Индуцируемый теплом промотор и его использование

Индуцируемый теплом промотор и его использование

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к индуцируемым теплом промоторам, наборам и способам получения одного или большего количества белков с использованием индуцируемого теплом промотора. Индуцируемый теплом промотор выбирают из следующих нуклеиновых кислот: (а) нуклеиновой кислоты с последовательностью, указанной в описании; (b) нуклеиновой кислоты с последовательностью, которая проявляет по меньшей мере 40% идентичности на участке длиной в 300 п.н. с последовательностью, указанной в (а); (с) нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях с комплементарной цепью одной из нуклеиновых кислот, указанных в (а) или (b); (d) фрагмента одной из нуклеиновых кислот, указанных в (а)-(с), который сохраняет функцию индуцируемого теплом промотора; (е) комбинации нескольких нуклеиновых кислот, указанных в (а)-(d), где последовательности нуклеиновых кислот могут отличаться или быть одинаковыми; или нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность, комплементарную последовательности одной из нуклеиновых кислот, указанных в (а)-(е). Представлен вектор, используемый для экспрессии белков, несущий индуцируемый теплом промотор. Вектор входит в набор для экспрессии белков наряду с клеткой-хозяином, подходящей для индукции индуцируемого теплом промотора и для продуцирования рекомбинантного белка. Изобретение позволяет получить промотор, параметр тепловой индукции которого избирателен, насколько это возможно, в частности промотор, который активен у дрожжей и который подходит для экспрессии белка при высоких температурах. 5 с. и 27 з.п. ф-лы, 16 ил., 2 табл.

Данное изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, включающим индуцируемый теплом промотор, а также к экспрессирующим векторам и клеткам-хозяевам, содержащим, по меньшей мере, одну молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Кроме того, данное изобретение относится к наборам и способам получения одного или большего количества белков, используя молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению, и к различным применениям вышеупомянутого.

Микроорганизмы способны отвечать на ряд стрессовых ситуаций, таких как тепловой или холодовой шок, этанол, ионы тяжелых металлов, кислородная депривация или пищевая депривация, в частности глюкозная депривация. Известно, что дрожжи и другие грибы накапливают трегалозу в течение фаз пониженного роста. Обычно это стадии развития, которые, например, толерантны к водной депривации и теплу, такие как споры, конидии, склероции или клетки в стационарной фазе роста. Также уже известно, что клетки Saccharomyces cerevisiae накапливают трегалозу во время одночасового теплового шока от 27С до 40С и что накопление трегалозы коррелирует с повышенной термотолерантностью. Были использованы селективные мутации для того, чтобы показать, что трегалоза действительно является необходимым фактором для индукции термотолерантности.

HSE (элементы теплового шока) и STRE (элементы, отвечающие на стресс) присутствуют в промоторных областях генов, индуцируемых при стрессе, таких как гены S. cerevisiae, ответственные за синтез трегалозы. По-видимому, данные элементы опосредуют активацию стресс-генов при индукции стресса, включая индукцию тепловым шоком. В настоящее время общепризнанным является то, что фосфорилирование Msn2p и Msn4p посредством пути Ras/цАМФ ингибирует факторы транскрипции Msn2p и Msn4p. В отсутствие такого ингибирования (например, в условиях стресса) Msn2p и Msn4p становятся активными. STRE с последовательностью ССССТ приписывают роль в ответе на условия стресса.

Благодаря своей способности осуществлять котрансляционные и посттрансляционные модификации, которые сходны с модификациями у человека, грибы и, в частности, дрожжи являются привлекательными системами для продукции рекомбинантных белков. Для продукции рекомбинантных белков кодирующая последовательность гена, который кодирует интересующий белок, часто экспрессируется под контролем подходящего гетерологичного промотора. Так называемые индуцируемые промоторы, которые можно индуцировать конкретными условиями окружающей среды, оказались особенно выгодными для данной цели. Например, промоторы генов, которые кодируют ключевые ферменты в метаболизме у метилотрофов, такие как промотор МОХ (метанолоксидаза) или FMD (формиатдегидрогеназа), предоставляют возможности широкого применения для экспрессии гетерологичных генов, которая строго регулируется источником углерода.

