Обнаружение имеющей отношение к заболеванию нуклеиновой кислоты

Обнаружение имеющей отношение к заболеванию нуклеиновой кислоты

Реферат

 

Изобретение относится к области медицинской генетики. Сущность изобретения состоит в способах получения информации о нуклеиновой кислоте, имеющей отношение к заболеванию, которое, в частности, может быть вызвано патогенным микроорганизмом, присутствующим в организме этого субъекта. Настоящее изобретение относится также к подложкам с иммобилизованными зондами, предназначенными для использования в указанных способах. В частности, настоящее изобретение относится к способам и подложкам с иммобилизованными зондами, предназначенным для получения информации о восприимчивости субъекта к лечению заболевания, вызванного патогенными микроорганизмами. Технический результат - расширение арсенала средств генной терапии. 6 с. и 27 з.п.ф-лы, 3 табл., 3 ил.

Область техники

Настоящее изобретение относится к способам получения информации о имеющей отношение к заболеванию нуклеиновой кислоте, выделяемой из организма субъекта. Данное изобретение относится к способам получения информации о нуклеиновой кислоте субъекта, в том числе о нуклеиновой кислоте, имеющей отношение к заболеванию, и нуклеиновой кислоте патогенного микроорганизма, вызывающего данное заболевание. Настоящее изобретение относится также к подложкам с иммобилизованными зондами, в частности к чипам с иммобилизованными зондами, предназначенным для использования при осуществлении указанных способов.

Предпосылки изобретения

Способы обнаружения генов при помощи ДНК-чипа описаны в публикациях Beattie et al., Clin. Chem. 39:719-22, Fodor et al., Science, 251, 767 (1991), Khrapko et al., FEBS Lett., 256, 118 (1989) и Southern et al., Nucleic Acids Res., 22, 1368 (1994). ДНК-чип представляет собой стеклянную или силиконовую подложку площадью в несколько квадратных сантиметров, на которой находится несколько иммобилизованных ДНК-зондов с разными последовательностями. ДНК-зонды, иммобилизованные на таком чипе, подвергают взаимодействию с испытуемой нуклеиновой кислотой, меченной таким маркером, как флуоресцентный пигмент или радиоизотоп (RI), или смесью немеченой испытуемой нуклеиновой кислоты и меченого олигонуклеотида. При наличии в пробе последовательности, комплементарной ДНК-зонду, иммобилизованному на чипе, метка, присоединенная к определенному месту на чипе, подает сигнал. Поэтому, если заранее известна последовательность и положение иммобилизованного ДНК-зонда, можно идентифицировать последовательность оснований, имеющуюся в испытуемой нуклеиновой кислоте (Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5022 (1994), Parinov et al., Nucleic Acids Res., 24, 2998 (1996).

Таким образом, взяв у субъекта пробу крови и экстрагировав из нее нуклеиновую кислоту, можно получить нуклеиновую кислоту, присущую данному субъекту. Если нуклеиновую кислоту, присущую указанному субъекту, далее подвергнуть генному анализу, можно получить информацию о конституционной предрасположенности данного субъекта, в частности о его подверженности какому-либо заболеванию, об эффективности лекарственного средства и/или возможных побочных эффектах. На основании полученных данных можно разработать схему лечения, специально предназначенную для данного субъекта. Схема лечения, учитывающая особенности конкретного субъекта, получила название "специализированной медицинской помощи".

В настоящее время по-прежнему существует необходимость в более точных и простых методах определения схемы медицинского лечения на основе пробы, взятой у пациента.

Все ссылки и публикации патентов, приведенные в данном описании изобретения, полностью включены в него в качестве ссылки.

Описание изобретения

Способ получения первичной информации о нуклеиновой кислоте отдельного субъекта, подверженного конкретному заболеванию, и вторичной информации о нуклеиновой кислоте патогенного микроорганизма, присутствующего в организме указанного субъекта и вызывающего конкретное заболевание, заключается в том, что:

(a) экстракт нуклеиновой кислоты субъекта подвергают взаимодействию с зондами, иммобилизованными на подложке, содержащей первый и второй зонды, причем первый зонд предназначен для обнаружения последовательности специфической нуклеиновой кислоты патогенного микроорганизма, вызывающего конкретное заболевание, и второй зонд предназначен для обнаружения специфической нуклеиновой кислоты указанного субъекта; и

(b) в результате выполнения реакции, описанной в пункте (а), получают первичную информацию о наличии нуклеиновой кислоты, связанной с первым зондом, если таковая имеется, и вторичную информацию о наличии нуклеиновой кислоты, связанной со вторым зондом, если таковая имеется.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 дано схематическое изображение ДНК-чипа по одному из вариантов осуществления настоящего изобретения.

