Cd19xcd3-специфические полипептиды и их применение

Cd19xcd3-специфические полипептиды и их применение

Реферат

 

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается полипептидов, специфичных в отношении CD19 и CD3, и их применения. Изобретение включает одноцепочечный многофункциональный полипептид, специфичный в отношении С19 и CD3 антигенов формулы: V_LCD19 - V_HCD19 - V_HCD3 - V_LCDS, полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, экспрессирующий вектор, штамм культуры клеток, способ получения полипептида, фармацевтическую композицию для лечения злокачественных заболеваний В-клеток, диагностическую композицию, способ выявления активаторов или ингибиторов Т-клеточной активации или стимуляции, способ приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для лечения злокачественных заболеваний В-клеток, способ лечения злокачественных заболеваний В-клеток или истощения В-клеток и способ замедления развития патологического состояния. Преимущество изобретения заключается в разработке методов, пригодных для лечения опосредованных В-клетками болезней. 11 с. и 17 з.п. ф-лы, 22 ил., 2 табл.

Настоящее изобретение относится к новым одноцепочечным многофункциональным полипептидам, включающим по меньшей мере два антигенсвязывающих участка, специфических для антигенов CD19 и CD3 соответственно. Кроме того, настоящее изобретение относится к полипептиду, где указанный выше полипептид включает по меньшей мере один дополнительный домен, предпочтительно с заранее определенной функцией. Кроме того, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим эти полипептиды, а также к векторам, включающим эти полинуклеотиды, и к трансформированным ими клеткам-хозяевам, и к их применению для получения указанных полипептидов. Изобретение также относится к композициям, предпочтительно фармацевтическим и диагностическим композициям, включающим любые из вышеуказанных полипептидов, полинуклеотидов или векторов. Еще одним объектом настоящего изобретения является применение указанных выше полипептидов, полинуклеотидов и векторов для приготовления фармацевтических композиций для иммунотерапии, предпочтительно для лечения злокачественных заболеваний В-клеток, таких как не-ходжкинская лимфома.

В настоящем описании процитировано несколько документов. Каждый из процитированных документов (включая любые спецификации производителей, инструкции и т.д.) включен в настоящее описание в виде ссылки; однако не подразумевается, что все процитированные документы действительно являются прототипами настоящего изобретения.

Несмотря на важное медицинское значение, при исследовании опосредованных В-клетками болезней, таких как не-ходжкинская лимфома, получено лишь небольшое количество приемлемых для клинического применения данных, и обычные подходы к лечению таких болезней остаются тривиальными и болезненными и/или имеют высокий риск рецидива. Например, хотя химиотерапия высокими дозами в качестве первичного лечения высокозлокачественной не-ходжкинской лимфомы может повысить общий уровень выживаемости, примерно 50% пациентов до сих пор умирают от этой болезни (2-4). Кроме того, низкозлокачественный напоминающий не-ходжкинскую лимфому хронический лимфатический лейкоз и лимфома клеток покрывающего слоя все еще являются неизлечимыми болезнями. Эти причины стимулировали разработку альтернативных стратегий типа иммунотерапии. Антитела, которые вырабатываются к молекулам клеточной поверхности, для которых характерны антигены CD, дают уникальную ценную возможность разработки терапевтических реагентов.

Экспрессия определенных антигенов CD в значительно степени ограничена специфическими линиями дифференцировки лимфогематопоэтических клеток и в последние несколько лет антитела, полученные к специфическим для лимфоидной ткани антигенам, применялись для разработки методов лечения, которые проявили эффективность либо in virto, либо на животных-моделях (5-13). В этой связи CD19 представляет собой очень ценную мишень. CD19 экспрессируется во всей В-клеточной линии дифференцировки от про-В-клетки до зрелой В-клетки, он не исчезает, единообразно экспрессируется на поверхности всех лимфатических клеток и отсутствует в стволовых клетках (8, 14). Представляет интерес применение биспецифического антитела специфического как по отношению к антигену CD19, так и к антигену CD3 на Т-клетках. Однако недостатком доступных в настоящее время биспецифических антител является их низкая Т-клеточная цитотоксичность, и для проявления достаточно высокой биологической активности необходимы дополнительные стимулирующие агенты.

