Усиление иммунных ответов, опосредованных белками, слитыми из антитела и цитокина, посредством совместного введения ингибитора ангиогенеза

Усиление иммунных ответов, опосредованных белками, слитыми из антитела и цитокина, посредством совместного введения ингибитора ангиогенеза

Реферат

 

Изобретение относится к области иммунологии. Сущность изобретения состоит в том, что открыты композиции и способы для усиления цитоцидных иммунных ответов, направленных против предварительно выбранного типа клеток, у млекопитающих. Способы и композиции основаны на сочетании иммуноконъюгата типа антитело-цитокин и ингибитора ангиогенеза. При введении млекопитающему иммуноконъюгат вызывает иммунный ответ против предварительно выбранного типа клеток, например раковых клеток, который в результате синергии с ингибитором ангиогенеза больше иммунного ответа, вызываемого одним иммуноконъюгатом. Способы и композиции особенно подходят для уничтожения плотных опухолей или инфицированных вирусом клеток млекопитающих. Технический результат - расширение арсенала средств-иммуномодуляторов. 3 с. и 24 з.п. ф-лы, 5 ил.

Данная заявка претендует на приоритет и эффект изобретения в соответствии с предварительной заявкой на патент США с регистрационным номером 60/081,863, поданной 15 апреля 1998 г., содержание которой включено сюда посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится, в целом, к иммуноконъюгатам, в частности к белкам, слитым из антитела и цитокина, пригодным для целенаправленной иммунотерапии и общей стимуляции иммунитета. Более конкретно, настоящее изобретение относится к использованию ингибиторов ангиогенеза для усиления иммунного ответа, опосредованного белками, слитыми из антитела и цитокина, направленного против предварительно выбранного типа клеток, например клеток плотной опухоли.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Антитела использовали для лечения заболеваний людей в течение многих лет, главным образом для обеспечения пассивного иммунитета к вирусной или бактериальной инфекции. Однако недавно антитела и конъюгаты антител были использованы в качестве противоопухолевых агентов. Противоопухолевую активность трудно было продемонстрировать в отношении большинства типов опухолей, кроме тех случаев, когда клиническая картина представляет собой минимальное остаточное проявление заболевания (Reithmuller et al., LANCET 94:1177-1183) или когда опухоль доступна для циркулирующих антител, например в случае В-лимфомы (Maloney et al. (1994) BLOOD 84: 2457-2466). Плотные опухоли значительно более устойчивы к терапевтическому воздействию, опосредованному антителами, чем микрометастатические очаги, обнаруживаемые при картине минимальных остаточных проявлений заболевания.

Предшествующие исследования показали, что эффективность лечения опухолей антителами in vivo может быть значительно повышена за счет присоединения к молекуле антитела иммуностимулирующих цитокинов. Тем не менее белки, слитые из антитела и цитокина, были значительно менее эффективными в отношении деструкции крупных плотных опухолей, чем в отношении диссеминированных метастатических очагов (Xiang et al. (1997) CANCER RESEARCH 57: 4948-4955, и Lode et al. (1998) BLOOD 91: 1706-1715).

Поэтому в данной области техники все еще сохраняется потребность в композициях и способах, использующих такие композиции, для усиления иммунных ответов, опосредованных белками, слитыми из антитела и цитокина, и направленных против предварительно выбранных типов клеток, например типов клеток, присутствующих в плотных опухолях.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение частично основано на обнаружении того факта, что при введении млекопитающему иммуноконъюгата можно вызвать более сильный иммунный ответ против предварительно выбранного типа клеток, если иммуноконъюгат вводят вместе с ингибитором ангиогенеза. В частности, было обнаружено, что такие комбинации особенно эффективно опосредуют иммунную деструкцию предварительно выбранного типа клеток, например типов клеток, обнаруживаемых в плотных опухолях, и клеток, инфицированных вирусами.

В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает способ индуцирования у млекопитающего цитоцидного иммунного ответа против предварительно выбранного типа клеток. Способ включает введение млекопитающему: (1) иммуноконъюгата, содержащего сайт связывания антигенов антитела, способный соединяться с предварительно выбранным типом клеток, и цитокин, способный вызывать иммунный ответ против предварительно выбранного типа клеток, и (2) ингибитора ангиогенеза в количестве, достаточном для усиления иммунного ответа по сравнению с иммунным ответом, стимулируемым одним иммуноконъюгатом.

