Аденовирус-рекомбинант, несущий структуру аденовирусного вектора (варианты), способ восстановления функции протеина p53 в опухолевой клетке с дефицитом природного p53, способ производства аденовируса-рекомбинанта

Аденовирус-рекомбинант, несущий структуру аденовирусного вектора (варианты), способ восстановления функции протеина p53 в опухолевой клетке с дефицитом природного p53, способ производства аденовируса-рекомбинанта

Реферат

 

Изобретение относится к генной инженерии. Предложен адновирус-рекомбинант, включающий аденовирусный вектор, который содержит природный ген р53, экспрессирующий в клетках млекопитающих протеин р53. Эффект повышения уровня протеина р53 в организме используется в способе восстановления функции протеина р53 в опухолевой клетке. Изобретение позволяет предотвращать рост опухолевых клеток. 4 c. и 30 з.п. ф-лы, 24 ил., 2 табл.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ ОБЛАСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ Настоящее изобретение относится, в основном, к области технологии получения рекомбинантов. В частности, оно касается вопроса упрощения и повышения эффективности способов получения рекомбинантных аденовирусов. Кроме того, предложены новые составы и способы использования структур аденовируса р53, включая способы восстановления нормальных функций р53 и подавления роста клеток с отклоненными от нормы р53.

ОПИСАНИЕ УРОВНЯ ТЕХНИКИ Современные методы лечения рака, включающие радиационную терапию, хирургию и химическую терапию, характеризуются ограниченной эффективностью. Только рак легких убивает в Соединенных Штатах более 140000 человек ежегодно. Недавно для установленной возрастной группы смертность от рака легких превысила смертность от рака груди у женщин. Хотя введение в жизнь программы борьбы с курением снизило темпы распространения курения, уровень смертности от рака легких останется высоким даже в 21-м веке. Развитие новых терапевтических методов лечения рака легких будет зависеть от проникновения в механизм биологии рака легких на молекулярном уровне.

В настоящее время установлено, что разновидности рака вызываются, по крайней мере частично, генетическими отклонениями, которые проявляются или в повышенной экспрессии одного или более генов, или в экспрессии отклоненного от нормы или мутантного гена или генов.

Например, во многих случаях, как известно, экспрессия онкогенов вызывает развитие рака. "Онкогены" - это генетически измененные гены, чей мутированный продукт экспрессии каким-то образом нарушает нормальное функционирование клетки или управление этим процессом (Spandidos et al., 1989).

Большинство из изученных на настоящий момент онкогенов получили определение "активированных" в результате мутации, часто точечной мутации, в кодирующей области нормального клеточного гена, то есть "протоонкогена", результатом чего является замещение аминокислоты в протеиновом продукте, экспрессия которого претерпела изменение. Этот продукт с видоизмененной экспрессией проявляет отклоненные от нормы биологические функции, которые оказывают влияние на протекание процесса образования опухолей (Travali et al. , 1990). He проявляющие себя мутации могут развиваться при различных обстоятельствах, например в результате химического мутагенеза или ионизирующей радиации. Целый ряд онкогенов или онкогенных семейств, включая ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun, abl, в настоящее время уже идентифицированы и в различной степени описаны (Travali et al., 1990, Bishop, 1987).

Как установлено, при нормальном росте клетки протоонкогены, стимулирующие рост, сбалансированы генами-супрессорами, сдерживающими рост новообразований. Некоторые факторы могут внести дисбаланс во взаимодействие этих двух сил, ведущий к состоянию, предполагающему образование опухолей. Одним из таких факторов является мутация в генах-супрессорах новообразований (Weinberg, 1991).

Одним из важных генов-супрессоров новообразований является ген, кодирующий клеточный протеин, р53, который представляет собой ядерный фосфопротеин kD 53 (замещенный в цикле фосфопротеин kD 53), который управляет клеточной пролифератией (процессом разрастания клеток). Мутации, происходящие с геном р53, и потеря аллельного гена на хромосоме 17р, где этот ген размещен, представляют собой одни из наиболее распространенных видоизменений, идентифицированных в злокачественных новообразованиях человека. Протеин р53 обладает высокой степенью сохранности в процессе эволюции и проявляется в наиболее нормальных тканях. Было продемонстрировано, как природный р53 должен быть вовлечен в управление клеточным циклом (Mercer, 1992), в процесс транскрипционного регулирования (Fields et al., 1990, and Mietz et al., 1992), в репликации DNA (Wilcock and Lane, 1991, and Bargonetti et al., 1991) и в возбуждение апоптоза (Yonish - Rouach et al., 1991, and Shaw et al., 1992).