Таким образом, техническая проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, - это разработка способов и методик, пригодных для лечения опосредованных В-клетками болезней, таких как различные формы не-ходжкинской лимфомы. Решение этой технической проблемы достигается с помощью вариантов осуществления, которые представлены в формуле изобретения.

Таким образом, настоящее изобретение относится к одноцепочечному многофункциональному полипептиду, включающему

(а) первый домен, содержащий антигенсвязывающий участок цепи иммуноглобулина или антитела, который специфически распознает антиген CD19, и

(б) второй домен, содержащий антигенсвязывающий участок цепи иммуноглобулина или антитела, который специфически распознает антиген CD3.

Понятие "первый домен" и "второй домен" согласно настоящему изобретению обозначает, что один из антигенсвязывающих участков распознает pan-В-клеточный маркер CD19, который единообразно экспрессируется на поверхности практически всех злокачественных В-клеток, а другой антигенсвязывающий участок распознает антиген CD3 человеческих Т-клеток.

Понятие "антигенсвязывающий участок" в контексте настоящего изобретения обозначает домен, включающий трехмерную структуру, обладающую способностью специфически связываться с эпитопом, аналогичную таковой нативных антител, свободных scFv-фрагментов, или одной из их соответствующих цепей иммуноглобулина, предпочтительно V_H-цепи. Таким образом, этот домен может включать V_H- и/или V_L-область антитела или цепи иммуноглобулина, предпочтительно по меньшей мере V_H-область. С другой стороны, эти антигенсвязывающие участки, входящие в полипептид по изобретению, могут включать по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) антитела или цепи иммуноглобулина, распознающий антигены CD19 и CD3 соответственно. В этой связи следует отметить, что домены антигенсвязывающих участков, которые присутствуют в полипептиде по изобретению, могут не только происходить из антител, но также из других CD19- или CD3-связывающих протеинов, таких как встречающиеся в естественных условиях поверхностные рецепторы или лиганды. Согласно изобретению, этот антигенсвязывающий участок включен в домен.

Понятие "многофункциональный пептид" в контексте настоящего описания обозначает полипетид, включающий по меньшей мере две аминокислотные последовательности, происходящие из разных источников, т.е. из двух различных молекул, необязательно происходящие из различных видов, причем по меньшей мере два из этих источников определяют специфичность антигенсвязывающих участков. Таким образом, эти антигенсвязывающие участки определяют специфичность функций или по меньшей мере некоторых функций этого многофункционального пептида. Такие полипептиды включают, например, биспецифические одноцепочечные (bsc) антитела.

Понятие "одноцепочечный" в контексте настоящего описания обозначает, что указанные первый и второй домен полипептида ковалентно связаны, предпочтительно в форме колинейной аминокислотной последовательности, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты. CD19 обозначает антиген, который экспрессируется В-клеточной линией дифференцировки, такой как про-В-клетка и зрелая В-клетка, он не исчезает, единообразно экспрессируется на поверхности всех лимфатических клеток и отсутствует в стволовых клетках (8, 14).

CD3 обозначает антиген, который экспрессируется на поверхности Т-клеток как часть многомолекулярного комплекса Т-клеточного рецептора, и он состоит из трех различных цепей CD3, CD3 и CD3. Образование кластеров CD3 на Т-клетках, например, путем иммобилизации антител к CD3 приводит к Т-клеточной активации, аналогичной для активации Т-клеточного рецептора, но которая не зависит от типичной для этого клона специфичности. Характерно, что основная часть антител к CD3 распознает CD3-цепь.

Антитела, которые специфично распознают антиген CD19 или CD3, известны из существующего уровня техники, например описаны в (24), (25) и (43) соответственно, и могут быть получены с помощью известных в данной области методов.

