Белок, соответствующий антигенному белку neisseria meningitidis и обладающий иммуногенными свойствами (варианты), связывающееся с ним антитело, нуклеотидная последовательность (варианты) и содержащая их фармацевтическая композиция

Белок, соответствующий антигенному белку neisseria meningitidis и обладающий иммуногенными свойствами (варианты), связывающееся с ним антитело, нуклеотидная последовательность (варианты) и содержащая их фармацевтическая композиция

Реферат

 

Настоящее изобретение представляет белки бактерий менингококка Neisseria meningitidis (штаммы А и В) и Neisseria gonorrhoeae. Аминокислотные последовательности заявленных белков представлены в описании. Представлены соответствующие нуклеотидные последовательности, кодирующие заявленные белки. Представленные белки в качестве антигенов входят в состав вакцин, иммуногенных композиций и(или) применимы для диагностических целей. Заявлено антитело, которое связывается с указанным белком. Изобретение позволяет повысить эффективность препаратов, используемых для диагностики, лечения и предупреждения инфекций, вызываемых Neisseria meningitidis и gonorrhoeae. 9 н. и 3 з.п. ф-лы, 61 ил., 2 табл.

Настоящее изобретение касается антигенов бактерий рода Neisseria.

Предпосылки для изобретения

Бактерии Neisseria meningitidis и Neisseria gonorrhoeae являются неподвижными грамотрицательными бактериями-диплококками, проявляющими патогенность в отношении человека. N.meningitidis образуют колонии в глоточном отделе и вызывают менингит (а также, в отдельных случаях, септицемию без менингита); N.gonorrhoeae образуют колонии в половых путях, вызывая гоноррею. Несмотря на то, что они образуют колонии в разных частях тела и вызывают совершенно разные заболевания, эти два патогена очень близки друг к другу, хотя имеется и отчетливое различие между менингококком и гонококком, связанное с наличием полисахаридной капсулы, которая имеется у всех патогенных менингококков.

Гонококк N.gonorrhoeae обусловливает приблизительно 800 тысяч заболеваний в год за период 1983-90 гг. только в США (глава, написанная Meitzner & Cohen, 1997, "Vaccines Against Gonococcal Infection", In "New Generation Vaccines", 2d ed., ed. Levine, Woodrow, Kaper & Gobon, Marcel Dekker, NY, pp.817-842). Это заболевание имеет широкую распространенность, хотя смертность от него низка. Очень желательной является вакцинация против возбудителя гонорреи, однако многочисленные такие попытки были безуспешными. Основными "антигенами-кандидатами" для создания таких вакцин являются расположенные на поверхности белки, такие как пили, порины, ассоциированные с помутнением белки (Opas) и другие поверхностные белки, такие как Lip, Laz, IgAl-протеаза и трансферрин-связывающие белки. Также в качестве вакцины предлагалось использовать липополисахарид (LOS) (Meitzner & Cohen, цит. выше).

Менингококк N.meningitidis обусловливает и эндемическую, и эпидемическую форму заболевания. В США уровень заболеваемости составляет 0,6-1 на 100 тысяч человек в год, и этот показатель может повышаться в условиях вспышки заболевания (см. Lieberman et al., 1996, "Safety and Immunogenicity of a Serogroups A/C Neisseria meningitidis Oligosaccharide-Protein Conjugate Vaccine in Young Children", JAMA, 275 [19], 1499-1503; Schuchat et al., 1997, "Bacterial Meningitis in the United States in 1995", New England J. Med., 337 [14], 970-976). В развивающихся странах частота эндемических случаев заболевания существенно выше и при возникновении эпидемий этот показатель может достигать 500 случаев на 100 тысяч человек в год. Уровень смертности очень высок - примерно 10-20% в США и еще выше в развивающихся странах. После внедрения комбинированной вакцины против Haemophilus influenzae менингококк N.meningitidis становится основным возбудителем бактериальных форм менингита во всех возрастных группах в США (Schuchat et al., 1997, цит. выше).

