Рекомбинантный вектор, экспрессирующий полипептид с активностью глюкозооксидазы, трансформированный штамм saccharomyces cerevisiae, рекомбинантный полипептид с активностью глюкозооксидазы и способ его получения

Рекомбинантный вектор, экспрессирующий полипептид с активностью глюкозооксидазы, трансформированный штамм saccharomyces cerevisiae, рекомбинантный полипептид с активностью глюкозооксидазы и способ его получения

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения глюкозооксидазы. Рекомбинантный вектор для экспрессии полипептида с активностью глюкозооксидазы (ГО) содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид или его мутеин, имеющий Ser в положении Cys у аминокислотного остатка 521, и оперативно связанные регуляторные последовательности. Сконструированным вектором трансформируют клетки, в частности клетки Saccharomyces cerevisiae. Рекомбинантный полипептид с активностью ГО получают путем культивирования трансформированных клеток. Изобретение позволяет получать глюкозооксидазу из грибов рекомбинантным путем. 4 с. и 6 з.п. ф-лы, 17 ил., 5 табл.

Методическая область

Настоящее изобретение относится к использованию технологии рекомбинантной ДНК для получения белков для промышленного использования. Более конкретно, настоящее изобретение относится к рекомбинантным векторам, содержащим полинуклеотид, происходящий от грибов, который кодирует глюкозооксидазу, и к продукции глюкозооксидазы хозяйскими клетками, трансформированными векторами экспрессии, содержащими этод полинуклеотид.

Предпосылки

Методы генной инженерии успешно применялись в фармацевтической индустрии, что дало новый продукт. Более того, стало ясно, что те же методы могут быть применены в широких масштабах в производстве ферментов, ценных для других производств. Преимущества получения коммерчески полезных процессов посредством генной инженерии, как ожидается, включают снижение стоимости получения фермента, получение ферментов в безопасных организмах, что удобно для пищевых продуктов, и специфически генетические модификации на геномном уровне, улучщающие свойства фермента, такие как термостабильность и рабочие характеристики, так же, как и те, которые упрощают очистку фермента.

Глюкозооксидаза – это фермент, который катализирует окисление глюкозы в глюконовую кислоту с сопутствующим образованием перекиси водорода. Фермент имеет много промышленных применений, включая его использование в обессахаривании яиц, в удалении кислорода из напитков, влажных пищевых продуктов /вкусовые добавки/ и герметично закрытых упаковок пищи, и в определении и оценке глюкозы в промышленных растворах и в таких жидкостях тела, как кровь и моча.

Глюкозооксидаза была впервые выделена из клеток Aspergillus niger Мюллером /Biochemische Zeitschrift /1928/, 199, 136-170 и /1931/, 232, 423-424/ и была также выделена из А. niger Франке и Деффнером /Annalen der Chemie /1939/, 541, 117-150/. Продукция глюкозооксидазы клетками Penicillum chrysogenum, Penicillum glaucum, Penicillum purpurogenum, Aspergillus niger и Aspergillus bumaricus описана Бэйкером, патент США №2482724. Способ препаративного получения глюкозооксидазы, в котором подуцирующие глюкозооксидазу /ГО/ линии родов Aspergillus и Penicillum культивировали в среде, имеющей низкое содержание углеводов, описан в патенте США №3701715. Фермент из Aspergillus niger /A. niger/ был очищен до высокой степени чистоты и по сообщениям имеет мол. вес. приблизительно 150,000, изоэлектрическую точку 4.2 и содержание флавинадениннуклеотида /ФАД/ – 3 ФАД на моль /Pazur и Kleppe /1964/ Biochemistry 3,578-583/. Известны также аминокислотный состав фермента из А. niger, а также его гликопротеиновая природа /Pazur и др., /1965/, Aroh. Biochem. Biophys III, 351-357/. Однако неизвестны ни аминокислотная последовательность ГО, ни нуклеотидная последовательность, кодирующая ее.

Проблема с использованием ГО, выделенной из ее природного источника, заключается в том, что организмы, продуцирующие фермент, могут иметь загрязнения, вредные для отдельных применений желаемого фермента. Например, ГО используется для коммерческого приготовления пищевых продуктов. Однако А. niger, который является основным источником коммерчески приготовленного фермента, сильно аллергенет и не применим для использования в пище. Более того, процедура жесткой очистки может быть относительно дорогой, поскольку ГО – преимущественно внутриклеточный фермент. Эти проблемы могут быть разрешены получением ГО в рекомбинантных системах.

Ферменты грибов были экспрессированы в рекомбинантных векторах. Глюкоамилаза из Aspergillus /Innis и др., /1985/, Science 228, 21-26/ и эндоглюканаза 1 из brichoderma rusei (van Arsdelf и др., /1987/, Biotechnology. 5,60-64/ были экспрессированы в Saccharomyces cerevisial.