Ранее было установлено, что биспецифические антитела CD19CD3, которые не имеют одноцепочечный формат, повторно направляют Т-клеточную цитотоксичность на клетки лимфомы независимым от МНС образом, обладают эффективностью in vitro (5, 6, 9-11, 13, 43), на животных-моделях (7, 28), а также в некоторых пилотных клинических испытаниях (12, 29, 30). Для этой цели антитела конструировали с помощью методов на основе межвидовых гибридом путем ковалентного связывания моноклональных антител (31) или использования биспецифических антител (43). Проведение более обширных клинических исследований затруднено тем фактом, что эти антитела обладают низкой биологической активностью, что приводит к необходимости использовать высокие дозы, кроме того, применение одних антител не оказывало требуемого терапевтического действия. Кроме того, доступность клинически чистого материала была ограниченной.

Не вдаваясь в теорию, можно предположить, что полученные с помощью описанного выше биспецифического напоминающего антитела формата полипептиды, такие как биспецифические антитела CD19CD3, как правило, могут разрушить CD19-позитивные клетки-мишени путем рекрутмента цитотоксичных Т-лимфоцитов, не нуждаясь при этом в пре- и/или костимуляции Т-клеток. Это находится в прямой противоположности со всеми известными биспецифическими антителами CD19CD3, которые продуцируются согласно другим молекулярным форматам и, как правило, не зависят от конкретной CD19- или CD3-специфичности антитела, примененного в конструкции, например, биспецифического одноцепочечного антитела. Независимость от пре- и/или костимуляции Т-клеток может в значительной степени определять чрезвычайно высокую цитотоксичность, опосредуемую полипептидом по изобретению, что видно на примере использования конкретных биспецифических антител CD19CD3, описанных в примерах.

Еще одним ценным качеством полипептида по изобретению является то, что в из-за своей небольшой, относительно компактной структуры он может быть легко получен и очищен, что решает проблемы, связанные с низким уровнем выхода, получением вредных побочных продуктов, или с процедурами лабораторной очистки (15-19), которые известны для CD19CD3-специфических антител, получаемые с помощью межвидовых гибридом, путем химического связывания или путем ренатурации из бактериальных внутриклеточных телец. Далее преимущества и неожиданные свойства полипептида по изобретению будут обсуждены в приведенных примерах, которые не направлены на ограничение объема изобретения, включая некоторые приведенные ниже предпочтительные варианты осуществления, которые иллюстрируют широкую концепцию настоящего изобретения.

Согласно настоящему изобретению, применяли эукариотическую систему экспрессии, которая была разработана для получения рекомбинанатных биспецифических одноцепочечных антител (1) с целью производства рекомбинанатного биспецифического одноцепочечного антитела CD19CD3 путем экспрессии в СНО-клетках. Полностью функционально активное антитело легко может быть очищено из супернатанта культуры с помощью его С-концевой гистидиновой метки хроматографией на Ni-NTA-колонке. Специфическое связывание с CD19 и CD3 было продемонстрировано анализом с использованием FASC (клеточный сортер с возбуждением флуоресценции). У полученной в результате молекулы bscCD19CD3 (биспецифическое одноцепочечное антитело CD19CD3) обнаружены некоторые неожиданные свойства:

- она индуцирует высокую, направленную к лимфоме, Т-клеточную цитотоксичность in vitro и in vivo. Даже в очень низких концентрациях на уровне 10-100 пг/мл и низких соотношения Е (эффектор): Т (мишень), таких как 5:1 и 2,5:1, наблюдали значительный специфичный лизис линий клеток лимфомы. Кроме того, при щадящем применении 3-10 мкг молекулы bscCD19CD3 по изобретению обнаружено четкое и существенное улучшение медицинского состояния. По сравнению с известными к настоящему времени антителами CD19CD3, полученными с помощью межвидовых гибридом и методов с использованием двойных антител (которые также представляют собой различные форматы), которые проявляют цитотоксическую активность в диапазоне от нескольких нанограмм/мл или даже мкг/мл, антитело bscCD19CD3 по изобретению, вероятно, является намного более эффективным (5-7, 27, 43), например, как показано в приведенных далее примерах 4, 5 и 7.

