Модифицирование экспрессии гена fsh с помощью гомологичной рекомбинации

Модифицирование экспрессии гена fsh с помощью гомологичной рекомбинации

Реферат

 

Изобретение относится к области молекулярной генетики. Сущность изобретения состоит в том, что представлена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая гибридизует в жестких условиях или проявляет 80%-ный уровень идентичности с определенным геномным участком, расположенным выше кодирующего сегмента гена FSH, а также ДНК-конструкция, включающая эту молекулу нуклеиновой кислоты в качестве последовательности, являющейся направляющей последовательностью для обеспечения гомологичной рекомбинации. Технический результат - расширение арсенала генетических терапевтических средств. 8 с. и 10 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 табл.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается геномной ДНК.

Предпосылки для изобретения

Современные подходы к лечению заболеваний, основанные на применении белков, обладающих лечебными свойствами, включают как прямое введение таких белков, выработанных in vitro, так и генотерапевтические методы. В принципе, выработка белка in vitro включает внесение экзогенной ДНК, кодирующей представляющий интерес белок, в подходящие культивируемые клетки-хозяева. С другой стороны, методы генотерапии включают введение пациенту генетически модифицированных клеток, плазмид или вирусов, которые включают последовательность, кодирующую конкретный интересующий терапевтический белок.

Некоторые терапевтические белки также могут быть выработаны в результате изменения экспрессии кодирующих их эндогенных генов желательным образом с помощью методов “направления генов”: см., например, патенты США №№5641670, 5733761 и 5272071 и международные патентные заявки WO 91/06666, WO 91/06667 и WO 90/11354; их полное содержание включено здесь для сведения в виде библиографических ссылок.

Резюме изобретения

Настоящее изобретение основывается на идентификации и секвенировании участка геномной ДНК, расположенного с 5’-стороны от кодирующей последовательности гена фолликулостимулирующего гормона- (“FSH”) человека. Эта ДНК может быть использована, например, в составе ДНК-конструкции, которая изменяет (например, интенсифицирует) экспрессию эндогенного гена FSH в клетке млекопитающего за счет встраивания в состав генома этой клетки по механизму гомологичной рекомбинации. Термин “эндогенный ген FSH” обозначает геномную (т.е. хромосомную) копию гена, который кодирует белок FSH. Такая конструкция включает “направляющую” (“метящую”) последовательность, составленную заявляемой 5’-некодирующей последовательностью или производной от нее, а также последовательность, регулирующую транскрипцию. Последовательность, регулирующая транскрипцию, предпочтительно отличается по своей нуклеотидной последовательности от транскрипционной регуляторной последовательности эндогенного гена FSH. Направляющая последовательность обеспечивает встраивание регуляторной последовательности в участок в пределах кодирующей последовательности гена-мишени FSH или выше ее таким образом, что эта регуляторная последовательность оказывается функциональной присоединенной к эндогенной кодирующей последовательности. Термин “функционально присоединенный” обозначает то, что регуляторная последовательность способна обеспечивать экспрессию кодирующей последовательности эндогенного гена, кодирующего FSH. Дополнительно данная конструкция может включать ген селективного маркера, что облегчает отбор клеток, которые несут стабильно встроенную конструкцию, и (или) иную кодирующую последовательность, функциональным образом соединенную с промотором.

В одном варианте данная ДНК-конструкция включает: (а) направляющую последовательность; (b) регуляторную последовательность; (с) экзон; (d) донорный сайт сплайсинга. Направляющая последовательность обеспечивает встраивание ее самой и элементов (b)-(d) в участок, находящийся в пределах кодирующей последовательности гена-мишени FSH или выше ее. После такого встраивания элемент (b) может обеспечивать транскрипцию элементов (с) и (d) и всех остальных нижерасположенных кодирующих последовательностей эндогенного гена. В данной конструкции экзон обычно находится с 3’-стороны от регуляторной последовательности, а донорный сайт сплайсинга находится с 3’-стороны данного экзона.