Сссылки, цитированные в последующем тексте

References Cited in Following Text

Barr et аl. (1986), Biotechniques 4, 428.

Boel et al. (1984), Embo J. 3, 1581.

Botstein et al. (1979), Gene 8: 17.

Broach (1981), in MOLECULAR BIOLOGY OF THE YEAST SACCHAROMYCES, vоl. 1, р. 445.

Chang et al. (1977), Nature 198, 1056.

Chirgwin et al. (1979), Biochemistry 18, 5294.

Clewell et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 1159.

Clewell et аl. (1972), J. Bacteriol. 110, 667.

Cohen (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110.

De Воеr еt аl. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 292, 128.

Edge (1981), Nature 292, 756.

Ehrhart and Hollenberg (1983), J. Bacterio1. 156, 625.

Gate, ed. (1984), OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS.

Glisin (1974), Biochemistry 13, 2633.

Glover, ed. (1985), DNA CLONING: vol. 1 and vol 2.

Goeddel et al. (1980), Nucleic Acids Res. 8, 4057.

Graham and Van der Eb (1978), Virology 52, 546.

Grunstein and Hogness (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 6961.

Hames & Higgins, eds. (1985), NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION.

Hammerling et al. (1981) MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS.

Hess et al. (1968), J. Adv. Enzym Reg. 7, 149.

Hinnen et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929.

Hitzeman (1980), J. Biol. chem. 255, 2073.

Holland (1978), Biochemistry 17, 4900.

Holland (1981) J. Biol. chem. 256, 1385.

Huynh et al. (1985), DNA CLONING, A PRACTICAL APPROACH (D.M. Glover, ed., IRL Press, рр. 47-78).

Innis et al. (1985), Science 228, 21.

Jay et al. (1984), J. Biol. Chem. 259, 6311.

Кеllеу and Reddy (1986), J. Bact. 166, 269.

Kennet et al. (1980), MONOCLONAL ANTIBODIES.

Laemmli (1970), Nature 227, 680.

Lei et al. (1987), J. Bacteriol 169, 1987.

Malikkides and Weiland (1982), Biotech. Bioeng. 24, 1911.

Maniatis et al. (1982), MOLECULAR CLONING: А LABORATORY MANUAL.

Maxam et al. (1980), Methods in Enzymology 65, 499.

Messing et al. (1981), Nucleic Acids Res. 9, 309.

Messing (1983), Methods in Enzymology 101, 20-37.

METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.).

Miller and Calos, eds. (1987), GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J.Н. Miller and М.P. Calos, eds., Cold Spring Harbor Laboratory).

Nambair et al. (1984), Science 223, 1299

Pazur and Кlерре (1964), Biochem. 3, 578.

Perbal (1984), А PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING.

Poznansky et аl. (1980) in DRUG DELIVERY SYSTEMS (R.L. Juliano, ed., Oxford, N.Y. 1980).

Poznansky et аl. (1984), Phar. Revs. 36, 277.

Sanger et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463.

Schreier et al. (1980), HYBRIDOMA TECHNIQUES.

Scopes (1987), PROTEIN PURIFICATION, PRINCIPLES AND PRACTICE, 2nd edition (Springer-Verlag).

Shimatake et al. (1981), Nature 292, 128.

Taylor et аl. (1985), Nucl. Acids Res. 13, 8749.

Travis et аl. (1985), J. Biol. Chem. 260, 4384-4389.

Urdea et аl. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7461.

Warner (1984), DNA 3, 401.

Wood et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1585.

Zoller (1982), Nucleic Acids Res. 10, 6487.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает последовательность кДНК, кодирующую глюкозооксидазу /ГО/ из грибного источника из рода Aspergillus более конкретно из A. niger. Знание этой последовательности делает возможным экспрессию в рекомбинантных системах полипептидов, существенно сходных с ГО, включая ГО, аналоги ГО и фрагменты ГО. Что удивительно, относительно большие количества фермента продуцируются и секретируются дрожжевыми клетками, когда клетки трансформированы вектором экспрессии, кодирующим ГО и выращены при условиях, позволяющих экспрессию фермента. Секреция может быть под контролем либо дрожжевых секреторных последовательностей, либо препропоследовательности ГО, кодируемой в A. niger.