Известны различные мутантные аллельные гены р53, в которых единственное базовое замещение ведет к синтезу протеинов, которые имеют совершенно другие характеристики, определяющие закономерности роста, что в конечном счете ведет к злокачественным новообразованиям (Hollstein et al., 1991). Действительно, было установлено, что ген р53 является наиболее часто мутированным геном при раке у человека (Hollstein et al., 1991; Weinberg, 1991) и, в частности, ассоциируется с теми разновидностями рака, возникновение которых связано с сигаретным дымом (Hollstein et al., 1991; Zakut - Houri et аl., 1985). Чрезмерная экспрессия р53 в опухолях груди также была документально подтверждена (Casey et al., 1991).

Одним из аспектов, привлекающих наибольшее внимание генной терапии рака, является использование генов-супрессоров, таких как р53, для лечения опухолей. Было установлено, что трансфекция (заражение клеток чужеродной нуклеиновой кислотой, например вирусной) природного гена р53 в определенного типа опухолевых клетках рака груди и легких может восстановить управление процессом подавления роста в клеточных линиях (Casey et al., 1991, Takahasi et аl. , 1992). Хотя трансфекция DNA не является жизнеспособным средством введения DNA в клетки пациентов, эти результаты служат демонстрацией того, что внедрение природного гена р53 в раковые клетки, содержащие мутированный р53, может стать эффективным методом лечения, если будут разработаны усовершенствованные способы внедрения гена р53.

В настоящее время ведется изучение проблемы и создаются системы внедрения гена, которые могут быть применены в генной терапии для подавления роста опухоли. Средства на основе вируса для трансфекции гена вызывают особый интерес благодаря способности вирусов инфицировать действительно живые клетки. Налицо способ, в котором вирусный генетический материал перемещается самостоятельно. В этой связи уже были отмечены некоторые успешные решения, например воспроизведение ретровирусных векторов (направленных на вирусы), разработанных для доставки внедряемых генов. Однако существуют серьезные проблемы, связанные с использованием ретровирусных векторов в генной терапии. Поскольку их эффективность зависит от наличия ретровирусных рецепторов на клетках-мишенях, их трудно сконцентрировать и обеззаразить, и, кроме того, они могут эффективно внедряться только в размножающиеся клетки (репликационные клетки).

Недавно были предложены аденовирусные векторные системы для использования в некоторых протоколах перемещения определенных генов, однако, современные методы приготовления аденовирусов-рекомбинантов имеют недостатки, которые заключаются в следующем. Эти методы основаны на трансфекции вирусов экспрессии и аденовирусных плазмидов в клетках-хозяевах и последующей реакции розеткообразования на зараженных клетках. При этом данные методы трансфекции имеют промежуточное звено в виде фосфата кальция.

Такие методы осуществления трансфекции неэффективны и их типичным результатом является низкий уровень воспроизведения вирусов.

Поэтому остается очевидной необходимость в разработке новых методов внедрения генов-супрессов подавления роста новообразований, таких как р53, в клетки в качестве средств для восстановления функции подавления роста. Большой интерес вызывают также способы приготовления вирусов-рекомбинантов, которые исключают трансфекцию с промежуточным звеном в виде фосфата кальция и присоединение агарозы для реакции розеткообразования.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ Настоящее изобретение относится к изложенным выше проблемам создания эффективных способов получения аденовирусов-рекомбинантов, таких, например, как аденовирус р53, и эффективных средств, с помощью которых возможно восстановление функции р53, воздействующих на клетку с видоизмененным р53.

Получены векторы аденовируса-рекомбинанта и вирионы; предложены способы использования этих составов, с целью доставки природной экспрессии р53 в клетки с отклоненными от нормы функциями р53, какими являются раковые клетки. Кроме того, еще одним существенно новым признаком изобретения является упрощенный протокол воспроизведения аденовируса-рекомбинанта, благодаря использованию трансфекции DNA с промежуточным звеном липосомы с последующим цитопатогенным эффектом, т. е. патогенным воздействием вируса на культуру ткани, и предпочтительно исследованиями цепной реакции полимеризации (PCR).

Более того, использование этого нового метода образования и воспроизведения аденовирусов-рекомбинантов показало, что другие гены могут быть инкорпорированы в бином вириона. Эти гены могут включать гены - супрессоры новообразований, например ген ретинобластомы (rb), невосприимчивые онкогены, т. е. anti-с-mус и anti-k ras, и другие гены, несущие ответственность за управление процессом роста при генной терапии рака.

