Комплекс, содержащий ингибирующий остеокластогенез фактор (ocif) и полисахарид

Комплекс, содержащий ингибирующий остеокластогенез фактор (ocif) и полисахарид

Реферат

 

Изобретение относится к области медицинских препаратов. Сущностью изобретения является новый комплекс, содержащий по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы: ингибирующего остеокластогенез фактора (OCIF), его аналогов и его вариантов, которое связано с веществом, выбранным из группы, состоящей из полисахаридов и их производных. Комплекс обнаруживает свойство пролонгированного удерживания в кровотоке после введения, что делает его применимым при лечении и профилактики костных метаболических заболеваний. Технический результат - расширение арсенала средств для нормализации костного метаболизма. 7 н. и 27 з.п.ф-лы, 8 табл.

Область техники

Данное изобретение относится к комплексу, содержащему по меньшей мере один ингибирующий остеокластогенез фактор (далее называемый OCIF) или его аналог или его вариант и по меньшей мере один полисахарид или его производное, к способу получения указанного комплекса, к лекарственному средству для лечения или предупреждения костных метаболических заболеваний, содержащему этот комплекс в качестве активного ингредиента, и к применению указанного комплекса при лечении или для предупреждения костных метаболических заболеваний.

Предпосылки изобретения

Кости содержат около 99% общего кальция, присутствующего в живом организме, и, следовательно, играют важную роль не только в поддержании тела, но также в функционировании в качестве самого крупного запасающего кальций органа в теле. Кости играют важную роль в поддержании гомеостаза кальция. Известно, что активация остеокластов, которые играют важную роль в резорбции костей, вызывает избыточный приток кальция в кровь из костей с нарушением гомеостаза кальция в крови, индуцируя гиперкальциемию. Эта индукция гиперкальциемии посредством активации остеокластов и стимуляции резорбции костей может быть вызвана цитокинами, которые секретируются ненормально вследствие распространения рака в кость [например, см. Jean-Jacques Body, Current and Future Directions in Medical Therapy: Hypercalcemia, CANCER Supplement, 88(12), 3054-3058 (2000)]. Прогноз для пациентов, страдающих от раковой гиперкальциемии, обычно является плохим, и, следовательно, крайне желательным является нахождение эффективного лечения для этого состояния.

Известно, что в ревматизме, таком как ревматоидный артрит и т.п. или остеоартрит, ненормальное образование или ненормальная активация остеокластов является одной из основных причин различных симптомов, которые присутствуют в костях и суставах пациентов, страдающих от этих состояний [см., например, Е. Romas, M.T. Gillespie and T.J. Martin, Involvement of Receptor Activator NF-кВ Ligand and Tumor Necrosis Factor- in Bone Destruction in Rheumatoid Arthritis, Bone, 30(2), 340-346 (2002)]. Боль в суставах и костях, вызываемая ревматизмом, таким как ревматоидный артрит и остеоартрит, является чрезвычайно интенсивной и является крайне вредной для качества жизни пациентов, страдающих от этих состояний. Опять, следовательно, является крайне желательным нахождение эффективного лечения для таких состояний.

Известно также, что остеокласты играют роль в остеопорозе. Баланс резорбции костей, стимулируемой остеокластами, и костеобразования, стимулируемого остеобластами, постепенно склоняется в сторону резорбции костей вследствие пониженной секреции женских гормонов после менопаузы или вследствие старения, в результате чего плотность костей понижается и возникает остеопороз, если это уменьшение плотности костей является достаточно тяжелым. Когда стареющие пациенты с высоким риском остеопороза получают перелом, возможность, что они станут прикованными к постели, является очень высокой, и это стало социальной проблемой в результате все увеличивающейся стареющей популяции во всех частях света [например, см. Bruno Fautrel and Francis Guillemin, Cost of illness studies in rheumatic diseases, Current Opinion in Rheumatology, 14, 121-126 (2002)]. Таким образом ведется энергичный поиск эффективного способа лечения и предупреждения остеопороза.