Последовательность кДНК, обеспеченная здесь, также позволяет выделение последовательностей, кодирующих ГО, из других источников, которые также могут быть использованы для получения рекомбинантной ГО. Эти другие источники могут быть любого происхождения, в которых природно кодируется фермент, но должны быть преимущественно грибными источниками, в которых ГО-кодирующая последовательность содержит по крайней мере 8 пар оснований, предпочтительнее 20 пар оснований и даже более предпочтительно по крайней мере 40 пар оснований, которые сильно гомологичны /т.е. имеют максимум 1 нуклеотидную замену в комплементарных последовательностях/ с последовательностью на фиг. 5в. С другой стороны, ГО, выделенная из источника другого нежели A. nider, может иметь последовательность как минимум около 4 аминокислот, гомологичную последовательности ГО A. niger, кодируемой кДНК на фиг. 5в.

Были исследованы полипептиды, экспрессированные в дрожжах, трансформированных векторами экспрессии, кодирующими кДНК ГО, и был получен удивительный результат, что продукты гипергликозилированы и что гипергликозилирование рекомбинантно полученных полипептидов мало влияет на ферментативную активность по сравнению с природной ГО, но что рекомбинантный продукт проявляет повышенную термостабильность.

Другой удивительный результат заключается в том, что удаление углеводных остатков как рекомбинантно-полученной ГО, так и с нативной ГО, не ингибирует, по-видимому, ферметативную активность.

Еще другой удивительный результат заключается в том, что хотя природная ГО присутствует в A. niger в относительно больших количествах, кодирующая ее мРНК относительно редка в клетках A. niger в течение фазы логарифмического роста.

И еще удивительный результат заключается в том, что аналог ГО, т.е. мутеин, проявляет повышенную термостабильность по отношению к природной молекуле из A. niger и ее рекомбинантному аналогу, экспрессированному в дрожжах.

Соответственно один аспект изобретения - вектор-рекомбинант, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, существенно сходный с глюкозооксидазой /ГО/, существенно свободный от остальных векторов, не кодирующих ГО.

Другой аспект изобретения – хозяйская клетка, трансформированная рекомбинантным полинуклеотидом с последовательностью, кодирующей полипептид, существенно сходный с ГО.

И еще аспект изобретения – неприродный, существенно сходный с ГО.

Изобретение включает способ получения рекомбинантного полипептида, существенно сходного с ГО, заключающийся в:

а) получении популяции трансформированных клеток, содержащих рекомбинантный вектор, включающий кодирующую последовательность для полипептида, существенного сходного с ГО, операционно связанную с последовательностями, позволяющими экспрессию указанной кодирующей последовательности в указанных клетках;

б) выращивании указанной популяции трансформированных клеток при условиях, когда указанный полипептид, существенно сходный с ГО, экспрессируется;

в) выделении указанного полипептида, существенно сходного с ГО.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 демонстрирует аминокислотную последовательность природной ГО из A. niger.

Фиг. 2 демонстрирует олигонуклеотидные пробы, полученные из аминокислотной последовательности природной ГО из A. niger для скрининга на последовательности, кодирующей ГО.

Фиг. 3 демонстрирует 42-членные пробы long7 и long8 и их связь с пробой long6.

Фиг. 4В демонстрирует последовательность кДНК ГО в клоне 4, полученную из нее аминокислотную последовательность и расположение сайтов рестрикции.

Фиг. 5В показывает последовательность сложной кДНК, кодирующей ГО из A. niger, полученную из нее аминокислотную последовательность и расположение сайтов рестрикции.

Фиг. 6 показывает идентичность фрагнетов нативной ГО из A. niger с последовательностями, полученными из сложной кДНК, показанной на фиг. 5В, и использование кодонов.

Фиг. 7 показывает нуклеотидную последовательность 5'–района гена ГО из A. niger.

Фиг. 8 показывает схему конструирования векторов экспрессии p.AB24AGS_GO GO и pAB24AG_Альфа GO.

Фиг. 9 – карта существенных участков челночного вектора рАВ24.

Фиг. 10 показывает полиакриламидный гель, в котором электрофоретически разделялись частично очищенная рекомбинантная ГО, когда ГО была обработана в присутствии и в отсутствие эндогликозидазы Н.

Фиг. 11 - карта рSGO-2, показывающая некие существенные черты, включая сайты рестрикции.

Фиг. 12 – карта pSGO-1, показывающая некоторые существенные черты, включая сайты рестрикции.

Фиг. 13 – график, демонстрирующий термостабильность во времени полипептида ГО, экспрессированного в дрожжах с pAB24AGS6O в сравнении с природной ГО из A. niger.

Фиг. 14 – график, показывающий термостабильность во времени мутеина, кодируемого C521S и экспрессированного в дрожжах в сравнении с природной ГО из A. niger.

Фиг. 15 – рестриктная карта клона.

Фиг. 16 показывает частичную нуклеотидную последовательность геномного сегмента P.amagasakiense в клоне pBRpGОxA11, также показаны аминокислоты и рестриктные сайты, кодируемые там.