Используя настоящее изобретение, изобретатели продемонстрировали замечательный эффект в управлении ростом метастазa. Было показано, что аденовирус - рекомбинант Ad5CMV - р53 значительно снижает интенсивность роста измененных клеток. Вирус подавлял онкогенность инфицированных вирусом клеток Н 358. Кроме того, он предотвращал рост ортотопического рака легких, когда вирус вводился внутритрахеально, следуя за внутритрахеальной инокуляцией клеток Н226Вr.

Подавление онкогенности также наводит на мысль о том, что даже временной экспрессии высокого уровня протеина р53 может быть достаточно для возбуждения эффекта, уничтожающего опухолевые клетки.

В одном из вариантов осуществления данное изобретение касается векторных структур для введения природных генов р53 в клетки-мишени, причем существует подозрение, что данные клетки-мишени содержат мутированные или отклоненные от нормы гены р53, включающие раковые клеточные группы.

Эти варианты изобретения предусматривают приготовление экспрессии гена или единицы транскрипции, в которой ген располагается под контролем промотора, а упомянутая единица внедряется в аденовирусный вектор вместе с аденовирусом-рекомбинантом. Данное изобретение обладает новизной и оригинальностью решения проблемы по нескольким причинам. Во-первых, ранее существовало мнение, что вирус р53 не может воспроизводиться в "упаковывающих" клетках, например, таких, которые используются для получения аденовирусов, из-за их возможной токсичности; во -вторых, ЕIB аденовируса оказывает влияние на р53 и этим самым отрицательно влияет на его функции; в третьих, получив возможность к воспроизведению, аденовирус р53 обнаруживает неожиданную способность к эффективному подавлению роста различных раковых клеток, и наконец, онкогенность клеток рака легких была подавлена благодаря лечению с помощью Ad5CMV-p53, но не с помощью контрольного вируса.

Все эти моменты указывают на то, что новый метод доставки протеина р53 и способ его приготовления обнаруживают поразительную терапевтическую эффективность. Таким образом, настоящее изобретение касается аденовирусных векторных структур, которые вовлекаются за счет использования аденовируса в процесс переноса генов-супрессоров роста новообразований, например р53, нечувствительных онкогенов и других генов при терапевтическом лечении рака у человека. В одном из вариантов изобретения показаны рекомбинантные аденовирусные вирионы или частицы, инкорпорирующие такие векторы, и их фармакологические составы, которые содержат рекомбинантную вставку, имеющую область экспрессии, кодирующую природный р53, посредством которого векторы получают возможность создавать условия для проявления р53 (экспрессии р53) в метастатических клетках человеческого организма. Область экспрессии р53 в векторе может содержать последовательность геномов, но для упрощения можно предположить, что более предпочтительно использование последовательности cDNA р53, так как это легко доступно для анализа уровня техники в данной области и проще в управлении процессом. Рекомбинантная вставка вектора должна также включать провоцирующую область и сигнал полиаденилации (polyadenilation), например SV40 или сигнал полиаденилации гена протамина.

В предпочтительных вариантах изобретения предполагается, что может возникнуть необходимость в создании сильного, существенного (структурного) промотора, например промотора цитомегаловируса (CMV), вирусного LTR, RSV, промогора SV40 или промотора, ассоциированного с генами, которые проявляются на высоких уровнях в клетках млекопитающих, например в факторе-1 элонгации или в промоторах актина. В настоящее время наиболее предпочтительным промотором считается промотор IE вируса цитомегалии (CMV).

Ген р53 cDNA может быть введен в аденовирус-рекомбинант, в соответствии с настоящим изобретением, простым включением или добавлением кодирующей последовательности р53 в вирусный геном, который испытывает недостаток в Е1В. Однако в качестве предпочтительных аденовирусов следует рассматривать дефектные вирусы репликаций, в которых вирусный ген, существенный для репликации и/или "упаковывания" был удален из аденовирусной векторной структуры, давая возможность зоне экспрессии р53 переместиться на свое место. Любой ген, в дополнение к Е1В, то ли существенный, например Е1А, Е2, Е4, то ли несущественный, например Е3, для репликации, может быть удален и замещен р53.

В частности, предпочтительными являются те векторы и вирионы, в которых области Е1А и Е1В векторов аденовируса удалены, а зона экспрессии р53 внедрена на их место, что показано в качестве примера на структуре генома на фиг. 1.