В предпочтительном примере осуществления изобретения предварительно выбранным типом клеток могут быть раковые клетки, присутствующие, например, в плотной опухоли, более предпочтительно в крупной плотной опухоли (а именно, больше 100 мм³). Альтернативно, предварительно выбранным типом клеток может быть инфицированная вирусом клетка, например клетка, инфицированная вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ).

В другом предпочтительном примере осуществления изобретения ингибитор ангиогенеза может быть введен одновременно с иммуноконъюгатом. Альтернативно, ингибитор ангиогенеза может быть введен до введения иммуноконъюгата. Кроме того, предполагается, что иммуноконъюгат может быть введен совместно с несколькими различными ингибиторами ангиогенеза. Альтернативно, предполагается, что ингибитор ангиогенеза может быть введен совместно с несколькими различными иммуноконъюгатами.

В другом аспекте изобретение предусматривает композицию для индуцирования у млекопитающего цитоцидного иммунного ответа против предварительно выбранного типа клеток. Композиция включает в комбинации: (1) иммуноконъюгат, включающий сайт связывания антигенов антитела, способный присоединять предварительно выбранный тип клеток, и цитокин, способный вызывать этот иммунный ответ против предварительно выбранного типа клеток млекопитающего, и (2) ингибитор ангиогенеза в количестве, достаточном для усиления иммунного ответа, вызываемого иммуноконъюгатом комбинации, по сравнению с иммунным ответом, стимулируемым одним иммуноконъюгатом.

В предпочтительном примере осуществления изобретения сайт связывания антигенов антитела имммуноконъюгата предпочтительно включает тяжелую цепь иммуноглобулина или ее антигенсвязывающий фрагмент. Тяжелая цепь иммуноглобулина предпочтительно включает, в направлении от амино-конца к карбокси-концу, домен 1 константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (СН1), домен 2 константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (СН2) и факультативно может также включать домен 3 константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (СНЗ). В более предпочтительном примере осуществления изобретения иммуноконъюгат является слитым белком, включающим тяжелую цепь иммуноглобулина или ее антигенсвязывающий фрагмент, соединенные посредством пептидной связи с цитокином. Соответственно, предпочтительный белок, слитый из антитела и цитокина, включает, в направлении от амино-конца к карбокси-концу, (1) сайт связывания антигена антитела, включающий вариабельную область иммуноглобулина и способный присоединять антиген клеточной поверхности предварительно выбранного типа клеток, домен иммуноглобулина СН1, домен иммуноглобулина СН2 (факультативно – СН3 домен), и (2) цитокин. Способы получения и использования таких слитых белков подробно описаны в работе Gillies et al. (1992) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89:1428-1432; Gillies et al. (1998) J. IMMUNOL. 160:6195-6203 и Патенте США №5,650,150.

Домены константной области иммуноглобулина (а именно, СН1, СН2 и/или СН3 домены) могут быть доменами константной области, в норме связанными с тем же доменом вариабельной области в антителе, существующем в природе. Альтернативно, один или несколько доменов константной области могут быть получены из антител, отличающихся от антитела, использованного в качестве источника домена вариабельной области. Другими словами, домены вариабельной и константной областей иммуноглобулина могут быть получены из различных антител, например антител, полученных от различных видов животных. См., например, Патент США №4,816,567. Кроме того, вариабельные области иммуноглобулина могут включать последовательности каркасной области (КО), полученные от одного вида, например от человека, и последовательности области, определяющей комплементарность (ООК), вставленные между КО, полученные от второго, другого, вида, например от мыши. Способы получения и использования таких химерных вариабельных областей иммуноглобулинов описаны, например, в Патентах США №5,225,539 и №5,585,089.

Иммуноконъюгаты на основе антител, кроме того, предпочтительно включают легкую цепь иммуноглобулина, которая предпочтительно ковалентно связана с тяжелой цепью иммуноглобулина посредством, например, дисульфидной связи. Вариабельные области соединенных тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина совместно образуют один законченный сайт связывания для присоединения предварительно выбранного антигена. В других примерах осуществления изобретения иммуноконъюгаты включают две химерные цепи, каждая из которых включает, как минимум, один участок тяжелой цепи иммуноглобулина, присоединенный к цитокину. Две химерных цепи предпочтительно ковалентно соединены друг с другом, например, при помощи одной или нескольких межцепочечных дисульфидных связей.