Исходя из параметров составляющих капсулу менингококка полисахаридов было идентифицировано 12 серогрупп N.meningitidis. Группа А включает патоген, который в основном связан с эпидемиологическими формами заболевания в присахарских областях Африки. Серогруппы В и С связаны с подавляющим большинством случаев менингита в США и большинстве развитых стран. Серогруппы W135 и Y связаны с остальными случаями в США и развитых странах. Применяемая в настоящее время менингококковая вакцина является тетравалентной полисахаридной вакциной, содержащей факторы серогрупп А, С, Y и W135. Будучи эффективной в приложении к подросткам и взрослым, эта вакцина обусловливает слабый иммунный ответ и кратковременную защиту, а также не может быть применена для маленьких детей (см., например, еженедельный доклад "Morbidity and Mortality weekly report., Vol.46, N RR-5, 1997). Это обусловливается тем, что полисахариды являются независимыми от Т-клеток антигенами, которые обусловливают весьма слабый иммунный ответ, который не может быть усилен (подвергнут "бустингу") путем повторной иммунизации. Достигнув успеха в вакцинации против Н.influenzae, были разработаны комбинированные вакцины против серогрупп А и С - в настоящее время заканчиваются их клинические испытания (W.D.Zollinger, "New and Improved Vaccines Against Meningococcal Disease", In "New Generation Vaccines", supra, pp. 469-488; Lieberman et al., 1996, цит. выше; Constantino et al., 1992, "Development and phase I clinical testing of a conjugate vaccine against meningococcus A and C", Vaccine, 10, 691-698).

Однако проблемным остается серотип В менингококка. В настоящее время этот серотип обусловливает примерно 50% общего количества случаев менингита в США, Европе и Южной Америке. "Полисахаридный подход" не может быть использован, потому что капсулярный полисахарид menB является полимером связанных по (2-8) N-ацетилнейраминовых кислот, которые также присутствуют в тканях млекопитающих. Это обусловливает толерантность к данному антигену: действительно, если предположить проявление иммунного ответа, то он будет направлен и на собственный организм - т.е. такой ответ является нежелательным. С целью исключения индукции аутоиммунного ответа и индукции защитного иммунного ответа входящий в состав капсулы полисахарид был, например, химически модифицирован путем замещения N-ацетильных групп на N-пропионильные группы, вследствие чего специфичная антигенность остается неизмененной (Romero & Outschoorn, 1994, "Current Status of Meningococcal group В vaccine candidates: capsular or non-capsular?", Clin. Microbiol. Rev., 7 [4], 559-575).

В альтернативных подходах к созданию вакцин против менингита-В использовали комплексные смеси белков внешней мембраны (ОМР), включая сами по себе белки ОМР или ОМР, обогащенные поринами, или делетированные варианты ОМР 4-го класса, которые, как считается, индуцируют выработку антител, блокирующих бактерицидную активность. В этом подходе получают вакцины, полной характеристики которых пока не получено. Эти вакцины способны обеспечивать защиту от гомологичного штамма, но при этом оказываются по сути неэффективными в тех случаях, когда имеются многочисленные антигенные варианты белков внешней мембраны. Для преодоления фактора антигенной изменчивости были получены мультивалентные вакцины, содержащие вплоть до 9 различных поринов (см., например, J.T.Poolman, 1992, "Development of a meningococcal vaccine", Infect. Agents Dis., 4, 13-28). Другими белками, которые используются при создании "внешнемембранных вакцин", являются белки ора и орс - однако ни один из применяемых подходов не обеспечивает преодоления фактора антигенной изменчивости (см., например, Ala'Aldeen & Borriello, 1996, "The meningococcal transferrinbinding proteins 1 and 2 are both surface exposed and generate bactericidal antibodies capable of killing homologous and heterologous strains", Vaccine, 14, 49-53).

Доступными являются некоторые данные по последовательностям менингококковых и гонококковых генов и белков (например, по патентным заявкам ЕР А-0467714 и WO 96/29412), однако, безусловно, они неполны. Получение дополнительных данных по последовательностям предоставит хорошие перспективы для идентификации секретируемых или располагающихся на поверхности клеток белков, которые являются перспективными мишенями для иммунной системы и которые не характеризуются антигенной изменчивостью. Например, некоторые из идентифицированных белков могли бы быть компонентами эффективных вакцин против менингококка-В, некоторые из них могли бы быть компонентами вакцин против всех менингококковых серотипов и другие могли бы быть компонентами вакцин против всех патогенных форм рода Neisseria.

Изобретение

Настоящее изобретение представляет белки, включающие аминокислотные последовательности, принадлежащие нейссериям, описанные в нижеследующих примерах. Эти последовательности относятся к N.meningitidis или N.gonorrhoeae.

