Конъюгаты эритропоэтина и полиэтиленгликоля, фармацевтические композиции (варианты), способ профилактического и/или терапевтического лечения нарушений и способ получения коньюгата или композиции

Конъюгаты эритропоэтина и полиэтиленгликоля, фармацевтические композиции (варианты), способ профилактического и/или терапевтического лечения нарушений и способ получения коньюгата или композиции

Реферат

 

Изобретение относится к конъюгату гликопротеина эритропоэтина, который имеет по меньшей мере одну свободную аминогруппу и обладает биологической активностью in vivo, обусловливающей увеличение производства ретикулоцитов и эритроцитов клетками костного мозга, и который выбирают из группы, включающей человеческий эритропоэтин и его аналоги, которые имеют последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированную добавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования или перегруппировкой по меньшей мере одного сайта гликозилирования. Этот гликопротеин ковалентно связан с 1-3 (низш.)алкоксиполи(этиленгликольными) группами, каждая поли(этиленгликольная) группа ковалентно связана с гликопротеином через линкер формулы -C(O)-X-S-Y, при этом С(O)-группа линкера образует амидную связь с одной из этих аминогрупп, где Х обозначает -(СН₂)_k- или -СН₂(О-СН₂-СН₂)_k- , k обозначает 1-10, Y обозначает

Средняя молекулярная масса каждого поли(этиленгликольного) фрагмента составляет от примерно 20 до примерно 40 кДа и молекулярная масса конъюгата составляет от примерно 51 до примерно 175 кДа. Также изобретение относится к фармацевтическим композициям, композиции, способу профилактического и/или терапевтического лечения и способу получения коньюгата. Изобретение позволяет получить коньюгаты, отличающиеся более продолжительным временем полужизни в кровотоке и временем сохранения в плазме, пониженным клиренсом и более высокой активностью in vivo. 6 с. и 33 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.

Предпосылки создания изобретения

Эритропоэз представляет собой процесс образования эритроцитов, который служит для восполнения клеточной деструкции. Эритропоэз представляет собой контролируемый физиологический механизм, в результате которого образуется количество эритроцитов, необходимое для соответствующего насыщения кислородом ткани. Встречающийся в естественных условиях человеческий эритропоэтин (hЕРО) представляет собой состоящий из 165 аминокислот гликопротеин, который продуцируется почкой и является гуморальным плазменным фактором, стимулирующим образование эритроцитов (Carnot P. и Deflandre С., C.R.Acad. Sci. 143: 432 (1906); Erslev A.J., Blood 8: 349 (1953); Reissmann K.R., Blood 5: 372 (1950); Jacobson L.O., Goldwasser E., Freid W. и Pizak L.F., Nature 179: 6331-6334 (1957)). Человеческий ЕРО стимулирует деление и дифференцировку коммитированных эритроидных предшественников в костном мозге. Человеческий ЕРО проявляет свою биологическую активность посредством связывания с рецепторами на эритоидных предшественниках (Ktantz B.S. (1991) Blood 77: 419). Встречающийся в естественных условиях человеческий эритропоэтин представляет собой присутствующий в плазме в низких концентрациях кислый гликопротеин, стимулирующий восполнение эритроцитов, которые погибают в процессе старения.

Эритропоэтин был получен путем биологического синтеза с использованием методики рекомбинантной ДНК (Egrie J.C., Strickland T.W., Lane J. и др., Immunobiol. 72: 213-224 (1986)) и является продуктом клонированного человеческого гена ЕРО, встроенного и экспрессируемого в клетках ткани яичника китайского хомячка (СНО-клетки). Встречающийся в естественных условиях человеческий эритропоэтин сначала транслируют в состоящую из 166 аминокислот кислот (ак) полипептидную цепь, содержащую аргинин в положении 166. В результате посттрансляционной модификаци аргинин в положении 166 расщепляют с помощью карбоксипептидаз. Первичная структура человеческого ЕРО (165 ак) приведена на фиг.1. Первичная структура человеческого ЕРО (166 ак) приведена на фиг.2. Присутствуют два дисульфидных мостика между Cys⁷Cys¹⁶¹ и Cys²⁹-Cys³³ Молекулярная масса полипептидной цепи человеческого ЕРО без фрагментов сахара составляет 18236 Да. В интактной молекуле ЕРО примерно 40% молекулярной массы приходится на долю углеводных групп (Sasaki П., Bothner В. Dell А. и Fukuda М., J. Biol. Chem. 262: 12059 (1987)).