На фиг.2 дано схематическое изображение ПНК-чипа по одному из вариантов осуществления настоящего изобретения.

На фиг.3 показана блок-схема способа по одному из вариантов осуществления настоящего изобретения.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к способам получения информации о нуклеиновой кислоте отдельного субъекта, подверженного какому-либо заболеванию. Субъект может находиться на ранней или поздней стадии данного заболевания. Кроме того, субъект уже может быть болен указанным заболеванием или может заболеть им в будущем.

Настоящее изобретение относится к корреляции информации о нуклеиновой кислоте субъекта и патогенного микроорганизма. В описываемых вариантах осуществления изобретения субъект подвержен заболеванию, вызываемому патогенным микроорганизмом, таким как, например, вирус, бактерия, дрожжи или микоплазма, в связи с этим настоящее изобретение относится к корреляции информации о нуклеиновой кислоте, выделенной из патогенного микроорганизма, присутствующего в организме субъекта, и информации о нуклеиновой кислоте, выделенной из организма субъекта.

Таким образом, одной целью настоящего изобретения являются способы получения информации о нуклеиновой кислоте, имеющей отношение к конкретному заболеванию субъекта, и, в частности, о нуклеиновой кислоте, которая определяет восприимчивость к лечению данного заболевания, а также информации о нуклеиновой кислоте, имеющей отношение к конкретному заболеванию, которую выделяют из патогенного микроорганизма, присутствующего в организме субъекта. Настоящее изобретение относится также к специфическим НК-зондам, используемым для идентификации нуклеиновой кислоты, выделенной из организма субъекта и патогенного микроорганизма. В некоторых вариантах осуществления изобретения НК-зонды иммобилизованы на подложке, такой как чип. Настоящее изобретение относится также к подложкам с иммобилизованными зондами, в частности к чипам с иммобилизованными зондами, предназначенным для использования при осуществлении указанных способов. В настоящем изобретении можно также использовать другие подложки, такие как устройство для капиллярного электрофореза ДНК, некоторые типы гранул, мембранная матрица, микротитрационный планшет, электрод, некоторые типы полупроводниковых устройств, некоторые типы волноводных материалов, а также резонанс поверхностного плазмона (SPR), кварцевые микровесы (QCV) и масс-спектроскопию. Кроме того, при осуществлении настоящего изобретения можно также использовать аллельспецифическую олигогибридизацию, методы рестрикции (диагональный гель-электрофорез на микротитрационной матрице), методы лигирования (фильтрующий зонд, анализ методом лигирования олигонуклеотидов, лигирование меченных красителем олигонуклеотидов), введение нуклеотидов (минисеквенирование, анализ методом терминации с направленным окрашиванием матрицы) и анализ методом инвазии. Можно также использовать другие общие методы гибридизации в растворе, позволяющие обнаружить нуклеиновую кислоту субъекта и патогенного микроорганизма, такие как метод амплификации (полимераэная реакция синтеза цепи (PCR), лигазная реакция синтеза цепи (LCR), амплификация на основе последовательности нуклеиновой кислоты (NASBA), амплификация с замещением цепи (SDA), изотермическая амплификация в петле (LAMP), изотермическая и инициируемая химерной затравкой амплификация нуклеиновых кислот (ICAN), разветвленная ДНК).

Отбираемые у субъекта пробы, содержащие нуклеиновую кислоту, включают цельную кровь, кровь, сыворотку, лейкоциты, мочу, фекалии, сперму, слюну, биоптат, культивированные клетки и мокроту. Предпочтительной анализируемой пробой является кровь. Взятая проба предпочтительно содержит как нуклеиновую кислоту субъекта, то есть нуклеиновую кислоту, определяющую восприимчивость к лечению заболевания, так и нуклеиновую кислоту патогенного микроорганизма, присутствующего в организме субъекта и вызывающего данное заболевание. При необходимости взятую пробу можно подвергнуть предварительной обработке, такой как гомогенизация и экстракция. Тип предварительной обработки может быть выбран специалистом в данной области в зависимости от характера анализируемого материала.