Даже низкие концентрации bscCD19CD3 по изобретению обладали способностью индуцировать быструю направленную к лимфоме цитотоксичность (через 4 ч) при низких соотношениях Е:Т и без необходимости в какой-либо предварительной стимуляции Т-клеток. В противоположность этому обычное биспецифическое антитело CD19CD3 (5-7, 27) в этих условиях (а именно без предварительной стимуляции Т-клеток и при низком соотношении Е:Т) не проявило никакой заметной цитотоксической активности даже при высоких концентрациях, достигающих 3000 нг/мл. Хотя индукция цитотоксической активности без предварительной стимуляции ранее была установлена для другого обычного антитела CD19CD3, этот эффект достигался только при более высоких концентрациях и высоких соотношениях Е:Т (100 нг/мл, 27:1) (9) по сравнению с bscCD19CD3 по изобретению (100 пг/мл; 2,5:1). Кроме того, цитотоксическое действие этого обычно антитела наблюдали только через 1 день после предварительной стимуляции самим биспецифическим антителом, в то время как bscCD19CD3 по изобретению индуцирует направленную к лимфоме цитотоксичность уже через 4 ч. По данным заявителей, такая быстрая и специфическая цитотоксическая активность нестимулированных Т-клеток при таких низких концентрациях и соотношениях Е:Т не описана для других применяемых ранее биспецифических антител. Хотя недавно было установлено, что F(ab)₂-фрагмент биспецифического антитела к p185HER2/CD3 индуцирует цитотоксическую активность в таких же концентрациях, что и bscCD19CD3 по изобретению, для этого антитела требуется предварительная стимуляция в течение 24 ч IL-2 (32). Таким образом, bscCD19CD3-антитело по изобретению обладает уникальными свойствами цитотоксичности, что отличает эту молекулу от других известных биспецифических антител.

BscCD19CD3 по изобретению опосредует цитотоксические действия, которые являются антигенспецифическими, о чем свидетельствуют такие факты:

- это антитело не обладает способностью осуществлять лизис линий клеток плазмацитомы NCI и L363, которые относятся к линиях клеток В-клеточной дифференцировки, не экспрессирующим антиген CD19; и

- цитотоксичность в отношении клеток лимфомы может блокироваться родительским антителом к CD19 HD37 (антитело HD37 происходит из гибридомы HD37 (22)).

Блокада пути биосинтеза перфорина путем истощения кальция с помощью ЭГТК (этиленгликольтетрауксусная кислота) полностью подавляла опосредуемую bscCD19CD3 цитотоксичность, что позволяет предположить, что специфический лизис скорее опосредован Т-клетками, а не связан с непосредственным воздействием самого антитела.

Обобщая вышесказанное, можно заключить, что сконструированное согласно общим концепциям изобретения антитело bscCD19CD3 превосходит ранее описанные биспецифические антитела CD19CD3 как с точки зрения его значительно более высокой биологической активности, так и с точки зрения возможности его быстрого и простого способа получения, дающего большие количества высококачественного клинически чистого материала.

Таким образом, молекулы bscCD19CD3 по изобретению могут рассматриваться в качестве приемлемых кандидатов для доказательства того, что терапевтически ценные биспецифические антитела могут использоваться для лечения опосредуемых В-клетками болезней, таких как не-ходжкинская лимфома, в клинических условиях.

В предпочтительном полипептиде по изобретению указанные домены соединены полипептидным линкером. Этот линкер расположен между первым и вторым доменом, причем этот полипептидный линкер предпочтительно включает многочисленные, гидрофильные, связанные пептидом аминокислоты, и он соединяет N-конец первого домена и С-конец второго домена.

Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления первый и/или второй домен описанного выше полипептида имитирует или соответствует V_H- и V_L-области природного антитела. Антитело, несущее антигенсвязывающий участок полипептида по изобретению, может представлять собой, например, моноклональное антитело, поликлональное антитело, химерное антитело, "гуманизированное" антитело, биспецифическое антитело, синтетическое антитело, фрагмент антитела, такой как Fab-, Fv- или scFv-фрагмент и т.д., или химические модифицированное производное любого из них. Моноклональные антитела могут быть получены, например, методами, первоначально описанными Кohler и Milstein, Nature 256 (1975), 495 и Galfre, Meth. Enzymol. 73, 3 (1981), которые включают слияние клеток мышиной миеломы с клетками селезенки, полученными из иммунизированных млекопитающих, и с помощью модификаций, принятых в данной области.