Для исследования в молекулярной биологии были созданы экспрессирующие векторы, которые включают промотор, индуцируемый теплом, например промотор гена hsp70 Drosophila. Промоторы, используемые в прошлом для индукции теплового шока в клетках грибов и, в частности, у дрожжей, имеют тот недостаток, что они не отвечают избирательно на тепловой шок. Поэтому нельзя достаточно хорошо контролировать механизм их активации и дезактивации, что может, в частности, вызывать проблемы во время продукции белков, которые являются повреждающими по отношению к клеткам. Например, в промоторе TPS1 S. cerevisiae обнаруживаются несколько последовательностей, известных как общие элементы стресса (STRE-элементы), а именно ССССТ и AGGGG, но не более чем одна последовательность, действующая как элемент теплового шока (HSE), а именно GGAACAGAACAATCG. Кроме того, вследствие своего широкого стрессорного ответа известные в настоящее время промоторы активируются фактором стресса в степени, которая не достаточна для многих применений.

Поэтому целью изобретения является предоставление промотора, характеристика индукции теплом которого настолько избирательна, насколько возможно, в частности промотор, который активен в грибах и, в частности, в дрожжах и который пригоден для экспрессии белков при высоких температурах.

Согласно изобретению данная цель достигается посредством молекулы нуклеиновой кислоты, включающей индуцируемый теплом промотор и которая выбрана из следующих нуклеиновых кислот:

(a) нуклеиновая кислота, последовательность которой включает последовательность промотора гена Hansenula polymorpha, кодирующего белок с активностью трегалоза-6-фосфатсинтазы;

(b) нуклеиновая кислота с последовательностью, указанной в SEQ ID NO:1;

(c) нуклеиновая кислота с последовательностью, которая проявляет, по меньшей мере, 40% идентичность на протяжении длины в 300 п.н. с одной из последовательностей, указанных в (а) или (b);

(d) нуклеиновая кислота, которая гибридизуется с комплементарной цепью одной из нуклеиновых кислот, указанных в (а), (b) или (с);

(e) производная одной из нуклеиновых кислот, указанных в (а), (b) или (с), полученная заменой, присоединением и/или делецией одного или большего количества нуклеотидов;

(f) фрагмент одной из нуклеиновых кислот, указанных в (а)-(е), который сохраняет функцию индуцируемого теплом промотора;

(g) комбинация нескольких нуклеиновых кислот, указанных в (а)-(f), где последовательности нуклеиновых кислот могут отличаться или быть одинаковыми;

или посредством молекулы нуклеиновой кислоты, последовательность которой комплементарна последовательности одной из нуклеиновых кислот, указанных в (а)-(g).

Термин “индуцируемый теплом промотор” в используемом в данном контексте виде относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая при повышении температуры в культуральной среде от 25С до, по меньшей мере, 37С, предпочтительно до 47С, приводит к увеличению, по меньшей мере, примерно на 50% в транскрипции (синтезе РНК) гена, находящегося под транскрипционным контролем промотора.

“Активность трегалоза-6-фосфатсинтазы” относится к превращению глюкоза-6-фосфата (Glu6P) и UDP-глюкозы (UDPG) в трегалоза-6-фосфат и UDP, которое катализируется ферментом трегалоза-6-фосфатсинтазой (TPS). Трегалоза-6-фосфатсинтазную активность белка или полипептида можно измерить, например, способом, описанным ниже в “Материалах и способах”.

Признак “последовательность, которая гибридизуется с комплементарной цепью одной из нуклеиновых кислот, указанных в (а), (b) или (с)”, относится к последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях с комплементарной цепью нуклеиновой кислоты, имеющей признаки, указанные в (а), (b) или (с). Например, гибридизацию можно проводить при 68С в 2SSC или согласно протоколу набора для мечения диоксигенином производства Boehringer (Mannheim). Следующим примером жестких условий гибридизации является инкубация при 65С в течение ночи в 7% SDS, 1% БСА, 1 мМ ЭДТА, 250 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 7,2) с последующей промывкой при 65С в 2SSC, 0,1% SDS.

Термин “% идентичности”, как известно в данной области, относится к степени сходства между последовательностями двух или более молекул ДНК или двух или более молекул полипептидов, которая выявляется при сравнении последовательностей. Процент “идентичности” является результатом, получаемым на основании процента идентичных областей в двух или более последовательностях при рассмотрении пробелов или других конкретных особенностей последовательности.