В другом варианте ДНК-конструкция включает: (а) направляющую последовательность; (b) регуляторную последовательность; (с) экзон; (d) донорный сайт сплайсинга; (е) интрон; (f) акцепторный сайт сплайсинга, при том, что направляющая последовательность обеспечивает встраивание ее самой и элементов (b)-(f) таким образом, чтобы элементы (b)-(f) располагались в пределах данного эндогенного гена или выше его. После этого регуляторная последовательность обеспечивает образование транскрипта, который включает не только элементы (c)-(f), но также и кодирующую последовательность эндогенного гена FSH. Предпочтительно интрон и акцепторный сайт сплайсинга в составе данной конструкции расположены ниже донорного сайта сплайсинга.

Направляющая последовательность гомологична заранее выбранному сайту-мишени в геноме, по которому происходит гомологичная рекомбинация. Она включает по крайней мере 20 (например, по крайней мере 30, 50, 100 или 1000) подряд расположенных нуклеотидов из состава SEQ ID NO 4, что соответствует нуклеотидам [-7454]-[-1417] геномной последовательности FSH человека (нумерация по отношению к старт-кодону), или из состава SEQ ID NO 5, что соответствует нуклеотидам [-696]-[-155] геномной последовательности FSH человека. Термин “гомологичная” указывает на то, что направляющая последовательность идентична или в существенной степени сходна со своим геномным сайтом-мишенью на таком уровне, что направляющая последовательность и сайт-мишень могут претерпевать гомологичную рекомбинацию в клетке человека. Допустим небольшой процент несоответствий нуклеотидов, лишь бы гомологичная рекомбинация протекала с необходимой частотой. Для облегчения гомологичной рекомбинации длина направляющей последовательности предпочтительно составляет примерно по крайней мере 20 (например, по крайней мере 50, 100, 250, 400 или 1000) пар нуклеотидов (“п.н.”). Также направляющая последовательность может включать геномные последовательности из участков, находящихся за пределами последовательностей SEQ ID NO 4 или 5, лишь бы они включали по крайней мере 20 нуклеотидов из пределов одного из этих двух участков. Например, дополнительная направляющая последовательность может быть производной от последовательности, находящейся между SEQ ID NO 4 и сайтом инициации транскрипции гена FSH.

Из-за возможного полиморфизма в геномном локусе гена FSH небольшие изменения в нуклеотидном составе по данному геномному сайту-мишени могут иметь место у любого данного вида млекопитающего. Направляющие последовательности, которые соответствуют таким полиморфным вариантам последовательностей SEQ ID NO 4 или 5 (в частности, полиморфным вариантам, встречающимся у человека), попадают в объем настоящего изобретения.

В результате гомологичной рекомбинации регуляторная последовательность данной конструкции встраивается в заданный участок выше кодирующей последовательности гена FSH в хромосоме клетки. Полученный в результате новый транскриптон, включающий производную от конструкции регуляторную последовательность, изменяет экспрессию гена-мишени FSH. Вырабатываемый в результате белок FSH может быть идентичен по своей последовательности белку FSH, кодируемому неизмененным эндогенным геном, или же он может включать добавочные, замененные или сокращенные аминокислотные остатки по сравнению с белком FSH дикого типа, что обусловливается изменениями, внесенными в процессе гомологичной рекомбинации.

Изменение экспрессии гена включает в себя и активацию (т.е. побуждение к экспрессии) гена, который в норме является “молчащим” (т.е. по существу неэкспрессирован) в данной исходно полученной клетке, повышение или снижение уровня экспрессии гена и изменение параметров регуляции гена так, что в результате эти параметры отличаются от тех, которые имеются в исходно полученной клетке. Термин “исходно полученная клетка” обозначает клетку до прохождения гомологичной рекомбинации в ней.

Также в объем настоящего изобретения входит способ использования представляемой ДНК-конструкции, нацеленный на изменение экспрессии эндогенного гена FSH в клетке млекопитающего. Этот способ включает следующие этапы: (1) внесение ДНК-конструкции в клетку млекопитающего; (2) содержание клетки в условиях, которые способствуют гомологичной рекомбинации между данной конструкцией и геномным сайтом-мишенью, гомологичным данной направляющей последовательности, с образованием гомологично рекомбинантной клетки; (3) поддержание гомологично рекомбинантной клетки в условиях, которые способствуют экспрессии кодирующей последовательности FSH под контролем регуляторной последовательности, происходящей от данной конструкции. По крайней мере отчасти геномный сайт-мишень расположен с 5’-стороны от кодирующей последовательности эндогенного гена FSH. Следовательно, такой геномный сайт-мишень может включать кодирующую последовательность, равно как и 5’-некодирующую последовательность.