Поскольку человеческий эритропоэтин играет ключевую роль в образовании эритроцитов, этот гормон может применяться при лечении заболеваний крови, для которых характерно низкое производство или производство аномальных эритроцитов. В клинических условиях ЕРО применяют, например, для лечения анемии у пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН) (Eschbach J.W., Egri J.C., Downing M.R. и др., NEJM 316: 73-78 (1987); Eschbach J.W., Abdulhadi M.H., Browne J.K. и др., Ann. Intern. Med. 111: 992 (1988); Egrie J.C., Eschbach J.W,. McGuire Т., Adamson J.W., Kidney Intl. 33: 262 (1988); Lim V.S., Degowin R.L., Zavala D. и др., Ann. Intern. Med. 110: 108-114 (1989)) и страдающих СПИДом и раковых больных, подвергающихся химиотерапии (Danna R.P., Rudnick S.A., Abels R.I. в: М.В.Garnick (ред.) Erythropoietin in Clinical Application An International Perspective, New York, NY: Marcel Dekker; 1990: стр.301-324). Однако биологическая доступность поступающих в продажу терапевтических средств на основе протеинов, таких как ЕРО, ограничена их коротким временем полужизни в плазме и чувствительностью к разложению протеазами. Эти недостатки препятствуют проявлению их максимальной потенциальной активности в клинических условиях.

Краткое изложение сущности изобретения

Таким образом, настоящее изобретение относится к новому классу ПЭГилированых производных эритропоэтина. Физиологически активные конъюгаты ПЭГ-ЕРО по изобретению включают гликопротеин эритропоэтин, имеющий по меньшей мере одну свободную аминогруппу и обладающий биологической активностью in vivo, обусловливающей увеличение производства ретикулоцитов и эритроцитов клетками костного мозга, и выбранный из группы. включающей человеческий эритропоэтин и его аналоги, которые имеют первичную последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированную добавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования; этот гликопротеин ковалентно связан с 1-3 (низш.)алкоксиполи(этиленгликольными) группами, каждая поли(этиленгликольная) группа ковалентно связана с гликопротеином через линкер формулы -C(О)-X-S-Y, при этом С(О)-группа линкера образует амидную связь с одной из этих аминогрупп, Х обозначает - (CH₂)_k или -CH₂(О-CH₂-CH₂)_k-, где k равно 1-10, Y обозначает

средняя молекулярная масса каждого поли(этиленгликольного) фрагмента составляет от примерно 20 до примерно 40 кДа и молекулярная масса конъюгата составляет от примерно 51 до примерно 175 кДа. Изобретение также относится к композициям, содержащим приведенные в настоящем описании конъюгаты, при этом процентное содержание конъюгатов в композиции, в которых n равно 1, составляет по меньшей мере 90%.

По сравнению с немодицированным ЕРО (т.е. ЕРО без присоединенного ПЭГ) и обычными конъюгатами ПЭГ-ЕРО конъюгаты по настоящему изобретению отличаются более продолжительным временем полужизни в кровотоке и временем сохранения в плазме, пониженным клиренсом и более высокой активностью, проявляемой in vivo в клинических условиях. Конъюгаты по изобретению могут применяться в таких же целях, что и ЕРО. В частности, конъюгаты по изобретению могут применяться для лечения пациентов, стимулируя деление и дифферецировку коммитированных эритроидных предшественников в костном мозге, аналогично тому как используют для лечения пациентов ЕРО.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения анемии у человека. Изобретение также относится к способу получения продуктов, включающих гликопротеин эритропоэтин, который предусматривает ковалентное взаимодействие -аминогруппы лизина протеина эритропоэтина с бифункциональным реагентом с получением промежуточного продукта с амидной связью. Бифункциональный реагент содержит реакционноспособную группу и защищенную тиольную группу. Промежуточный продукт с амидной связью затем подвергают ковалентному взаимодействию с активированным полиэтиленгликольным производным с получением продуктов по настоящему изобретению, включающих гликопротеин эритропоэтин.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 - первичная структура человеческого ЕРО (165 аминокислот).

Фиг.2 - первичная структура человеческого ЕРО (166 аминокислот).

Фиг.3 - активность in vivo ПЭГилированного ЕРО, определенная с помощью анализа с использованием нормоцитарных мышей (мышей с нормоцитами (зрелыми эритроцитами)).