Идентичность соотносимых молекул ДНК или полипептидов можно определить посредством известных процедур. В основном применяют специализированные компьютерные программы, используя алгоритмы, которые вводят поправку на конкретные требования. Предпочтительные способы определения идентичности сначала генерируют наибольшие совпадения между изучаемыми последовательностями. Компьютерные программы для определения идентичности между двумя последовательностями включают, но не ограничены этим, пакет программ GCG, включая GAP (Devereux J., et al., Nucleic Acids Research 12 (12): 387 (1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (WI)); BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul S., et al., J. Molec Biol 215: 403/410 (1990)). Программу BLAST X можно приобрести в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) и из других источников (BLAST Manual, Altschul S., et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403/410 (1990)). Хорошо известный алгоритм Smith Waterman также можно использовать для определения идентичности.

Предпочтительные параметры сравнения последовательностей включают в себя следующее:

Алгоритм: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)

Матрикс сравнения: Совпадения = +10

Несоответствия = 0

Штраф пробела: 50

Штраф длины пробела: 3

Программа GAP также пригодна для применения с указанными выше параметрами. Указанные выше параметры представляют собой параметры, устанавливаемые по умолчанию для сравнений последовательностей нуклеиновых кислот.

Могут применяться другие алгоритмы, штрафы открытия пробела, штрафы удлинения пробела, матрицы сравнения, включая те, которые представлены в руководстве по программированию Program Manual, Wisconsin Package, Version 9, September 1997. Сделанные выборы будут зависеть от конкретного сравнения, которое будет проводиться, и, кроме того, от того, проводится ли сравнение между парами последовательностей, и в этом случае предпочтительны GAP или Best Fit, или между одной последовательностью и большой базой данных последовательностей, и в этом случае предпочтительны FASTA или BLAST.

Неожиданно в настоящее время обнаружено, что молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению и, в частности, промотор гена трегалоза-6-фосфатсинтазы (TSP1) Hansenula polymorpha не содержат, по меньшей мере, в первых 300 п.н. выше кодирующей последовательности ни одного STRE-элемента, которые были обнаружены в S. cerevisiae и для которых было сделано предположение, что они являются первично отвечающими элементами для стрессорного ответа, включая индукцию данного гена тепловым шоком. Затем было обнаружено, что данный промотор хорошо и очень избирательно отвечает на тепло.

Молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению могут быть либо получены синтетически стандартными способами, либо выделены из подходящих библиотек ДНК и затем мутированы, как это необходимо. Получение таких библиотек также известно в данной области. Выделение предпочтительно выполняют посредством подготовки зонда длиной, по меньшей мере, 200-400 п.н. из кодирующей последовательности гена TPS1 Н. polymorpha (см. фиг.6), которая используется для скрининга библиотеки ДНК, в частности библиотеки геномной ДНК. Зонд такого вида можно получить посредством ПЦР (полимеразной цепной реакции), используя подходящие праймеры, каждый из которых предпочтительно должен быть длиной, по меньшей мере, 20-21 п.н. и иметь подходящие последовательности согласно фиг.6 (или соответствующие комплементарные последовательности), и геномную ДНК или кДНК Н. polymorpha в качестве “матрицы”.

Таким образом, способность нуклеиновой кислоты согласно изобретению отвечать на тепло приписывается исключительно двум элементам, отвечающим на тепло, которые присутствуют в последовательности промотора, а именно элементу NGAANNNNNNNGAAN (SEQ ID №2), включающему нуклеотиды 627-641 в последовательности промотора (SEQ ID №l), и элементу TGAATATAAAGGAAA (SEQ ID №5), включающему нуклеотиды 698-713 в указанной последовательности промотора. Таким образом, способность отвечать на тепло проявляется двумя элементами, состоящими из 15 п.н., которые разделены 57 п.н. Следовательно, для гетерологической экспрессии гена может быть сконструирован промотор, содержащий один (или гомологичный) элемент или два элемента в любой комбинации, разделенных участком нуклеотидов со схожей последовательностью. Могут быть также задействованы элементы STRE с последовательностями ССССТ и AGGGG, что имеет место в генах теплового шока S.cerevisiae, но которые не являются обязательными. Возможные варианты таких промоторов представлены в примерах.

Зонды могут быть либо синтезированы, либо получены фрагментацией имеющейся в распоряжении ДНК TPS1, где это применимо. Конечно, также можно прямо проводить скрининг посредством зондов, которые соответствуют частям последовательности промотора; однако эта процедура менее предпочтительна из-за в лучшем случае неполной консервативности последовательности в пределах некодирующих частей.

В варианте молекул нуклеиновых кислот согласно изобретению последовательность нуклеиновой кислоты проявляет, по меньшей мере, 60%, предпочтительно, по меньшей мере, 80% идентичности на участке из 300 п.н. с одной из последовательностей, указанных выше в (а) или (b).