Также настоящее изобретение представляет трансфицированные или инфицированные клетки, в которых конструкция претерпела гомологичную рекомбинацию с геномной ДНК, находящейся выше эндогенного старт-кодона ATG одного или обоих аллелей эндогенного гена FSН. Такие трансфицированные или инфицированные клетки, также определяемые как претерпевшие гомологичную рекомбинацию клетки, характеризуются измененными параметрами экспрессии FSH. Эти клетки, особенно, применимы для выработки FSH in vitro и для доставки FSH методами генотерапии. Способы получения и применения таких клеток также охватываются настоящим изобретением. Такие клетки могут происходить от позвоночного животного, такого как млекопитающее (например, человек, не являющийся человеком примат, корова, свинья, лошадь, коза, овца, домашняя кошка, домашняя собака, кролик, мышь, морская свинка, хомячок или крыса).

Далее настоящее изобретение представляет способ получения белка FSH млекопитающего in vitro или in vivo путем внесения описанной выше конструкции в геном клетки-хозяина по механизму гомологичной рекомбинации. Затем претерпевшую гомологичную рекомбинацию клетку выдерживают в условиях, которые способствуют транскрипции, трансляции и, что необязательно, секреции белка FSH.

Также настоящее изобретение представляет выделенные нуклеиновые кислоты, включающие последовательность длиной по крайней мере 20 (например, по крайней мере 30, 50, 100, 200 или 1000) расположенных подряд нуклеотидов из состава SEQ ID NO 4 или по крайней мере 20 (например, по крайней мере 30, 50, 100 или 200) расположенных подряд нуклеотидов из состава SEQ ID NO 5, или сходного размера последовательность, идентичную участку SEQ ID NO 4 или 5, за исключением полиморфных вариаций или других небольших изменений (например, менее чем по 5% этой последовательности), которые не предотвращают гомологичной рекомбинации с последовательностью-мишенью.

В одном из вариантов выделенная нуклеиновая кислота по настоящему изобретению включает непрерывный 100-нуклеотидный блок из последовательности SEQ ID NO 4 или 5. Например, выделенная ДНК может включать нуклеотиды 1-100, 101-200, 201-300, 301-400, 401-500, 501-600, 601-700, 701-800, 801-900, 901-1000, 1001-1100, 1101-1200, 1201-1300, 1301-1400, 1401-1500, 1501-1600, 1601-1700, 1701-1800, 1801-1900, 1901-2000, 2001-2100, 2101-2200, 2201-2300, 2301-2400, 2401-2500, 2501-2600, 2601-2700, 2701-2800, 2801-2900, 2901-3000, 3001-3100, 3101-3200, 3201-3300, 3301-3400, 3401-3500, 3501-3600, 3601-3700, 3701-3800, 3801-3900, 3901-4000, 4001-4100, 4101-4200, 4201-4300, 4301-4400, 4401-4500, 4501-4600, 4601-4700, 4701-4800, 4801-4900, 4901-5000, 5001-5100, 5101-5200, 5201-5300, 5300-5400, 5401-5500, 5501-5600, 5601-5700, 5701-5800, 5801-5900, 5901-6000 или 5939-6038 из последовательности SEQ ID NO 4 или ее комплемента. С другой стороны, выделенная нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может включать нуклеотиды 1-100, 101-200, 201-300, 301-400, 401-500 или 443-542 из последовательности SEQ ID NO 5. Эти блоки SEQ ID NO 4 или 5 или их комплементы применимы в качестве направляющих последовательностей в составе конструкций по настоящему изобретению.