Фиг. 17 показывает сравнение аминокислот, кодируемых фрагментом, полученным из геномной вставки P.amagasakiense в pBRpGОХA11 с аминокислотной последовательностью ГО A. niger, кодируемой нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг. 5В.

Способы осуществления изобретения

Определения

1. В описании настоящего изобретения будет использована следующая терминология в соответствии с определениями, представленными ниже.

Как использовано здесь, термин “глюкозооксидаза” относится к полипептиду, который катализирует окисление глюкозы в глюконовую кислоту с сопутствующим образованием перекиси водорода. Способы определения активности глюкозооксидазы известны и включают, например, колориметрический анализ, в котором активность глюкозооксидазы сопряжена с системой пероксидаза-о-дианизидин. Этот тип системы анализа обсуждается в примере IV.

Термин “рекомбинантный полинуклеотид”, как используется здесь, характеризует полинуклеотид, полезный для продукции ГО, означает полинуклеотид из источника: генома, кДНК, полусинтетического или синтетического, который благодаря источнику или манипуляциям: 1/ не ассоциирован совсем или частью полинуклеотида, с которым он ассоциирован в природе, и/или 2/ связан с другим полинуклеотидом нежели тот, с которым он связан в природе, или 3/ не существует в природе.

Термин “полинуклеотид”, как используется здесь, относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины как рибонуклеотидов, так и дезоксирибонуклеотидов. Этот термин относится только к первичной структуре молекулы. Следовательно, термин включает 2- и 1-нитевые ДНК, как и 2- и 1-нитевые РНК. Он также включает модифицированные, например, метилированием, фосфорилированием и /или кэппингом и немодифицированные формы полинуклеотидов.

“Репликон” – любой генетический элемент, например плазмида, хромосома, вирус, который ведет себя как автономная единица полинуклеотидной репликации в клетке, т.е. способен к репликации под собственным контролем.

“Вектор” – репликон, который встроен в другой полинуклеотидный сегмент так, чтобы сообщить внесенному сегменту способность к репликации и/или экспрессии.

“Контрлирующая последовательность” относится к полинуклеотидным последовательностям, которые необходимы для влияния на экспрессию и/или секрецию кодирующей последовательности, к которой они подстроены. Природа таких контролирующих последовательностей различается в зависимости от хозяйского организма: у прокариот такие контролирующие последовательности в общем включают промотор, сайт связывания рибосомы и терминаторы; у эукариот, в общем, такие контролирующие последовательности включают промоторы, реминаторы и в некоторых случаях энхансеры. Кроме того, как у прокариот, так и эукариот лидерные последовательности контролируют серецию экспрессированного полипептида из хозяйской клетки. Термин “контролирующая последовательность” предназначен включать, как минимум, все компоненты, чье присутствие необходимо для экспрессии, и может также включать дополнительные компоненты, присутствие которых желательно, например лидерные последовательности.

“Операционно связанные” – относится к соседству, где компоненты, описанные так, находятся во взаимодействии, позволяющем им функционировать в присущей им манере. Контролирующая последовательность, “операционно связанная” с кодирующей последовательностью, лигирована таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается при условии совместных с контролирующими последовательностями.

“Открытая рамка считывания” – район полинуклеотидной последовательности, который кодирует полипептид; этот район может представлять собой часть кодирующей последовательности или всю кодирующую последовательность.

“Кодирующая последовательность” – полинуклеотидная последовательность, транскрибируемая в мРНК и/или транслируемая в полипептид, будучи помещена под контроль подходящих регуляторных последовательностей. Границы кодирующей последовательности определены стартовым кодоном трансляции на 5-конце и стоп-кодоном трансляции на 3-конце. Кодирующая последовательность может включать мРНК, кДНК и рекомбинантные полинуклеотидные последовательности, но не ограничена ими.

“Рекомбинантные хозяйские клетки”, “хозяйские клетки”, “клетки”, “линии клеток”, “культуры клеток” и другие термины, определяющие микроорганизмы или линии клеток высших эукариот, культивированные в одноклеточном виде, использованы взаимозаменяемо и относятся к клеткам, которые могут быть или были использованы как реципиенты для рекомбинантного вектора или других переносимых полинуклеотидов и включают потомство исходной клетки, которая была трансформирована. Понятно, что потомство единичной родительской клетки может не обязательно быть полностью идентично в морфологическом или геномном аспекте или в аспекте тотальной ДНК, исходному родителю из-за случайной или умышленной вызванной мутации. Потомство родительской клетки, которое существенно исходно с родителем, может быть характеризовано по оставшему свойству, такому как присутствие нуклеотидной последовательности, кодирующей желаемый пептид, включается в потомство, подразумеваемое этим определением, и перекрывается вышеперечисленными терминами.