Также представляются белки, включающие последовательности, гомологичные (т.е. характеризующиеся идентичностью последовательностей) аминокислотным последовательностям нейссерий, показанных в примерах. В зависимости от конкретной последовательности, уровень идентичности предпочтительно превышает 50% (например, 65, 80, 90% или больше). Эти гомологичные белки включают мутантные и аллельные варианты последовательностей, описанных в примерах. Обычно 50%-ная или более высокая идентичность двух белков рассматривается как свидетельство функциональной эквивалентности. Уровень идентичности двух белков предпочтительно определяют по методу Смита-Уотермана, алгоритм которого заложен в компьютерную программу MPSRCH (Oxford Molecular): используется поиск "аффинных гэпов" (т.е. не совпадающих в двух последовательностях участков) с установлением параметров "gap open penalty=12" и "gap extension penalty=1".

Далее настоящее изобретение представляет белки, включающие фрагменты аминокислотных последовательностей нейссерий, описанных в нижеследующих примерах. Эти фрагменты должны включать по крайней мере n непрерывных аминокислот из базовой последовательности, а, в зависимости от конкретной последовательности, n равно 7 и больше (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или больше). Предпочтительно такие фрагменты включают эпитоп из последовательности.

Белки по настоящему изобретению могут быть получены, конечно, с использованием различных подходов (например, методами рекомбинантной экспрессии, очистки из клеточных культур, химического синтеза и т.п.) и в различных формах (например, нативной, химерной и т.п.). Предпочтительно их получают в существенно чистой или выделенной форме (т.е. в существенной степени свободной от других белков нейссерий или клеточных белков организма-хозяина).

В соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения представляются антитела, которые связываются с такими белками. Это могут быть поликлональные или моноклональные антитела, которые могут быть получены с применением подходящих способов.

В соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения представляются нуклеиновые кислоты, включающие нуклеотидные последовательности нейссерий, описанные в примеpaх.

Кроме того, настоящее изобретение представляет нуклеиновые кислоты, включающие гомологичные последовательности (т.е. характеризующиеся идентичностью последовательностей) по отношению к нуклеотидным последовательностям нейссерий, описанным в примерах.

Далее, настоящее изобретение представляет нуклеиновые кислоты, которые могут гибридизовать с нуклеиновыми кислотами нейссерий, описанными в примерах, причем предпочтительно в жестких условиях гибридизации (например, при 65С в растворе 0,1SSC, 0,5% SDS).

Также представляются нуклеиновые кислоты, включающие фрагменты таких последовательностей. Они должны включать по крайней мере n расположенных подряд нуклеотидов из состава последовательностей нейссерий, а, в зависимости от конкретной последовательности, n равно 10 или больше (например, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 или больше).

В соответствии со следующим аспектом настоящее изобретение представляет нуклеиновые кислоты, кодирующие белки и фрагменты белков по настоящему изобретению.

Также должно быть понятно, что настоящее изобретение представляет нуклеиновые кислоты, включающие последовательности, комплементарные тем последовательностям, которые были описаны выше (например, для целей получения антисмысловых последовательностей или зондов).

Нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением могут быть, конечно, получены многими способами (например, с помощью химического синтеза, из библиотек геномной ДНК или кДНК, непосредственно из организма и т.п.) и могут принимать различные формы (например, одноцепочечную, двухцепочечную, векторную формы, форму зондов и т.п.).

Дополнительно следует сказать, что термин "нуклеиновая кислота" включает ДНК и РНК, а также их аналоги, такие как те, которые включают модифицированные молекулярные скелеты, а также нуклеопротеины (PNA) и т.п.

В соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения представляются векторы, включающие нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению (например, экспрессирующие векторы) и клетки-хозяева, трансформированные такими векторами.

В соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения представляются композиции, содержащие белок, антитело и (или) нуклеиновую кислоту в соответствии с настоящим изобретением. Эти композиции могут быть использованы в качестве, например, вакцин или в качестве диагностических реагентов, или в качестве иммуногенных композиций.

Настоящее изобретение также представляет нуклеиновую кислоту, белок или антитело, соответствующие настоящему изобретению, для использования в качестве лекарственных средств (например, в качестве вакцин) или в качестве диагностических реагентов. Также представляется использование нуклеиновой кислоты, белка или антител в соответствии с настоящим изобретением в производстве: (1) лекарственного средства, предназначенного для лечения или профилактики инфицирования бактериями рода Neisseria; (2) диагностического реагента, предназначенного для детекции присутствия бактерий Neisseria или антител, специфичных в их отношении; и (или) (3) реагента, который может обусловливать выработку антител против нейссерий. Упомянутые бактерии рода Neisseria могут быть представлены любым видом или штаммом (таким как N.gonorrhoeae или любой штамм N.meningitidis, такие как штамм А, штамм В или штамм С).

