Диагностический анализ

Диагностический анализ

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к анализу на основе нуклеиновых кислот для обнаружения вируса гепатита В. Сущность изобретения состоит в проведении одностадийного амплификационного анализа для обнаружения последовательностей нуклеиновых кислот вируса гепатита В, идентификации варианта вируса гепатита и нуклеотидных последовательностей, применимых в качестве иммунологического маркера и/или для генерирования иммуноглобулинов для применения в диагностике и/или терапии. Техническим результатом является разработка одностадийного амплификационного анализа нуклеиновых кислот для скрининга нуклеотидных последовательностей вируса гепатита В и идентификации указанных последовательностей. 6 с. и 5 з.п.ф-лы, 2 ил., 2 табл.

Область изобретения

Изобретение относится в общем к анализу на основе нуклеиновых кислот для обнаружения присутствия вирусного патогена, в частности вируса гепатита В. Более конкретно, данное изобретение обеспечивает одностадийный амплификационный анализ для обнаружения последовательностей нуклеиновых кислот вируса гепатита В. Анализ данного изобретения является легко адаптируемым для автоматизации и делает возможной быструю пропускную способность тестирования подлежащих тестированию проб. Данное изобретение обеспечивает также агенты, применимые для проведения анализа детектирования на основе нуклеиновых кислот на вирус гепатита В, и набор, содержащий эти агенты.

Предпосылки изобретения

Библиографические подробности публикаций, цитируемых в виде цифр в описании, приводятся в конце описания.

Вирус гепатита В (далее называемый “HBV”) может вызывать изнуряющие патологические состояния и может приводить к острой печеночной недостаточности, кровотечению вследствие цирроза и первичному раку печени. HBV инфицирует миллионы индивидуумов ежегодно и способствует по меньшей мере миллиону смертей каждый год.

HBV представляет собой ДНК-вирус, который реплицируется через промежуточные РНК и использует обратную транскрипцию в его репликационной стратегии. Геном HBV является геномом сложной природы, имея частично двухцепочечную структуру ДНК с перекрывающимися открытыми рамками считывания, кодирующими различные вирусные белки.

Несмотря на доступность HBV-вакцины, сотни миллионов индивидуумов являются носителями этого вируса. HBV обычно идентифицируют детектированием поверхностного антигена HBV (HBsAg), внутреннего (корового) антигена вируса (НВсАg) и антител к НВеАg (анти-НВеАg).

После инфекции HBV или вакцинации HBsAg появляются антитела к HBsAg (анти-HBs). Это было основанием для иммунного детектирования HBsAg. В этой системе детектирования скринингу подвергают HBsAg или анти-HBs. Этот анализ использовали для скрининга крови перед переливанием крови (гемотрансфузией) в случае HBV, для детектирования связанного с HBV заболевания печени у пациентов с острым и хроническим гепатитом, циррозом печени и первичным раком печени и скрининга на носителей HBV, например, в случае реципиентов и доноров при трансплантации.

HBsAg содержит антигенный район, называемый детерминантой “а” (1). Детерминанта “а” является комплексной, конформационной и зависит от образования дисульфидной связи среди высококонсервативных остатков цистеина. Считалось, что генетическая изменчивость, приводящая к изменениям в детерминанте “а”, участвует в образовании мутантов HBV, которые ускользают от иммунологической реакции, генерируемой общепринятыми вакцинами (2-6). Одной особенно распространенной мутацией является замена глицина (G) на аргинин (R) в положении аминокислоты 145 (G145F) HBsAg. Эта мутация влияет на район эпитопа “а”.

Все увеличивающаяся надежда на химическое и иммунологическое вмешательство в лечении или предупреждении инфекции HBV приводит к более селективному давлению в отношении появления вариантов HBV, которые являются резистентными к подобной интервенционной терапии. Благодаря перекрывающейся геномной структуре HBV может происходить прямая или опосредованная селекция (отбор) вариантов HBV в результате использования химических агентов или вакцин.

Таким образом, общепринятые анализы на основе антител для HBsAg могут приводить к ложноотрицательным результатам. Это может иметь очень серьезные последствия в отношении борьбы с распространением этого заболевания и лечения пациентов.