В соответствии с одним описанным вариантом осуществления изобретения сначала у человека берут пробу цельной крови, которую используют для выделения нуклеиновой кислоты генома человека и вируса, присутствующего в организме человека, при помощи промышленно выпускаемого набора для экстракции генома человека, например набора средней величины для экстракции ДНК из крови QIAamp (торговое название фирмы QIAGEN, Токио, Япония). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения нуклеиновые кислоты, которые могут содержать последовательность-мишень, подвергают амплификации. Амплифицированный продукт анализируют путем гибридизации с чипом, содержащим иммобилизованные зонды, и затем выявляют нуклеиновую кислоту, которая связывается с чипом. Таким образом получают информацию о нуклеиновой кислоте субъекта, имеющей отношение к конкретному заболеванию, вместе с информацией о нуклеиновой кислоте патогенного микроорганизма, присутствующего в организме субъекта и вызывающего данное заболевание.

В вышеописанном способе в качестве субъекта представлен человек. Однако человек не является единственным субъектом по данному изобретению. В соответствии с целью настоящего изобретения "субъектом" может быть любое позвоночное, включая млекопитающих, таких как приматы, в том числе человек, собаки, кошки, коровы, козы, свиньи, овцы и обезьяны. Среди них человек является наиболее приемлемым субъектом. Объектом настоящего изобретения может быть здоровый или страдающий каким-либо заболеванием субъект. Однако способы по настоящему изобретению в большей степени предназначены для обследования человека, страдающего заболеванием, вызываемым патогенным микроорганизмом, и для исследования типа последовательности специфической нуклеиновой кислоты субъекта. Термин "конкретное заболевание" в используемом здесь значении означает заболевания, вызываемые патогенными микроорганизмами, такими как, например, вирусы, бактерии, дрожжи или микоплазма, а также онкологические заболевания, причем указанный термин предпочтительно относится к заболеваниям, вызываемым патогенными микроорганизмами, и более предпочтительно к заболеваниям, возникновение которых и терапевтический эффект изменяются в зависимости от типа нуклеиновой кислоты субъекта, страдающего данным заболеванием, и/или экспрессии или отсутствия экспрессии гена, имеющего такую нуклеиновую кислоту. Однако список заболеваний не имеет каких-либо ограничений.

Термин "нуклеиновая кислота-мишень" в используемом здесь значении означает нуклеиновую кислоту, содержащую детектируемую и/или анализируемую последовательность.

В соответствии с целью настоящего изобретения в качестве экстрагированной нуклеиновой кислоты субъекта можно использовать любую нуклеиновую кислоту, выделенную из организма данного субъекта. В частности, такой нуклеиновой кислотой может быть ДНК, РНК и геномная ДНК. В качестве экстрагированной нуклеиновой кислоты патогенного микроорганизма можно использовать любую нуклеиновую кислоту, выделенную из патогенного микроорганизма-мишени, в частности ДНК или РНК.

Способ экстракции нуклеиновой кислоты из пробы не ограничивается вышеуказанными средствами. Можно выполнять экстракцию в системе жидкость - жидкость с использованием фенола-хлороформа, экстракцию в системе твердое тело - жидкость с использованием носителя и тому подобные. Альтернативно можно использовать промышленно производимый набор для экстракции нуклеиновой кислоты QIAamp (фирмы QIAGEN), набор для очистки геномной ДНК (фирмы Promega) или испытательный набор SMAI (фирмы Sumitomo Metal Co., Ltd), не ограничиваясь указанными наборами. Экстрагированная нуклеиновая кислота может быть подвергнута амплификации, например, методом PCR.

В том случае, когда экстрагированная нуклеиновая кислота представляет собой РНК, полученную РНК можно непосредственно использовать в качестве испытуемой нуклеиновой кислоты. Альтернативно в качестве испытуемой нуклеиновой кислоты можно использовать кДНК, полученную из РНК при помощи обратной транскриптазы. В этом случае можно использовать неразделенную смесь нуклеиновой кислоты, выделенной из организма субъекта, и нуклеиновой кислоты, выделенной из патогенного микроорганизма. В частности, указанные нуклеиновые кислоты экстрагируют при помощи набора средней величины для экстракции ДНК из крови QIAamp в соответствии с вышеуказанным способом, обрабатывают обратной транскриптазой и амплифицируют методом PCR.