Подробное описание изобретения

Определения

Понятие "протеин эритропоэтин", "эритропоэтин", "ЕРО" или "гликопротеин эритропоэтин" относится к гликопротеину, имеющему последовательность, представленную на фиг.1 (SEQ ID NО:1) или фиг.2 (SEQ ID NО:2), или к протеину или полипептиду, практически гомологичным им, биологические свойства которого связаны со стимуляцией производства эритроцитов и стимуляцией деления и дифференцировки коммитированных эритроидных предшественников в костном мозге. В контексте настоящего описания понятие протеин ЕРО включает такие протеины, которые модифицированы преднамеренно, например, с помощью сайтнаправленного мутагенеза, или в результате случайных мутаций. Эти понятия также включают аналоги, имеющие от 1 до 6 дополнительных сайтов гликозилирования, аналоги, имеющие по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту на карбоксильном конце протеина, причем дополнительная(ые) аминокислота(ы) включает(ют) по меньшей мере один сайт гликозилирования, и аналоги, имеющие аминокислотную последовательность, которая включает перегруппировку по меньшей мере одного сайта гликозилирования, например, аналоги, которые описаны в ЕР-А 640619. Эти понятия включают как имеющий естественное происхождение, так и полученный рекомбинантным путем человеческий эритропоэтин.

Понятие "практически гомологичная" относится к конкретной рассматриваемой последовательности, например, мутантной последовательности, отличающейся от последовательности, с которой проводится сравнение, наличием одной или нескольких замен, делеций или добавлений, "чистое" воздействие которых не приводит к неблагоприятному функциональному различию между рассматриваемой последовательностью и последовательностью, с которой проводится сравнение. Для целей настоящего изобретения последовательности, гомологичные более чем на 95%, обладающие эквивалентными биологическими свойствами и эквивалентными характеристиками экспрессии, рассматриваются как практически гомологичные. С целью оценки гомологии укорочением мутантной последовательности следует пренебрегать. Последовательности, имеющие меньшие степени гомологии, сопоставимые по биологической активности и имеющие эквивалентные характеристики экспрессии, считаются практически эквивалентными,

Понятие "фрагмент" протеина ЕРО обозначает любой протеин или полипептид, аминокислотная последовательность которого соответствует последовательности части или фрагмента протеина ЕРО, и который обладает биологической активностью ЕРО. Фрагменты включают протеины или полипептиды, полученные в результате протеолитического расщепления протеина ЕРО или с помощью общепринятых методов химического синтеза. Протеин ЕРО или его фрагмент являются "биологически активными", если введение протеина или фрагмента человеку приводит к стимуляции производства эритроцитов и стимуляции деления и дифференцировки коммитированных эритроидных предшественников в костном мозге. Определение биологической активности протеина ЕРО осуществляют с помощью общепринятых хорошо известных в данной области тестов, с использованием для этих целей одного или разных видов млекопитающих. Ниже приведен приемлемый тест, который может применяться для демонстрации биологической активности.

Понятие "терапевтически эффективное количество" относится к такому количеству продукта, включающего гликопротеин эритропоэтин, которое необходимо для проявления биологической активностью in vivo, обусловливающей увеличение производства клетками костного мозга ретикулоцитов и эритроцитов. Точное количество продукта, включающего гликопротеин эритропоэтин, предпочтительно определяется такими факторами, как конкретный тип заболевания, подлежащего лечению, состояние пациента, подвергаемого лечению, а также другими ингредиентами в композиции. Фармацевтические композиции, которые содержат продукт, включающий гликопротеин эритропоэтин, могут иметь форму, которая обладает высокой эффективностью при введении различными путями больному человеку, страдающему заболеваниями крови, для которых характерно низкое производство или производство аномальных эритроцитов. Средние терапевтически эффективные количества продукта, включающего гликопротеин эритропоэтин, могут варьироваться и, в частности, должны основываться на рекомендациях и предписаниях квалифицированного лечащего врача.

Настоящее изобретение относится к продуктам, включающим гликопротеин эритропоэтин, которые обладают биологической активностью in vivo, обусловливающей увеличение производства клетками костного мозга ретикулоцитов и эритроцитов, которые представлены формулой 1:

где X и Y имеют указанные выше значения, m равно от примерно 450 до примерно 900; n равно 1-3; R обозначает (низш.)алкил и Р обозначает гликопротеин эритропоэтин без аминогруппы или аминогрупп, которая(ые) образует(ют) амидную связь с X. Как будет описано ниже, получение и очистка ЕРО хорошо известны в данной области. Под ЕРО подразумевают встречающийся в естественных условиях или рекомбинантный протеин, предпочтительно человеческий, полученный из любого обычного источника, такого как ткани, культуры встречающихся в естественных условиях или рекомбинантных клеток, а также в результате синтеза протеинов. Под это понятие подпадают любые протеины, обладающие активностью ЕРО, такие как мутеины или другим путем модифицированные протеины. Рекомбинантный ЕРО можно получать путем экспрессии в клетках линии СНО, ВНК или HeLa с использованием метода рекомбинантной ДНК или путем эндогенной активации гена, т.е. когда экспрессия гликопротеина эритропоэтина происходит в результате эндогенной активации гена. Предпочтительными видами ЕРО для получения продуктов, включающих гликопротеин эритропоэтин, являются виды человеческого ЕРО. Более предпочтительно виды ЕРО представляют собой человеческий ЕРО, имеющий аминокислотную последовательность, представленную на фиг.1 (SEQ ID NО:1) или на фиг.2 (SEQ ID NО:2), наиболее предпочтительно аминокислотную последовательность человеческого ЕРО, представленную на фиг.1 (SEQ ID NО:1).

Человеческий протеина эритропоэтин также можно модифицировать, вводя по меньшей мере один дополнительный сайт гликозилирования, например, 1-6 дополнительных сайтов гликозилирования, в результате они имеют представленные ниже аминокислотные последовательности (но не ограничены ими). Приведенными ниже условными обозначениями показано, что представленная на фиг.1 последовательность модифицирована заменой нативной аминокислоты в обозначенном верхним индексом положении на аминокислоту, указанную слева от верхнего индекса.

Asn³⁰Thr³² фиг.1;

Asn⁵¹Thr⁵³ фиг.1;

Asn⁵⁷Thr⁵⁹ фиг.1;

Asn⁶⁹ фиг.1;

Asn⁶⁹Thr⁷¹ фиг.1;

Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹ фиг.1;

Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ фиг.1;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ фиг.1;

Ser⁸⁷ Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰ фиг.1;

Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Gly⁸⁹ Thr⁹⁰ фиг.1;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹² фиг.1;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²фиг.1;

Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ фиг.1;

Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asr⁸⁸Thr⁹⁰ фиг.1;

Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹ фиг.1;

Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹ фиг.1;

Asn¹³⁶Thr¹³⁸ фиг.1;

Аsn¹³⁸Тbr¹⁴⁰ фиг.1;

Thr¹²⁵ фиг.1 и

Pro¹²⁴Thr¹²⁵ фиг.1.

Человеческий протеин эритропоэтин также может являться аналогом, имеющим по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту на карбоксильном конце гликопротеина, причем дополнительная аминокислота включает по меньшей мере один сайт гликозилирования, т.е. гликопротеин имеет последовательность, включающую последовательность человеческого эритропоэтина и вторую последовательность на карбоксильном конце последовательности человеческого эритропоэтина, причем вторая последовательность содержит по меньшей мере один сайт гликозилирования.

Дополнительная аминокислотная последовательность может включать пептидный фрагмент, полученный из карбоксильного конца человеческого относящегося к хориону гонадотропина. Предпочтительно гликопротеин представляет собой аналог, выбранный из группы, включающей (а) человеческий эритропоэтин, имеющий аминокислотную последовательность SerSerSerSerLysAlaProProProSerLeuProSerProSerArgLeuProGlyProSerAspThrProIle LeuProGln (SEQ ID NО:3), простирающуюся от карбоксильного конца; (б) аналог, указанный в разделе (а), дополнительно включающий Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO; и (в) аналог, указанный в разделе (а), дополнительно включающий Аsn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO.

Человеческий протеин эритропоэтин также может являться аналогом, имеющим аминокислотную последовательность, которая включает перегруппировку по меньшей мере одного сайта гликозилирования. Перегруппировка может представлять собой делецию любого их N-связанных углеводных сайтов в человеческом эритропоэтине и добавление N-связанного углеводного сайта в положение 88 аминокислотной последовательности человеческого эритропоэтина. Предпочтительно гликопротеин представляет собой аналог, выбранный из группы, включающей Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO; Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO и Gln⁸³ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO.

Аналоги эритропоэтина с дополнительными сайтами гликозилирования описаны в ЕР-А 640619, на имя Elliot, опубликованной 1 марта 1995 г., содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

В формуле 1 R может обозначать любой (низш.)алкил, который имеет линейную или разветвленную алкильную группу, включающую от 1 до 6 атомов углерода, такой как метил, этил, изопропил т.д. Предпочтительным алкилом является метил.