Также настоящее изобретение представляет способ лечения пациента, включающий введение этому пациенту терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты, белка и (или) антитела, соответствующих настоящему изобретению.

В соответствии с другими аспектами настоящего изобретения представляются различные способы.

Представляется способ получения белков по настоящему изобретению, включающий этап культивирования клетки-хозяина в соответствии с настоящим изобретением в условиях, которые стимулируют экспрессию белка.

Представляется способ получения белка или нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, при том, что такой белок или такая нуклеиновая кислота синтезируются полностью или частично с использованием химических методик.

Представляется способ детекции полинуклеотидов по настоящему изобретению, включающий следующие этапы: (1) контакт нуклеотидного зонда по настоящему изобретению с биологическим образцом в условиях, пригодных для молекулярной гибридизации с образованием дуплексов; и (2) детекция упомянутых дуплексов.

Представляется способ детекции белков по настоящему изобретению, включающий следующие этапы: (1) контакт антитела по настоящему изобретению с биологическим образцом в условиях, пригодных для образования комплекса "антиген-антитело"; и (2) детекция упомянутых комплексов.

Далее следует обзор стандартных методологий и процедур, которые могут быть использованы с целью осуществления настоящего изобретения (например, с целью использования заявляемых последовательностей для вакцинации или в диагностических целях). Этот обзор не является ограничением для настоящего изобретения, но при этом является примером такого его осуществления, которое не является строго обязательным.

Общие положения

Практическая реализация настоящего изобретения основывается, за исключением отдельно оговариваемых случаев, на стандартных методиках молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, которые известны специалистам в данной области техники. Такие методики подробно описаны в научной литературе: например, Sambrook, 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2d Ed.; "DNA Cloning", Vol.I & II, ed. D.N. Glover, 1985; "Oligonucleotide Synthesis", ed. M.J.Gait, 1984; "Nucleic Acid Hybridization", eds. B.D.Hames & S.J.Higgins, 1984; "Transcription and Translation", eds. B.D.Hames & S.J.Higgins, 1984; "Animal Cell Culture", ed. R.I.Freshney, 1986; "Immobilized Cells and Enzymes", IRL Press, 1986; B.Perbal, 1984, "A Practical Guide to Molecular Cloning"; серия руководств "Methods in Enzymology" (издано Academic Press Inc.), особенно тома 154 и 155; "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells", eds. J.H.Miller & M.P.Calos, Cold Spring Harbor Lab., 1987; "Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology", eds. Mayer & Walker, Acad. Press, London, 1987; Scopes, 1987, "Protein Purification: Principles and Practice", 2d ed., Springer-Verlag, NY; и "Handbook of Experimantal Immunology", Vol.I-IV, eds. D.M.Weir & C.C.Blackwell, 1986).

В настоящем описании используются стандартные аббревиатуры для обозначения аминокислот и нуклеотидов.

Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в данном тексте, включены в полном своем объеме в виде библиографических ссылок. В частности, в данный текст включены для сведения британские патентные заявки №№9723516.2, 9724190.5, 9724386.9, 9725158.1, 9726147.3, 9800759.4 и 9819016.8.

Определения

Композиция, содержащая X, "в существенной степени свободна от Y" тогда, когда по крайней мере 85% по весу от суммы X+Y приходится на долю компонента X. Предпочтительно Х составляет по крайней мере примерно 90% по весу от общего количества X+Y в данной композиции, более предпочтительно по крайней мере примерно 95% или даже 99% по весу.

Термин "включающий" означает "состоящий", равно как и "содержащий": например, композиция, "включающая" X, может состоять исключительно из компонента Х или может включать нечто дополнительное к X, например, сочетание X+Y.

Термин "гетерологичный" относится к двум биологическим компонентам, которые не встречаются вместе в природе. Такими компонентами могут быть клетки-хозяева, гены или регуляторные сегменты, такие как промоторы. Хотя гетерологичные компоненты в природе вместе не обнаруживаются, они могут обладать совместной функциональностью, например, когда промотор, гетерологичный по отношению к гену, функционально с ним соединен. Другим примером является такая ситуация, в которой последовательность нейссерии является гетерологичной в отношении мышиной клетки-хозяина. Дополнительными примерами могут быть два эпитопа из состава одного и того же или разных белков, которые компонуются в едином белке в таком сочетании, которое никогда не обнаруживается в природе.