Таким образом, изобретение относится к слитым белкам, у которых специфичность связывания антигена и активность антитела сочетаются с высокой биологической активностью цитокина. Слитый белок согласно настоящему изобретению можно использовать для избирательной доставки цитокина к клетке-мишени in vivo, так что цитокин может оказывать локальный биологический эффект в непосредственной близости от клетки-мишени. В предпочтительном примере осуществления изобретения компонент слитого белка, представляющий собой антитело, избирательно присоединяет антиген на поверхности раковой клетки и в результате этого слитый белок проявляет локальную противораковую активность. В альтернативном предпочтительном примере осуществления изобретения компонент слитого белка, являющийся антителом, специфически присоединяет клетку, инфицированную вирусом, такую как ВИЧ-инфицированная клетка, и в результате слитый белок проявляет локальную противовирусную активность.

Предпочтительные цитокины, которые могут быть включены в иммуноконъюгаты согласно настоящему изобретению, включают, например, факторы некроза опухолей, интерлейкины, колониестимулирующие факторы и лимфокины. Предпочтительные факторы некроза опухолей включают, например, фактор некроза опухолей (ФНО ). Предпочтительные интерлейкины включают, например, интерлейкин-2 (ИЛ-2, IL-2), интерлейкин-4 (ИЛ-4, IL-4), интерлейкин-5 (ИЛ-5, IL-5), интерлейкин-7 (ИЛ-7, IL-7), интерлейкин-12 (ИЛ-12, IL-12), интерлейкин-15 (ИЛ-15, IL-15) и интерлейкин-18 (ИЛ-18, IL-18). Предпочтительные колониестимулирующие факторы включают, например, колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (ГМ-КСФ, GM-CSF) и колониестимулирующий фактор макрофагов (М-КСФ, M-CSF). Предпочтительные лимфокины включают, например, лимфотоксин (ЛТ). Другие подходящие цитокины включают интерфероны (ИФН, IFN), в том числе ИФН- , ИФН- и ИФН- , которые обладают иммунологическими эффектами, а также антиангиогенными эффектами, которые не зависят от их противовирусной активности.

Предпочтительные ингибиторы ангиогенеза, которые можно использовать при осуществлении настоящего изобретения, включают, например, эндостатин, ангиостатин, пептиды, обладающие аффинностью к _v3-интегрину, антитела или их фрагменты, обладающие аффиностью к _v3-интегрину, пептиды с аффинностью к рецептору эпидермального фактора роста (ЭФР, EGF), антитела или их фрагменты, обладающие аффинностью к рецептору ЭФР, ингибиторы циклооксигеназы (ЦОГ) СОХ-2, фумагиллин, талидомид, антиангиогенные цитокины, например ИФН- , ИФН- и ИФН- , и слитые белки, включающие цитокин, с таким антиангиогенным цитокином.

Также предусмотрены предпочтительные дозировки и схемы введения для введения иммуноконъюгатов в комбинации с ингибиторами ангиогенеза.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Вышеизложенные и прочие цели, отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения, а также собственно изобретение можно лучше понять из нижеследующего описания предпочтительных примеров осуществления изобретения, сопровождаемого прилагаемыми графическими материалами, в которых:

ФИГ.1 представляет собой схематическое изображение типичного иммуноконъюгата, который пригоден для использования при осуществлении изобретения.

ФИГ.2А и 2Б являются графиками, отображающими экспрессию ЕрСАМ человека в трансфицированных клетках карциномы легких Левиса (КЛЛ, LLC) мышей, проанализированную с помощью сортировки флуоресцентно-активированных клеток (ФАКС, FACS). Одинаковое количество трансфицированных клеток окрашивали либо только вторичным специфическим антителом к Fc человека, меченным флуоресцеина изотиоцианатом (ФИТЦ, FITC) (ФИГ.2А), либо вначале их окрашивали белком, слитым из антитела и huKS-huIL2, а затем специфичным к Fc человека антителом, меченным ФИТЦ (ФИГ.2Б).