Молекулы нуклеиновых кислот, которые включают индуцируемый теплом промотор и которые проявляют, по меньшей мере, 90% идентичности на участке из 300 п.н. с одной из последовательностей, указанных выше в пунктах (а) или (b), особенно предпочтительны. Однако наиболее предпочтительны молекулы нуклеиновых кислот, которые проявляют, по меньшей мере, 95% идентичности на участке из 300 п.н. с одной из последовательностей, указанных выше в пунктах (а) или (b).

Молекулы нуклеиновых кислот, предпочтительные для выполнения изобретения, представляют, по меньшей мере, один элемент теплового шока с последовательностью NGAANNNNNNNGAAN (SEQ ID № 2) или комплементарной ей последовательностью, где нуклеотидами, обозначенными N, независимо друг от друга могут быть А, Т, С или G. Молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению предпочтительно представляют, по меньшей мере, один элемент теплового шока с последовательностью NGAANNBWMNNGAAN (SEQ ID №3) или комплементарной ей последовательностью, где В представляет собой G, С или Т, W означает А или Т, и М означает С или А.

В особо предпочтительном варианте изобретения элемент теплового шока выбран из TGAAGCCTCTTGAAA (SEQ ID №4) и/или TGAATATAAAGGAAA (SEQ ID №5) и/или комплементарных им последовательностей, где два или более элементов теплового шока там, где они присутствуют, могут представлять одну и ту же или различные последовательности. Предпочтительная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению представляет, по меньшей мере, два различных элемента теплового шока.

В предпочтительном варианте изобретения молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению не содержат STRE-элемента, имеющего последовательность ССССТ или AGGGG.

Изобретение также предоставляет фрагменты молекул нуклеиновых кислот согласно изобретению, как указано выше, которые сохраняют функцию индуцируемого теплом промотора. Фрагмент, включающий последовательность от нуклеотида 228 до нуклеотида 792 в SEQ ID №l, особенно предпочтителен. Следующий предпочтительный фрагмент включает последовательность от нуклеотида 493 до нуклеотида 792 в SEQ ID №l. Также можно использовать фрагмент, содержащий последовательность от нуклеотида 627 до нуклеотида 713 в SEQ ID №l.

Молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению могут, кроме того, содержать, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты гетерологичного гена под транскрипционным контролем индуцируемого теплом промотора.

“Гетерологичный ген” следует относить к кодирующей части структурного гена, который либо не экспрессируется под контролем своего собственного (гомологичного) промотора, либо не экспрессируется в организме, из которого ген получен, или не экспрессируется ни под контролем исходного промотора, ни в исходном организме.

В следующем варианте изобретения молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению включают последовательность нуклеиновой кислоты под транскрипционным контролем индуцируемого теплом промотора, которая выбрана из следующих последовательностей:

i) последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид с аминокислотной последовательностью трегалоза-6-фосфатсинтазы Hansenula polymorpha;

(ii) последовательность нуклеиновой кислоты, которая указана в SEQ ID №6;

(iii) последовательность нуклеиновой кислоты, которая проявляет, по меньшей мере, 80% идентичность с последовательностью, указанной в SEQ ID №6;

(iv) последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID №7 или с ее частичной последовательностью, где полипептид проявляет трегалоза-6-фосфатсинтазную активность;

(v) последовательность нуклеиновой кислоты, которая, принимая во внимание вырожденность генетического кода, кодировала бы полипептид с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID №7, или с ее частичной последовательностью, где полипептид проявляет трегалоза-6-фосфатсинтазную активность;

(vi) последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, аминокислотная последовательность которого проявляет, по меньшей мере, 80% идентичности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID №7.

Последовательность нуклеиновой кислоты, указанная в (iii), предпочтительно проявляет, по меньшей мере, 90% идентичности с последовательностью, указанной в SEQ ID №6. В альтернативной форме молекул нуклеиновых кислот согласно изобретению последовательность нуклеиновой кислоты, указанная в (vi), кодирует полипептид, аминокислотная последовательность которого проявляет, по меньшей мере, 90% идентичности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID №7.

Молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может, кроме того, включать последовательность, кодирующую сигнальный пептид, который обеспечивает перенос экспрессированного белка, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальный пептид, предпочтительно непосредственно связана с экспрессируемым гетерологичным геном. Секреция и модификация многих эукариотических белков требует, чтобы N-конец последовательности белка был слит с сигнальной последовательностью, для того чтобы направлять полипептиды в секреторный аппарат. Компоненты гена GAM1 S. occidentalis и гормонального гена краба Carcinus maenas, которые были успешно использованы для секреции гирудина (Weydemann et al., 1995), могут быть здесь рассмотрены для примера. Молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может, кроме того, включать элемент терминатора, содержащий сигнальные структуры для РНК-полимеразы, которые приводят к терминации транскрипции. Примерами терминирующих элементов, которые могут быть использованы, являются терминаторы МОХ или РНО1 Н. polymorpha.

Следующим объектом изобретения является клетка-хозяин, содержащая, по меньшей мере, одну молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению, при этом клеткой-хозяином является прокариотическая или эукариотическая клетка. Эукариотической клеткой может быть, например, растительная клетка. Эукариотической клеткой предпочтительно является клетка гриба, особенно предпочтительна клетка дрожжей. Особо рассматриваются грибы в качестве клеток-хозяев для выполнения данного изобретения, например гифомицеты, такие как Aspergillus, Neurospora, Mucor, Trichoderma, Acremonium, Sordaria и Penicillium, или дрожжи, такие как Saccharomyces, Hansenula, Pichia, Kluyveromyces, Schwanniomyces, Yarrowia, Arxula, Trichosporon и Candida.

В наиболее предпочтительном варианте изобретения дрожжевая клетка является клеткой факультативных метилотрофных дрожжей Hansenula, предпочтительно Hansenula polymorpha. H. polymorpha является термотолерантной дрожжевой клеткой и относится к небольшой группе так называемых метилотрофных дрожжей, которые способны использовать метанол в качестве источника углерода и энергии. Н. polymorpha выделяли из почвенных образцов при инкубации при 37С (Levine and Cooney, 1973). Высокая температура, при которой Н. polymorpha продолжает расти и продуцировать белок, дает возможность удалить другие нежелательные организмы. Основанием для этого является то, что было показано, что Н. polymorpha не только имеет очень высокую оптимальную температуру роста, в районе 37С, но также способна переживать невредимой температуры примерно в 50С (смотри фиг.1). Жизнеспособность Н. polymorpha после вхождения в стационарную фазу не падает в течение примерно 50 часов даже при 47С (фиг.2).

Следующим предметом данного изобретения является экспрессирующий вектор, включающий, по меньшей мере, одну молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Такой экспрессирующий вектор также может содержать другие последовательности нуклеиновых кислот в дополнение к индуцируемому теплом промотору, например последовательность, которая кодирует полипептид, ген селектируемого маркера, начало репликации Е. coli и т.д.

Данное изобретение также предоставляет набор, включающий:

(a) экспрессирующий вектор согласно изобретению, который пригоден для включения в него клонированной нуклеиновой кислоты, которая кодирует рекомбинантный белок, и

(b) подходящую клетку-хозяина для индукции индуцируемого теплом промотора и для продукции рекомбинантного белка.

Термин “клонирование” должен включать все способы клонирования, известные в данной области, которые могут применяться для этой цели. Не все эти способы описаны в данной работе в отдельности, будучи известными специалисту в данной области.

Кроме того, изобретение предоставляет набор, включающий:

(a) экспрессирующий вектор и

(b) клетку-хозяина, пригодную для индукции индуцируемого теплом промотора и для продукции белка, кодируемого кодирующей последовательностью под транскрипционным контролем индуцируемого теплом промотора.

Молекулы нуклеиновых кислот, клетки-хозяева, экспрессирующие векторы и наборы согласно изобретению могут быть использованы для рекомбинантной экспрессии гена под контролем индуцируемого теплом промотора или для продукции одного или большего количества белков.

“Рекомбинантную экспрессию в подходящей клетке-хозяине” следует относить ко всем способам экспрессии, известным на данной стадии в этой области в известных системах экспрессии, которые можно использовать для данной цели. Не все эти способы описаны здесь в отдельности, поскольку известны специалисту в данной области.

Следующим предметом изобретения является способ получения одного или большего количества белков, указанный способ включает:

(i) клонирование, по меньшей мере, одной нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный белок, в экспрессирующем векторе согласно изобретению, так чтобы клонированная таким образом нуклеиновая кислота находилась под транскрипционным контролем индуцируемого теплом промотора;

(ii) введение экспрессирующего вектора, полученного на этапе (i) в клетку-хозяина, подходящую для индукции индуцируемого теплом промотора и для продукции рекомбинантного белка;

(iii) культивирование клетки-хозяина, полученной в (ii);

(iv) индукцию индуцируемого теплом промотора способами, по существу известными.