"Точка начала репликации" обозначает полинуклеотидную последовательность, которая инициирует и регулирует репликацию полинуклеотидов, таких как экспрессирующий вектор. Точка (или сайт) начала репликации ведет себя как автономная единица полинуклеотидной репликации в клетке, обеспечивая способность к репликации под ее контролем. Присутствие точки начала репликации может быть необходимым для обеспечения репликации вектора в конкретной клетке-хозяине. При наличии нескольких точек начала репликации экспрессирующий вектор может воспроизводиться в большом числе копий в присутствии подходящих белков внутри клетки. Примерами точек начала репликации являются автономно реплицирующиеся последовательности, которые эффективны в клетках дрожжей, а также вирусные Т-антигены, эффективные в клетках линии COS-7.

Термин "мутантная последовательность" определяет ДНК, РНК или аминокислотную последовательность, отличающуюся от нативной или заявленной последовательности, но при этом имеющую сходство с ней. В зависимости от конкретной последовательности уровень идентичности последовательностей при сравнении нативной или заявленной последовательности и мутантной последовательности предпочтительно превышает 50% (составляя, например, 60, 70, 80, 90, 95, 99% и больше: расчет проводится с помощью алгоритма Смита-Уотермана, описанного выше). По использованию в данном тексте термин "аллельный вариант" молекулы нуклеиновой кислоты или участка, для которого представляется нуклеотидная последовательность, является молекулой нуклеиновой кислоты или сегментом, который по сути находится в том же локусе конкретного генома другого или второго изолята, при том, что, ввиду естественной изменчивости, обусловливаемой, например, мутационным или рекомбинационным процессами, характеризуется сходной, но не идентичной нуклеотидной последовательностью. Кодирующий сегмент аллельного варианта обычно кодирует белок, обладающий сходным уровнем активности по сравнению с таковым у белка, кодируемого тем геном, с которым проводится данное сравнение. Аллельный вариант также может включать чередование 5'- или 3'-нетранслируемых участков конкретного гена, таких как регуляторные контрольные сегменты (см., например, патент США №5753235).

Экспрессионные системы

Нуклеотидные последовательности нейссерий могут быть экспрессированы с использованием различных экспрессионных систем: например, для этой цели используются клетки млекопитающих, бакуловирусы, растения, бактерии и дрожжи.

I. Системы млекопитающих

Экспрессионные системы млекопитающих известны в данной области техники. Промотором млекопитающих может являться любая последовательность ДНК, способная связывать РНК-полимеразу млекопитающих, инициируя тем самым транскрипцию нижерасположенной (т.е. по 3'-сторону) кодирующей последовательности (например, структурного гена) с образованием мРНК. Промотор должен включать сайт инициации транскрипции, который обычно располагается проксимально по отношению к 5'-концу кодирующей последовательности, а также бокс ТАТА, обычно расположенный в 25-30 нуклеотидах выше сайта инициации транскрипции. Считается, что бокс ТАТА обеспечивает контролируемое РНК-полимеразой II начало синтеза РНК в правильном сайте. Промотор млекопитающих также должен включать расположенный выше промоторный элемент, обычно находящийся в 100-200 нуклеотидах выше бокса ТАТА. Верхний промоторный элемент определяет скорость, с которой инициируется транскрипция, и может быть активен в любой ориентации (Sambrook et al., 1989, "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells", In "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2d ed.).

Гены вирусов млекопитающих обычно характеризуются интенсивной экспрессируемостыо и характеризуются широким кругом хозяев: следовательно, последовательности, кодирующие гены вирусов млекопитающих, являются особенно перспективными для применения в качестве промоторных последовательностей. Примерами являются промотор ранних генов вируса SV40, промотор LTR вируса опухоли молочной железы мыши, промотор главного позднего гена аденовируса (AdMLP) и промотор простого герпес-вируса. Кроме того, последовательности, производные от невирусных генов, таких как ген металлотионеина мыши, также представляют применимые промоторные последовательности. Экспрессия может быть как конститутивной, так и регулируемой (индуцибельной), что зависит от возможности индукции промотора глюкокортикоидами в клетках, контролируемых такими гормонами.