В соответствии с целью настоящего изобретения амплификацию выполняют любым известным способом, используемым для амплификации нуклеиновой кислоты. Амплификацию предпочтительно осуществляют при помощи полимеразной реакции синтеза цепи (далее именуемой "PCR"). Амплификацию можно не выполнять, если проба содержит достаточное количество нуклеиновых кислот.

В соответствии с целью настоящего изобретения подложка с иммобилизованными зондами, такая как чип с иммобилизованными зондами, содержит первый и второй зонды, имеющие разные последовательности оснований и иммобилизованные на подложке. Первый зонд используют для обнаружения последовательности специфической нуклеиновой кислоты, выделенной из патогенного микроорганизма, вызывающего конкретное заболевание. Второй зонд используют для обнаружения специфической нуклеиновой кислоты, выделенной из организма субъекта.

Такая подложка с иммобилизованными зондами является особенно эффективной, так как на одной подложке можно одновременно анализировать нуклеиновые кислоты, выделенные из двух разных организмов, таких как субъект и патогенный микроорганизм. Такой чип с иммобилизованными зондами впервые описан авторами настоящего изобретения. Указанная подложка с иммобилизованными зондами является одним из объектов настоящего изобретения.

В чипе с иммобилизованными зондами по настоящему изобретению первый зонд используют для обнаружения последовательности нуклеиновой кислоты, выделенной из патогенного микроорганизма, имеющегося в пробе, такой как, например, проба цельной крови, взятая у человека. Указанный зонд имеет последовательность оснований, соответствующую хромосомной ДНК или гену (РНК), выделенным из патогенного микроорганизма, который может инфицировать организм-мишень (например, человека). Помимо этого, в качестве первого зонда можно использовать последовательность оснований, соответствующую кДНК, кРНК, фрагменту хромосомной ДНК, РНК, кДНК и кРНК или комплементарной последовательности каждого из указанных фрагментов.

Кроме того, при помощи первого зонда можно определить количество патогенного микроорганизма, содержащегося в пробе, то есть при помощи зонда, имеющего последовательность оснований, соответствующую последовательности нуклеиновой кислоты, выделенной из патогенного микроорганизма, фрагменту последовательности нуклеиновой кислоты, комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты или ее фрагменту.

Первый зонд предпочтительно используют не только для обнаружения патогенного микроорганизма, имеющегося в пробе, но и генной мутации патогенного микроорганизма.

При помощи первого зонда можно измерить количество нуклеиновой кислоты (РНК), экспрессируемой патогенным микроорганизмом в пробе, то есть при помощи зонда, имеющего последовательность оснований, соответствующую последовательности нуклеиновой кислоты, выделенной из патогенного микроорганизма, фрагменту последовательности нуклеиновой кислоты или комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты и ее фрагменту. В данном случае указанный зонд позволяет производить качественное и количественное определение РНК, кДНК или кРНК.

В соответствии с вариантом осуществления изобретения, в котором патогенный микроорганизм является вирусом, можно определить эффективность лекарственного средства, измеряя характер экспрессии (количество, качество), так как вирус экспрессирует большое количество специфического гена в период роста.

В соответствии с целью настоящего изобретения второй зонд на чипе с иммобилизованными зондами представляет собой последовательность оснований, соответствующую последовательности хромосомной ДНК или гену (РНК), выделенной из организма субъекта и имеющей отношение к какому-либо заболеванию. Помимо этого, в качестве второго зонда можно использовать последовательность оснований, соответствующую кДНК, кРНК, фрагменту последовательности хромосомной ДНК, РНК, кДНК и кРНК или комплементарной последовательности указанных фрагментов. Нуклеиновая кислота субъекта, "сопутствующая заболеванию", представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, присутствующую в хромосоме клетки субъекта и определяющую восприимчивость к лечению. В частности, указанная последовательность нуклеиновой кислоты определяет подверженность субъекта заболеванию, эффективность лекарственного средства и/или вероятность возникновения побочных эффектов.

Благодаря наличию второго зонда можно обнаружить последовательность специфической нуклеиновой кислоты, экспрессируемое количество специфического гена и характер экспрессии гена у субъекта.