Технологические процессы приготовления репликационных дефектных аденовирусов хорошо известны из уровня техники, что подтверждается приведенными в данном описании аналогами Ghoss-Choudhury и Graham (1987); McGrory et al. (1988), и Gluzman et al. (1982), перечисленными в ссылках на использованную литературу. Кроме того, хорошо известно, что могут быть использованы различные клеточные линии с целью воспроизведения аденовирусов-рекомбинантов, при этом их воспроизведение может продолжаться до тех пор, пока существует возможность дополнения дефекта репликации, если таковой присутствует. Предпочтительной клеточной линией является клеточная линия 293 человека, но существуют также и другие клеточные линии, приемлемые для репликации, например могут быть использованы в предпочтительном случае экспрессии Е1А и Е1В. Причем клетки могут воспроизводиться как на пластмассовых чашках, так и в культуре суспензии, чтобы получить запасы культуры вирусов.

Изобретение не ограничивается вирусами с недостающим звеном Е1 и клетками с экспрессией Е1. Действительное в связи с настоящим изобретением могут быть использованы другие дополняемые комбинации вирусов и клеток-хозяев, причем этот процесс дополнения (замещения) будет длиться до тех пор, пока вектор р53 не останется без Е1В. Могут быть использованы клетки с экспрессией Е2 и вирус, теряющий функциональное звено Е2 точно так же, как и клетки с экспресией Е4 и вирус, теряющий функциональное звено Е4 и т.д. В том случае, если несущественный для репликации ген удаляется или замещается, каковым, например, является ген Е3, такой дефект нет надобности отдельно укомплектовывать с помощью клетки-хозяина.

Что касается природы векторов аденовирусов и вирионов, то для успешного их использования в связи с настоящим изобретением решающим фактором является только удовлетворение требований, связанных с отсутствием в векторах аденовирусов и вирионах E1В. Может быть использован любой аденовирус из 42 известных различных серотипов или подгрупп A-F. Аденовирус типа 5 подгруппы С является предпочтительным стартовым материалом для получения цельного репликационно-дефектного вектора аденовируса для использования в методике, предлагаемой настоящим изобретением. Аденовирус типа 5 выбран потому, что в связи с этим аденовирусом человека накоплен значительный объем биохимической и генетической информации, и, кроме того, он традиционно применяется для большинства структур, использующих аденовирус в качестве вектора.

Дополнительными объектами настоящего изобретения являются новые сегменты DNA р53 или векторы экспрессии, а также рекомбинантные клетки-хозяева, которые инкорпорируют аденовирусный вектор р53, приготовленный в соответствии с настоящим изобретением. Сегменты DNA в соответствии с настоящим изобретением должны, в основном, содержать, в направлении 5'-3' транскрипции, промотор цитомегаловируса 1Е, структурный ген для природного человеческого р53 и ранний сигнал полиаденилации SV40. Рекомбинантная, содержащая аденовирус клетка-хозяин должна представлять собой эукариотическую клетку-хозяин или клетку млекопитающего, такую как, например, клетка 293, или такой клеткой может быть клетка с дефектом в гене р53, которая была инфицирована аденовирусом в соответствии с изобретением.

Следующие примеры осуществления изобретения касаются фармацевтических составов, содержащих аденовирус-рекомбинант, который кодирует природный р53, рассеянных в фармакологически допустимых растворах или буферных смесях. Предпочтительные фармакологически допустимые растворы включают нейтральные физиологические растворы, защищенные фосфатом, лактатом, трис (Tris) и т.п. Безусловно существует стремление очистить аденовирус до такой степени, чтобы существенно освободить его от нежелательных загрязнений, таких, например, как дефектные, создающие помехи аденовирусные частицы или эндотоксины и другие пирогены, чтобы этот аденовирус не вызывал побочных реакций в организме животного или человека, получающего векторную структуру. Предпочтительными средствами очистки вектора является создание условий для использования градиентов плавучей плотности, например центрифугирование хлорида цезия в градиенте плотности.

Последующие варианты.

Последующие варианты создания изобретения относятся к способу возбуждения экспрессии р53 или восстановления экспрессии природного протеина р53 в клетках, испытывающих дефицит в природном протеине р53. Для выполнения этой задачи следует обеспечить контакт клетки, несущей мутацию р53, с некоторым количеством аденовирусов-рекомбинантов, которые в соответствии с изобретением способны заставить проявиться экспрессии природного р53 в клетке. Это может быть осуществлено путем введения физиологически эффективного количества фармацевтического состава, содержащего аденовирус, в организм животного или человека, который поражен клетками с дефектным р53, каковыми, например, являются раковые клетки. Поэтому настоящее изобретение относится также к эффективным способам лечения раковых заболеваний человека, а именно рака груди и рака легких.