В формуле 1 Х обозначает -(CH₂)_kили -CH₂(О-CH₂-CH₂)_k-, где k обозначает от 1 до примерно 10. Предпочтительно k обозначает от 1 до примерно 4, более предпочтительно k обозначает 1 или 2. Наиболее предпочтительно Х обозначает (CH₂).

В формуле 1 Y обозначает

Предпочтительно Y обозначает

Наиболее предпочтительно Y обозначает

В формуле 1 значение m выбирают таким образом, чтобы образовавшийся конъюгат формулы 1 имел физиологическую активность, сопоставимую с активностью немодицированного ЕРО, указанная активность может быть такой же, более высокой или составлять только часть активности немодифицированного ЕРО. “m” обозначает количество этиленоксидных звеньев в ПЭГ-фрагменте. Одна субъединица ПЭГ, т.е. -(ОСН₂СН₂)-, имеет молекулярную массу примерно 44 Да. Таким образом, молекулярная масса конъюгата (включая молекулярную массу ЕРО) зависит от величины m. Понятие "примерно" по отношению к молекулярной массе обозначает определенные значения, которые находятся в приемлемом диапазоне значений этой величины при определении с использованием общепринятых аналитических методов, "m" обозначает целое число от примерно 450 до примерно 900 (что соответствует молекулярной массе от 20 до 40 кДа), предпочтительно от примерно 550 до примерно 800 (что соответствует молекулярной массе примерно от 24 до 35 кДа) и наиболее предпочтительно "m" имеет значение от примерно 650 до примерно 700 (что соответствует молекулярной массе примерно от 29 до 31 кДа).

В формуле 1 "n" обозначает количество -аминогрупп аминокислоты лизина в протеине эритропоэтине, ковалентно связанных с ПЭГ через амидную связь. Конъюгат по изобретению может иметь одну, две или три ПЭГ-группы на молекулу ЕРО. "n" обозначает целое число, находящееся в диапазоне от 1 до 3, предпочтительно "n" обозначает 1 или 2 и более предпочтительно "n" обозначает 1.

Предпочтительные включающие гликопротеин эритропоэтин продукты представлены формулами:

где Р, R, X, m и n имеют указанные выше значения.

Наиболее предпочтительные включающие гликопротеин эритропоэтин продукты, представлены формулой:

где Р, R, X, m и n имеют указанные выше значения.

Другие предпочтительные включающие гликопротеин эритропоэтин продукты представлены формулами:

где Р и n имеют указанные выше значения.

Наиболее предпочтительные включающие гликопротеин эритропоэтин продукты представлены формулой:

где Р и n имеют указанные выше значения.

Предпочтительными являются соединения, в которых Х обозначает -(CH₂)_k-, предпочтительно соединения, в которых k обозначает от 1 до 4, наиболее предпочтительно соединения, в которых Х обозначает -(CH₂)-.

Изобретение также относится к описанным выше конъюгатам, в которых m обозначает целое число от 550 до 800, предпочтительно m обозначает целое число от 650 до 700.

Предпочтительными соединениями по изобретению являются соединения, в которых n равно 1 и/или R обозначает метил.

Кроме того, изобретение относится к соединениям, в которых средняя молекулярная масса каждого поли(этиленгликольного) фрагмента составляет от примерно 24 до примерно 35 кДа, более предпочтительно примерно до 30 кДа.

Кроме того, изобретение относится к соединениям, в которых гликопротеин ковалентно связан с одним или двумя блокированными (низш.)алкоксигруппами поли(этиленгликольными) фрагментами, предпочтительно с одним блокированным (низш.)алкоксигруппой поли(этиленгликольным) фрагментом.

В предпочтительном варианте поли(этиленгликольные) фрагменты блокированы метоксигруппой.

Согласно наиболее предпочтительнму варианту осуществления изобретение относится к указанным выше соединениям, в которых Х обозначает -(СН₂)-, m обозначает целое число от 650 до 700, n равно 1, R обозначает метил и средняя молекулярная масса каждого поли(этиленгликольного) фрагмента составляет примерно 30 кДа.

Еще одним объектом изобретения является способ лечения анемии у человека, предусматривающий введение человеку терапевтически эффективного количества включающего гликопротеин эритропоэтин продукта формулы 1.

