Способ количественной оценки функциональной активности тучных клеток кожи

Способ количественной оценки функциональной активности тучных клеток кожи

Реферат

 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для количественной оценки функциональной активности тучных клеток. Сущность изобретения состоит в том, что образец дермальной ткани измельчают, трипсонизируют, термостатируют, центрифугируют, готовят контрольную пробу путем добавления физиологического раствора и пробу сравнения добавлением раствора активатора дегрануляции, термостатируют, центрифугируют, окрашивают 0,3% раствором нейтрального красного, фотоколориметрируют при 490 нм, вычисляют степень дегрануляции тучных клеток (СДТК) и при значениях СДТК от 2,1 до 2,5 функциональная активность тучных клеток кожи соответствует норме. Техническим результатом является повышение точности способа оценки функциональной активности тучных клеток кожи. 1 табл.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, лабораторному делу, конкретно к способам количественной оценки функциональной активности тучных клеток.

Известен способ количественной оценки функциональной активности тучных клеток, который заключался в заборе кусочка кожи, весом 5-10 г со спины животного, который фиксировали в жидкости Карнуа и готовили парафиновые срезы. Затем их окрашивали 0,1% раствором толуидинового синего. Под микроскопом (Х400) подсчитывали общее количество тучных клеток кожи в 30 полях зрения.

Все тучные клетки по сумме морфологических признаков делили на 3 типа: 1 тип - мелкие, чаще вытянутые клетки с неоформленной ортохроматической зернистостью и плохо различимым ядром (молодые, незрелые формы); 2 тип - крупные клетки овальной или неправильной формы с хорошо дифференцированной метахроматической гранулярностью в цитоплазме и отчетливо различимым ядром (зрелые формы); 3 тип - клетки дегранулирующие с явными признаками нарушения целостности клеточного тела и выделения в окружающее пространство цитоплазматических гранул (дегранулированные формы). Для оценки функциональной активности тучных клеток кожи вычисляли индекс активности (ИА) - отношение числа дегранулированных тучных клеток к количеству всех интактных (1). При величине индекса активности в пределах от 0,09 до 0,28 определяли нормальную функциональную активность, а при величине <0,28 - повышение функциональной активности.

Однако данный способ имеет недостатки: недостаточная точность, т.к. способ оценки носит субъективный характер.

Новая техническая задача - повышение точности способа.

Указанную задачу решают применением нового способа количественной оценки функциональной активности тучных клеток кожи, заключающегося в заборе клеточного материала и последующем его исследовании, причем его гомогенизируют, трипсонизируют, термостатируют, затем центрифугируют и готовят контрольную пробу, добавляя в нее физиологический раствор, и пробу сравнения, добавляя в нес активатор дегрануляции, после пробы помещают в термостат и далее окрашивают 0,3% раствором нейтрального красного, фотоколориметрируют и вычисляют степень дегрануляции тучных клеток по формуле: СДТК=D₂-D₁х100, где СДTК степень дегрануляции тучных клеток, в усл.ед.; D₁ - оптическая плотность пробы сравнения; D₂ - оптическая плотность контрольной пробы.

Способ осуществляют следующим образом.

Из области спины животного берут кусочек кожи весом 0,5 г, промывают физиологическим раствором, помещают в фарфоровую ступку и измельчают ножницами. Измельченную дермальную ткань переносят в центрифужную пробирку, заливают 3 мл 0,12% раствора трипсина и оставляют на 60 мин при 37^oС, периодически тщательно перемешивая. После термостатирования в пробирку добавляют 3 мл 5% лошадиной сыворотки, чтобы остановить действие трипсина (2).

Взвесь центрифугируют в течение 10 мин при 600-700 об/мин. По окончании центрифугирования надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют 5 мл среды 199.

Из центрифужной пробирки по 2 мл полученной взвеси переносят в две новые пробирки, в одну из которых добавляют 2 мл 1% раствора активатора дегрануляции, например пирогенала (проба сравнения), а во вторую - 2 мл физиологического раствора (контрольная проба). Пробирки помещают в термостат на 30 мин при 37^oС. Затем их повторно центрифугируют в течение 20 мин при 600-700 об/мин. Сливают супернатант и ресуспендируют осадок средой 199, по 3 мл в каждую пробирку.

В обе пробы вносят по 1 капле 0,3% нейтрального красного и тщательно перемешивают. Содержимое пробирок фотоколориметрируют против воздуха при длине волны 490 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 5 мм, определяют оптическую плотность (3).