В случае, когда экспрессирующий вектор согласно изобретению содержит последовательность, кодирующую полипептид, и находящуюся под транскрипционным контролем индуцируемого теплом промотора, способ согласно изобретению для получения одного или большего количества белков включает следующие этапы:

(i) введение экспрессирующего вектора в клетку-хозяина, подходящую для индукции индуцируемого теплом промотора и для продукции рекомбинантного белка;

(ii) культивирование клетки-хозяина, полученной в (i);

(iii) индукцию индуцируемого теплом промотора способами, по существу известными.

Далее изобретение описывается с более подробными деталями, со ссылками на фигуры, на которых показано следующее:

Фиг.1 показывает кривые роста Н. polymorpha при 27С, 37С и 47С.

Фиг.2 показывает жизнеспособность после вхождения в стационарную фазу при 27С, 37С и 47С.

Фиг.3А показывает Нозерн-блот РНК Н. polymorpha дикого типа после теплового шока от 27С до 47С и последующего охлаждения до 27С. Клетки культивировали в среде YDP при 27С до ранней экспоненциальной фазы роста; затем температуру увеличивали до 47С (нулевое время) и снова снижали до 27С через 120 минут.

Фиг.3В показывает Вестерн-блот белка Tps1 (Tps1p) H. polymorpha после теплового шока от 27С до 47С и последующего охлаждения до 27C (см. фиг.3А), из чего можно видеть корреляцию между увеличением TPSl-мРНК и увеличением белка Tps1 (Tps1p).

Фиг.3С показывает внутриклеточную концентрацию трегалозы и трегалоза-6-фосфатсинтазную активность, нанесенные против времени для Н. polymorpha после теплового шока от 27С до 47С и последующего охлаждения до 27С (см. фиг.3А). Не закрашенными кружками изображена внутриклеточная концентрация трегалозы, закрашенными квадратами показана трегалоза-6-фосфатсинтазная активность. Из фигуры очевидна корреляция между увеличением TPSl-мРНК и увеличением трегалоза-6-фосфатсинтазной активности и внутриклеточной концентрацией трегалозы.

На фиг.4 показаны три гистограммы, изображающие трегалоза-6-фосфатсинтазную активность (белые столбики) и внутриклеточную концентрацию трегалозы (черные столбики) в клетках Hansenula polymorpha, культивируемых при 27С (А), 37С (В) и 47С (С) и при глюкозной депривации спустя 7, 10, 17 и 36 часов. Накопление трегалозы коррелирует с увеличением трегалоза-6-фосфатсинтазной активности (фиг.4А), увеличением TPSl-мРНК (фиг.4 В) и увеличением белка Tps1 (Tps1p) (фиг.4 С).

На фиг.5 показана гомология некоторых областей последовательности ДНК трегалоза-6-фосфатсинтазы ряда организмов.

На фиг.6 показана последовательность ДНК гена TPS1 Н. polymorpha (SEQ ID №8) и выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID №6). Элементы теплового шока в последовательности промотора подчеркнуты.

На фиг.7 показана плазмида рС11, производная рМ1 (М. Suckow, персональное сообщение), которая была получена встраиванием гена lacZ в полилинкер рМ1. Плазмида содержит последовательность HARS1 (автономно реплицирующиеся последовательности Н. polymorpha), ori (начало репликации) pBR322, ген устойчивости к ампициллину, ген URA3 для размножения и селекции в Н. polymorpha и Е. coli и терминатор МОХ после гена lacZ для терминации процесса транскрипции.

На фиг.8 показана плазмида pCll-FMD, полученная посредством встраивания промотора FMD перед репортерным геном lacZ плазмиды рС11.

На фиг.9 показана плазмида pCll-TPS1, полученная посредством встраивания промотора TPS1 перед репортерным геном lacZ плазмиды рС11.

На фиг.10 показано сравнение между активностью промоторов FMD (А) и TPS1 (В) при 30, 37 и 44С в трех различных источниках углерода (2% глюкозы, 2% глицерина или 2% метанола).

На фиг.11 показана плазмида pTPSlConphysMT, используемая в примере 4. МОХ-Т = терминатор МОХ, Conphys = ген Соnрhys3, TPS1 = промотор TPS1 Hansenula polymorpha, HARS = автономно реплицирующиеся последовательности Н. polymorpha, tet = ген устойчивости к тетрациклину, URA3 = URA3 S. cerevisiae, amp = ген устойчивости к ампициллину.