Следующим объектом изобретения является способ получения включающего гликопротеин эритропоэтин продукта, который обладает биологической активностью in vivo, обусловливающей увеличение производства ретикулоцитов и эритроцитов клетками костного мозга, который предусматривает следующие стадии:

(а) ковалентное взаимодействие -аминогруппы лизина протеина эритропоэтина, представленного формулой P-[NH₂]_n, с бифункциональным реагентом, представленным формулой Z-CO-X-S-Q, с получением промежуточного продукта с амидной связью, представленного формулой:

P-[NH-CO-X-S-Q]_n,

где Р обозначает протеин эритропоэтин, не содержщий аминогрупы, образующей амидную связь; n обозначает целое число от 1 до 3; Z обозначает реакционно-способную группу, например, NHS-эфиры карбоновой кислоты; Х обозначает - (СН₂)_k, или -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-, где k обозначает от 1 до примерно 10; и Q обозначает защитную группу типа алканоила, например ацетил;

(б) ковалентное взаимодействие промежуточного продукта с амидной связью, полученного на стадии (а), с активированным полиэтиленгликольным производным, представленным формулой W-[OCH₂CH₂]_m-OR, с получением включающего гликопротеин эритропоэтин продукта, представленного формулой

где W обозначает сульфгидрильную реакционноспособную форму Y; m обозначает целое число от примерно 450 до примерно 900; R обозначает (низш.)алкил; и Y обозначает

Согласно этому варианту бифункциональный реагент предпочтительно представляет собой N-сукцинимидил-S-ацетилтиопропионат или N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат, Z предпочтительно обозначает N-гидроксисукцинимид, а активированное полиэтиленгликольное производное W-[OCH₂CH₂]_m-OR предпочтительно выбирают из группы, включающей йодаце-тилметокси-ПЭГ, метокси-ПЭГ-винилсульфон и метокси-ПЭГ-малеимид.

Еще одним объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая конъюгаты, при этом каждый из конъюгатов, включает гликопротеин эритропоэтин, который имеет по меньшей мере одну свободную аминогруппу и обладает биологической активностью in vivo, обусловливающей увеличение производства ретикулоцитов и эритроцитов клетками костного мозга, и выбран из группы, включающей человеческий эритропоэтин и его аналоги, которые имеют первичную структуру человеческого эритропоэтина, модифицированную добавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования или путем перегруппировки по меньшей мере одного сайта гликозилирования; и гликопротеин ковалентно связан с 1-3 (низш.)алкоксиполи(этиленгликольными) группами, каждая поли(этиленгликольная) группа ковалентно связана с гликопротеином через линкер формулы -C(O)-X-S-Y, при этом С(O)-группа линкера образует амидную связь с одной из этих аминогрупп,

Х обозначает -(CH₂)_k или -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-,

k равно 1-10,

Y обозначает

средняя молекулярная масса каждого поли(этиленгликольного) фрагмента составляет от примерно 20 до примерно 40 кДа, и молекулярная масса конъюгата составляет от примерно 51 до примерно 175 кДа; и процентное содержание конъюгатов, в которых n равно 1, составляет по меньшей мере 90%. Предпочтительной указанной выше содержащей конъюгаты композицией является композиция, в которой процентное содержание конъюгатов, для которых n равно 1, составляет по меньшей мере 90%, более предпочтительно в которой процентное содержание конъюгатов, в которых n равно 1, составляет по меньшей мере 92% и еще более предпочтительно в которой процентное содержание конъгогатов, для которых n равно 1, составляет по меньшей мере 96%, и наиболее предпочтительно в которой процентное содержание конъюгатов, для которых n равно I, составляет от 90 до 96%.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей конъюгат или композицию, как они описаны выше, и фармацевтически приемлемый эксципиент, и к применению конъюгата или композиции, как они определены выше, для приготовления лекарственных средств, предназначенных для лечения или профилактики болезней, связанных с анемией у пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН), больных СПИДом и для лечения раковых больных, подвергающихся химиотерапии. Кроме того, изобретение относится к способу профилактического и/или терапевтического лечения нарушений, включающих анемию у пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН), больных СПИДом и раковых больных, подвергающихся химиотерапии, предусматривающей стадию введения пациенту композиции, как она описана выше.

Изобретение также относится к способу получения описанных выше конъюгатов или композиции, который предусматривает ковалентное связывание тиольных групп с гликопротеином эритропоэтином и сочетание образовавшегося активированного гликопротеина эритропоэтина с поли(этиленгликольным) (ПЭГ) производным. Кроме того, изобретение относится к конъюгатам и композициям, как они определены выше, полученным с помощью любого из описанных выше способов, и к конъюгатам и композициям, как они определены выше, предназначенным для лечения болезней, связанных с анемией у пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН), больных СПИДом и для лечения раковых больных, подвергающихся химиотерапии.