Присутствие энхансерного элемента (энхансера) совместно с промоторными элементами, описанными выше, обычно приводит к усилению уровней экспрессии. Энхансер - это регуляторная последовательность ДНК, которая способна стимулировать транскрипцию до тысячекратного уровня в случае ее связывания с гомологичными или гетерологичными промоторами, при том, что синтез начинается в нормальном инициирующем сайте РНК. Энхансеры также активны тогда, когда они помещаются или выше, или ниже сайта инициации транскрипции, как в нормальной, так и в инвертированной по механизму переключения фаз ориентации, или на расстоянии даже больше 1000 нуклеотидов от промотора (Maniatis et al., 1987, Science, 236, 1237; Alberts et al., 1989, "Molecular Biology of the Cell", 2d ed.). В частности, могут быть использованы энхансерные элементы, происходящие от вирусных геномов, поскольку они обычно характеризуются широким кругом потенциальных хозяев. Примерами являются энхансер раннего гена вируса SV40 (Dijkema et al., 1985, EMBO J., 4, 761) и энхансер + промотор, производные от участка длинных концевых повторов (LTR) вируса саркомы Рауса (Gorman et al., 1982b, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6777) и цитомегаловируса человека (Boshart et al., 1985, Cell, 41, 521). Кроме того, некоторые энхансеры являются регулируемыми и становятся активными только в присутствии индуктора, такого как гормон или ион металла (Sassone-Corsi & Borelli, 1986, Trends Genet., 2, 215; Maniatis et al., 1987, Science, 236, 1237).

Молекула ДНК может быть экспрессирована внутри клеток млекопитающих. Промоторная последовательность может быть напрямую присоединена к молекуле ДНК с учетом того, что первая с N-конца аминокислота в составе рекомбинантного белка всегда должна быть метионином, который кодируется старт-кодоном ATG. Если желательно, N-концевая часть может быть отщеплена от белка путем инкубации in vitro с цианогенбромидом.

С другой стороны, чужеродные белки также могут секретироваться из клетки непосредственно в питательную среду в результате создания химерных молекул ДНК, которые бы кодировали химерный белок, включающий лидерную последовательность сегмента, обеспечивающего секрецию чужеродного белка в клетках млекопитающих. Предпочтительным является наличие сайтов процессинга, кодируемых между лидерным сегментом и чужеродным геном, который бы мог быть расщеплен либо in vivo, либо in vitro. Лидерный сегмент обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые обеспечивают секрецию белка из клетки. Аденовирусный трипартитный лидерный сегмент является примером лидерной последовательности, обеспечивающей секрецию чужеродного белка клетками млекопитающих.

Обычно терминация транскрипции и полиадениловые последовательности, распознаваемые клетками млекопитающих, являются регуляторными сегментами, расположенными с 3'-стороны от стоп-кодона: т.е., вместе с промоторными элементами, они являются мотивами, фланкирующими кодирующую последовательность. 3'-конец зрелой мРНК образуется в результате сайт-специфичного посттранскрипционного расщепления и полиаденилирования (Birnstiel et al., 1985, Cell, 41, 349; Proudfoot & Whitelaw, 1988, "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA", In "Transcription and splicing", ed; B.D.Hames & D.M.Glover; Proudfoot, 1989, Trends Bio-chem. Sci., 14, 105). Эти последовательности обеспечивают транскрипцию мРНК, которая затем может быть транслирована в полипептид, кодируемый исходной ДНК. Примерами сигналов терминации транскрипции и полиаденилирования являются те мотивы, которые происходят из генома вируса SV40 (Sambrook et al., 1989, "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells". In "Molecular Cloning: A Laboratory Manual").

Обычно описанные выше компоненты, включая промотор, полиадениловый сигнал и сайт терминации транскрипции, включают одновременно в состав экспрессирующих конструкций. Энхансеры, интроны, включающие функциональные донорные и акцепторные сайты сплайсинга, и лидерные последовательности могут быть также включены в экспрессирующую конструкцию, если это является желательным. Экспрессирующие конструкции часто поддерживаются в виде репликона, такого как внехромосомный элемент (например, плазмиды), способный стабильно сохраняться в организме хозяина, таком как клетка млекопитающего или бактерия. Репликационные системы млекопитающих включают те системы, которые являются производными от вирусов животных, для реплицирования которых необходимо участие трансрегулирующих факторов. Например, плазмиды, включающие репликационные системы паповавирусов, таких как вирус обезьян SV40 (Gluzman, 1981, Cell, 23, 175), или полиомавирусов, реплицируются в исключительно большом числе копий в присутствии подходящего вирусного Т-антигена. Дополнительными примерами репликонов для клеток млекопитающих являются те, которые происходят от бычьего папилломавируса и вируса Эпштейна-Барр. Кроме того, такой репликон может нести две репликационные системы, что тем самым обеспечивает возможность поддержания их, например, в клетках млекопитающих с целью экспрессии и в прокариотических клетках с целью клонирования и амплифицирования. Примеры таких бифункциональных векторов для млекопитающих/бактерий включают конструкции рМТ2 (Kaufman et al., 1989, Mol. Cell. Biol., 9, 946) и рНЕВО (Shimizu et al., 1986, Mol. Cell. Biol., 6, 1074).