ПРИМЕРЫ

Материалы и способы

Специальные реактивы и материалы

Bio 101, Vista, USA - набор Geneclean II

BioRad Lab., Munich, Germany - анализ белка BioRad (Bredford)

Boehringer, Mannheim, Germany - набор GOD/POD для измерения глюкозы, этанольный набор, таблетки для “полного” коктейля ингибиторов протеаз “COMPLETE”

Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland - циклогексимид (актидион), SDS, D⁺-тpeгaлoзa, PEP, трицин, НАДФ, фенольный реактив Фолина-Чиокалтеу

ICN Biochemicals, Ohio/USA - "Liquigel" 40% акриламид/N'N'-метиленбисакриламид (37,5:1)

Kodak, New York, USA - регистрирующая пленка для научных целей ВIOМАХ MR

Mediatech, Herndon, USA - сульфат генетицина G418 (антибиотик)

Perkin Elmer Applied Biosystems - набор для секвенирования ДНК Forest City, USA

Pharmacia Biotech, Sweden - колонки Nap-10 (с сефадексом G-25), все используемые рестриктазы, полимераза Taq

Qiagen GmbH, Germany - набор для плазмид Plasmide

Midi (50)

Schleicher + Schuell, Dassel, Germany - Protran BA 83 0,2 мкм/ 82 мм

(круглый фильтр из нитрата целлюлозы), Protran BA 83 0,2 мкм (мембрана для переноса при блоттинге)

Sigma, St. Louis, USA - моноклональные антикроличьи иммуноглобулины козы (конъюгат с щелочной фосфатазой), трегалоза почек свиньи (№ в каталоге Т-8778), UDPG, глюкоза-6-Р, LDH, пируваткиназа

Stratagene, La Jolla, USA - набор Prime-It II (набор для мечения со случайным праймером), колонки NucTrap (колонки для очистки проб, включая защитное устройство от бета-излучения для колонок под давлением)

US Biological, Swampscott, USA - бактериологический агар, бульон YPD, дополненный композицией W/Peptone X, бульон LB Миллера

Используемая аппаратура

Прибор для электропорации - генератор импульсов для Е. coli, BioRad Laboratories, Hercules USA

ВЭЖХ - DIONEX DX-300, DIONEX, Sunnyvale, USA

Охлаждаемые центрифуги - Centricon H-401, Kontron Instr. AG, Zurich, Switzerland IEC Centra GP8R, Brouwer, Lucerne, Switzerland

Biofuge 17RS, Heraeus Sepatech, Germany

Аппаратура для ПЦР - Progene, Techne, Cambridge, United Kingdom

Визуализатор фосфора - GS 250 молекулярный визуализатор (включая связанное оборудование), BioRad Laboratories, Hercules, USA

Фотометр - Anthos 2001 (для планшетов для микротитрования), Anthos Labtec Instruments, Salzburg, Austria

Shimadzu UV-160A, Japan

Секвенатор - ABI PRISM 301 Genetic Analyzer, Perkin Elmer, Applied Biosystems, Foster City, USA

Бактериальный штамм и условия культивирования

Штамм DH5 E. coli (F' endAlhsdR17r_km_k+supE44thi-lrecAlgyra relA(lacZYA-argF) U169 (80(lacZ)M15)(Gibco BRL, Gaithersburg MD, USA) использовали для клонирования гена TPS1 Н. polymorpha, следуя стандартному протоколу (Sambrook et al., 1989). Среду для Е. coli также получали в соответствии со стандартными процедурами (Sambrook et. al.,1989).

Выделение плазмидной ДНК из Е. coli (STET prep)

Плазмидную ДНК выделяли в соответствии с модифицированным протоколом, согласно Sambrook et. al. (1989). Использовали шпатель для того, чтобы соскабливать клеточный материал с чашки. Затем полученный материал добавляли к 500 мкл STET (8% [мас./об.] сахарозы, 5% [об./об.] тритона Х-100, 50 мМ ЭДТА, 50 мМ трис-HCl, рН 8,0) с 35 мкл лизоцима (10 мг/мл) и перемешивали. Затем образцы кипятили в течение 1 мин 40 с при 100С и центрифугировали в течение 10 минут при 20000 g и 4С. Примерно 400 мкл надосадка отбирали пипеткой и осаждали ДНК, используя 400 мкл изопропанола. После центрифугирования в течение 10 минут при 20000 g и 4С надосадок полностью удаляли и осадок ДНК один раз промывали ледяным 70% [об./об.] этанолом. Наконец ДНК сушили при комнатной температуре и суспендировали в 50-70 мкл ТЕ (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0).