В выделенной ДНК непрерывная нуклеотидная последовательность не связана с последовательностью, кодирующей полноразмерный FSH, или по крайней мере не связана в той же конфигурации (т.е. отделена такой же последовательностью), как в любом из нативных геномов. Таким образом, по использованию в данном тексте термин “выделенная ДНК” не обозначает хромосому или крупный фрагмент геномной ДНК (которая должна включаться в состав космиды или искусственной хромосомы дрожжей), который бы включал не только часть или полную последовательность SEQ ID NO 4 или 5, но также и интактную кодирующую последовательность FSH и все последовательности, которые находятся между кодирующей последовательностью FSH и последовательностью, соответствующей SEQ ID NO 4 или 5 в соответствии с расположением их в геноме клетки. Она включает, тем самым не ограничиваясь, ДНК, (i) которая встроена в плазмиду или вирус; или (ii) которая существует в виде отдельной молекулы, независимой от других последовательностей, например в виде фрагмента, полученного в методе полимеразной цепной реакции (“ПЦР”) или в результате расщепления рестриктазами. Предпочтительно выделенная ДНК не включает последовательность, которая кодирует интактный предшественник FSH (т.е. FSH с включением эндогенного сигнального сегмента, обеспечивающего секрецию).

Также настоящее изобретение представляет выделенную ДНК, включающую цепь, в составе которой имеется последовательность, которая включает по крайней мере 100 (например, по крайней мере 200, 400 или 1000) нуклеотидов и которая гибридизует либо в жестких условиях, либо в условиях средней степени жесткости с последовательностью SEQ ID NO 4 или 5 или с комплементом SEQ ID NO 4 или 5. Эта последовательность не связана с кодирующей последовательностью FSH или по крайней мере не связана в той конфигурации, которая имеет место в естественном геноме. Под условиями средней степени жесткости понимается проведение гибридизации при 50С в буфере Черча (7% SDS, 0,5% NaHPO₄, 1 M EDTA, 1% бычьего сывороточного альбумина) и промывки при 50С в буфере 2SSC. Высокая степень жесткости соответствует гибридизации при 42С в присутствии 50% формамида, первой промывке при 65С в 2SSC, содержащем 1% SDS, и последующей второй промывке при 65С в 0,1SSC.

Также настоящим изобретением представляется выделенная ДНК, включающая цепь, в составе которой находится последовательность, которая (i) состоит по крайней мере из 100 (например, по крайней мере 200, 400 или 1000) нуклеотидов и (ii) проявляет по крайней мере 80%-ный уровень идентичности последовательности (например, 85%, 90%, 95% или 98%) с сегментом равной длины из последовательности SEQ ID NO 4 или 5 или комплемента SEQ ID NO 4 или 5. Эта последовательность не связана с кодирующей последовательностью гена FSH или по крайней мере не связана с ней в той же конфигурации, которая имеет место в любом нативном геноме.

Когда о конкретном полипептиде или молекуле нуклеиновой кислоты говорят, что она характеризуется определенным процентом идентичности или консерватизма по отношению к сравниваемому полипептиду или молекуле нуклеиновой кислоты, то такой процент идентичности или консерватизма определяют на основании алгоритма, предложенного Майерсом-Миллером (Myers & Miller, 1989, CABIOS), который встроен в программу ALIGN (версия 2.0) или в ее аналог, при том что величины штрафных баллов за точечный разрыв и разрыв последовательности по необходимости их использования установлены на уровне 4 и 12 соответственно. Все остальные параметры программы использованы по умолчанию. Программа ALIGN доступна из Интернета по адресу, например: http://www2.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi.

Также настоящее изобретение представляет способ введения животному FSH (например, млекопитающему, такому как человек, не являющийся человеком примат, корова, свинья, лошадь, коза, овца, домашняя кошка, домашняя собака, кролик, мышь, морская свинка, хомячок или крыса) путем получения клетки, у которой эндогенный ген FSH активирован в соответствии с описанным в данном тексте, с последующим имплантированием этой клетки данному животному, в организме которого данная клетка секретирует FSH. Также настоящим изобретением представляется способ выработки FSH путем получения клетки, у которой эндогенный ген FSH был активирован в соответствии с описанным в данном тексте, с последующим культивированием этой клетки in vitro в условиях, способствующих экспрессии и секреции FSH этой клеткой.