В исследовании, приведшем к данному изобретению, авторы изобретения искали альтернативный анализ на HBV. В соответствии с данным изобретением авторы изобретения разработали одностадийный амплификационный анализ нуклеиновых кислот для скрининга последовательностей нуклеиновых кислот HBV из HBV, которые могут обнаруживать или могут не обнаруживать иммунодетектируемые вирусные маркеры. Анализ на основе нуклеиновых кислот данного изобретения обеспечивает чувствительный анализ на HBV-агенты, в частности, когда такие агенты не могут быть детектированы общепринятыми иммунологическими диагностическими тестами. Кроме того, анализ данного изобретения позволяет получать специфический иммуноглобулин (например, IgG) и вакцины на основе консервативных районов среди вариантов HBV.

Сущность изобретения

Во всем данном описании, если контекст не требует иного значения, слово “содержат” или его вариации, такие как “содержит” или “содержащий”, следует понимать как включение указанного элемента, или целого, или группы элементов, или целых, но не как исключение любого другого элемента, или целого, или группы элементов, или целых.

Один аспект данного изобретения обеспечивает способ обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в пробе, причем указанный способ включает в себя подвергание данной пробы денатурирующим условиям для получения одноцепочечных форм указанной последовательности-мишени, контактирование денатурированной пробы с набором праймеров, содержащим по меньшей мере два праймера, где по меньшей мере один праймер способен гибридизоваться с одной цепью последовательности-мишени, и где по меньшей мере один другой праймер способен гибридизоваться с цепью, комплементарной первой упомянутой цепи, и где указанные праймеры могут удлиняться от их 3’-концов с образованием продукта удлинения, комплементарного цепи, с которой каждый из указанных праймеров гибридизовался, и подвергание этой пробы условиям, облегчающим амплификацию, для генерирования продукта амплификации, содержащего комплементарные продукты удлинения, и затем детектирование присутствия этого продукта амплификации, причем присутствие указанного продукта амплификации свидетельствует о присутствии указанной происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты.

Другой аспект данного изобретения рассматривает способ обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в пробе, причем указанный способ предусматривает подвергание данной пробы денатурирующим условиям для получения одноцепочечных форм указанной последовательности-мишени, контактирование денатурированной пробы с набором праймеров, содержащим по меньшей мере два праймера, где по меньшей мере один праймер способен гибридизоваться с одной цепью последовательности-мишени, и где по меньшей мере один другой праймер способен гибридизоваться с цепью, комплементарной первой упомянутой цепи, и где указанные праймеры могут удлиняться от их 3’-концов с образованием продукта удлинения, комплементарного цепи, с которой каждый из указанных праймеров гибридизовался, и где эти праймеры выбраны для гибридизации с районами, соответствующими консервативной нуклеотидной последовательности или фланкирующими консервативную нуклеотидную последовательность в нуклеотидной последовательности или части нуклеотидной последовательности, кодирующей HBsAg, и подвергание этой пробы условиям, облегчающим амплификацию, для генерирования продукта амплификации, содержащего комплементарные продукты удлинения, и затем детектирование присутствия этого продукта амплификации, причем присутствие указанного продукта амплификации свидетельствует о присутствии указанной происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты.

Еще один аспект данного изобретения рассматривает способ обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени ДНК в пробе, причем указанный способ предусматривает необязательное подвергание этой пробы условиям обратной транскрипции для получения одно- или двухцепочечных молекул кДНК из происходящей из HBV мРНК, подвергание этой пробы денатурирующим условиям для получения одноцепочечных молекул ДНК, соответствующих указанной последовательности-мишени, контактирование денатурированной пробы с набором праймеров, содержащим по меньшей мере два праймера, где по меньшей мере один праймер способен гибридизоваться с одной цепью ДНК указанной последовательности-мишени, и где по меньшей мере один другой праймер способен гибридизоваться с цепью, комплементарной первой упомянутой цепи, и где указанные праймеры могут удлиняться от их 3’-концов с образованием продукта удлинения, комплементарного цепи, с которой каждый из указанных праймеров гибридизовался, и подвергание этой пробы условиям, облегчающим амплификацию, для генерирования продукта амплификации, содержащего комплементарные продукты удлинения, и затем детектирование присутствия этого продукта амплификации, причем присутствие указанного продукта амплификации свидетельствует о присутствии указанной происходящей из HBV последовательности-мишени ДНК.