ФИГ.3 представляет собой линейный график, отображающий воздействия на подкожные опухоли белка, слитого из антитела и цитокина, вводимого или отдельно, или в комбинации со вторым белком, слитым из антитела и цитокина, в котором цитокин обладает антиангиогенной активностью. Лечение, продолжавшееся в течение 5 дней, было начато через 13 дней после имплантации КПЛ-клеток. Мышам вводили раствор фосфатного буфера (незаполненные ромбики); 15 мкг/день только слитого белка huKS-mu 2a-muIL2 (сплошные квадратики); 10 мкг/день слитого белка huKS-mu 2a-muIL2 (сплошные треугольники); и комбинацию 7,5 мкг/день слитого белка huKS-mu 2a-mulL2 и 5 мкг/день huKS-mu 2a-muIL12 (крестики).

ФИГ.4 представляет собой линейный график, отображающий воздействия на подкожные опухоли белка, слитого из антитела и цитокина, вводимого либо отдельно, либо в комбинации со слитым белком, включающим эндостатин. Размер подкожных опухолей СТ26/ЕрСАМ регистрировали у мышей, которым вводили раствор фосфатного буфера (сплошные ромбики), слитый белок muFc-muEndo (сплошные квадратики), слитый белок huKS-hu 4-huIL2 (сплошные треугольники) и комбинацию слитого белка muFc-muEndo и слитого белка huKS-hu 4-huIL2 (крестики).

ФИГ.5 представляет собой линейный график, отображающий воздействие на подкожные опухоли белка, слитого из антитела и цитокина, вводимого либо отдельно, либо в комбинации с индометацином. Размер подкожных опухолей LLC-ЕрСАМ регистрировали у мышей, которым вводили раствор фосфатного буфера (сплошные ромбики), слитый белок huKS-hu 1-huIL2 (сплошные квадратики), индометацин (сплошные треугольники) и комбинацию слитого белка huKS-hu 1-huIL2 и индометацина (крестики).

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К настоящему времени было обнаружено, что цитоцидные иммунные ответы против предварительно выбранного типа клеток, инициируемые иммуноконъюгатом, можно значительно усилить посредством введения иммуноконъюгата совместно с ингибитором ангиогенеза. Комбинированная терапия особенно эффективна при опосредовании иммунной деструкции пораженной ткани, например, определенных опухолевых или инфицированных вирусом клеток. Настоящее изобретение описывает способы получения и использования пригодных для этой цели иммуноконъюгатов, а также анализы, которые можно использовать для тестирования их фармакокинетической активности в доклинических модельных опытах на животных in vivo, если иммуноконъюгаты сочетают с подходящими ингибиторами ангиогенеза.

При использовании в настоящей работе термин “цитоцидный иммунный ответ” понимают как обозначающий любой иммунный ответ у млекопитающего, как гуморальный, так и клеточный по природе, который усиливается иммуноконъюгатом согласно настоящему изобретению и который либо убивает, либо другим способом снижает жизнеспособность предварительно выбранного типа клеток млекопитающего. В иммунный ответ может быть включен один или несколько типов клеток, в том числе Т-клетки, клетки - натуральные киллеры (НК, NK) и макрофаги.

При использовании в настоящей работе, термин “иммуноконъюгат” понимают как обозначающий конъюгат (1) сайта связывания антигенов антитела, обладающего специфичностью связывания и способного присоединять поверхностный антиген раковой клетки или инфицированной вирусом клетки, и (2) цитокина, который способен индуцировать или стимулировать цитоцидный иммунный ответ, направленный против раковых или инфицированных вирусом клеток. Соответственно, иммуноконъюгат способен избирательно доставлять цитокин к клетке-мишени in vivo, так что цитокин может опосредовать локальный иммунный ответ, направленный против клетки-мишени. Например, если компонент иммуноконъюгата, являющийся антителом, избирательно присоединяет антиген, находящийся на поверхности раковой клетки, например раковой клетки плотной опухоли, в частности крупной плотной опухоли размером более 100 мм³, то иммуноконъюгат проявляет локальную противораковую активность. Альтернативно, если компонент иммуноконъюгата, являющийся антителом, избирательно присоединяет антиген инфицированной вирусом клетки, такой как клетка, инфицированная вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), иммуноконъюгат проявляет локальную противовирусную активность.