“Трасформация”, как использовано здесь, относится к введению экзогенного полинуклеотида в хозяйскую клетку безотносительно к способу, использованному для введения, например прямое введение, трансдукция, или f-спаривание. Экзогенный полинуклеотид может поддерживаться как неинтегрированный вектор, например плазмида, или альтернативно может быть интегрирован в хозяйский геном.

Как использовано здесь, термин “полипептид” относится к аминокислотному продукту, имеющему последовательность, закодированную в геноме, и не относится к специфической длине продукта, т.е. пептиды, олигепептиды и белки включены в определение полипептида. Этот термин также не относится к постэкспрессионным модификациям полипептида, например гликозилированию, ацетилированию, фосфорилированию, сиалилированию и т.п.

Термин “полипептид, существенно сходный с глюкозоксидазой или ГО”, относится к формам ГО неприродного происхождения, например, в отношении посттрансляционных модификаций, включая гликозилирование, фосфорилирование и т.п., но которые имеют ту же аминокислотную последовательность, что нативная ГО, аналоги ГО, фрагменты ГО, аналоги фрагментов ГО и слитные белки, где ГО, или аналог, или фрагмент слит с другим полипептидом, с которым он не слит обычно в природе. “Аналог ГО” или “фрагмент ГО” – тот, у которого гомология с нативной ГО или сравнимым фрагментом более примерно 70% в отношении аминокислотной последовательности и предпочтительно более примерно 80%. В этот термин также включены аналоги, в которых один или более природный аминокислотный остаток замещен веществом неприродного происхождения, которое известно, например аминокислотой неприродного происхождения, и т.д. Полипептиды, являющиеся аналогами или фрагментами ГО, могут быть или не быть “активными”. “Активный” полипептид – такой, который с подходящими кофакторами и субстратами катализируется реакцией, в номере катализируемую природным ферментом, выделенным из Aspergillus. “Неактивный" полипептид – такой, который утерял природную активность или у которого природная активность была существенно изменена в отношении образования продукта /тип или количество/, но который имеет по крайней мере указанную выше степень гомологии аминокислотной последовательности с природной ГО или со сравнимым фрагментом ГО. Способы определения форм и аналогов ГО неприродного происхождения известны. Формы и аналоги ГО неприродного происхождения могут быть детектированы, например, по изменениям в связывании с различными хромотографическими материалами и элюции с них и по их прохождению через электрофоретические гели. Кроме того, аналоги ГО могут быть детектированы, например, сравнением аминокислотных последовательностей.

Один тип аналога ГО – полипептид, в котором один или более присутствующих в норме остаток цистеина заменен другой аминокислотой или делетирован; этот тип полипептида назван здесь “мутеин”. Способы получения мутеина известны.

Как использовано здесь, термин “гипергликозилированная ГО” относится к ГО, которая содержит дополнительные остатки углеводов относительно количества углеводов, связанных с природной ГО. Методики определения того, содержит ли полипептид больше или меньше углеводов, известны и включают, например, ряд методик, следящих за разницей в молекулярном весе модифицированных полипептидов /например, электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДДС-Na, как описано Лэммли/ и прохождение через колонки, содержащие материалы – молекулярные сита /например, Sephadex/, как и методики, основывающиеся на сродстве или потере сродства между углеводными группами и материалами, связывающими углеводы.

“Полипептид дикого типа” – такой, который имеет аминокислотную последовательность, идннтичную последовательности, закодированной в геноме организма, который является источником кодируемой последовательности.

“Природная ГО” и сходные термины относятся к ГО, выделенной из грибного источника, в котором она в норме продуцируется в природе с происходящего из природы генома.

“Неприродный полипептид” относится к полипептиду, который продуцирован в хозяине, нежели такай, который продуцирован в природе.

“Жесткие условия” гибридизации, как использовано здесь, это условия, которые позволяют не более 1-нуклеотидного нарушения спаривания двух комплементарных последовательностей. Условия гибридизации и отмывки различной степени жесткости известны экспериментаторам и обсуждаются, например, в Maniatis и др. /1982/.

Как использовано здесь, “дрожжи” включают аскоспорогенные дрожжи /Endomycetales/, базидиоспорогенные дрожжи и дрожжи, принадлежащие к несовершенным грибам (Blastomycetes). Аскоспорогенные дрожжи подразделяются на два семейства, Spermophthraceal и Saccharomycetaceae. Последние представлены четырьмя подсемействами, Schizosaccharomycoideae /например, род Schizosaccharomycoideae/, Nadsonioideae, Lipomycoideae Saccharomycoideae /например, роды Pichia. Kluyverosnyces и Saccharomyces/. Базидиоспорогенные дрожжи включают роды Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium и Filobasidiella.