Еще один аспект данного изобретения рассматривает способ обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени ДНК в пробе, причем указанный способ предусматривает необязательное подвергание этой пробы условиям обратной транскрипции для получения одно- или двухцепочечных молекул кДНК из происходящей из HBV мРНК, подвергание этой пробы денатурирующим условиям для получения одноцепочечных молекул ДНК, соответствующих указанной последовательности-мишени, контактирование денатурированной пробы с набором праймеров, содержащим по меньшей мере два праймера, где по меньшей мере один праймер способен гибридизоваться с одной цепью ДНК указанной последовательности-мишени, и где по меньшей мере один другой праймер способен гибридизоваться с цепью, комплементарной первой упомянутой цепи, и где указанные праймеры могут удлиняться от их 3’-концов с образованием продукта удлинения, комплементарного цепи, с которой каждый из указанных праймеров гибридизовался, причем один из указанных праймеров помечен репортерной молекулой, способной давать идентифицируемый сигнал, а другой из указанных праймеров помечен улавливаемой частью молекулы, подвергание указанной пробы условиям, облегчающим амплификацию, для генерирования продукта амплификации продукта, содержащего комплементарные продукты удлинения, имеющие репортерную молекулу, способную обеспечивать идентифицируемый сигнал, на одной цепи и улавливаемую твердым носителем часть молекулы на другой цепи, иммобилизацию продукта амплификации через его улавливаемую часть молекулы и затем скрининг на детектируемый сигнал, причем присутствие этого сигнала свидетельствует о присутствии продукта амплификации и, следовательно, происходящей из HBV последовательности-мишени ДНК.

Еще один аспект данного изобретения рассматривает способ обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени ДНК в пробе, причем указанный способ предусматривает введение указанной пробы в реакционный сосуд, содержащий праймер, иммобилизованный на твердом носителе, и второй праймер в фазе раствора, причем оба праймера способны гибридизоваться с комплементарной нуклеотидной последовательностью на комплементарных отдельных цепях происходящей из HBV ДНК в районе, находящемся в консервативном районе, вблизи него или смежно с ним на геноме HBV, и причем праймер фазы раствора помечен репортерной молекулой, способной давать идентифицируемый сигнал, подвергание этого реакционного сосуда условиям, облегчающим амплификацию, и затем детектирование присутствия идентифицируемого сигнала, причем присутствие указанного сигнала свидетельствует о присутствии происходящей из HBV ДНК.

Еще один аспект данного изобретения относится к способу обнаружения одной или нескольких происходящих из HBV последовательностей-мишеней ДНК из одинаковых или различных штаммов или вариантов HBV, причем указанный способ предусматривает контактирование пробы, предположительно содержащей происходящую из HBV ДНК в одноцепочечной форме, с двумя или более праймерами, иммобилизованными по отдельности или в виде ряда на твердом носителе, в реакционном сосуде, причем реакционный сосуд дополнительно содержит праймеры фазы раствора, имеющие партнер, иммобилизованный на твердом носителе, причем этот иммобилизованный праймер и его праймер-партнер фазы раствора способны амплифицировать в условиях амплификации район происходящей из HBV ДНК, причем праймер фазы раствора несет репортерную молекулу, способную давать идентифицируемый сигнал, так что присутствие сигнала в определенном местоположении на твердом носителе позволяет идентифицировать конкретный изолят или вариант HBV.

Другой аспект данного изобретения обеспечивает ряд из двух или более олигонуклеотидных праймеров, иммобилизованных на твердом носителе, причем указанные праймеры способны гибридизоваться с комплементарной нуклеотидной последовательностью из происходящей из HBV ДНК.