При использовании в настоящей работе термин “сайт связывания антигенов антитела” понимают как обозначающий, как минимум, один участок тяжелой цепи иммуноглобулина, например вариабельную область иммуноглобулина, способный присоединять предварительно выбранный тип клеток. Сайт связывания антигенов антитела также предпочтительно включает, как минимум, один участок константной области иммуноглобулина, включающий, например, СН1 домен, СН2 домен и, факультативно, СН3 домен. Кроме того, тяжелая цепь иммуноглобулина может быть соединена либо ковалентно, либо не ковалентно с легкой цепью иммуноглобулина, включающей, например, вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина и, факультативно, константную область легкой цепи. Соответственно, предполагается, что сайт связывания антигена антитела может включать интактное антитело или его фрагмент, способные присоединять предварительно выбранный тип клеток.

Что касается иммуноконъюгата, то предполагается, что фрагмент антитела может быть присоединен к цитокину различными способами, хорошо известными специалистам в данной области техники. Например, в искусственно полученном слитом белке сайт связывания антигена антитела предпочтительно присоединен к цитокину посредством пептидной связи. Альтернативно, сайт связывания антигена антитела можно химически присоединить к цитокину с помощью реакционноспособных групп, например, сульфгидрильных групп, в пределах боковых цепей аминокислот, присутствующих в сайте связывания антигенов антитела и цитокине.

При использовании в настоящей работе термин “цитокин” понимают как обозначающий любой белок или пептид, их аналог или функциональный фрагмент, который способен стимулировать или вызывать у млекопитающих цитоцидный иммунный ответ, направленный против предварительно выбранного типа клеток, например раковых клеток или инфицированных вирусом клеток. Соответственно, предполагается, что в иммуноконъюгаты согласно настоящему изобретению можно включать различные цитокины. Пригодные для этой цели цитокины включают, например, факторы некроза опухолей, интерлейкины, лимфокины, колониестимулирующие факторы, интерфероны, включая видовые варианты и усеченные аналоги, которые способны стимулировать или вызывать такие цитоцидные иммунные ответы. Подходящие факторы некроза опухолей включают, например, ФНО . Подходящие лимфокины включают, например, ЛТ. Подходящие колониестимулирующие факторы включают, например, ГМ-КСФ и М-КСФ. Подходящие интерлейкины включают, например, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-7, ИЛ-12, ИЛ-15 и ИЛ-18. Подходящие интерфероны включают, например, ИФН- , ИФН- и ИФН- .

Гены, кодирующие отдельные цитокины, представляющие интерес, можно клонировать de novo, получить из стандартных источников или синтезировать посредством стандартного синтеза ДНК из известных последовательностей нуклеотидов. Например, известна ДНК-последовательность ЛТ (см., например, Nedwin et al. (1985) NUCLEIC ACID RES. 13:6361), а также последовательности ИЛ-2 (см., например, Taniguchi et al. (1983) NATURE 302:305-318), ГМ-КСФ (см., например, Gasson et al. (1984) SCIENCE 266:1339-1342) и ФНО (см., например, Nedwin et al. (1985) NUCLEIC ACID RES. 13:6361).

В предпочтительном примере осуществления изобретения иммуноконъюгаты представляют собой рекомбинантные слитые белки, полученные с помощью обычных методик получения рекомбинантных ДНК, то есть путем формирования искусственной нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный иммуноконъюгат. Конструирование рекомбинантных белков, слитых из антитела и цитокина, было описано в прототипах. См., например, Gillies et al. (1992) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89:1428-1432; Gillies et al. (1998) J. IMMUNOL. 160:6195-6203; и Патент США №5,650,150. Предпочтительно искусственный ген, кодирующий иммуноконъюгат согласно настоящему изобретению, включает, в направлении от 5’ к 3’-концу, сегмент ДНК, кодирующий домен вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, сегмент ДНК, кодирующий константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, и ДНК, кодирующую цитокин. Слитый ген соединяют с вектором экспрессии или внедряют в него для трансфекции соответствующей клетки-реципиента, где слитый ген экспрессируется. Гибридную полипептидную цепь предпочтительно соединяют с легкой цепью иммуноглобулина, так что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина (V_н) и вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина (V_L) объединяются с образованием одного законченного сайта связывания предварительно выбранного антигена. В предпочтительном примере осуществления изобретения тяжелая и легкая цепи иммуноглобулина соединены ковалентно, например, посредством межцепочечной дисульфидной связи. Кроме того, две тяжелых цепи иммуноглобулина, одна или обе из которых слиты с цитокином, могут быть ковалентно связаны, например, посредством одной или нескольких межцепочечных дисульфидных связей.