Еще в одном варианте осуществления изобретения аденовирус р53 с выраженной экспрессией р53 используется для предотвращения раковых заболеваний и даже для подавления роста метастазов. В одном из вариантов использования изобретения рекомбинантный аденовирус с проявляющейся экспрессией р53 используется для подавления бесконтрольного роста клеток, которые имеют мутации гена р53. В предпочтительных вариантах аденовирус с проявляющейся экспрессией р53 подавляет онкогенность и рост только клеток Н358, но никаких других, что может быть использовано в качестве индикатора функции р53.

В следующем варианте использования изобретения вирус с выраженной экспрессией р53 используется для предотвращения ортотопического роста опухоли легких при введении вируса внутритрахеальным способом. Вирус Ad5CMV показал обнадеживающие результаты в испытаниях на безволосых мышах. Вирус подавлял онкогенность пораженных вирусом клеток Н358, клеток которые нормально производят значительные опухолевые массы. Введение вируса также предотвращало ортотопический рост опухоли легких при введении вируса внутритрахеальным способом, сопровождающим внутритрахеальную инокуляцию клеток Н226Вr, подтверждая воздействие Ad5CMV-p53 in vitro на клетки рака легких. Онкогенность клеток рака легких подавлялась только посредством лечения Ad5CMV-p53, но не контрольным вирусом Ad5/RSV/GL2, что указывает на терапевтическую эффективность протеина р53. Специалистам, компетентным в данной области знаний, должно быть очевидно, что в соответствии с настоящим изобретением предполагаются и другие методы доставки вируса.

Поскольку все признаки данного изобретения представлены использованием структур р53, в связи с восстановлением нормальной функции клетки и для использования при лечении рака, существует предположение, что данное изобретение применимо, в основном, для любой ситуации, когда есть намерение достичь высокого уровня экспрессии протеина, подавляющего рост в клетке-мишени или клетке-хозяине путем использования аденовирусов-рекомбинантов. Например, в контексте моделей для лечения рака, касающихся формы, но не содержания, изобретением предлагается частный вариант, в дополнение к замещению р53, который представляет собой введение гена (rb) ретинобластомы, (с-mуc или с-ras) нечувствительных (антисенсорных) онкогенов и других генов, имеющих отношение к терапии рака человека.

Следует отметить, что, поскольку используемый вектор аденовируса является дефектной репликацией, он не сможет повториться (размножиться) в таких клетках, которые являются раковыми и которые обязательно инфицируются. Итак, при продолжении лечения определенной группы пациентов, например пациентов, которые вступили в начальную стадию терапии рака, для них может потребоваться повторное внедрение вируса после определенного периода времени, например через 6 месяцев или через год.

Векторы аденовируса по настоящему изобретению находят также применение в вариантах осуществления изобретения, которые непосредственно не связаны с генной терапией. Альтернативные варианты использования включают, например, анализы in vitro и исследования мутагенезиса различных генов р53 и рекомбинантное получение протеинов для использования, например, в воспроизведении антитела или в других вариантах. В вариантах изобретения, которые не связаны с терапевтическими способами лечения человека, включая все те, которые касаются дальнейшего определения активности р53 на молекулярном уровне, могут быть использованы другие соответствующие вирусы для переноса р53 в клетку. Вирусы, относящиеся к семейству герпес-вирусов, например герпес-симплекс - вирус (HSV), Эпштейн - Барр - вирус (EBV), цитомегаловирус (CMV), а также вирусы инфекционного бульбарного паралича (PRV) могут послужить доказательством данного суждения.

Отдельным аспектом настоящего изобретения является упрощение способа получения любого из типов аденовирусов-рекомбинантов благодаря исключению использования неэффективного способа трансфекции с применением в качестве промежуточного звена фосфата кальция и трудоемкой реакции розеткообразования. В соответствии с настоящим изобретением, чтобы получить аденовирус-рекомбинант, следует просто ввести плазмид аденовируса и вектор экспрессии в подходящую клетку-хозяин путем трансфекции с промежуточным звеном липосомы, а затем проанализировать культивированную клетку-хозяин на предмет присутствия цитопатогенного эффекта (СРЕ), который является показателем осуществления гомологической рекомбинации и получения вируса.

Новый способ отличается увеличением эффективности трансфекции первого этапа, который способствует лучшему протеканию второго, который эффективно проявляется на этапе цитопатогенного эффекта (СРЕ).