Желательно, чтобы первый и второй зонды по настоящему изобретению имели последовательность, включающую по крайней мере 11 оснований, предпочтительно по крайней мере 12 оснований, более предпочтительно по крайней мере 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 и даже 30 оснований. Если длина последовательности оснований, иммобилизуемой на подложке, является слишком большой, трудно распознать изменение одного основания. В отличие от этого, если последовательность оснований, иммобилизуемая на подложке, является слишком короткой, трудно определить данную последовательность оснований в пробе.

В качестве первого или второго зонда можно использовать олигонуклеотид, такой как рибонуклеиновая кислота (РНК), дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), пептидная нуклеиновая кислота (ПНК), метилфосфонатная нуклеиновая кислота или S-олиго; либо полинуклеотид, такой как кДНК и кРНК.

В соответствии с целью настоящего изобретения подложку с иммобилизованными зондами получают, иммобилизуя первый и второй зонды, имеющие вышеуказанные последовательности, на подложке, представляющей собой пластинчатую основу, пористый материал (Beattie et al., Clin. Chem., 41, 700 (1995)), микротитрационный планшет (Kawai et al., Anal. Biochem., 209, 63 (1993)), гранулы (Mirkin et al., Nature, 382, 607 (1996)), сферический материал, гранулированный материал, магнитный материал или магнитные гранулы (Miller et al., J. Magnet. Magn. Mater., 225, 138 (2001)), чип для капиллярного электрофореза ДНК (Chou et al., Proc. Natl. Acd. Sci., 96, 11 (1999)), мембранную матрицу (Lemieux et al., Molecular Breeding, 4, 277 (1998)), некоторые типы полупроводниковых устройств (Thewes et al., 2002, IEEE International Solid-State Circuits Conference, 350 (2002)), некоторые типы волноводных материалов (Piunno et al., Anal., Chim. Acta, 288, 205 (1994)), SPR (Nelson et al., Anal. Chem., 73, 1 (2001)), QCM (Ito et al., Anal. Chim. Acta, 327, 29 (1996)) и масс-спектроскопию (Amexis et al., Proc. Natl. Acd. Sci., 98, 12097 (2001)). Качество, размер и форма материала подложки, используемой для иммобилизации нуклеиновой кислоты, не имеют каких-либо конкретных ограничений. В качестве подложки можно использовать материал любого качества, размера и формы, если он способен иммобилизовывать нуклеиновую кислоту. Последовательность нуклеиновой кислоты в пробе обнаруживают при помощи подложки с иммобилизованными зондами, для чего из пробы, взятой у субъекта, экстрагируют нуклеиновую кислоту, получая таким образом испытуемую нуклеиновую кислоту, затем испытуемую нуклеиновую кислоту наносят на подложку с иммобилизованными зондами, такую как чип с иммобилизованными зондами, и выявляют гибридизацию между зондом на подложке с иммобилизованными зондами и испытуемой нуклеиновой кислотой.

Для обнаружения гибридизации между зондом на чипе с иммобилизованными зондами и нуклеиновой кислотой в пробе в объем настоящего изобретения входит (1) способ с использованием вещества-маркера и (2) способ с использованием электрохимического устройства.

(1) В способе с использованием вещества-маркера испытуемую нуклеиновую кислоту предварительно метят флуоресцентным пигментом, таким как FITC, Су3, Су5 или родамин; ферментом, таким как биотин, гаптен, оксидаза или фосфатаза; или электрохимически активным веществом, таким как ферроцен или хиноны. Альтернативно для обнаружения гибридизации используют другой зонд, меченный таким веществом-маркером. Одновременно можно использовать несколько веществ-маркеров.

(2) В способе с использованием электрохимического устройства чип с иммобилизованными зондами применяют в качестве электрода, используя для изготовления подложки такого чипа материал, проводящий электрический ток. В данном случае помимо вышеуказанного электрода можно использовать противоэлектрод и электрод сравнения для обнаружения гибридизации в соответствии с известным способом электрохимического детектирования. В качестве электрода сравнения можно использовать электрод, изготовленный из серебра и хлорида серебра, или электрод, изготовленный из ртути и хлорида ртути. Чип с иммобилизованными зондами можно изготовить, иммобилизуя зонды с разными последовательностями оснований на разных проводящих подложках и располагая указанные проводящие подложки на одной пластинчатой основе. Такой чип с иммобилизованными зондами позволяет производить точное детектирование. В данном случае можно определить электрохимические сигналы, подаваемые разными зондами.