Методы экспрессии ЕРО-протеинов

Эритропоэтин (ЕРО) представляет собой человеческий гликопротеин, который стимулирует образование эритроцитов. Его получение и терапевтическое применение подробно описано, например, в патентах США 5547933 и 5621080, ЕР-В 0148605, у Huang S.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2708-2712 (1984), ЕР-В 0205564, ЕР-В 0209539 и ЕР-В 0411678, а также у Lai Р.Н. и др., J.Вiol.Chem. 261 3116-3121 (1986), Sasaki Н. и др., J.Biol.Chem. 262 12059-12076 (1987). Эритропоэтин для терапевтических целей можно получать методами рекомбинации (ЕР-В 0148605, ЕР-В 0209539 и у Egrie J.C., Strickland T.W., Lane J. и др., Immunobiol. 72: 213-224 (1986)). Экспрессия протеинов, включая ЕРО, с помощью эндогенной активации гена хорошо известна в данной области и описана, например, в патентах США 5733761, 5641670 и 5733746 и опубликованных международных заявках на патент WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 и WO 91/09955, содержание каждого документа включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Методы экспрессии и получения эритропоэтина в бессывороточной среде описаны, например, в WO 96/35718 на имя Burg, опубликованной 14 ноября 1996 г. и в ЕР-А 513738, на имя Koch, опубликованной 12 июня 1992 г.

Методы очистки человеческого ЕРО-протеина

Кроме методов, описанных в указанных выше публикациях, также известно, что в бессывороточной среде можно осуществлять ферментацию рекомбинантных СНО-клеток, которые содержат ген ЕРО. Такие методы описаны, например, в ЕР-А 0513738, ЕР-А 0267678 и в общей форме у Kawamoto Т. и др., Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453, ЕР-А 0248656, у Kowar J. и Franek F. Methods in Enzymology 421 (1986) 277-292, Bavister В., Expcology 271 (1981) 45-51, ЕР-А 0481791, ЕР-А 0307247, ЕР-А 0343635, WO 88/00967.

В ЕР-А 0267678 описано применение ионообменной хроматографии на S-сефарозе, препаративной хроматографии ЖХВР с обращенной фазой на колонке С₈ и гель-фильтрации для очистки ЕРО, полученного в бессывороточной культуре после диализа. В этом контексте стадию гель-фильтрации можно заменять ионообменной хроматографией с высокой скоростью потока на S-сефарозе. Также предлагается перед ионообменной хроматографией осуществлять хроматографию с красителем на колонке типа Blue Trisacryl.

Метод очистки рекомбинантного ЕРО описан у Nobuo I. и др., J.Biochem. 107 352-359 (1990). Согласно этому методу перед стадиями очистки ЕРО обрабатывают раствором Tween20, фенилметилсульфонилфторидом, этилмалеимидом, пепстатином А, сульфатом меди и оксаминовой кислотой.

В некоторых публикациях, включая WO 96/35718 на имя Burg, опубликованную 14 ноября 1996 г., описан метод получения эритропоэтина путем ферментации в бессывороточной среде (EPOsf). Ниже в качестве примера описан один из способов получения ЕРО, который является исходным продуктом для ПЭГилирования.

Биологический анализ для определения удельной активности ЕРО и включающих ЕРО конъюгатов

Удельную активность ЕРО или включающих ЕРО конъюгатов согласно настоящему изобретению можно определять различными известными в данной области методами. Биологическая активность очищенных ЕРО-протеинов по настоящему изобретению проявляется в том, что при введении ЕРО-протеина путем инъекции больным людям в клетках костного мозга увеличивается производство ретикулоцитов и эритроцитов по сравнению с неподвергавшимися инъекции или контрольными группами людей. Биологическая активность ЕРО-протеинов или их фрагментов, полученных и очищенных согласно настоящему изобретению, можно оценивать с помощью методов, описанных в Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio, 1997(2).

Другой биологический метод определения активности ЕРО-протеина, основанный на использовании нормоцитарных мышей, описан в примере 4.