Предпочтительным составом для использования в трансфекции с промежуточным звеном липосомы является DOTAP (N-[1-(2,3-дидеоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмониумметисульфат), который доступен для приобретения на коммерческом рынке. Цитопатогенный эффект (СРЕ) является признаком, который поддается непосредственному наблюдению. Он может оцениваться путем использования метода фазово-контрастной микроскопии. Цитопатогенный эффект (СРЕ) характеризует морфологические признаки цитотоксичности аденовируса, которая начинается со сморщивания инфицированной клетки, за счет лизирующего влияния, и завершается образованием литической бляшки. Отличительной особенностью данного метода является то, что воспроизведение вируса обязательно дает о себе знать после 10-14 дней инкубационного периода. Это является значительным преимуществом по сравнению с трансфекцией, использующей в качестве промежуточного звена фосфат кальция и последующую реакцию розеткообразования, при которой требуется, по крайней мере, 14, а обычно минимум до 21 дня, хотя зачастую этот срок вырастает до нескольких недель, прежде чем могут быть оценены результаты.

В некоторых примерах осуществления способ по изобретению может быть использован в связи с аденовирусными плазмидами, которые являются репликационно-дефектными вместе с клеткой-хозяином, которая дополняет дефект, как показано на примере плазмид с недостающим Е1 и клеток 293. Аденовирусные плазмиды с недостающими функциональными Е1А и Е1В, которые инкорпорируют зону экспрессии р53, используются для описания примера осуществления способа по данному изобретению. Однако любые зоны экспрессии могут быть инкорпорированы в аденовирусе-рекомбинанте подобным образом. Отдельные методологические аспекты могут при желании меняться. Однако предполагается, что в определенных случаях должна быть предпочтительной среда MEM.

Данные новые методы могут быть скомбинированы с цепными реакциями полимеризации (PCR) для подтверждения наличия правильно рекомбинированного вируса.

Цепная реакция полимеризации (PCR) хорошо известна из уровня техники, см. патент США N 4683195, приведенный в качестве аналога. Чтобы получить возможность использования PCR в соответствии с настоящим изобретением, следует получить DNA из надосадочной жидкости клеток, проявляющих цитопатогенный эффект, и подвергнуть анализу DNA с использованием цепной реакции полимеризации (PCR), в которой участвуют две пары первичных элементов, один - специфический вектор экспрессии, другой - аденовирусный геном-специфическая DNA.

Вектор или вводимая специфическая DNA - (по определению) генный сегмент, который является частью DNA, кодирующей полипептид или генный сегмент RNA, который стремится к выражению своей экспрессии, как это проиллюстрировано DNA-экспрессией р53, mRNA и получением ротеина. Специфическая DNA генома аденовируса может являться любой частью генома, проявляющей свою экспрессию при управлении процессом воспроизведения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ Частью настоящего описания являются чертежи, которые включены для дополнительного раскрытия определенных аспектов изобретения. Изобретение может быть лучше понято при обращении к одному или целому ряду приведенных чертежей в сочетании с подробным описанием отдельных вариантов осуществления изобретения.

На фиг. 1 дана схема образования аденовируса-рекомбинанта р53. Кассета экспрессии р53 была введена между Хbа I и Сlа I участками pXCJL. 1. Вектор экспрессии р53 (рЕС53) и рекомбинантный плазмид (pJM17) были подвергнуты котрансфекции в клетках 293. Зараженные клетки выдерживались в среде до тех пор, пока не проявлялся цитопатогенный эффект. Идентификация вновь образованных аденовирусов-рекомбинантов р53 (Ad5CMV - р53) производилась на пробах цепной реакции полимеризации (PCR) DNA с использованием матриц DNA, приготовленных из надосадочной жидкости, обработанной протеиназой К и экстрактом фенола.

На фиг. 2А показана карта, применяемая для структурных исследований DNA Ad5CMV-p53. Карта DNA генома AdCMV-p53 с местами расположения кассет экспрессии р53, первичных материалов цепной реакции полимеризации (PCR) и ограничивающих участков. Размер генома около 35,4 kb, разделенные на 100 ячеек карты (1 M.U. (ячейка карты) = 0,35 kb). Кассета экспрессии заняла место зоны Е1 (1,3 -9,2 M.U.) генома Ad5. Первичный элемент 1 сосредоточен в первом интроне, расположенном вниз по траектории движения промотора главного гена 1Е цитомегаловируса (CMV) человека. Первичный элемент 2 сосредоточен в зоне раннего сигнала полиаденилации SV40. Оба эти элемента, расположенные в 15-20 bp от ввода cDNA p53 на двух концах, определяют продукт 1,40 kb цепной реакции полимеризации (РСК). Первичные элементы 3 и 4 сосредоточены в 11 ячейке карты (M.U.) и 13,4 ячейке карты (M.U.) генома Ad5 соответственно и определяют специфический продукт 0,86 kb цепной реакции полимеризации (РСК) генома вируса.