В некоторых вариантах осуществления изобретения гибридизацию между нуклеиновой кислотой, экстрагированной из пробы, и зондом, иммобилизованным на чипе с иммобилизованными зондами, выполняют следующим образом. Гибридизацию производят в буфере с ионной силой от 0,01 до 5 и рН от 5 до 10. Раствор для гибридизации может содержать добавки, такие как декстран-сульфат, служащий в качестве ускоряющего гибридизацию агента, ДНК спермы лососевых, ДНК из тимуса теленка, этилендиамин-тетрауксусная кислота (EDTA) и поверхностно-активное вещество. Нуклеиновую кислоту, экстрагированную из пробы, добавляют к буферному раствору и денатурируют под действием тепла при 90С и выше. Чип с иммобилизованными зондами можно ввести сразу же после денатурации или после быстрого охлаждения до С. Альтернативно гибридизацию выполняют, нанося по каплям раствор для гибридизации на подложку. Указанную реакцию можно осуществлять, перемешивая или встряхивая реакционный раствор для увеличения скорости реакции. Данную реакцию можно выполнять при температуре от 10 до 90С в течение периода времени от одной минуты и на протяжении всей ночи. После выполнения гибридизации электроды удаляют и производят промывку буферным раствором с ионной силой от 0,01 до 5 и рН от 5 до 10.

(1) В способе с использованием вещества-маркера гибридизацию детектируют, выявляя меченую последовательность оснований или маркер дополнительного зонда, имеющегося в пробе, при помощи детектирующего устройства, выбираемого в зависимости от типа маркера. Например, в случае флуоресцентной метки можно использовать флуоресцентный детектор.

(2) В способе с использованием электрохимического устройства гибридизацию детектируют следующим образом. Подложку промывают и на поверхность электрода наносят вещество, распознающее двухцепочечную последовательность, которое способно избирательно связываться с двухцепочечной частью. Вещество, распознающее двухцепочечную последовательность, не имеет каких-либо конкретных ограничений и может включать, например, бис-интеркаляторы, такие как хехст 33258, акридин оранжевый, хинакрин, дауномицин, металлоинтеркалятор и бисакридин; трис-интеркалятор и полиинтеркалятор. Кроме того, такой интеркалятор можно предварительно модифицировать комплексом электрохимически активного металла, такого как ферроцен или виологен. Концентрация такого ДНК-связывающего вещества может изменяться в зависимости от типа интеркалятора, однако обычно она находится в пределах от 1 нг/мл до 1 мг/мл. В данном случае используют буфер с ионной силой от 0,001 до 5 и рН от 5 до 10. После взаимодействия электрода с веществом, распознающим двухцепочечную последовательность, производят промывку и электрохимическое измерение.

Для электрохимического измерения подводят напряжение, при котором вещество, распознающее двухцепочечную последовательность, вступает в электрохимическую реакцию, и измеряют величину тока, выделяемого веществом, распознающим двухцепочечную последовательность. Напряжение можно подводить, производя развертку с постоянной скоростью или в импульсном режиме. Альтернативно можно подводить напряжение постоянного тока. Ток реакции измеряют при помощи такого устройства, как потенциометр, цифровой мультиметр или генератор функций. Концентрацию нуклеиновой кислоты-мишени можно вычислить на основании калибровочной кривой с учетом полученной величины тока.

Устройство для обнаружения последовательности оснований с использованием электрода включает секцию экстракции нуклеиновой кислоты, секцию взаимодействия с нуклеиновой кислотой, секцию взаимодействия с веществом, распознающим двухцепочечную последовательность, секцию электрохимического измерения и секцию промывки.

Другой ДНК-чип, предназначенный для измерения гибридизации электрохимическим способом, описан в нижеследующих публикациях. Hashimoto и др. описали способ обнаружения гена специфической последовательности при помощи золотого электрода, модифицированного ДНК-зондами и электрохимически активным красителем. Анодный ток, выделяемый красителем, соответствует концентрации ДНК-мишени. Wang и др. описали биодатчик электрохимической гибридизации ДНК без индикатора. Конструкция биодатчика включает иммобилизацию инозинзамещенного (без гуанина) зонда на электроде из угольной пасты и прямое хронопотенциометрическое детектирование образования дуплекса по появлению пика окисления гуанина мишени. Указанные публикации включены в данное описание изобретения в качестве ссылки.