Выделенная ДНК по настоящему изобретению может быть использована, например, в качестве источника для прямой ПЦР-затравки с целью получения (путем сочетания с подходящей обратной затравкой) регуляторных и (или) кодирующих сегментов эндогенного гена FSH или в качестве гибридизационного зонда для указания на присутствие хромосомы 11 на препарате хромосом человека. Она также может быть использована в соответствии с описанным здесь далее в способе изменения экспрессии эндогенного гена FSH в клетке позвоночного животного.

За исключением специально оговариваемых случаев, все используемые в данном тексте методические и научные термины имеют те же значения, которые известны специалистам в той области техники, к которой относится настоящее изобретение. Ниже описаны методы и материалы, которые были взяты в качестве примеров, хотя методы и материалы, сходные или эквивалентные тем, что описаны в данной заявке, также могут быть использованы на практике осуществления или проверки настоящего изобретения. Все научные публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упоминающиеся здесь, включены во всей своей полноте только для сведения в виде библиографии. При возникновении каких-либо конфликтов настоящая заявка, включая терминологию, подлежит урегулированию. Упомянутые материалы, методы и примеры являются исключительно иллюстративными и не призваны ввести какие бы то ни было ограничения.

Другие параметры и преимущества настоящего изобретения будут ясны из нижеследующего подробного описания и прилагаемой формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 схематически изображена геномная структура гена FSH человека.

На фиг.2 схематически показан участок генома человека, в котором находится ген FSH (вверху), охватываемый вставкой (внизу) в составе плазмиды pHFB2. Три черные полосы в центре соответствуют геномным участкам данного гена, нуклеотидные последовательности которых опубликованы.

На фиг.3 представлена частичная нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO 1) гена FSH человека, включая 7454 нуклеотида последовательности, расположенной с 5’-стороны от старт-кодона ATG. Также показана частичная полипептидная последовательность (SEQ ID NO 2), кодируемая данной кодирующей последовательностью. Опубликованные последовательности подчеркнуты. Метками “SD” и “SА” обозначены, соответственно, донорный и акцепторный сайты сплайсинга. Знак “зрелый” указывает на начало зрелого (процессированного) белка FSH.

На фиг.4 схематически показана конструкция по настоящему изобретению. Эта конструкция включает первую направляющую последовательность (1); амплифицируемый маркерный ген (AM); селективный маркерный ген (SM); регуляторную последовательность; САР-сайт; последовательность, идентичную первому некодирующему экзону гена FSH человека; неспаренный донорный сайт сплайсинга (SD); вторую направляющую последовательность (2). Зачерненными участками показана кодирующая ДНК, а заштрихованными участками - нетранслируемые последовательности.

На фиг.5-7 схематически проиллюстрированы три конструкции по настоящему изобретению. Эти конструкции отличаются друг от друга по размеру 5’-нетранслируемого (5’-UTS) сегмента альдолазного гена, включаемого в состав плазмиды. Эти конструкции включают последовательность, кодирующую гликопротеиновую -субъединицу ФСГ (т.е. FSH), соединенную с промотором цитомегаловируса (CMV). На схеме использованы такие сокращенные обозначения: UTS - нетранслируемая последовательность; аmр - ампициллин; Ori - начало репликации; SD - донорный сайт сплайсинга; HSV ТК - ген тимидинкиназы простого герпесвируса; DHFR - дигидрофолатредуктаза; HBV - вирус гепатита-В; hGH - ген гормона роста человека.

На фиг.8 показана диаграмма, отражающая выработку FSH клетками НТ-1080, трансфицированными плазмидой pGA308 (фиг.5) и отобранными по способности расти в присутствии различных концентраций метотрексата.

На фиг.9 показана последовательность SEQ ID NO 4 -последовательность, находящаяся выше сайта инициации транскрипции гена FSH человека.

На фиг.10 показана последовательность SEQ ID NO 5 -последовательность, находящаяся выше сайта инициации транскрипции гена FSH человека.

На фиг.11 показана первая направляющая последовательность (SEQ ID NO 6), используемая в конструкции по настоящему изобретению.

На фиг.12 показана вторая направляющая последовательность (SEQ ID NO 5), используемая в конструкции по настоящему изобретению.