Кроме того, антитела к вышеуказанным антигенам или их фрагменты могут быть получены с использованием методов, описанных, например, у Harlow и Lane в "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Антитела могут быть получены из нескольких видов, включая человека. Когда производные указанных антител получают с помощью доступной методики с использованием фагов, то для повышения эффективности антител фагов, которые связываются с эпитопом антигена CD19 или CD3, может применяться поверхностный плазменный резонанс (Schier, Human Antibidies Hybridomas 7, 97-105 (1996); Malmbord, J. Immunol. Methods 183, 7-13 (1995)). Получение химерных антител описано, например, в WO 89/09622. Методы получения гуманизированных антител описаны, например, в ЕР-А 10239400 и WO 90/07861. Дополнительным источником антител, которые могут применяться согласно настоящему изобретению, являются так называемые ксеногенные антитела. Общие принципы получения ксеногенных антител, таких как человеческие антитела в мышах, описаны, например, в WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 и WO 96/33735.

Антитела, которые применяются согласно изобретению, и их соответствующая(ие) иммуноглобулиновая(ые) цепь(и), могут быть дополнительно модифицированы с помощью обычных методов, известных в данной области, например, с использованием аминокислотной(ых) делеции(ий), инсерции(ий), замены(н), добавки(ок) и/или рекомбинации(ий) и/или другой (их) модификации(ий), известных в данной области, отдельно или в сочетании. Методы введения таких модификаций в последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность цепи иммуноглобулина, хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, у Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), N.Y. Описанные в этом руководстве модификации предпочтительно осуществляют на нуклеотидном уровне.

Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения, по меньшей мере один из указанных доменов в описанном выше полипептиде представляет собой одноцепочечный фрагмент вариабельной области антитела.

Как хорошо известно, Fv₁, т.е. минимальный фрагмент антитела, который содержит полный сайт узнавания антигена и антигенсвязывающий участок, состоит из димера, включающего одну вариабельную область тяжелой цепи и одну вариабельную область легкой цепи (V_H- и V_L-области), которые не являются ковалентно связанными. В этой конфигурации, которая обнаружена в природных антителах, три гипервариабельных участка (CDR) каждой вариабельной области взаимодействуют для того, чтобы определить антигенсвязывающий участок на поверхности V_H-V_L-димера. В целом шесть CDR обусловливают специфичность связывания антигена антителом. Каркасные участки (FR), фланкирующие CDR, имеют третичную структуру, которая в основном является консервативной в природных иммуноглобулинах столь различных видов, как человек и мышь. Эти FR служат для поддержания CRD в соответствующей ориентации. Постоянные области не требуются для функции связывания, но они могут принимать участие в стабилизации V_H-V_L-взаимодействия. Даже отдельная вариабельная область (или половина Fv-фрагмента, включающего только три специфичных для антигена CDR) обладает способностью узнавать и связывать антиген, хотя, как правило, с более низкой аффинностью, чем полный антигенсвязывающий участок (Painter, Biochem., 11, 1327-1337 (1972)). Следовательно, этот домен антигенсвязывающего участка полипептида по изобретению может представлять собой пару V_H-V_L-, V_H-V_H- или V_L-V_L-областей либо одного и того же, либо различных иммуноглобулинов. Порядок расположения V_H- и V_L-областей в полипептидной цепи не имеет решающего значения для настоящего изобретения, приведенный выше порядок доменов может быть изменен, как правило, без какой-либо потери функции.

Однако важно, чтобы V_H- и V_L-области были расположены так, чтобы антигенсвязывающий участок мог быть соответствующим образом уложен (изогнут).

В предпочтительных полипептидах по изобретению эти домены расположены в следующем порядке: V_LCD19-V_HCD19-V_HCD3-V_LCD3, где V_L и V_H обозначают вариабельную область легкой и тяжелой цепи специфических антител к CD19 и CD3.