При выполнении электрохимического измерения необязательно метить препарат маркером. Поскольку детектирование производится путем измерения электрического сигнала, не нужна сложная система, используемая при детектировании флуоресценции. Поэтому при желании можно уменьшить размер системы электрохимического измерения.

В соответствии с целью настоящего изобретения, используя пробу, например кровь, взятую у субъекта, можно легко получить не только информацию о последовательности нуклеиновой кислоты данного субъекта, имеющей отношение к какому-либо заболеванию, но и информацию о последовательности нуклеиновой кислоты патогенного микроорганизма инфицирующего субъекта.

В соответствии с целью настоящего изобретения подложку с иммобилизованными зондами используют для определения приемлемого метода лечения данного субъекта, подверженного заболеванию. Подложка с иммобилизованными зондами включает второй и первый зонды, иммобилизованные на одной подложке, причем второй зонд используют для получения информации о последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей отношение к заболеванию и присутствующей в хромосоме клетки субъекта, и первый зонд используют для получения информации о последовательности нуклеиновой кислоты патогенного микроорганизма, вызывающего данное заболевание. При помощи подложки с иммобилизованными зондами можно простым способом одновременно получить информацию, касающуюся конкретного заболевания, и/или прогнозировать восприимчивость к лечению данного заболевания со стороны субъекта и патогенного микроорганизма на основании взятой у субъекта пробы.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способы и подложки с иммобилизованными зондами используют для определения эффективности лечения гепатита С. В других вариантах осуществления изобретения описанный способ и подложки с иммобилизованными зондами используют для оценки эффективности лечения СПИДа (титр ВИЧ и мутации). В других вариантах осуществления изобретения описанный способ и подложки с иммобилизованными зондами используют для оценки эффективности лечения гепатита В (титр вируса гепатита В, тип и мутации).

Способом по настоящему изобретению можно определить эффективность лечения гепатита С. Указанный случай будет рассмотрен ниже в качестве примера.

Известно, что гепатит С приводит к циррозу и затем раку печени. Одним из методов лечения гепатита С является введение интерферона (далее именуемого "IFN"). Для лечения гепатита С часто используют альфа- и бета-IFN. Однако эффективность IFN изменяется в значительной степени. Например, IFN влияет только на 20-30% японцев. Даже если лечение IFN оказывается эффективным, у принимающего его субъекта возникают чрезвычайно сильные побочные эффекты. Считается, что такое различие в эффективности IFN связано с различиями в генотипе вируса гепатита С (далее именуемого "HCV"), поражающего человека (см. J. Clin. Microbiol., 34, 2516 (1996)), количестве вируса и различиями в последовательностях нуклеиновой кислоты субъекта, инфицированного данным вирусом. На основании сравнения нуклеотидных и предполагаемых аминокислотных последовательностей разных областей генома HCV описано по крайней мере шесть основных генотипов (Forns et al., J. Clin. Microbiol., 34, 2516 (1996), Andonov et al., J. Clin. Microbiol., 33, 254 (1995)). В соответствии с целью настоящего изобретения можно оценить эффективность воздействия IFN на гепатит С. Термин "интерферон (IFN)" в используемом здесь значении означает -, -, - и/или -интерферон. Например, если субъект инфицирован вирусом гепатита С, относящимся к типу Ib (наиболее распространенный тип в Японии), лечение IFN оказывается менее эффективным. Это значит, что концентрация РНК вируса гепатита С, антитела к HCV, GOP и GTP в сыворотке не уменьшается при лечении IFN. Однако, если вирус относится к типу 2а, IFN характеризуется более высокой эффективностью. Из этого следует, что в результате подобного лечения в сыворотке уменьшается концентрация РНК вируса гепатита С, антитела к HCV, GOP и GTP. С другой стороны, при большом количестве вируса, равном 106 копиям/мл или выше, эффективность IFN оказывается низкой. Поэтому для выявления генотипа и количества инфицирующих субъекта вирусов на уровне нуклеиновой кислоты используют первый зонд по настоящему изобретению.