Подробное описание

Настоящее изобретение основано на открытии нуклеотидного состава последовательности, расположенной выше кодирующей последовательности гена FSH человека.

FSH (ФСГ) является гонадотропином, который играет ключевую роль в росте и развитии ооцитов и сперматоцитов при нормальных физиологических условиях воспроизводства. Гормон ФСГ состоит из двух субъединиц - и , причем вторая из них обеспечивает биологическую специфичность ФСГ.

Ген FSH человека кодирует белок-предшественник, состоящий из 129 аминокислот, из которых 16 аминокислот приходятся на сигнальный пептид. Данный ген составлен тремя экзонами и двумя интронами, причем первый экзон является некодирующим экзоном. Геномная карта гена FSH человека показана на фиг.1. Эта карта выстроена на основе опубликованных последовательностей (HUMFSHBQ1, депозитарные №№ в базе данных GenBank - М54912, М38644, М21219 и М18536), которые соответствуют трем отдельным сегментам генома (фиг.1). Первый сегмент состоит из 720 пар нуклеотидов - 503 п.н. нетранслируемой последовательности и 1-й экзон (63 п.н.; некодирующий) и 127 п.н. 1-го интрона. Второй сегмент начинается с нуклеотида [-152] и заканчивается нуклеотидом [+367] (все номера положений, используемые здесь, даны, за исключением специально оговариваемых случаев, по отношению к сайту инициации трансляции). Этот сегмент включает 146 п.н. 1-го интрона, весь 2-й экзон (165 п.н.) и 208 п.н. 2-го интрона. Третий сегмент включает 102 п.н. 2-го интрона и весь 3-й экзон, а также 1480 пар нуклеотидов после стоп-кодона.

Конкретные последовательности с 5’-стороны от кодирующей последовательности FSH и их использование для целей изменения экспрессии эндогенного гена FSH.

Для получения геномной ДНК, включающей последовательность вверх от гена FSH, скринингу с использованием 40-нуклеотидного зонда ВЕТА2 подвергали геномную библиотеку лейкоцитов человека, встроенную в ЕMBL2 (Clontech, № по каталогу HL1006d). Этот зонд является производным 23 п.н. 1-го экзона и 17 п.н. 1-го интрона и имеет следующую последовательность:

5’-TTGGCATCTACCGTTTTCAAGTGGTGACAGCTACTTTTGA-3’ (SEQ ID NO 3).

С использованием радиоактивно помеченного зонда ВЕТА2 были проскринированы примерно миллион рекомбинантных фагов. Была выделена одна фаговая бляшка, обозначенная 8-1-1-1. HindIII/KpnI-фрагмент длиной 7600 пар нуклеотидов из состава фага 8-1-1-1 был субклонирован в состав pBluescript-II-SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) с получением плазмиды, включающей примерно 6600 пар нуклеотидов верхней последовательности, 1-й экзон, 1-й интрон, 2-й экзон и 9 п.н. 2-го интрона (фиг.2). Эту плазмиду обозначили как pHFB2.

Плазмиду pHFB2 секвенировали по методу Сэйнджера. Путем сопоставления полученных данных секвенирования получили полную последовательность фаговой вставки 8-1-1-1. Эта нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO 1) показана на фиг.3.

Как было показано, эта вставка охватывает участок гена FSH длиной 7622 пары нуклеотидов, начиная с нуклеотида [-7454] (фиг.3). Последовательности, охватывающие нуклеотиды [-7454]-[-1417] (6038 п.н. верхней последовательности: SEQ ID NO 4), и нуклеотиды [-696]-[-155] (542 п.н. 1-го интрона: SEQ ID NO 5) ранее опубликованы не были.

Для изменения экспрессии эндогенного гена FSH был применен базовый подход, проиллюстрированный на фиг.4. Роль первой направляющей последовательности (5’) выполняли нуклеотиды 3860-5784 последовательности SEQ ID NO 4, в то время как второй направляющей последовательностью (3’) являлась последовательность SEQ ID NO 5. ДНК-фрагменты, включающие такие последовательности, затем субклонировали в состав плазмид с получением направляющих конструкций pGA308, pGA301 и pGA307, которые изображены на фиг.5-7 соответственно. Каждая из этих плазмид включает примерно по 3200 п.н. 5’-направляющей последовательности и примерно по 500 п.н. 3’-направляющей последовательности.