Дрожжи, принадлежащие к несовершенным грибам, подразделяются на два семейства, Sporobolomycetaceae /например, роды Sporobolomyces, Bullera (например, род Candida). Особенный интерес для данного изобретения представляют виды родов Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces и Candida, конкретно интересны виды Saccharomyces S. cervisiae, S. carlsbergiensis, S. diastaticus, S. dougbasii, S. Kluyveri, S. norbensis и S. oviformis. Виды, представляющие особенный интерес в роде Kluyveromyces, включают K. lactis. Поскольку классификация дрожжей в будущем может меняться, для целей этого изобретения дрожжи будут определяться, как описано в BIOLOGY AND ACTIVITIES OF YEAST (F.A. Skinner, S.M. Passmore, R.R. Davenport eds. 1980) (Soc. App. Bacteriol Symp. Series №9/. В дополнение к предшествующему, те, кто достаточно опытен, преимущественно знакомы с биологией дрожжей и манипуляциями генетики дрожжей. См., например, BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF YEAST (M. Bacila, B.L. Horecker, A.O.M. Steppany eds. 1978; THE YEAST (A.H. ROSE, J.S. Harrison eds. 2^nd ed., 1987) и THE MOLECUZAR BIOLOGY OF THE YEAST SACCHAROMYCES (Strathern et al. eds.).

Как использовано здесь, “грибы” включают классы Phycomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes и Deuteromycetes. Представительные группы Phycomycetes включают, например, Rhizopus, Mucor и водные плесени. Представительные группы Ascomycetes включают, например, Neurospora Penicillum Aspergillus (Aspergillus) и настоящие дрожжи, перечисленные выше. Примеры Basidiomycetes включают, например, грибы, ржавчины и головни.

II. Описание изобретения

Практическая часть настоящего изобретения использует, если не указано другое, общепринятые методики молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и энзимологии, которые приняты. Эти методики полностью объяснены в литературе. См., например, literature. See е.g., Maniatis, Fitsch & Sambrook, MOLECUIAR CLONING; А LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING; VOLUMES I AND II (D.N. Glover ed. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J. Gait Ed. 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (В.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (R.I Freshney ed. 1986); В. Perbal, А PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); the treatise, METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.) and particularly vols. 154 and 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., respectively); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J.H. Miller and М.P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); IMMUNOCHEMICAL METHODOS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London), and Scopes, PROTEIN PURIFICATION; PRINCIPLES AND PRACTICE, 2^nd edition (Springer Verlag, 1987).

Все патенты, патентные приложения и публикации, упомянутые здесь как выше, так и ниже, включены здесь посредством ссылок.

Неуклеотидная конструкция, кодирующая ГО, может быть использована в способах получения фермента рекомбинантными методами.

ДНК, кодирующая ГО, более частно грибную ГО, еще более конкретно ГО из Aspergillus, еще более конкретно была выделена из библиотеки кДНК, созданной обратной транскрипцией поли /А⁺/ РНК, выделенной из A. niger в логарифмической фазе роста. Однако создание проб для скрининга библиотеки на последовательности, кодирующей ГО, было проблематично. Данные о как аминокислотной последовательности, так и нуклеотидной последовательности, которые кодируют грибной фермент, отсутствовали. Более того, неожиданно оказалось, что попытки секвенировать фермент, выделенный из A. niger, дали лишь последовательность первых 10 аминокислот природного полипептида, что сделало необходимым другой подход к конструированию последовательности, которые могли быть использованы для скрининга на ГО–кодирующие последовательности.

Для конструирования проб, удобных для детектирования последовательностей кДНК, кодирующих ГО, в библиотеке олигопептидные фрагменты природного фермента из A. niger были очищены и аминокислотные последовательности определены. Основываясь на этих последовательностях, олигонуклеотидные пробы конструировали двумя способами. Пробы в 17-23 нуклеотида были получены из районов наименьшей вырожденности.

Альтернативно уникальные более длинные пробы основывались на угадывании использования кодонов. Последовательности этих проб показаны на фиг. 2.

Скрининг библиотеки кДНК A. niger в gt 10 дал удивительные результаты. Во-первых, ни одна из коротких проб не была полезна для детектирования клонов, содержащих кДНК ГО. Кроме того, в то время как две 42-членные пробы могли быть использованы успешно для детектирования этих клонов, 72-членная проба, участками которой за исключением одного нуклеотида являлись 42-членные пробы, не были полезны для детектирования. 42-членные пробы, которые могут быть использованы для детектирования клонов, содержащих кДНК, показаны на фиг. 3.