Еще один аспект данного изобретения обеспечивает применение матрицы, содержащей ряд (массив) олигонуклеотидов, определяемых формулой a₁a₂...a_n, имеющих координаты на этой матрице (x₁y₁), (х₂y₂)...(х_ny_n), где а₁a₂...a_n обозначают одинаковые или различные олигонуклеотиды, всего n олигонуклеотидов, и каждый олигонуклеотид определяется координатами координатной сетки (x₁y₁), (х₂y₂)...(x_ny_n), и где эти олигонуклеотиды имеют партнеров амплификации, определяемых b₁b₂...b_n, так что олигонуклеотиды a₁b₁, а₂b₂...a_nb_n способны гибридизоваться с комплементарными цепями происходящей из HBV ДНК, причем интронная ДНК содержит последовательность нуклеотидов, консервативную между двумя или более вариантами HBV, такими как HBsAg-варианты, причем указанная матрица применима для детектирования конкретных HBV-агентов, определяемых тем, что они несут консервативный район амплификации указанной происходящей из HBV ДНК.

Можно отметить, что согласно настоящему изобретению детектируется любой вариант поверхностного антигена вируса гепатита В (таких как глицин 145 аргинин и глицин 130 аспартат мутанты) из существующих диких типов путем технологии изолирования и детектирования этих двух мутантных цепей, которые не могут быть детектированы стандартными технологиями.

Краткое описание графических материалов

Фиг.1 является схематическим представлением, показывающим структурную организацию поверхностного антигена HBV. (А) Локализация основной гидрофильной петли, охватывающей консервативную детерминанту “а” (заимствованную из Chen et al. (7). Указан размер полноразмерного HBsAg в аминокислотных остатках (1-400). Положения рrеS1 (1-118), preS2 (119-174) и основного HBsAg (175-400) показаны ниже этого блока. Указано также положение основной гидрофильной петли относительно полноразмерного HBsAg. Соответствующее положение основной гидрофильной петли в основном HBsAg (SHBsAg) является положением от аминокислоты 100 до аминокислоты 160, а консервативной детерминанаты “а” от 124 до 147 в SHBsAg. (В) Геномная локализация района, кодирующего SHBsAg Положения 5’- и 3’-конца кодирующего района показаны ниже этого блока (nt 156 и 835 генома HBV соответственно, причем положение 1 определяется как первый нуклеотид А EcoRI-сайта - GAATTC (<400>3) HBV дикого типа с номером доступа банка генов (GenBank) Z35717). Положения праймерных олигонуклеотидов, обеспеченных в данном изобретении (<400>1 и <400>2), также указаны ниже блока (начинающиеся от nt 456 и 689 генома HBV соответственно). Размер ПЦР-амплифицированного ДНК-фрагмента с использованием праймерных олигонуклеотидов данного изобретения (<400>1 и <400>2) составляет 233 пар оснований (п.н.), как указано под блоком.

Фиг.2 является фотографическим представлением, показывающим распределение при электрофорезе ПЦР-амплифицированного фрагмента HBV из тест-проб, отрицательных в отношении HBsAg при применении иммунологических диагностических наборов, но положительных в отношении анти-НВс и анти-HBs при использовании праймерных олигонуклеотидов, обеспеченных в данном изобретении (<400>1 и <400>2). В дорожке 4 показаны положения миграции маркеров молекулярного веса (100 п.н.-лестница, MBI Fermentas). Дорожка 1 соответствует первой тест-пробе в таблице 1; дорожка 2 соответствует второй тест-пробе в таблице 1. Дорожки 6 и 9 соответствуют третьей и четвертой тест-пробам в таблице 1 соответственно. Не обнаружены продукты амплификации в дорожках 3, 5, 7 и 8, которые представляют тест-пробы, обнаруживающие одинаковые вирусные маркеры (отрицательные в отношении HBsAg, положительные в отношении анти-НВс и анти-HBs).

Подробное описание предпочтительных вариантов

Данное изобретение основано отчасти на идентификации нуклеотидных последовательностей, которые являются консервативными среди вариантов HBV, и их применении для получения праймеров для основанных на амплификации диагностических анализов на HBV.

Некоторые термины определены ниже для внесения ясности.

“Смесь для амплификации” обозначает водный раствор, содержащий различные реагенты, требующиеся для амплификации происходящей из вируса последовательности-мишени нуклеиновой кислоты. Они включают в себя фермент, водные буферы, соли, нуклеиновую кислоту-мишень и дезоксинуклеозидтрифосфаты.