Выбор используемых процедур трансформации зависит от вида организма-хозяина, который будет трансформироваться. Способы внесения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области техники: они включают опосредуемую декстраном трансфекцию, преципитацию фосфатом кальция, опосредуемую полибреном трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсуляцию полинуклеотида(ов) в липосомы и прямое микроинъецирование ДНК в ядра клеток-мишеней.

Линии клеток млекопитающих, пригодные в качестве хозяев для целей экспрессии, хорошо известны и включают большое число иммортализованных клеточных линий, доступных из Американской коллекции типовых культур (АТСС), включая, но тем самым не исчерпываясь, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки HeLa человека, клетки почек новорожденных хомячков (ВНК), клетки почки зеленой мартышки (COS), клетки гепатоклеточной карциномы человека (например, HepG2) и множество других клеточных линий.

2. Бакуловирусные системы

Полинуклеотид, кодирующий белок, также может быть встроен в подходящий экспрессирующий вектор для клеток насекомых: его функциональным образом соединяют с регуляторными элементами в составе такого вектора. При конструировании вектора используются методики, хорошо известные в данной области техники. В целом, компоненты экспрессионной системы включают собственно вектор для переноса, обычно являющийся бактериальной плазмидой, который включает и фрагмент бакуловирусного генома, и стандартный рестрикционный сайт, предназначенный для встраивания гетерологичного гена или генов, которые будут экспрессироваться; бакуловирус дикого типа, характеризующийся сходством последовательности с бакуловирусо-специфичным фрагментом вектора для переноса (это обеспечивает гомологичную рекомбинацию гетерологичного гена в бакуловирусном геноме); и подходящие клетки-хозяева насекомого и культуральную среду.

После внесения последовательности ДНК, кодирующей конкретный белок, в состав вектора для переноса, этот вектор и вирусный геном дикого типа используют для трансфекции в клетку-хозяин насекомого, в которой вектор и вирусный геном могут рекомбинировать. Упакованный рекомбинантный вирус экспрессируется, а рекомбинантные бляшки могут быть идентифицированы и очищены. Материалы и методы формирования экспрессионных систем "бакуловирус/клетки насекомых" доступны в виде специальных наборов на коммерческой основе, например, помимо прочего, от фирмы Invitrogen (Сан-Диего, США): набор реактивов "МахВас". Эти методики в целом известны специалистам в данной области техники и полно охарактеризованы в руководстве Саммерса и Смита (Summers & Smith, 1987, Texas Agricult. Exper. Stat. Bull., N 1555) (здесь и далее цитируется как "Summers & Smith").

Перед встраиванием последовательности ДНК, кодирующей белок, в состав бакуловирусного генома, описанные выше компоненты, включая промотор, лидерный сегмент (если он является желательным), представляющую интерес кодирующую последовательность и сайт терминации транскрипции, обычно компонуют в промежуточную конструкцию (вектор для переноса). Такая конструкция может включать в своем составе единственный ген и функционально присоединенные к нему регуляторные элементы; или множественные гены, каждый из которых имеет "собственный" набор функционально присоединенных регуляторных элементов; или множественные гены, находящиеся под контролем одних и тех же регуляторных элементов. Промежуточные перемежающиеся конструкции часто поддерживаются в виде репликона, такого как внехромосомный элемент (например, плазмида), способного стабильно сохраняться в организме-хозяине, таком как бактерия. Такой репликон должен включать репликационную систему, что тем самым обеспечит поддержание в подходящем организме-хозяине с целью клонирования и амплифицирования.

В настоящее время наиболее распространенным вектором для переноса с целью внесения чужеродных генов в AcNPV является рАс373. Также могут быть сформированы и многие другие векторы, известные специалистам в данной области техники. Они включают, например, pVL985 (в котором изменяется старт-кодон гена полигедрина с ATG на АТТ и который вносит клонирующий BamHI-сайт в 32 парах нуклеотидов ниже кодона АТТ: см. Luckow & Summers, 1989, Virology, 17, 31.

Обычно используемая плазмида также включает сигнал полиаденилирования гена полигедрина (Miller et al., 1988, Ann. Rev. Microbiol., 42, 177) и прокариотический ген резистентности к ампициллину (аmр) и точку начала репликации, необходимые для отбора и воспроизведения в клетках E.coli.