С использованием 42-членных проб были получены клоны gt 10, которые содержали нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид ГО или их фрагменты; кДНК в этих клонах была субклонирована и секвенирована. Составная кДНК, составленная из 2 кДНК ГО, показана на фиг. 5В. Аминокислотная последовательность ГО была выведена из кодирующей ее нуклеотидной последовательности. Из последовательности может быть определено, что зрелый белок состоит из 583 аминокислот; аминокислотная последовательность содержит только 3 остатка цистеина и 8 консенсусов сайта гликозилирования. В аминокислотной последовательности есть препропоследовательность из 22 аминокислот с единственным основным сайтом расщепления у начала зрелой последовательности.

Рекомбинантный полинуклеотид, показанный на фиг. 5В, кодирует ГО из A. niger. Можно ожидать, однако, что ГО из других источников, конкретнее других грибных источников и более конкретно из других видов Aspergillus, содержит районы, которые гомологичны таковым ГО из A. niger. Районы гомологии могут быть определены сравнением аминокислотной последовательности ГО из другого источника с таковой ГО из A. niger; аминокислотная последовательность, полученная из последовательностей кДНК ГО, показана на фиг. 5В. Если аминокислотная последовательность всего полипептида не может быть определена, последовательности олигопептидных фрагментов могут быть сравнены с последовательностью ГО A. niger. Информация кодонового выбора источника также может быть сравнена; кодоновый выбор A. niger представлен на фиг. 6. Таким образом, пробы могут быть получены из последовательности на фиг. 5В и полезны в скрининге библиотек кДНК или геномных библиотек из других детектирования ГО–кодирующих последовательностей из этих источников. Параметры создания проб известны экспериментаторам, и некоторые обеспечены в примерах. Обычно пробы содержат как минимум 8 оснований, более предпочтительно как минимум 20 оснований и еще более предпочтительно как минимум 40 оснований, которые идентичны последовательности в последовательности кДНК на фиг. 5В. Идентичность может быть как кодирующей, так и с некодирующей нитью кДНК. Эти пробы будут гибридизоваться в жестких условиях с подходящей цепью дуплекса ДНК, содержащей ГО-кодирующую последовательность и которые должны быть выделены. Жесткие условия гибридизации известны и обсуждаются, например, в Maniatis и др. /1982/ и в Methods in Ensymology. ГО–кодирующие последовательности, которые были детектированы пробой/ами/, могут затем быть клонированы и выделены с использованием методик, которые общеизвестны. См., например, Maniatis (1982), B.Perbal (1984) и Glover ed. (1985).

Выделение последовательности, кодирующей часть ГО из Penicillum, более конкретно P.amagasakiense, описано в примерах. Выделение было проведено с использованием пробы, полученной из кДНК ГО, содержавшейся в рекомбинантном векторе, описанном здесь. С использованием фрагмента, кодирующего ГО Penicillum, для получения проб возможно получить целую последовательность полинуклеотида, кодирующего этот грибной фермент из библиотеки кДНК или геномных, созданных из источника Penicillum.

Хотя способ получения конструкции ДНК, кодирующей ГО A. niger, базирующийся на создании библиотеки кДНК, описан здесь, в настоящем изобретении получение таких конструкций не ограничено этим методом. С использованием информации о последовательности, обеспеченной здесь, могут быть выдвинуты другие методы получения полинуклеотидных конструкций, кодирующих ГО. Например, нуклеотидная последовательность, кодирующая ГО, может быть синтезирована с использованием автоматического синтеза ДНК. См., например, Edge (1981), Nambair и др. (1984) и Jay и др. (1984). С другой стороны, могут быть синтезированы олигонуклеотиды, содержащие часть информации о последовательности; они затем могут быть использованы как пробы для скринирования библиотек геномной ДНК и библиотек кДНК. Основные стратегии получения олигонуклеотидных проб и библиоте ДНК, как и их скрининг гибридизацией нуклеиновых кислот, общеизвестны. См., например, Glover D.P. ed. (1985), B.D. Hames and S.J. Higgins eds. (1985), M.J. Gate ed (1984), Maniatis и др. (1982) и B. Perbal (1984).

После того, как последовательность, кодирующая ГО, получена или выделена, она может быть клонирована в любой удобный репликон для создания вектора, и т.о. поддерживаться в состоянии, существенно свободном от векторов, которые не содержат ген ГО /например, других клонов, происходящих из библиотеки/. Множество векторов клонирования общеизвестно, и отбор подходящего вектора – дело выбора. Примеры векторов, удобных для клонирования рекомбинантной ДНК, и хозяйских клеток, которые они могут трансформировать, включают бактериофаг (E. coli); pBR 322 (E. coli); pACYC177 (E. coli); pKT230, pGV1106 грамотрицательные бактерии/; рМЕ290 /грамотрицательные бактерии, не E. coli /; pHV14 /E. coli и B.subtilis/; pBD9 (Bacillus); pIJ61 (Streptomyces); YIp5 (Saccharomyces); YCp19 (Saccharomyces) и вирус папилломы быка /клетки млекопитающих/. См., в основном, Т. Maniatis и др. (1982), B. Perbal (1984) и Glover, ed. (1985).