Фиг.1 представляет собой схематическое изображение типичного иммуноконъюгата (10). В этом примере осуществления изобретения молекулы цитокинов (2 и 4) присоединены пептидной связью к карбоксильным концам (6 и 8) СН3-областей (10 и 12) тяжелых цепей антител (14 и 16). _L-области (26 и 28) изображены спаренными с V_н-областями (18 и 20) в типичной конфигурации IgG, образуя таким образом два сайта связывания антигена (30 и 32) на аминотерминальных концах иммуноконъюгата (10) и два сайта связывания с рецепторами цитокина (40 и 42) на карбокси-концах иммуноконъюгата (10). Конечно, в широком смысле, нет необходимости спаривать иммуноконъюгаты, как это показано на чертеже, или к молекуле цитокина может потребоваться присоединить только одну из двух тяжелых цепей иммуноглобулина.

Иммуноконъюгаты согласно настоящему изобретению могут считаться химерными на основании двух особенностей их структуры. Во-первых, иммуноконъюгат является химерным, так как он включает тяжелую цепь иммуноглобулина, обладающую специфичностью связывания антигена, соединенную с определенным цитокином. Во-вторых, иммуноконъюгат согласно настоящему изобретению может быть химерным в том смысле, что он включает вариабельную область иммуноглобулина (V) и константную область иммуноглобулина (С), полученные из различных антител, так что образующийся в результате белок является химерой V/C. Например, вариабельная и константная области могут быть получены из существующих в природе молекул антител, которые можно выделить из различных видов животных. См., например, Патент США №4,816,567. Также сюда относятся конструкции, в которых либо одна, либо обе вариабельные области иммуноглобулина содержат последовательности каркасной области (КО) и последовательности области, определяющей комплементарность (ООК), полученные от различных видов животных. Такие конструкции описаны, например, в работах Jones et al. (1986) NATURE 321:522-525, Verhoyen et al. (1988) SCIENCE 239:1534-1535 и Патентах США №№5,225,539 и 5,585,089. Кроме того, предполагается, что последовательности вариабельной области могут быть получены при скрининге библиотек, например библиотек фагов, с целью поиска последовательностей вариабельной области, которые присоединяют предварительно выбранный антиген с желаемой аффинностью. Способы получения и скрининга библиотек фагов описаны, например, в работах Huse et al. (1989) SCIENCE 246:1275-1281 и Kang et al. (1991) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 88:11120-11123.

Домены константной области тяжелой цепи иммуноглобулина для иммуноконъюгатов могут быть выбраны из любого из пяти классов иммуноглобулинов, обозначаемых как IgA (Ig ), IgD (Ig ), IgE (Ig ), IgG (Ig ) и IgM (Ig ). Однако предпочтительны константные области тяжелой цепи иммуноглобулина из класса IgG. Кроме того, предполагается, что тяжелые цепи иммуноглобулина могут быть получены из любого подкласса антител IgG, обозначаемых в данной области техники как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Как известно, каждая константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит четыре или пять доменов. Домены называются последовательно как: СН1-шарнир-СН2-СН3-(-СН4). СН4 присутствует в IgM, который не имеет шарнирной области. ДНК-последовательности доменов тяжелой цепи обладают перекрестной гомологией для разных классов иммуноглобулинов, например СН2 домен IgG гомологичен СН2 домену IgA или IgD и СН3 домену IgM и IgE. Легкие цепи иммуноглобулинов могут включать либо каппа ( ), либо лямбда ( ) константные области. Последовательности и расположение последовательностей этих областей иммуноглобулинов хорошо известны в данной области техники (см., например, Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (“Последовательности белков, представляющих иммунологический интерес”), U.S.Department of Health and Human Services, third edition 1983, fourth edition 1987, Huck et al. (1986) NUC. ACIDS RES. 14:1779-1789).