Штамм дрожжей и условия культивирования

Используемым штаммом дрожжей был Hansenula polymorpha дикого типа (имеющийся в наличии благодаря Р. Piper, London (1994)). Исходные культуры выращивали на агаре YPD (2% [мас./об.] глюкозы, 2% [мас./об.] бактопептона, 1% [мас./об.] дрожжевого экстракта, 2% [мас./об.] агара), и исходные культуры обновляли каждые шесть недель. Данные культуры служили в качестве инокулята для жидких культур YPD (состав тот же, что и для агара YPD, но без 2% [мас./об.] агара).

Штамм RB11 Н. polymorpha (штамм Н. polymorpha odc1, без оротидин-5-фосфатдекарбоксилазы (ауксотрофный по урацилу) (Weydemann et al., 1995)) использовали для экспериментов в примерах 3 и 4. Используемая полная среда содержала 2% глюкозы или глицерина, 1% дрожжевого экстракта и 2% бактопептона; селективная среда содержала 0,17% азотистого основания дрожжей, 0,5% сульфата аммония, 2% глюкозы или глицерина, 38,4 мг/л аргинина, 57,6 мг/л изолейцина, 48 мг/л фенилаланина, 57,6 мг/л валина, 6 мг/мл треонина, 50 мг/л инозитола, 40 мг/л триптофана, 15 мг/л тирозина, 60 мг/л лейцина, 4 мг/л гистидина. Урацил не присутствовал в селективной среде.

Для культивирования клеточных культур в автоклавированную жидкую среду инокулировали исходную культуру и инкубировали в течение ночи в инкубаторах с качалками при 27, 37 или 47С, в зависимости от эксперимента.

Определение оптической плотности культур клеток Н. polymorpha

Чтобы определить оптическую плотность (OD) 200 мкл культуры клеток (соответствующим образом разведенной YPD там, где это применимо) помещали в лунку планшета для микротитрования и измеряли при 620 нм, используя фотоспектрометр Anthos 2001. 200 мкл YPD использовали в качестве пустого контроля.

Эксперименты по росту и тепловому шоку с Н. polymorpha

Ночные культуры использовали для инокуляции в среду YPD в колбах Эрленмейера. Засев данной исходной культуры при той температуре, при которой потом начинали сам эксперимент (27С для тепловых шоков, 27, 37 или 47С для ростовых экспериментов) проводили особенно тщательно.

Культуры высевали при начальной плотности OD₆₂₀ 0,2 для каждого ростового эксперимента и непрерывно поддерживали в инкубаторах с качалками (Multitron). Напротив, для экспериментов по тепловому шоку культуры высевали при начальной OD 0,05. Культурам давали возможность расти при 27С до OD₆₂₀ 0,4 (примерно 1-1,510⁸ клеток в мл культуры) перед проведением теплового шока при 47С в водяной бане с качалкой (Aquatron). Затем в течение следующих двух часов отбирали образцы. Затем культуру клеток охлаждали во второй водяной бане в течение одного часа до 27С.

Трансформация Н. polymorpha путем электропорации

В 100 мл YPD высевали 5 мл плотно выросшей ночной культуры. Культуру встряхивали при 37С примерно в течение трех часов до OD₆₀₀ 0,8-1,2. Клетки собирали центрифугированием при 3000 об/мин и снова суспендировали в 20 мл буфера Kp_i (50 мМ/рН 7,5). После добавления 0,5 мл DTT и встряхивания в течение 15 мин при 37С клетки осаждали центрифугированием при 2500 об/мин и дважды промывали буфером STM (270 мМ сахарозы, 10 мМ трисС1, 1 мМ MgCl₂, pH 7,5). Затем их суспендировали в 0,25 мл буфера STM, и аликвоты объемом 60 мкл хранили при -70С. Для трансформации векторами, интегрирующими в рДНК, плазмидную ДНК сначала линеаризовали XhoI или SacI. 0,1-1 мкг линеаризованной плазмидной ДНК смешивали со свежими компетентными клетками, размороженными на льду. Затем эти препараты помещали в 2 мм кюветы. Трансформацию выполняли в генераторе импульсов Gene Pulser (Bio-Rad, Munich) при 2,0 кВ, 25 мкФ и 200 Ом. З