Под воздействием активатора происходит массивная дегрануляция тучных клеток в пробе с добавлением 1% раствора пирогенала. Дегранулированные тучные клетки, при окраске нейтральным красным, остаются менее прокрашенными по сравнению с тучными клетками в пробирке с добавлением физиологического раствора и соответственно оптическая плотность при фотоколориметрировании содержимого первой пробирки с пробой сравнения ниже. Степень функциональной активности тучных клеток прямо пропорциональна разнице между оптической плотностью пробы сравнения и контрольной пробы и вычислялась но формуле: СДТК=D₂-D₁х100, где СДТК - степень дегрануляции тучных клеток, в усл.ед.; D₁ - оптическая плотность пробы сравнения; D₂ - оптическая плотность контрольной пробы.

Обоснование способа.

1. Для выделения тучных клеток кожу гомогенизируют и тринсонизируют, термостатируют, центруфугируют, так как эти этапы являются необходимыми для приготовления клеточной взвеси (2). При приготовлении проб руководствуются тем, что они готовятся из одного кусочка кожи и в одних условиях, исходя из этого, предполагается, что в них содержится одинаковое количество тучных клеток. В качестве активатора дегрануляции используется, например, пирогенал, так как он является мощным неспецифичным активатором дегрануляции, апробированным во многих экспериментальных работах (4). Окраска нейтральным красным позволяет выявить тучные клетки и по интенсивности окраски можно судить о зрелости тучной клетки (5). Фотоколориметрирование является распространенным методом исследования в случае анализа растворов с разной интенсивностью окраски. Использование формулы позволяет охарактеризовать функциональную активность тучных клеток кожи в количественном значении, что удобно для интерпретации и статистической обработки результатов.

2. Количественные критерии оценки были получены после интерпретации результатов экспериментальных исследований, которые были проведены на 60 взрослых беспородных крысах-самцах массой 180-220 г, разделенных на 2 группы: группа А с моделированным аллоксановым диабетом (45 крыс) и группа В - интактные животные (15 крыс). Для моделирования аллоксанового диабета у животных использовали 4% раствор аллоксангидрата ("Лахема-Хеманол", Чехословакия), который вводили подкожно однократно в дозе 400 мг/кг.

Животных забивали декапитацией согласно методическим рекомендациям МЗ СССР "Эвтаназия экспериментальных животных" [1985]. Исследуемым материалом являлись гистопрепараты кожи. Статистическую обработку данных проводили с помощью t-критерия Стьюдента и определяли значимость различий (p). Разницу двух сравнимаемых величин считали достоверной при р<0,05.

Данный способ может быть рекомендован для исследования функциональной активности тучных клеток кожи при различных патологиях, моделируемых на животных.

Список литературы 1. Соловьев Ю.Н. Действие холода и ультрафиолетовых лучей на синтез тучных клеток // Архив патологии, 1964. - 8. - с.63-68.

2. Голубев Д.Б., Соминина А.А., Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. - Л.: Медицина. - 1976 - 222 с.

3. Порядин Г. В., Зеличенко Л.И. Способ количественной оценки дегрануляции тучных клеток // Иммунология, 1991. - 3, с. 59-60.

4. Зеличенко Л. И., Ишимова Л.М. Пассивная анафилаксия тучных клеток и непрямой тест их дегрануляции // Тучные клетки соединительной ткани, - 1968. - С. 151.

5. Радунская С. Ф. Непрямой тест дегрануляции тучных клеток крыс как метод оценки специальной активности неинфекционными аллергенами. Автореф. дисс. кан. наук. М. - 1982. - 23 с.

Формула изобретения

Способ оценки функциональной активности тучных клеток кожи, заключающийся в исследовании дермальной ткани, отличающийся тем, что ее измельчают, добавляют 3 мл 0,12%-ного раствора трипсина, термостатируют 60 мин при 37С, добавляют 3 мл 5%-ной лошадиной сыворотки, центрифугируют 10 мин при 600-700 об/мин, осадок ресуспендируют 5 мл среды 199, готовят контрольную пробу путем добавления к 2 мл полученной взвеси 2 мл физиологического раствора, и пробу сравнения добавлением к 2 мл взвеси 2 мл 1%-ного раствора активатора дегрануляции, например пирогенала, термостатируют 30 мин при 37С, центрифугируют 20 мин при 600-700 об/мин, осадок ресуспендируют 3 мл среды 199, вносят по 1 капле 0,3%-ного нейтрального красного, фотоколориметрируют при 490 нм, вычисляют степень дегрануляции тучных клеток (СДТК) по формуле

СДТК=D₂-D₁ 100,

где D₁ - оптическая плотность пробы сравнения;

D₂ - оптическая плотность контрольной пробы,

и значения СДТК от 2,1 до 2,5 свидетельствуют о нормальной функциональной активности тучных клеток кожи.

РИСУНКИ

Рисунок 1