирован в вектор pT-Adv (Clontech, USA) в соответствии с инструкциями фирмы-изготовителя и его нуклеотидная последовательность определена путем автоматического секвенирования на приборе ABI 373 DNA Sequencer с использованием набора Perkin-Elmer "fluorescent dye Cycle sequencing kit". Сравнение полученной нуклеотидной последовательности с последовательностью ДНК гена LANS Erw. chrysanthemi (GenBank Acc# A 14577, ECRY-LANS) показало, что уровень гомологии между выделенным фрагментом и соответствующим центральным фрагментом гена ECRY-LANS составляет 85% (фиг.4). Таким образом, полученный фрагмент с высокой вероятностью соответствует центральной части искомого гена ECAR-LANS.

Пример 2. Определение кодирующей последовательности гена ECAR-LANS Для выделения и определения первичной структуры фланкирующих участков гена ECAR-LANS, перекрывающих кодирующую аминокислотную последовательность данного белка, использовали стратегию "инвертированной ПЦР". На основании данных секвенирования центральной части гена ECAR-LANS штамма 204 провели дизайн двух праймеров - 204F и 204R, структура и положение которых указаны в таблице 2 и на фиг.5.

Препараты геномной ДНК штамма 204 в количестве 2-4 мкг гидролизовали различными рестрикционными эндонуклеазами - BamHI, BglII, Bspl201, EcoRI, НаеIII, HindIII, KpnI, PstI, SalI, Sau3A, SpeI, Xba, XhoI по отдельности либо в комбинации двух ферментов, образующих после расщепления ДНК с идентичными "липкими концами", например BamHI+BglII, SalI+XhoI, XbaI+SpeI. После инкубации в течение 10-16 часов при нужной температуре присутствующие в смеси рестрикционные эндонуклеазы инактивировали прогреванием (10-15 мин при 65 градусах), добавляли 1/10 объема раствора, содержащего 100 мМ ДТТ и 10 мМ АТФ, 1-2 единицы Т4 ДНК-лигазы и инкубировали еще 10-12 часов при +4 градусах. Полученные образцы депротеинизировали обработкой смесью фенола с хлороформом (1: 1) и осаждали спиртом по общепринятым методикам /14/. ДНК растворяли в объеме 50 мкл и 10-15 мкл использовали в реакции ПЦР с праймерами 204F/204R, которую проводили с использованием Taq-полимеразы, либо набора Expand Long Template PCR system (Roche Diagnostics GmBh, Mannheim, Германия). Условия ПЦР и характеристики полученных продуктов приведены в таблице 2.

Образцы, полученные на матрицах Sau3A, HaeIII, EcoRI, SalI выделяли из агарозного геля с помощью набора "Wizard PCR prep purification system" производства Promega (США) в соответствии с инструкцией фирмы изготовителя и определяли их нуклеотидную последовательность путем автоматического секвенирования на приборе ABI 373. DNA Sequencer. В качестве праймеров использовали синтетические олигонулеотиды 204F и 204R. Полная последовательность была восстановлена путем построения "контига" с использованием программы Oligo /15/. Сравнение полученной последовательности со структурой гена ECRY-LANS показало, что уровень гомологии между данными последовательностями составляет 85% (фиг.6). На фиг.1 приведены нуклеотидная последовательность и выведенная из нее полная аминокислотная последовательность гена ECAR-LANS. Сравнение аминокислотных последовательностей ECAR-LANS и ECRY-LANS (фиг.7) подтвердило высокую степень гомологии между двумя белками. Степень идентичности составила 72%, степень сходства - 87%.

Пример 3. Выделение и клонирование фрагмента нуклеотидной последовательности гена ECAR-LANS, кодирующего полную аминокислотную последовательность этого белка.

Препарат геномной ДНК штамма 204 использовали в ПЦР реакции с олигонуклеотидами N204 и С204, структура и специфичность которых приведены в таблице 1. Использованные праймеры ограничивают фрагмент гена ECAR-LANS, включающий инициаторный кодон трансляции ATG, расположенный в положении + 1 последовательности, указанной на фиг.6, и терминаторный кодон ТАА, расположенный в положении + 1045 той же последовательности. Таким образом, полноразмерный специфичный продукт реакции амплификации должен включать полную кодирующую последовательность гена ECAR-LANS. Использовали следующие условия амплификации: начальная денатурация - 94, 2 мин, затем 30 циклов амплификации - 94, 40 с, 50, 40 с, 72,1 мин 30 с. Реакционную смесь разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле и выявляли продукт реакции - единичный фрагмент размером около 1100 пн. Фрагмент выделяли из геля с помощью набора "Wizard PCR preps Purification System" (Promega, США) и клонировали в вектор pT-AdV (Clontech, США), как описано в примере 1. Из полученных индивидуальных клонов трансформантов выделяли плазмидную ДНК по стандартной методике и анализировали ее путем гидролиза рестриктазой EcoRI и разделения продуктов реакции в 1% агарозном геле. Поскольку сайты рестриктазы EcoRI фланкируют с двух сторон место клонирования ПЦР-фрагмента в векторе pT-AdV, то появление в EcoRI-гидролизатах исследуемых плазмидных ДНК фрагмента размером около 1 тпн свидетельствует о наличии в рекомбинантных клонах нужной вставки. Всего отобрали 12 клонов, "положительных" по этому тесту, и использовали их в дальнейшей работе. Для доказательства того, что полученные клоны содержат фрагмент гена ECAR-LANS плазмидную ДНК использовали в "проверочных ПЦР-реакциях" с использованием комбинаций праймеров, указанных в таблице 3. Наличие продуктов ПЦР-реакции с характерными размерами, указанным в таблице 3, подтвердило, что полученные клоны содержат искомый фрагмент.