Например, в качестве зонда для обнаружения последовательности нуклеиновой кислоты вируса гепатита С (HCV) в пробе используют последовательность оснований, соответствующую РНК HCV, фрагменту РНК HCV, комплементарной последовательности РНК HCV или ее фрагменту. Желательно, чтобы зонд по настоящему изобретению, предназначенный для обнаружения генотипа или мутации РНК HCV, имел последовательность, включающую по крайней мере 11 оснований, предпочтительно по крайней мере 12 оснований, более предпочтительно по крайней мере 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 и даже 30 оснований. С другой стороны, зонды длиннее по крайней мере 30, предпочтительно по крайней мере 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000 оснований, также предпочтительны для обнаружения генома HCV. Последовательности длиной 11-30 оснований соответствуют формату чипа, и зонды длиннее 30 оснований соответствуют общему формату гибридизации. Например, можно использовать зонды, имеющие последовательности оснований, соответствующие SEQ ID №1, SEQ ID №2, SEQ ID №3 и SEQ ID №4 и их комплементарным последовательностям. Указанные последовательности являются практически консервативными во всех генотипах HCV (Andonov et al., J. Clin. Microbiol., 33, 254 (1995)).

В качестве первого зонда по настоящему изобретению желательно использовать зонд, способный обнаруживать не только наличие патогенного микроорганизма в пробе, но и генную мутацию патогенного микроорганизма. Установлено, что в случае гепатита С эффективность IFN изменяется в зависимости от наличия сайтспецифической мутации последовательности нуклеиновой кислоты вируса HCV (Nagayama et al., Hepatology, 31, 745 (2000)). В качестве примера первого зонда, предназначенного для обнаружения сайтспецифической мутации последовательности нуклеиновой кислоты вируса HCV в пробе, можно привести зонд, имеющий последовательность оснований для определения аминокислоты в положениях 434, 580, 938, 962, 1176 или 2774 полипротеина HCV (описанный в Hepatology, 31, 745 (2000)). Геномные последовательности HCV-lb, выделенные у субъектов, страдающих печеночно-клеточным раком (НСС), характеризуются повышенным содержанием мутантных остатков по сравнению с аналогичными последовательностями, выделенными у здоровых людей (ASC). Используя такой зонд, можно точно определить эффективность воздействия IFN на гепатит С.

Как описывалось выше, установлено, что эффективность лечения IFN зависит от генотипов HCV. Поэтому первый зонд может представлять собой последовательность оснований, соответствующую РНК HCV, фрагменту РНК HCV, комплементарной последовательности РНК HCV или ее фрагменту. В частности, первый зонд может быть выбран из зондов, предназначенных для специфического обнаружения генотипов HCV типа 1 (SEQ ID №5), HCV типа 2 (SEQ ID №6) и HCV типа 3 (SEQ ID №7), в зависимости от определяемого генотипа. Другими словами, первый зонд, предназначенный для обнаружения HCV, может представлять собой нуклеиновую кислоту, последовательность которой соответствует любой одной последовательности из SEQ ID №5, SEQ ID №6 и/или SEQ ID №7 или их комплементарных последовательностей.

При использовании зонда, способного обнаруживать генотип, точное определение можно произвести, если на одной подложке иммобилизованы зонды, соответствующие разным генотипам.

Генотип патогенного микроорганизма в пробе можно обнаружить следующим образом. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения последовательность нуклеиновой кислоты патогенного микроорганизма сначала подвергают PCR, используя затравку, специфичную для данного генотипа, и затем определяют генотип при помощи иммобилизованного универсального зонда. Используемый в настоящем изобретении универсальный зонд представляет собой зонд, способный обнаруживать все вирусы гепатита С независимо от их генотипов (Andonov et al., J. Clin. Microbiol., 33, 254 (1995)).

В случае гепатита С выполняют PCR, используя в качестве смысловой цепи последовательность оснований, представленную SEQ ID №8 или SEQ ID №9, и в качестве антисмысловой цепи последовательность оснований, представленную SEQ ID №10 для генотипа 1a, SEQ ID №11 для генотипа 1b, SEQ ID №12 для генотипа 2а или SEQ ID №13 для генотипа 3а. Последующее определение производят, используя в качестве универсального зонда последовательность оснований, представленную SEQ ID №15.

Количество патогенного микроорганизма в пробе можно измерить при помощи первого зонда, то есть зонда, имеющего последовательность оснований, соответствующую последовательности нуклеиновой кислоты, выделенной из патогенного микроорганизма, или последовательность оснований, соответствующую фрагменту нуклеиновой кислоты или ее комплементарной последовательности.

Установлено, что в случае гепатита С эффективность лечения IFN изменяется в зависимости от количества HCV в крови (J. Clin. Microbiol., 33, 254 (1995)