Как обсуждалось ранее, указанные антигенсвязывающие участки предпочтительно соединены гибким линкером, предпочтительно полипептидным линкером, который расположен между указанными доменами, причем этот полипептидный линкер предпочтительно включает многочисленные, гидрофильные, связанные пептидом аминокислотные последовательности, которые имеют длину, достаточную для того, перекрывать расстояние между С-концом одного из указанных доменов, включающего указанные антигенсвязывающие участки, и N-концом второго домена, включающего указанные антигенсвязывающие участки, когда полипептид по изобретению принимает пригодную для связывания конформацию при помещении его в водный раствор. Предпочтительно полипептидный линкер включает многочисленные остатки глицина, аланина и/или серина. Также предпочтительно, чтобы этот полипептидный линкер включал множество последовательных копий аминокислотных последовательностей. Как правило, полипептидный линкер включает 1-15 аминокислот, хотя полипептидные линкеры, состоящие более чем из 15 аминокислот, могут также хорошо выполнять свою функцию. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения, полипептидный линкер включает 1-5 аминокислотных остатков.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения, полипептидный линкер в полипептиде по изобретению состоит из 5 аминокислот. Как продемонстрировано в приведенных далее примерах, предпочтительно, чтобы полипептидный линкер включал аминокислотную последовательность Gly Gly Gly Gly Ser.

Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения, первый домен полипептида по изобретению включает по меньшей мере один CDR V_H- и V_L-области, который имеет аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью ДНК, представленной на фиг.8 от нуклеотида 82 до 414 (V_L) и от нуклеотида 460 до 831 (V_H), и/или второй домен включает по меньшей мере один CDR, более предпочтительно два, еще более три CDR V_H- и V_L-области, который(е) имеет(ют) аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью ДНК, представленной на фиг.8 от нуклеотида 847 до 1203 (V_H) и от нуклеотида 1258 до 1575 (V_L), необязательно в комбинации с каркасными участками, которые встречаются вместе в этих CDR в родительских антителах. CDR, содержащие указанные на фиг.8 вариабельные области, могут быть выявлены, например, согласно Кэбату, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (U.S. Department of Health and Human Services, 3-е изд. 1983 г; 4-е изд. 1987 г.; 5-е изд. 1990 г.). Специалисту в данной области должно быть очевидно, что антигенсвязывающий участок или по меньший мере один полученный из него CDR может применяться для конструирования полипептида по изобретению. Предпочтительно этот полипептид включает аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью ДНК, представленной на фиг.8 от нуклеотида 82 по 1575. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что антигенсвязывающие участки полипептида по изобретению могут быть сконструированы с помощью методов, известных в данной области, например описанных в ЕР-А10451261 и ЕР-А10549581.

Домены антигенсвязывающих участков полипептида по изобретению предпочтительно обладают специфичностью, по меньшей мере практически идентичны по специфичности связывания, например, антителу или цепи иммуноглобулина, из которых они получены. Такие домены антигенсвязывающих участков могут обладать аффинностью к связыванию по меньшей мере 10⁵M^-1, предпочтительно не выше чем 10⁷M^-1 в отношении антигена CD3 и предпочтительно до 10¹⁰М^-1 или выше в отношении антигена CD19.

В предпочтительном полипептиде по изобретению

(а) антигенсвязывающий участок первого домена обладает аффинностью по меньшей мере примерно 10^-7М, предпочтительно по меньшей мере примерно 10^-9М и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 10^-11М и/или

(б) антигенсвязывающий участок второго домена обладает аффинностью ниже, чем примерно 10^-7М, предпочтительно ниже, чем примерно 10^-6 и наиболее предпочтительно порядка 10^-5М.

Согласно указанным выше предпочтительным вариантам осуществления, целесообразно, чтобы антигенсвязывающий участок, который узнает антиген CD19, имел высокую аффинность для того, чтобы осуществлять захват клеток-мишеней, которые должны быть разрушены с высокой эффективностью. С другой стороны, аффинность связывания антигенсвязывающего участка, узнающего антиген CD3, должна иметь такой же порядок, что и природный CD3-рецептор, или соответствовать аффинности, которая наблюдается при взаимодействии Т-клеточного рецептора с лигандом, представляющим собой МНС-пептидный комплекс на поверхности клетки-мишени.

Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения, описанный выше полипептид представляет собой биспецифическое одноцепочечное антитело.

Настоящее изобретение также относится к полипептиду, включающему по меньшей мере один дополнительный домен, эти домены связаны ковалентными или нековалентными связями.

Связь может быть основана на генетическом слиянии, которое осуществляют согласно описанным выше известным в данной области методам, или может быть получена, например, путем химического перекрестного сшивания, как описано, например, в WO 94/04686. Дополнительный домен, присутствующий в полипептиде по изобретению, может предпочтительно быть связан гибким линкером, предпочтительно полипептидным линкером, с одним из доменов антигенсвязывающего участка, причем этот полипептидный линкер предпочтительно включает многочисленные, гидрофильные, связанные пептидом аминокислотные последовательности, которые имеют длину, достаточную для того, перекрывать расстояние между С-концом одного из указанных доменов и N-концом второго домена, когда полипептид по изобретению принимает пригодную для связывания конформацию при помещении его в водный раствор. Предпочтительно этот полипептидный линкер представляет собой полипептидный линкер, описанный ранее в предпочтительных вариантах осуществления. Полипептид по изобретению может также включать расщепляемый линкер или сайт расщепления протеиназами, такими как энтерокиназа (см. приведенные далее примеры).

Кроме того, этот дополнительный домен может иметь предварительно определенную специфичность или функцию. Например, в научной литературе имеется большое количество сведений о направленном переносе биологически активных веществ, таких как лекарства, токсины и ферменты, к определенным точкам в организме с целью разрушения или локализации злокачественных клеток или с целью индукции локализованного действия лекарства или фермента. Было предложено достигать этого действия путем конъюгации биологически активного вещества с моноклональными антителами (см., например, N.Y. Oxford University Press, и Ghose, J. Natl. Cancer Inst. 61, 657-676 (1978)).

В этом контексте также понятно, что полипептиды по изобретению могут быть дополнительно модифицированы обычными известными в данной области методами. Это позволяет конструировать химерные протеины, включающие полипептид по изобретению, и другие функционально активные аминокислотные последовательности, например сигналы ядерной локализации, трансактивирующие домены, ДНК-связывающие домены, гормонсвязывающие домены, протеины-метки (GST, GFP, пептид h-myc, FLAG, НА-пептид), которые могут быть получены из гетерологичных протеинов. Как описано ниже в примерах, полипептид по изобретению предпочтительно содержит метку FLAG, имеющую в длину 8 аминокислот (см. фиг.8).

Полипептиды по изобретению могут применяться для лечения пациентов, страдающих опосредованными В-клетками нарушениями, такими как В-клеточная лимфома, обусловленный В-клетками хронический лимфатический лейкоз (B-CLL), и/или имеющих связанное с В-клетками аутоимунное заболевание, такое как миостения тяжелая псевдопаралитическая, базедова болезнь, тиреоидит Хашимото или синдром Гудпасчера. Такая терапия может быть осуществлена, например, путем введения полипептидов по изобретению. Для такого введения могут использоваться как немеченые, так и меченые полипептиды.

Например, полипептиды по изобретению могут вводиться в виде полипептидов, меченных терапевтическим агентом. Эти агенты могут быть связаны либо непосредственно, либо опосредованно с антителами или антигенами по изобретению. Одним из примеров опосредованного связывания является связывание с помощью спейсерных фрагментов. Эти спейсерные фрагменты, в свою очередь, могут быть либо нерастворимыми, либо растворимыми (Diener, Science 231, 148 (1986)), и могут быть выбраны таким образом, чтобы позволять лекарству высвобождаться из антигена в месте-мишени. Примерами применяемых для иммунотерапии терапевтических агентов, которые могут быть связаны с полипептидами по изобретению, являются лекарственные средства, радиоактивные изотопы, лектины и токсины. Лекарственные средства, которые могут быть конъюгированы с полипептидами по изобретению, включают соединения, являющиеся классическими представителями лекарственных средств, такие как митомицин С, даунорубицин и винбластин.