Способы получения ПЭГилированного ЕРО

Способы получения включающих гликопротеин эритропоэтин продуктов, представленных формулой 1, заключается в ковалентном связывании тиольных групп ЕРО ("активация") и сочетании образовавшегося активированного ЕРО с поли(этиленгликольным) (ПЭГ) производным. Первая стадия получения ПЭГилированного ЕРО по настоящему изобретению заключается в ковалентном связывании тиольных групп через NН₂-группы ЕРО. Эту активацию ЕРО осуществляют с помощью бифункциональных реагентов, которые несут защищенную тиольную группу и дополнительную реакционноспособную группу, такую как активированные сложные эфиры (например, сукцинимидиловые эфиры), ангидриды, эфиры сульфоновых кислот, галогениды карбоновых кислот и сульфоновых кислот соответственно. Тиольную группу защищают известными в данной области группами, например ацетильными группами. Эти бифункциональные реагенты обладают способностью взаимодействовать с -аминогруппами содержащих лизин аминокислот путем образования амидной связи. Первая стадия реакции приведена ниже:

где ЕРО, n и Х имеют указанные выше значения и Z обозначает реакционноспособную группу, известную в данной области, например, N-гидроксисукцимидный (NHS) заместитель формулы

В предпочтительном варианте активацию -аминогрупп лизина осуществляют путем взаимодействия с бифункциональными реагентами, имеющими сукцинимидильный фрагмент. Бифункциональные реагенты могут нести различные вилы спейсеров, например, -(CH₂)_k или -СН₂-(O-СН₂-СН₂-)_k - фрагменты, где k имеет значения от 1 до примерно 10, предпочтительно от 1 до примерно 4 и более предпочтительно 1 или 2 и наиболее предпочтительно 1. Примерами этих реагентов являются N-сукцинимидил-S-ацетилтиопропионат (SATP) и N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат (SATA)

Ацетилтиoaлкилкapбoнoвый-NHS-эфиp типа

NHS-эфир 2-(ацетилтио)(этокси)_k-уксусной кислоты, где k имеет указанные выше значения.

Получение бифункциональных реагентов известно в данной области. Предшественники NHS-эфиров 2-(ацетилтио)(этокси)_k-уксусной кислоты описаны в DE-3924705, а дериватизация ацетилтиосоединения описана у March J. в: Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375-376. SATA имеется в продаже (фирма Molecular Probes, Эуген, штат Орегон, США и фирма Pierce, Рокфорд, штат Иллинойс).

Количество тиольных групп, которые необходимо добавлять к молекуле ЕРО, можно отобирать путем регулирования параметров реакции, т.е. концентрации протеина (ЕРО) и соотношения протеина/бифункционального реагента. Предпочтительно ЕРО активируют путем ковалентного связывания, используя от 1 до 5 тиольных групп на молекулу ЕРО, предпочтительно от 1,5 до 3 тиольных групп на молекулу ЕРО. Эти диапазоны соответствуют статистическому распределению тиольных групп в популяции ЕРО-протеина.

Реакцию осуществляют, например, в водном растворе буфера, рН 6,5-8,0, например, в 10 мМ фосфате калия, 50 мМ NaCl, рН 7,3. Бифункциональный реагент можно добавлять в ДМСО. После завершения реакции, предпочтительно через 30 мин, реакцию прекращают, добавляя лизин. Избыток бифункционального реагента можно удалять с помощью хорошо известных в данной области методов, например, диализом или фильтрацией на колонках. Среднее количество добавленных к ЕРО тиольных групп можно определять фотометрическими методами, описанными, например, у Grasetti D.R. и Murray J.E., J. Appl. Biotechnol., 119, 41-49(1967).

После указанной выше реакции осуществляют ковалентное сочетание активированного полиэтиленгликольного (ПЭГ) производного. Приемлемыми производными ПЭГ являются активированные молекулы ПЭГ со средней молекулярной массой от примерно 20 до примерно 40 кДа, более предпочтительно от примерно 24 до примерно 35 кДа, наиболее предпочтительно примерно 30 кДа.

Активированные производные ПЭГ известны в данной области и, например для ПЭГ-винилсульфона, описаны у Morpurgo М. и др., J.Biocohj. Chem., стр.363 и далее (1996). Для получения соединений формулы 1 можно применять виды ПЭГ с линейной цепью и разветвленной цепью. Примерами реакционноспособных ПЭГ-реагентов являются йодацетилметокси-ПЭГ и метокси-ПЭГ-винилсульфон:

Применение этих активированных йодом соединений известно в данной области и описано, например, у Hermanson G.T. в: Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996), стр.147-148.

Наиболее предпочтительно различные виды ПЭГ активируют с помощью малеимида (алкокси-ПЭГ-малеимид), такого как метокси-ПЭГ-малеимид (ММ 30000; фирма Shearwater Polymers Inc.)

Строение алкокси-ПЭГ-малеимида приведено ниже:

где R и m имеют указанные выше значения.

Наиболее предпочтительным производным является