Бакуловирусные трансфекционные векторы обычно включают бакуловирусный промотор. Бакуловирусный промотор - это любая последовательность ДНК, способная связываться с бакуловирусной РНК-полимеразой и инициировать транскрипцию кодирующей последовательности (например, структурного гена) в направлении 5'- 3' с образованием мРНК. Промотор должен включать сайт инициации транскрипции, который обычно помещают проксимально по отношению к 5'-концу кодирующей последовательности.

Этот участок инициации транскрипции обычно включает сайт связывания РНК-полимеразы и собственно сайт инициации транскрипции. Бакуловирусный трансфекционный вектор также может включать второй домен, определяемый как "энхансер", который, если присутствует, обычно находится дистальнее структурного гена. Экспрессия может быть либо индуцибельной, либо конститутивной.

Структурные гены, интенсивно транскрибируемые на поздних этапах вирусного инфекционного цикла, позволяют выделить конкретно применимые промоторные последовательности. Примерами являются последовательности, производные от гена, кодирующего вирусный белок - полигедрин (Friesen et al., 1986, "The Regulation of Baculovirus Gene Expression", In "The Molecular Biology of Baculoviruses", ed. W.Doerfler; европейские патентные публикации №№127839 и 155476), и гена, кодирующего белок р10 (Vlak et al., 1988, J. Gen. Virol., 69, 765).

ДНК, кодирующая подходящие сигнальные последовательности, может быть производной от генов, кодирующих секретируемые белки насекомых или бакуловирусов, такие как ген полигедрина бакуловируса (Carbonell et al., 1988, Gene, 73, 409). С другой стороны, при том, что сигналы посттрансляционных модификаций в клетках млекопитающих (таких как отщепление сигнального сегмента, протеолитическое расщепление и фосфорилирование), по-видимому, распознаются и клетками насекомых, а сигналы, необходимые для секреции и ядерной аккумуляции, также, по-видимому, консервативны в клетках позвоночных и беспозвоночных животных, для обеспечения секреции у насекомых также могут быть использованы лидерные сегменты, не связанные происхождением с насекомыми, такие как те, которые являются производными от генов, кодирующих -интерферон человека (Maeda et al., 1985, Nature, 315, 592), рилизинг-фактор гастрина человека (Lebacq-Verheyden et al., 1988, Mol. Cell. Biol., 8, 3129), интерлейкин-2 человека (Smith et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8404), интерлейкин-3 мыши (Miyajima et al., 1987, Gene, 58, 273).

Рекомбинантный полипептид или полипротеин может быть экспрессирован внутриклеточно или, если он экспрессируется с участием специальных регуляторных последовательностей, он может секретироваться. Эффективная внутриклеточная экспрессия нехимерных углеродных белков обычно требует наличия гетерологичных генов, которые в идеале включают короткую лидерную последовательность, включающую подходящие сигналы инициации трансляции, предшествующие старт-кодону ATG. Если желательно, остаток метионина с N-конца может быть отщеплен от зрелого белка путем инкубации in vitro с цианогенбромидом.

С другой стороны, рекомбинантные полипротеины или белки, которые нативно не являются секретируемыми, могут быть секретированы из клеток насекомых путем создания химерных молекул ДНК, которые бы кодировали химерный белок, включающий лидерный сегмент, который обеспечивает секрецию белка, чужеродного для насекомых. Сегмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, который контролируют перемещение белка в эндоплазматический ретикулюм.

После встраивания последовательности ДНК и (или) гена, кодирующего экспрессионный продукт, являющийся предшественником конкретного белка, клетку-хозяина насекомого одновременно трансформируют гетерологичной ДНК вектора для переноса и геномной ДНК бакуловируса дикого типа - обычно применяются котрансфекционные методы. Промотор и последовательность терминации транскрипции данной конструкции обычно должны включать сегмент бакуловирусного генома длиной 2-5 тысяч пар нуклеотидов. Способы внесения гетерологичной ДНК по желаемому сайту в состав бакуловируса известны в данной области техники (см. Summers & Smith, цит. выше; Ju et al., 1987; Smith et al., 1983, Mol. Cell. Biol., 3, 2156; Luckow & Summers, 1989). Например, встраивание может быть произведено внутрь гена, такого как ген полигедрина, для чего используется гомологичная двойная рекомбинация; также встраивание может быть осуществлено по рестрикционному ферментному сайту, искусственно созданному в п