“Система амплификации” обозначает любой способ in vitro для увеличения числа копий последовательности-мишени нуклеиновой кислоты.

Термин “реагенты амплификации” относится к различным буферам, ферментам, праймерам и дезоксинуклеозидтрифосфатам, требующимся для амплификации.

Термин “нуклеиновая кислота” относится к рибонуклеотидному или дезоксирибонуклеотидному полимеру либо в одноцепочечной, либо в двухцепочечной форме.

Термин “полимераза” относится к ферментам, способным катализировать синтез ДНК из нуклеозидтрифосфатных предшественников. В ПЦР-амплификации данного изобретения полимеразы являются предпочтительно зависимыми от матрицы, термостабильными и обычно присоединяют нуклеотиды к 3’-концу удлиняемого ДНК-полимера.

Термин “олигонуклеотид” относится к молекуле, состоящей из двух или нескольких рибонуклеотидов или дезоксирибонуклеотидов.

“Праймер” обозначает олигонуклеотид, природный или синтетический, способный действовать в качестве точки инициации синтеза ДНК в условиях, в которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера, который комплементарен цепи-мишени нуклеиновой кислоты. Эти условия включают в себя четыре различных нуклеозидтрифосфата и полимеразу в подходящем буфере и при подходящей температуре. Праймер является предпочтительно одноцепочечным олигодезоксинуклеотидом. Подходящая длина праймера зависит от цели и условий применения этого праймера (в том числе консервативности последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, условий ПЦР-циклирования и состава праймера).

Данное изобретение обеспечивает способ обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в пробе, причем указанный способ включает в себя подвергание данной пробы денатурирующим условиям для получения одноцепочечных форм указанной последовательности-мишени, контактирование денатурированной пробы с набором праймеров, содержащим по меньшей мере два праймера, где по меньшей мере один праймер способен гибридизоваться с одной цепью последовательности-мишени, и где по меньшей мере один другой праймер способен гибридизоваться с цепью, комплементарной первой упомянутой цепи, и где указанные праймеры могут удлиняться на их 3’-концах с образованием продукта удлинения, комплементарного цепи, с которой каждый из указанных праймеров гибридизовался, и подвергание этой пробы условиям, облегчающим амплификацию, для генерирования продукта амплификации, содержащего комплементарные продукты удлинения, и затем детектирование присутствия этого продукта амплификации, причем присутствие указанного продукта амплификации свидетельствует о присутствии указанной происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты.

В одном варианте последовательность-мишень соответствует району на геноме HBV, который является консервативным среди вариантов HBV и, в частности, вариантов HBV, имеющих измененные HBsAg. Измененный HBsAg может содержать замену, делецию и/или присоединение одной или многочисленных аминокислот, что происходит в результате замены, делеции и/или присоединения одного или многочисленных нуклеотидов в нуклеотидной последовательности, кодирующей HBsAg. Предполагается, что консервативный район в геноме HBV и, в частности, в нуклеотидной последовательности, кодирующей HBsAg, остается относительно стабильным несмотря на иммунологические изменения HBsAg. Таким образом, предполагается согласно данному изобретению, что варианты HBV, которые могут уже не детектироваться в иммунологическом анализе на HBsAg, все еще будут детектируемыми через консервативный район в гене HBsAg. Однако данное изобретение распространяется на применение рассматриваемого способа для идентификации вариабельных районов генома HBV, таких как районы, приводящие к модифицированным или новым эпитопам (например, на HBsAg).

Ссылка на варианты HBsAg включает в себя также варианты в других перекрывающихся генах, таких как ген ДНК-полимеразы.

Этот и другие аспекты данного изобретения не должны ограничиваться термином “ген”, который может называться такими терминами, как “молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая”, “нуклеотидная последовательность, кодирующая” и “генетическая последовательность, кодирующая”.