Пример 4. Конструирование рекомбинантной плазмиды pBADLANS для экспрессии ECAR-LANS в клетках Escherichia coli.

Для доказательства того, что клонированные в п.3. фрагменты ДНК способны направлять синтез функционально-активной ECAR-LANS в клетках кишечной палочки, осуществляли конструирование плазмид, содержащих фрагмент гена ECAR-LANS под контролем промотора PBAD вектора pBAD24. Для получения "вставки" по 2 мкг ДНК каждого из 12 "положительных" клонов, отобранных согласно процедуре, описанной в п. 3., объединяли в одной пробирке и проводили гидролиз суммарной ДНК рестриктазой EcoRI. Выделяли из агарозного геля "суммарный" EcoRI-фрагмент размером около 1 тпн, соответствующий фрагменту гена ECAR-LANS. Для получения "вектора" 2 мкг плазмидной ДНК pBAD24 линеаризовали по сайту EcoRI, обрабатывали фосфатазой кишки теленка для предотвращения замыкания вектора "сам на себя" и выделяли из агарозного геля фрагмент размером 4,5 тпн. 20 нг "вектора" лигировали с 50 нг "фрагмента" с помощью Т4 ДНК лигазы в стандартных условиях и смесью трансформировали компетентные клетки штамма E.coli XL1. Индивидуальные клоны трансформантов анализировали на способность направлять синтез функционально-активной ECAR-LANS. Для этого отдельные колонии (30 штук) выращивали на LB-среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина до ОП600 ~ 1,0 в объеме 5 мл. После этого в культуры вносили L-арабинозу до конечной концентрации 0,2% для индукции промотора pBAD и продолжали инкубацию в течение 2 часов. Аликвоты суспензии клеток выросших индивидуальных культур трансформантов использовали для определения L-аспарагиназной активности с помощью разработанного для этой цели микрометода. В основе данного метода лежит периплазматическая локализация экспрессируемой в клетках E.coli ECAR-LANS, благодаря чему субстрат (аспарагин) свободно проникает в клетку и взаимодействует с ферментом. Суспензии клеток (50 мкл) помещали в ячейку 96-луночной плашки и инкубировали (37^oС; 20 мин) с 50 мкл L-аспарагина (30 мг/мл в 0,0125 М боратном буфере, рН 9,5). По окончании инкубации в лунки добавляли 50 мкл реактива Несслера. Активность аспарагиназы оценивается визуально по интенсивности развивающегося окрашивания. Контрольные пробы содержат либо бактериальные клетки, либо раствор L-аспарагина. Таким образом, из 30 проанализированных клонов было выявлено 5 "положительных". Отобранные положительные клоны дополнительно анализировали на наличие вставки с фрагментом гена ECAR-LANS. Для этого выделяли плазмидную ДНК, гидролизовали ее рестриктазой EcoRI и выявляли наличие продуктов гидролиза размером 4.5 тпн ("вектор") и 1.1 тпн ("фрагмент"). Один из отобранных клонов вводили путем трансформации в штамм E.coli BL21(DE3). Для количественного определения уровня экспрессии ECAR-LANS в полученных рекомбинантных штаммах отдельные клоны трансформантов BL21(DE3)/pBADLANS выращивали на LB среде в объеме 50 мл в колбах объемом 500 мл при температуре 37^oС А₆₀₀ = 0,6-0,7 ОЕ. Далее вносили индуктор - L-арабинозу до концентрации 0,2% и проводили инкубацию еще в течение 22 часов, отбирая периодически пробы культуральной жидкости для определения роста культуры и активности фермента в бактериальных клетках /16/. Полученные данные обобщены в таблице 4. Как видно из представленных данных, удельная активность фермента достигает максимума около 55 МЕ/мг белка через 4 часа инкубации, что примерно в 50-60 раз выше, чем у исходного дикого штамма Erw.carotovora 204. Таким образом, в этих экспериментах был достигнут достаточно высокий уровень экспрессии рекомбинантной аспарагиназы Erw.carotovora (8-10%) от тотального белка клетки. Сопоставление полученных данных с известными ранее литературными сведениями о характеристиках рекомбинантных штаммов E.coli, продуцирующих бактериальные аспарагиназы, позволяет утверждать, что уровень продукции рекомбнантной ECAR-LANS в созданном нами штамме примерно в 1,5 раза превышает продуктивность лучших из ранее разработанных образцов /8/. Физическая и генетическая карта полученной плазмиды приведена на фиг.2.

Формула изобретения

1. Ген L-аспарагиназы Erwinia carotovora с кодирующей последовательностью SEQ ID №1.

2. Штамм Escherichia coli ВКПМ № В-8174, содержащий плазмидную ДНК рBADLANS, - продуцент L-аспарагиназы Erwinia carotovora.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15