Клетки НТ-1080 были раздельно трансфицированы каждой из указанных плазмид и помещены в селективную среду с антибиотиком G418. Примерно через 2 недели подсчитывали резистентные к G418 колонии в 6-луночных планшетах. Кроме того, кондиционированную среду в каждой лунке тестировали методом ТИФА на экспрессию GA-FSH. Клетки, характеризующиеся выработкой GA-FSH, обрабатывали трипсином и подсчитывали. Затем эти клетки разбавляли и вносили на 96-луночные планшеты для формирования клонов. Примерно через 2 недели культивирования клональные клеточные популяции тестировали методом ТИФА на экспрессию GA-FSH. Колонии, для которых устанавливалась выработка GA-FSH, воспроизводили в культуре и запасали для дальнейшего анализа. В таблице обобщены данные по частотам активации эндогенного гена и другим наблюдениям по описанной выше процедуре клонирования.

Более подробно были исследованы клетки, трансфицированные плазмидой pGA308. На фиг.8 показан диапазон уровней выработки ФСГ, проявляемых клетками НТ1080, трансфицированными pGA308 и культивировавшимися в среде, содержащей метотрексат в различных концентрациях. Линия, помеченная как “0,2 (клонированная)”, соответствует выработке ФСГ клеточной линией, клонированной с помощью ограничивающего разведения клеток, резистентных к 0,2 мкМ метотрексата. Полученные результаты, отображенные на фиг.8, отчетливо указывают на то, что при более высоких концентрациях метотрексата можно выделить такие клеточные линии, которые вырабатывают по крайней мере 50 мкг ФСГ на миллион клеток в день.

Базовые методы

Изменение уровня экспрессии эндогенного гена FSH

С использованием описанных выше верхних последовательностей гена FSH можно изменять экспрессию эндогенного гена FSH человека с помощью способа, принцип которого был описан в патенте США №5641670. Одна из таких стратегий изображена на фиг.4. В этом случае направляющая конструкция создается таким образом, чтобы она включала первую направляющую последовательность, гомологичную первому сайту-мишени на участке выше данного гена, амплифицируемый маркерный ген, ген селективного маркера, регуляторный сегмент, САР-сайт, экзон, неспаренный донорный сайт сплайсинга и вторую направляющую последовательность, соответствующую второму сайту-мишени, находящемуся ниже первого сайта-мишени и заканчивающемуся в пределах кодирующей последовательности FSH или выше ее. В этом подходе первый и второй сайты-мишени до гомологичной рекомбинации непосредственно примыкают друг к другу на хромосоме, хотя такая конфигурация и не является обязательной (см. ниже). Претерпевшие гомологичную рекомбинацию клетки будут вырабатывать мРНК-предшественник, который соответствует экзогенным экзону и донорному сайту сплайсинга, а также всем последовательностям, находящимся между этим донорным сайтом сплайсинга и последовательностью терминации транскрипции гена FSH, включая интроны, экзоны и 3’-нетранслируемый сегмент гена FSH (фиг.4). В результате сплайсинга такой про-мРНК образуется мРНК, в которой экзогенный экзон слит со 2-м экзоном эндогенного гена FSH. В результате трансляции этой мРНК образуется предшественник FSH.