Термин “ген” используется в самом широком смысле и включает в себя кДНК, соответствующую экзонам гена. Таким образом, должно быть понятно, что ссылка здесь на “ген” включает в себя

(i) классический геномный ген, состоящий из регуляторных последовательностей транскрипции и/или трансляции и/или кодирующего района и/или нетранслируемых последовательностей (т.е. интронов, 5’- и 3’-нетранслируемых последовательностей); или

(ii) мРНК или кДНК, соответствующие кодирующим районам (т.е. экзонам) и 5’-и 3’-нетранслируемые последовательности данного гена.

Термин “ген” используется также для описания синтетических или слитых молекул, кодирующих весь продукт экспрессии или часть продукта экспрессии. В конкретных вариантах термины “молекула нуклеиновой кислоты” и “ген” могут быть использованы взаимозаменяемо.

Таким образом, другой аспект данного изобретения рассматривает способ обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты в пробе, причем указанный способ предусматривает подвергание данной пробы денатурирующим условиям для получения одноцепочечных форм указанной последовательности-мишени, контактирование денатурированной пробы с набором праймеров, содержащим по меньшей мере два праймера, где по меньшей мере один праймер способен гибридизоваться с одной цепью последовательности-мишени, и где по меньшей мере один другой праймер способен гибридизоваться с цепью, комплементарной первой упомянутой цепи, и где указанные праймеры могут удлиняться от их 3’-концов с образованием продукта удлинения, комплементарного цепи, с которой каждый из указанных праймеров гибридизовался, и где эти праймеры выбраны для гибридизации с районами, соответствующими консервативной нуклеотидной последовательности или фланкирующими консервативную нуклеотидную последовательность в нуклеотидной последовательности или части нуклеотидной последовательности, кодирующей HBsAg, и подвергание этой пробы условиям, облегчающим амплификацию, для генерирования продукта амплификации, содержащего комплементарные продукты удлинения, и затем детектирование присутствия этого продукта амплификации, причем присутствие указанного продукта амплификации свидетельствует о присутствии указанной происходящей из HBV последовательности-мишени нуклеиновой кислоты.

Проба представляет собой обычно, но не исключительно, биологическую пробу, содержащую ткань или экстракт ткани, жидкость, в том числе кровь или экскрецию, или любой другой материал, который потенциально содержит частицы HBV или ДНК, мРНК или репликативные промежуточные РНК HBV. Таким образом, первая стадия могла бы обычно включать в себя выделение пробы из субъекта-млекопитающего, в том числе в предпочтительном варианте, субъекта-человека. Проба может быть также пробой, относящейся к окружающей среде, или пробой из потенциального источника загрязнения HBV.

Хотя данное изобретение относится, в частности, к “ускользающим” (от иммунологического надзора) вариантам HBV, т.е. вариантам, с которыми по существу уже не взаимодействуют антитела к по меньшей мере одной форме HBsAg, данное изобретение дополнительно распространяется на любой район генома HBV, который является консервативным среди вариантов HBV, в частности клинически релевантных вариантов HBV, и который служит в качестве применимой последовательности-мишени. Конкретно применимыми районами, рассматриваемыми на геноме HBV, являются районы, которые кодируют новые эпитопы или HBsAg. Такие районы применимы для генерирования рекомбинантных пептидов для диагностических целей.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает средство для обнаружения HBV путем детектирования происходящих из HBV последовательностей нуклеиновых кислот. “Происходящая из HBV” последовательность нуклеиновой кислоты включает в себя сам геном HBV, его одноцепочечные ДНК-формы, репликативные промежуточные РНК, а также одно- или двухцепочечные молекулы кДНК, полученные с использованием обратной транскриптазы. Что касается последних, мРНК-транскрипт из происходящей из HBV нуклеотидной последовательности может быть подвергнут обратной транскрипции с образованием комплементарной цепи ДНК. Последняя цепь и/или ее ДНК-комплемент может быть затем подвергнут реакции амплификации. Детектирование репликативных промежуточных последовательностей РНК и/или кДНК, соответствующих происходящей из HBV мРНК, также является указанием на активную репликацию вируса.