На фиг. 2В показаны пробы геля агарозы продукта цепной реакции полимеризации (PCR). Две пары первичных элементов (параметров), которые определяют фрагменты DNA 1,4 kb (р53) и 0,86 kb (Ad5), были использованы в каждой реакции. В каждой реакции были использованы матрицы DNA: плазмид рЕС53 (1-я полоса), DNA Ad5/RCV/GL2 (2-я полоса), никаких DNA (3-я полоса) и DNA Ad5CMV-р53 (4-я полоса). Полоса с обозначением (M) соответствует генам-маркерам молекулярного веса.

На фиг.2С показано картирование ограничения DNA Ad5CMV-p53. Образцы DNA, очищенной от CsCl - градиента Ad5CMV - р53, были классифицированы по признаку отсутствия энзима (U), Hind III (Н) (задний, задняя нога туши). Ваm HI (В), Eco RI (Е) и Сlа I (С) соответственно и проанализированы на 1% геле агарозы. Дорожка с обозначением (M) соответствует генам-маркерам молекулярного веса.

На фиг.3А, 3В, 3С и 3D показаны результаты наблюдения цитопатогенных эффектов на клетках 293, полученных с помощью аденовируса-рекомбинанта. На фиг.3А, 3В, 3С и 3D даны серии фазовых контрастных изображений (х 400) клеток 293. На фиг.3А, 3В, 3С и 3D даны четыре фотографии одной фигуры, показанной на странице. Фигура 2А - перед трансфекцией, фигура 3В - отрицательный контрольный результат на 12-й день после трансфекции, фигура 3С - появление цитопатогенного эффекта (СРЕ) на 12-й день после трансфекции, фигура 3D - полное проявление цитопатогенного эффекта (СРЕ) на 14-й день после трансфекции.

На фиг. 4А, 4В, 4С и 4D дана иммунология клеток, инфицированных аденовирусами-рекомбинантами. На фиг.4А, 4В, 4С и 4D показаны серии иммунологических изображений клеток Н358. На фиг.4А, 4В, 4С и 4D даны 4 фотографии фигуры, представленной на одной странице. Проявление способности к инфицированию в клетках Н358. Клетки Н358 были инфицированы Ad5CMV-p53 или Ad5/RCV/GL2 в 50 PFU/клетка в течение 24 часов. Питательная среда была использована единственно в качестве смоделированной инфекции. Инфицированные клетки были проанализированы с помощью иммуноокрашивания. На фиг.4А представлены результаты испытаний смоделированной инфекции с помощью антитела anti-p53. На фиг. 4В показаны клетки, инфицированные контрольным Ad5/RSV/GL2 и испытанные с помощью антитела anti-p53. На фиг.4С даны инфицированные клетки Ad5CMV-p53, испытанные с помощью несвязанного антитела (МОРС - 21). На фиг.4D показана клеточная инфекция Ad5CMV, испытанная антителом anti-p53. В качестве антитела anti-p53 был использован Pab 1801, а для окрашивания применяли авидино-биотиновый метод.

На фиг.5А показано сравнение относительного уровня экспрессии экзогенного р53 в клетках Н358 с помощью геля SDS - PAGE, окрашенного в голубой цвет (Coomassie - blue). Образцы клеток Н358, которые были инфицированы Ad5CMV-p53 или Ad5/RSV/GL2 в 30 PFU/клетка, препарировались в течение 24 и 72 часов после инфицирования. Испытывались образцы пробы SDS -PAGE, окрашенной в голубой цвет (Coomassie - blue), с целью определения относительного содержания протеина. Полосы 1 и 4 содержат образцы клеток, инфицированных Ad5/RSV/GL2. Полосы 2 и 3 содержат образцы клеток, инфицированных двумя индивидуальными группами Ad5CMV-р53 через 24 часа после инфицирования. Полосы 5 и 6 - это образцы Ad5CMV-p53 - инфицированной клетки, собранные через 72 часа после инфицирования. Полоса 7 - это образец Н358 с моделированным инфицированием через 72 часа после инфицирования. Полоса М - это предварительно окрашенные гены-маркеры молекулярного веса в kDa (GIBCO - BRL).