В предпочтительных примерах осуществления изобретения вариабельную область получают из антитела, специфического для предварительно выбранного антигена клеточной поверхности (антиген, ассоциированный с больной клеткой, такой как раковая клетка или клетка, инфицированная вирусом), а константная область включает СН1 и СН2 (и, факультативно, СН3) домены из антитела, которое представляет собой то же антитело, которое является источником вариабельной области, или отличается от него. В практике осуществления настоящего изобретения участок иммуноконъюгата, представляющий собой антитело, предпочтительно является неиммуногенным или является слабо иммуногенным для намеченного реципиента. Соответственно, участок, представляющий собой антитело, предпочтительно, насколько это возможно, получают от того же вида, что и намеченный реципиент. Например, если иммуноконъюгат должен вводиться человеку, домены константной области предпочтительно должны иметь происхождение от человека. См., например, Патент США №4,816,567. Кроме того, если вариабельная область иммуноглобулина получена от другого вида, нежели намеченный реципиент, например, если последовательности вариабельной области происходят от мыши, а намеченным реципиентом является человек, тогда вариабельная область предпочтительно должна включать КО-последовательности человека, а ООК-последовательности мыши располагают между КО-последовательностями с целью создания химерной вариабельной области, которая обладает специфичностью связывания с предварительно выбранным антигеном, но минимальной иммунореактивностью у намеченного реципиента. Конструкция и синтез таких химерных вариабельных областей описаны в работах Jones et al. (1986) NATURE 321:522-525, Verhoyen et al. (1988) SCIENCE 239:1534-1535 и Патентах США №№5,225,539 и 5,585,089. Клонирование и экспрессия гуманизированного белка, слитого из антитела и цитокина, а именно слитого белка КS-1/4 антитело к ЕрСАМ - IL-12, а также его способность уничтожать подтвержденные метастазы карциномы ободочной кишки были описаны в работе Gillies et al. (1998) J. IMMUNOL 160:6195-6203.

Ген, кодирующий цитокин, присоединяют либо непосредственно, либо с помощью линкера, например посредством ДНК, кодирующей линкер (Gl ₄-Sеr)₃, присоединенный к 3’-концу гена, кодирующего константную область иммуноглобулина (например, СН2 или СН3 экзон). В некоторых примерах осуществления изобретения линкер может включать последовательность нуклеотидов, кодирующую сайт протеолитического расщепления. Этот сайт, будучи расположен между константной областью иммуноглобулина и цитокином, может быть предназначен для обеспечения протеолитического высвобождения цитокина в месте назначения. Например, хорошо известно, что плазмин и трипсин производят расщепление после остатков лизина и аргинина на сайтах, доступных для протеаз. Многие другие сайт-специфические эндопротеазы и аминокислотные последовательности, которые они расщепляют, хорошо известны в данной области техники. Предпочтительные сайты протеолитического расщепления и протеолитические ферменты, которые действуют на эти сайты расщепления, описаны в Патентах США №№5,541,087 и 5,726,044.

Искусственная нуклеиновая кислота может включать эндогенный промотор и энхансер для гена, кодирующего вариабельную область, для регулирования экспрессии химерной цепи иммуноглобулина. Например, гены, кодирующие вариабельную область, могут быть получены из фрагментов ДНК, включающих лидерный пептид, VJ ген (функционально преобразованные вариабельные (V) области с соединительным (J) сегментом) для легкой цепи или VDJ-ген для тяжелой цепи, а также эндогенные промотор и энхансер для этих генов. Альтернативно, ген, кодирующий вариабельную область, может быть получен без эндогенных регуляторных элементов, а использоваться в экспрессирующем векторе, который предусматривает эти элементы.

Гены вариабельных областей можно получить при помощи стандартных процедур клонирования ДНК из клеток, которые продуцируют желаемые антитела. Скрининг геномной библиотеки на предмет поиска специфической, функционально преобразованной вариабельной области можно осуществить с использованием соответствующих пробных ДНК, таких как сегменты ДНК, содержащие ДНК последовательность J области и нижележащие последовательности. Идентификацию и подтверждение идентичности правильных клонов осуществляют путем секвенирования клонированных генов и сравнения последовательности с соответствующей последовательностью полномерной, соответствующим образом соединенной мРНК.