Также могут быть использованы и другие подходы. Например, первый и (или) второй сайты-мишени могут находиться в пределах первого интрона гена FSH. С другой стороны, ДНК-конструкция может быть сформирована таким образом, чтобы включать (в направлении от 5’ к 3’) первую направляющую последовательность, амплифицируемый маркерный ген, ген селективного маркера, регуляторный сегмент, САР-сайт, экзон, донорный сайт сплайсинга, интрон, акцепторный сайт сплайсинга и вторую направляющую последовательность. При таком подходе 5’-конец второго направляющего сайта предпочтительно расположен менее чем в 40 п.н. выше нативного сайта инициации транскрипции гена FSH, что имеет целью исключить нежелательные старт-кодоны ATG. После гомологичной рекомбинации в этом локусе образующаяся про-мРНК будет включать экзогенный экзон, экзогенный донорный сайт сплайсинга, экзогенный интрон, экзогенный акцепторный сайт сплайсинга и все последовательности, находящиеся между экзогенным акцепторным сайтом сплайсинга и сайтом терминации транскрипции эндогенного гена FSH. В результате сплайсинга такого транскрипта будет образовываться мРНК, которая может транслироваться с получением предшественника FSH человека, включающий либо нормальную сигнальную последовательность секреции FSH, либо генетически сконструированную сигнальную последовательность секреции. Размер экзогенного интрона, а следовательно, и положение экзогенного регуляторного сегмента по отношению к кодирующей последовательности эндогенного гена могут варьироваться с целью оптимизации функций этого регуляторного сегмента.

При любой стратегии активации нет необходимости в непосредственном примыкании или даже близком соседстве первого и второго сайтов-мишеней. Когда они не находятся в непосредственной близости друг от друга, участок нормального верхнего сегмента гена FSH и (или) участок кодирующего сегмента могут быть делегированы в процессе гомологичной рекомбинации.

Если желательно, продукт активированного гена FSH может быть получен в клетке такого типа, который характеризуется экспрессией гена, кодирующего гликопротеиновую -субъединицу человека ФСГ (FSH), продукт которой образует гетеродимер с продуктом гена FSH. Это может быть нативный клеточный штамм или клеточная линия. С другой стороны, ген гликопротеиновой -субъединицы человека (GenBank: последовательность № HUM-GLYCAl) может быть коэкспрессирована с продуктом гена FSH, при том что такая коэкспрессия достигается в результате экспрессии гена гликопротеиновой -субъединицы человека или кДНК под контролем подходящего промотора или путем активации гена гликопротеиновой -субъединицы человека с применением описанных в данной заявке способов.

В качестве примера последовательность, кодирующая гликопротеиновую -субъединицу, может быть включена в состав ДНК-конструкции. Эта кодирующая последовательность помещается под транскрипционный контроль, осуществляемый регуляторной последовательностью, нуклеотидный состав которой может быть идентичен регуляторной последовательности, которая обеспечивает экспрессию эндогенного гена FSH, или может отличаться от нее. На фиг.5-7 показаны примеры таких конструкций.

ДНК-конструкция

ДНК-конструкция по настоящему изобретению по крайней мере включает направляющую последовательность и регуляторную последовательность. Дополнительно она может включать экзон; или экзон и неспаренный донорный сайт сплайсинга; или экзон, донорный сайт сплайсинга, интрон и акцепторный сайт сплайсинга. Экзон, если он присутствует, расположен с 3’-стороны регуляторной последовательности, а неспаренный донорный сайт сплайсинга находится с 3’-стороны экзона. Интрон и акцепторный сайт сплайсинга, если они присутствуют, находятся с 3’-стороны донорного свита, сплайсинга. Кроме того, могут присутствовать множественные экзоны и интроны (с подходящими донорными и акцепторными сайтами), предвосхищающими (т.е. находящимися с 5’-конца от) экзон, фланкированный неспаренным донорным сайтом сплайсинга. ДНК в составе данной конструкции обозначают как “экзогенную”, т.е. эта ДНК не является исходной частью генома клетки-хозяина. Экзогенная ДНК может включать последовательности, идентичные частям эндогенной геномной ДНК, присутствующей в клетке перед трансфекцией, или инфекции вирусным вектором, или отличающиеся от них. По использованию в данном тексте термин “трансфекция” обозначает внесение плазмиды в клетку с помощью химических и физических способов, таких как совместная преципитация с фосфатом кальция или хлоридом кальция, трансфекция, опосредованная DEAE-декстраном, липофекция, электропорация, микроинъекция, стрельба микрочастицами или бомбардировка. По использованию в данном тексте термин “инфекция” обозначает внесение вирусной нуклеиновой кислоты в клетку путем заражения вирусом. Различные элементы, входящие в состав ДНК-конструкции по настоящему изобретению, подробно описаны далее.

ДНК-конструкция также может включать цис-активные или транс-активные вирусные последовательнос