Любая форма реакции амплификации может быть использована в практике данного изобретения, в том числе, но не только, полимеразная цепная реакция (ПЦР), реакция лигирования цепи, амплификация на основе последовательности нуклеиновой кислоты, амплификация на основе репликазы Q, способ вытеснения цепи, циклически повторяющаяся амплификация и рециркулирующее аллель-специфическое удлинение праймера. Однако предпочтительной является ПЦР.

Таким образом, другой аспект данного изобретения рассматривает способ обнаружения происходящей из HBV последовательности-мишени ДНК в пробе, причем указанный способ предусматривает необязательное подвергание этой пробы условиям обратной транскрипции для получения одно- или двухцепочечных молекул кДНК из происходящей из HBV мРНК, подвергание этой пробы денатурирующим условиям для получения одноцепочечных молекул ДНК, соответствующих указанной последовательности-мишени, контактирование денатурированной пробы с набором праймеров, содержащим по меньшей мере два праймера, где по меньшей мере один праймер способен гибридизоваться с одной цепью ДНК указанной последовательности-мишени, и где по меньшей мере один другой праймер способен гибридизоваться с цепью, комплементарной первой упомянутой цепи, и где указанные праймеры могут удлиняться от их 3’-концов с образованием продукта удлинения, комплементарного цепи, с которой каждый из указанных праймеров гибридизовался, и подвергание этой пробы условиям, облегчающим амплификацию, для генерирования продукта амплификации, содержащего комплементарные продукты удлинения, и затем детектирование присутствия этого продукта амплификации, причем присутствие указанного продукта амплификации свидетельствует о присутствии указанной происходящей из HBV последовательности-мишени ДНК.

В особенно предпочтительном варианте праймеры выбирают из последовательности, находящейся внутри нуклеотидной последовательности, кодирующей HBsAg. Наиболее предпочтительно, праймеры представляют собой <400>1 [смысловой праймер] и <400>2 [антисмысловой праймер]. Данное изобретение распространяется также на олигонуклеотидные праймеры, имеющие по меньшей мере приблизительно 70%-ное сходство с <400>1 или <400>2, а также праймеры, способные гибридизоваться с <400>1 или <400>2 или их комплементами в условиях низкой строгости.

Термин “сходство” в применении здесь включает в себя точную идентичность между сравниваемыми последовательностями на нуклеотидном уровне. Если имеется неидентичность на нуклеотидном уровне, “сходство” включает в себя различия между последовательностями, которые приводят к отличающимся аминокислотам, которые тем не менее являются родственными друг другу на структурном, функциональном, биохимическом и/или конформационном уровнях. В особенно предпочтительном варианте сравнения нуклеотидных последовательностей проводят на уровне идентичности, а не сходства.

Термины, используемые для описания родства между двумя или более полинуклеотидами или полипептидами, включают в себя “ссылочную последовательность”, “окно сравнения”, “сходство последовательности”, “идентичность последовательности”, “процент сходства последовательностей”, “процент идентичности последовательностей”, “по существу одинаковые” и “существенная идентичность”. “Ссылочной последовательностью” является последовательность длиной по меньшей мере 12, но часто 15-18 и часто по меньшей мере 25 или выше, например 30 мономерных единиц, в том числе нуклеотидов и аминокислотных остатков. Поскольку каждый из двух полинуклеотидов может содержать (1) последовательность (т.е. только часть полной полинуклеотидной последовательности), которая является одинаковой между этими двумя полинуклеотидами, и (2) последовательность, которая отличается между этими двумя полинуклеотидами, сравнения последовательности между двумя или несколькими полинуклеотидами обычно проводят посредством сравнения последовательностей этих двух полинуклеотидов на протяжении “окна сравнения” для идентификации и сравнения локальных районов сходства последовательностей. “Окно сравнения” представляет собой концептуальный сегмент обычно из 12 непрерывных остатков, который сравнивают со ссылочной последовательностью. Окно сравнения может содержать присоединения или делеции (т.е. гэпы) приблизительно 20% или менее в сравнении со ссылочной последовательностью (которая не содержит присоединений или делеции) для оптимального сопоставления этих двух последовательностей. Оптимальное сопоставление последовательностей для выстраивания окна сравнения может проводиться посредством компьютеризованных обеспечении алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wl, USA) или путем внимательного обследования и наилучшего сопоставления (т.е. с получением наивысшей процентной гомологии на протяжении окна сравнения), получаемого любым из различных выбранных способов. Можно сослаться на семейство программ BLAST, как описано, например, Altschul et al. (8). Подробное обсуждение анализа последовательности может быть найдено в Unit 19.3 Ausubel et al. (9).