Целевой антиген может быть поверхностным антигеном опухолевой или раковой клетки, клетки, инфицированной вирусом или другой больной клетки. Гены, кодирующие соответствующие вариабельные области, как правило, можно получить от иммуноглобулинпродуцирующих линий лимфоидных клеток. Например, гибридомные клеточные линии, продуцирующие иммуноглобулин, специфический для антигенов, связанных с опухолями, или вирусных антигенов, могут быть получены с помощью стандартных методик гибридизации соматических клеток, хорошо известных в данной области техники (см., например, Патент США №4,196,265). Эти иммуноглобулинпродуцирующие клеточные линии являются источником генов вариабельной области в функционально преобразованной форме. Гены вариабельной области обычно будут иметь происхождение от мышей, поскольку эта система мыши приспосабливается к производству очень разнообразных иммуноглобулинов с желаемой специфичностью. Кроме того, последовательности вариабельной области могут быть получены с помощью скрининга библиотек, например библиотек фагов, с целью поиска последовательностей вариабельной области, которые связывают предварительно выбранный антиген с желаемой аффинностью. Способы получения и скрининга библиотек фагов описаны, например, в работах Huse et al. (1989) SCIENCE 246:1275-1281 и Kang et al. (1991) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 88:11120-11123.

Фрагмент ДНК, кодирующий ген, содержащий функционально активную вариабельную область, присоединяют к фрагменту ДНК, содержащему ген, кодирующий желаемую константную область (или ее участок). Константные области иммуноглобулина (тяжелую и легкую цепи) можно получить из клеток, продуцирующих антитело, с использованием стандартных способов клонирования генов. Гены двух классов легких цепей человека ( и ) и пяти классов тяжелых цепей человека ( , , , и ) были клонированы, и поэтому константные области, имеющие происхождение от человека, легко можно получить из этих клонов.

Слитые гены, кодирующие гибридную тяжелую цепь иммуноглобулина, присоединяют или вставляют в экспрессирующий вектор для введения в клетку-реципиент. Внедрение генной конструкции в плазмидные векторы можно осуществить с помощью стандартных процедур сплайсинга генов. Химерную тяжелую цепь иммуноглобулина можно совместно экспрессировать в одной и той же клетке с соответствующей легкой цепью иммуноглобулина, так что одновременно может экспрессироваться и собираться полный иммуноглобулин. С этой целью конструкции тяжелой и легкой цепей можно поместить в один и тот же вектор или в раздельные векторы.

Линии клеток-реципиентов обычно являются лимфоидными клетками. Предпочтительной клеткой-реципиентом является миеломная (или гибридомная) клетка. Миеломы могут синтезировать, собирать и секретировать иммуноглобулины, кодируемые трансфицированными генами, и они могут гликозилировать белки. Особо предпочтительные реципиенты или клетки-хозяева включают клетки миеломы Sp2/0, которые в норме не продуцируют эндогенного иммуноглобулина, и клетки миеломы мыши NS/0. Будучи трансфицированной, клетка продуцирует только иммуноглобулин, кодируемый трансфицированными генными конструкциями.

Трансфицированные клетки миеломы могут расти в культуре или в брюшине мышей, при этом секретируемый иммуноконъюгат можно выделить из асцитной жидкости. В качестве клеток-реципиентов можно использовать другие лимфоидные клетки, такие как В-лимфоциты.

Существует несколько способов трансфекции лимфоидных клеток векторами, содержащими искусственные нуклеиновые кислоты, кодирующие химерную цепь иммуноглобулина. Например, векторы могут быть внедрены в лимфоидные клетки путем слияния со сферопластами (см., например, Gillies et al. (1989) BIOTECHNOL. 7:798-804). Другие подходящие способы включают электропорацию или преципитацию в фосфате кальция (см., например, Sambrook et al. eds. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (“Клонирование молекул:

Лабораторное руководство”), Cold Spring Harbor Press).

Другие способы, пригодные для получения иммуноконъюгатов, включают получение РНК-последовательности, кодирующей конструкцию, и ее трансляцию в соответствующей экспрессирующей системе in vivo или in vitro. Подразумевается, что методологии получения рекомбинантных ДНК для синтеза генов, кодирующих белки, слитые из антитела и цитокина, внедрения генов в клетку-хозяина, экспрессии генов в клетке-хозяине и накопления образующегося в результате этого слитого белка хорошо известны и подробно описаны в данной области техники. Специфические протоколы описаны, например, в работе Sambrook et al. eds. (198