Полинуклеотидная последовательность, кодирующая ГО, экспрессирована вставлением последовательности в подходящий репликон, что создает вектор экспрессии, транформатцией подходящих хозяйских клеток образовавшимся вектором экспрессии и выращиванием хозяйских клеток при условиях, которые позволяют рост и экспрессию.

При создании вектора экспрессии ГО-кодирующая последовательность помещена в вектор так, что она операционно связана с подходящими последовательностями для экспрессии и, возможно, для секреции. Как минимум, контролирующие последовательности включают промотор и транскрипционный и трансляционный стоп-кодон. Расположение и ориентация кодирующей последовательности по отношению к контролирующим последовательностям таково, что кодирующая последовательность транскрибируется под “контролем” контролирующих последовательностей: т.е. промотор контролирует транскрипцию мРНК с кодирующей последовательностью, и стоп-кодон, использованный для терминации трансляции, расположен ранее по ходу транскрипции, чем кодон терминации транскрипции.

Дополнительно к контролирующим последовательностям может быть желательно добавление регуляторных последовательностей, которые позволяют регуляцию экспрессии ГО относительно роста хозяйстких клеток. Это особенно верно, когда ГО экспрессируется в клетках, растущих в среде, содержащей глюкозу, поскольку перекись водорода, образуемая ГО, может быть токсична для клетки. Примеры регуляторных систем – те, которые вызывают включение или выключение экспрессии гена в ответ на химическое или физическое воздействие, включая присутствие регуляторного соединения. В прокариотические системы включены системы операторов lac и trp. У дрожжей они могут включать, например, систему ADH2. В примерах экспрессия ГО в S. cerevisiae находится под регуляцией гибридного промотора ADH2/GAP. Другой пример регуляторных последовательной – те, которые позволяют амплификацию генов. В эукариотических системах они включают ген дигидрофолатредуктазы, который амплифицируется в присутствии метотрексата, и металлотионеиновые гены, которые амплифицируются в присутствии тяжелых металлов. В этих случаях последовательность, кодирующая ГО, должна быть помещена тандемно с регуляторным элементом.

Другие типы регуляторных элементов также могут присутствовать в векторе, например те, которые не обязательно должны быть расположены тандемно с последовательностью, кодирующей ГО. Энхансерные последовательности, например последовательность энхансера SV40 - этого типа. Энхансерная последовательность одним своим присутствием вызывает усиление экспрессии генов на расстоянии от них.

Модификация последовательности, кодирующей ГО, до или после ее вставления в репликон может быть желательна или необходима в зависимости от выбора системы экспрессии. Например, в некоторых случаях может быть необходимо модифицировать последовательность так, чтобы она имела подходящее расположение, будучи присоединенной к контролирующим последовательностям. В некоторых случаях может быть желательно добавить или изменить последовательности, которые вызывают секрецию полипептида из хозяйского организма, с последующим отщеплением секреторного сигнала. В примерах вектора экспрессии, которые были созданы, имели либо природную препропоследовательность ГО А. niger, или же в них в качестве секреторного сигнала использовался -фактор из дрожжей. Кроме того, в некоторых случаях может быть желательно удалить интроны из последовательностей, выделенных из геномных библиотек, чтобы сделать возможной экспрессию в системах, например прокариотических системах, которые не способны к эксцизии последовательности интронов или которые не позволяют экспрессию кодирующих последовательностей, содержащих интроны. Пример последней обсуждается в Innis и др. /1985/. Способы модификации нуклеотидных последовательностей с использованием клонирования общеизвестны. Они включают, например, использование рестриктаз или таких ферментов, как Bal31 для удаления лишних нуклеотидов, и химически синтезированных олигонуклеотидов для использования в качестве адапторов для замещения утеренных нуклеотидов и в сайт направленное мутагенезе. См., например, Maniatis и др. (1982), Glover, ed. (1985) и Hames and Higgins, eds. (1984).

Модификация последовательности, кодирующей ГО, может также быть необходима для синтеза полипептидов, существенно сходных с ГО. Эти полипептиды отличаются некоторым искусственным образом от фермента, выделенного из природного источника. Например, если желаемый продукт – фрагмент ГО, последовательность, кодирующая фермент, модифицируется для удаления нежелательных последовательностей, соответствующих делетируемым аминокислотам. Если желаемый продукт – активный фрагмент ГО, дел