Термины “сходство последовательностей” и “идентичность последовательностей” в применении здесь относятся к степени, в которой последовательности являются идентичными или функционально или структурно одинаковыми на основе сравнения нуклеотида за нуклеотидом на протяжении окна сравнения. Так, “процент идентичности последовательностей”, например, рассчитывают посредством сравнения двух оптимально сопоставленных последовательностей на протяжении окна сравнения, определения числа положений, в которых идентичное основание нуклеиновой кислоты (например, А, Т, С, G, I) находится в обеих последовательностях, с получением числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения (т.е. размер окна) и умножения результата на 100 с получением процента идентичности последовательностей. Для целей данного изобретения “идентичность последовательностей” следует понимать как “процент совпадений”, рассчитанный при помощи компьютерной программы DNASIS (Версия 2.5 для Windows; доступная из Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, USA) с использованием стандартных значений по умолчанию, как указано в руководстве, прилагаемом к этому программному обеспечению. Подобные замечания относятся и к сходству последовательностей.

Ссылка здесь на низкую строгость включает в себя и требует от по меньшей мере приблизительно 0 до по меньшей мере приблизительно 15% об./об. формамида и от по меньшей мере приблизительно 1 М до по меньшей мере приблизительно 2 М соли для гибридизации и от по меньшей мере приблизительно 1 М до по меньшей мере приблизительно 2 М соли для условий промывки. Обычно низкая строгость включает в себя температуру от приблизительно 25-30С до приблизительно 42С. Температура может быть изменена и могут быть использованы более высокие температуры для вытеснения формамида и/или для получения альтернативных условий строгости. Альтернативные условия строгости могут применяться, если необходимо, например, умеренная строгость, которая включает в себя и требует от по меньшей мере приблизительно 16% об./об. до по меньшей мере приблизительно 30% об./об. формамида и от по меньшей мере приблизительно 0,5 М до по меньшей мере приблизительно 0,9 М соли для гибридизации и от по меньшей мере приблизительно 0,5 М до по меньшей мере приблизительно 0,9 М соли для условий промывки, или высокая строгость, которая включает в себя и требует от по меньшей мере приблизительно 31% об./об. до по меньшей мере приблизительно 50% об./об. формамида и от по меньшей мере 0,01 М до по меньшей мере приблизительно 0,15 М соли для гибридизации и от по меньшей мере приблизительно 0,01 М до по меньшей мере приблизительно 0,15 М соли для условий промывки. Обычно промывку проводят _m=69,3+0,41 (G+C)% (10). Однако Т_m, дуплексной ДНК уменьшается на 1С с каждым увеличением на 1% числа несовпадающих пар оснований (11). Формамид является необязательным в этих условиях гибридизации. Таким образом, особенно предпочтительные уровни строгости определяются следующим образом: низкая строгость представляет собой 6 SSC-буфер, 0,1% м./об. ДСН при 25-42С; умеренная строгость представляет собой 2 SSC-буфер, 0,1% м./об. ДСН при температуре в диапазоне 20С-65С; высокая строгость представляет собой 0,1 SSC-буфер, 0,1% м./об. ДСН при температуре по меньшей мере 65С.

Ссылка здесь на “праймер” не должна пониматься как какое-либо ограничение в отношении структуры, размера или функции. Праймер может быть использован в качестве молекулы для амплификации или может быть использован в качестве зонда для целей гибридизации. Предпочтительной формой этой молекулы является форма праймера нуклеиновой кислоты для амплификации.

Ссылка здесь на “праймер нуклеиновой кислоты” включает в себя ссылку на последовательность дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов, содержащих по меньшей мере 3 нуклеотида. Обычно праймер нуклеиновой кислоты содержит от приблизительно 3 до приблизительно 100 нуклеотидов, предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 50 нуклеотидов и даже более предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 25 ну