При использовании полипептидов по изобретению, конъюгированных с радиоактивными изотопами, например для иммунотерапии, некоторые изотопы могут быть более предпочтительны, чем другие, в зависимости от таких факторов как распределение в лейкоцитах, а также стабильность и излучение. В зависимости от аутоиммуного ответа некоторые излучатели являются более предпочтительными, чем другие. В целом для иммунотерапии предпочтительными являются радиоактивные изотопы, испускающие - и -частицы. Предпочтительными являются короткоживущие, обладающие большой энергией -излучатели, такие как ²¹²Bi. Примерами радиоактивных изотопов, которые могут быть связаны с полипептидами по изобретению для терапевтических целей, являются ¹²⁵I, ¹³¹I, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ²¹²Bi, ²¹²At, ²¹¹Pb, ⁴⁷Sc, ¹⁰⁹Pd и ¹⁸⁸Re.

Лектины представляют собой протеины, обычно выделяемые из растительного материла, которые связываются с определенными фрагментами сахаров. Многие лектины также способны склеивать клетки и стимулировать лимфоциты. Причем рицин представляет собой токсичный лектин, который уже ранее применялся для иммунотерапии. Иммунотерапию проводили путем связывания -пептидной цепи рицина, которая ответственна за токсичность, с полипептидом, способным обеспечивать сайтспецифичную направленность токсического действия.

Токсины - это ядовитые соединения, которые продуцируются растениями, животными или микроорганизмами и которые в соответствующей дозе часто являются летальными. Токсин дифтерии представляет собой вещество, продуцируемое Corynebacterium diphtheria, которое может применяться в терапевтических целях. Этот токсин состоит из - и -субъединиц, которые в соответствующих условиях могут быть разделены. Токсичный компонент А может быть связан с полипептидом по изобретению и может применяться для сайтспецифичного введения к взаимодействующим В-клеткам и Т-клеткам, которые находятся вблизи друг от друга в результате связывания с полипептидом по изобретению.

Другие терапевтические агенты из числа описанных выше, которые могут быть связаны с полипептидом по изобретению, а также соответствующие протоколы опытов ex vivi и in vitro являются известными или могут быть легко разработаны специалистами в данной области. При необходимости специалист в данной области может применять вместо самого белкового материала описанный ниже полинуклеотид по изобретению, кодирующий любой из полипептидов по изобретению, или соответствующие векторы.

Таким образом, специалисту в данной области должно быть очевидно, что полипептид по изобретению может применяться для конструирования других полипептидов с требуемой специфичностью и биологической функцией. Предполагается, что полипептиды по изобретению могут играть важную роль в области медицины как с терапевтической, так и с научной точки зрения, например, при создании новых способов лечения, связанных с В-клетками болезней, таких как определенные формы рака и аутоиммунных болезней, или в качестве перспективных инструментов анализа и модуляции путей трансдукции соответствующих клеточных сигналов.

Согласно еще одному варианту осуществления, указанный по меньшей мере один дополнительный домен содержит молекулу, выбранную из группы, включающей эффекторные молекулы, имеющие конформацию, пригодную для проявления биологической активности, аминокислотные последовательности, которые обладают способностью секвестровать ион, и аминокислотные последовательности, которые обладают способностью избирательно связываться с твердой подложкой или с предварительно отобранным антигеном.

Предпочтительно этот дополнительный домен включает фермент, токсин, рецептор, антигенсвязывающий участок, антигенсвязывающий участок синтезированного биологическим путем антитела, фактор роста, фактор клеточной дифференцировки, лимфокин, цитокин, гормон, обнаруживаемый на расстоянии фрагмент, антиметаболит, радиоактивный атом или антиген. Этот антиген может представлять собой, например, опухолевый антиген, вирусный антиген, микробный антиген, аллерген, аутоантиген, вирус, микроорганизм, полипептид, пептид или разнообразные опухолевые клетки.

Кроме того, последовательность, которая обладает способностью секвестровать и