На фиг.5В дан блотированный Western анализ геля, размещенного на полосе, идентичной той, которая принадлежит SDS-PAGE на фиг.5А. Относительные уровни экспрессии р53 были исследованы Western блотированием с использованием anti-р53. Первичные антитела были моноклональными антителами против протеина р53 (Pab 1801, Оncogene Science Inc.) и (-актина (Amersham Inc.). HRP-конъюгированное вторичное антитело и ECL-проявитель были получены из вирусинфицированных клеток Н358, прошедших Western блотирование (Amersham Inc.). Отпечаток, полученный Western блотированием, на фиг.5В, имеет эквивалентную методику восстановления и лечения, что и у тех, которые представлены на фиг. 5А.

На фиг.6А и В показано время протекания экспрессии р53, определенное Western блотированием. Множественные чашки клеток Н358 были инфицированы Ad5CMV при 10 PFU/клетка. Клеточные лизаты были приготовлены в установленные моменты времени после инфицирования. Western блотирование было испытано с помощью антител анти-р53 и анти-актина одновременно. Полосы с отметкой С представляют отрицательные результаты. Гистограмма показывает относительные количества р53, определенные с помощью денситометра.

На фиг.7А показана кривая роста вирусинфицированных клеток рака легких у человека в клеточных линиях Н358. Клетки были засеяны в количестве 10 клеток на чашку (60 мм), при этом в процессе участвовали 6 чашек на одну клеточную линию. Через 24 часа клетки были инфицированы Ad5CMV-p53 или Ad5/RSV/GL2 при 10 m.о.i. (множественность инфицирования, т.е. PFU/клетка). После инфицирования клетки подсчитывались ежедневно в течение 6 дней. Кривые роста представляют данные, полученные при наблюдении четырех отдельных исследований.

На фиг.7В показана кривая роста вирусинфицированных клеток рака легких у человека в клеточных линиях Н322. Клетки были засеяны в количестве 10⁵ клеток на чашку (60 мм), при этом в процессе участвовали 6 чашек на одну клеточную линию. Через 24 часа клетки были инфицированы Ad5CMV-p53 или Ad5/RSV/GL2 при 10 m.о.i. (множественность инфицирования, т.е. PFU/клетка). После инфицирования клетки подсчитывались ежедневно в течение 6 дней. Кривые роста представляют данные, полученные при наблюдении четырех отдельных исследований.

На фиг.7С показана кривая роста вирусинфицированных клеток рака легких у человека в клеточных линиях Н460. Клетки были засеяны в количестве 10⁵ клеток на чашку (60 мм), при этом в процессе участвовали 6 чашек на одну клеточную линию. Через 24 часа клетки были инфицированы Ad5CMV-p53 или Ad5/RSV/GL2 при 10 m. о. i. (множественность инфицирования, т.е. PFU/клетка). После инфицирования клетки подсчитывались ежедневно в течение 6 дней. Кривые роста представляют данные, полученные при наблюдении четырех отдельных исследований.

На фиг. 8 показана схема последовательности операций при исследовании Ad5CMV - р53 в ортотопической модели рака легких. Дозировка и методика лечения безволосых мышей, зараженных клетками Н226Вr и вирусами, представлены в указанной схеме.

На фиг. 9А, 9В, 9С и 9D показаны образцы средостений, легких мышей, прошедших лечение, и контрольных мышей. Фиг.9А, 9В, 9С и 9D - это фотографии одной фигуры. Особь была принесена в жертву в конце 6-недельного периода, наступившего после прекращения лечения. Ткани легкого и средостения были иссечены для изучения опухолевого формообразования. На фиг.9А показан образец медиастинального блока от нормальной безволосой мыши. На фиг.9В дан образец медиастинального блока из мыши, которая была подвергнута лечению с помощью переносчика фосфатно-солевого буферного раствора (PBS). На фиг.9С показан образец медиастинального блока от мыши, прошедшей курс лечения Ad5CMV-р53. На фиг.9D представлен образец медиастинального блока, взятого от мыши, прошедшей курс лечения Ad5/RSV/GL2. Стрелки указывают на опухолевые массы.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ А. ЯВЛЕНИЯ, ПРОИСХОДЯЩИЕ НА МОЛЕКУЛЯРНОМ УРОВНЕ, ПРИ РАЗВИТИИ РАКА ЛЕГКИХ.

Исследования, проведенные авторами настоящего изобретения, идентифицировали принципиально важные явления на молекулярном уровне, ведущие к появлению и прогрессированию рака. Это дало возможность изобретателям разработать новые методы восстановления известных нормальных функций протеина до такой степени, когда фенотип, вызывающий раковые новообразования, может быть подавлен in vivo.

Наиболее распространенные гистологии рака легких (80%) объединены под названием "рак легких с вовлечением значительного количества клеток (NSCLC)" и включают сквамозный рак, аденокарциному и неидентифицированную форму рака