Общепринятые способы лечения для этих состояний включают в себя восполнение гормонов, таких как эстроген, и применение агентов, которые подавляют активность остеокластов, таких как бифосфонаты или кальцитонины [см., например, Mohammed М. Iqbal and Tanveer Sobhan, Osteoporosis: A Review, Missouri Medicine, 99(1), 19-23 (2002).]. Однако гормоны могут иметь нежелательные побочные действия, такие как повышенный риск онкогенеза, индукция эндометриоза и ненормальное кровотечение из половых органов [например, см. Joyce Penrose White and Judith S. Schilling, Postmenopausal Hormone Replacement: Historical Perspectives and Current Concerns, Clinical Excellence for Nurse Practitioners, 4(5), 277-285 (2000)]. Хотя известно, что бифосфонаты легко связывают избыточный кальций в крови и накапливаются в кости, некоторые исследователи сомневаются в том, до какой степени может быть улучшена прочность костей с их использованием. Кроме того, сообщалось также, что существует опасность ухудшения функционирования почек, связанная с их применением [например, см, Jonathan R. Green, Yves Seltenmeyer, Knut A. Jaeggi and Leo Wildler, Renal Tolerability Profile of Novel, Potent Bisphosphonates in Two Short-Term Rat Model, Pharmacology and Toxicology, 80, 225-230 (1997)]. Что касается кальцитонина, то увеличение плотности костей, получаемое с его использованием, является, к сожалению, временным. Сообщалось также, что прерывание введения кальцитонина может вызвать регресс состояния, подлежащего лечению, в то время как эффективность кальцитонинов, происходящих из животных, иных, чем человек, может снижаться после продолжительного лечения вследствие появления циркулирующих антител к этому кальцитонину в теле человека [S.L. Porcel, J.A. Cumplido, В. dela Hoz, M. Cuevas and E. Losada, Anaphylaxis to calcitonin, Allergologia et Immunopathologia, 28(4), 243-245 (2000)].

Как объяснялось выше, остеокласты играют главную роль в стимуляции резорбции костей, которая является важным фактором, обусловливающим увеличение концентрации кальция в крови. Однако считается, что ни одно из вышеупомянутых лекарственных средств не является активным в супрессии образования остеокластов. Таким образом, ни одно из этих общепринятых лекарственных средств не является пригодным для фундаментального лечения костных метаболических заболеваний, так как эти лекарственные средства способны справляться только с симптомами, а не с причинами заболевания.

Не так давно было показано, что OCIF является эндогенным белком, который ингибирует дифференцировку клеток-предшественников остеокластов в остеокласты и/или костно-резорбционную активность зрелого остеокласта (см. WO-A-96/26217 и ЕР-А-0816380). Ввиду того факта, что вышеупомянутые костные метаболические заболевания, такие как гиперкальциемия, остеопороз и ревматоидный артрит, являются результатом по меньшей мере некоторой степени резорбции костей, была надежда, что эти заболевания могли бы успешно лечиться с использованием OCIF вследствие его способности подавлять образование самого остеокласта и/или подавлять костно-резорбционную активность зрелого остеокласта. Однако OCIF является основным белком, который имеет изоэлектрическую точку около 9, и он исчезает очень быстро из кровотока после введения. Попытка решить эту проблему описана в WO-A-2000/24416 и ЕР-А-1127578, где продолжительность времени, в течение которого OCIF остается в крови после введения (и, следовательно, действия OCIF), была продлена до некоторой степени совместным введением OCIF с полисахаридом, таким как гепарин или декстрансульфат. Однако пролонгирование времени удерживания, достигаемое в результате, может быть недостаточным для получения настолько пролонгированного удерживания OCIF в крови, чтобы сделать его истинным кандидатом для использования в лечении костных метаболических заболеваний, таких как гиперкальциемия, остеопороз и ревматизм. Таким образом, существует потребность в улучшенном способе прологирования продолжительности времени, в течение которого OCIF остается в кровотоке после введения.

Сущность изобретения

Таким образом, целью данного изобретения является обеспечение препарата, содержащего OCIF, который позволяет пролонгировать время, в течение которого OCIF удерживается в кровотоке после введения, с обеспечением таким образом агента (средства), в котором действие OCIF в лечении и профилактике костных метаболических заболеваний, которые опосредованы остеокластами, таких как гиперкальциемия, остеопороз и ревматизм, является усиленным и пролонгированным.

Другие цели и преимущества данного изобретения станут очевидными по мере продолжения описания.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает комплекс, содержащий по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из OCIF, его аналогов и его вариантов, которое связано с по меньшей мере одним веществом, выбранным из группы, состоящей из полисахаридов и их производных.

Данное изобретение обеспечивает также способ пролонгирования времени, в течение которого OCIF или его аналог или вариант удерживается в кровотоке после введения пациенту, посредством образования комплекса по меньшей мере одного указанного OCIF, указанного аналога или указанного варианта с по меньшей мере одним полисахаридом или его вариантом.

Данное изобретение обеспечивает также фармацевтическую композицию, содержащую эффективное количество фармакологически активного агента (средства) вместе с его носителем или разбавителем, где указанное фармакологически активное средство представляет собой комплекс, содержащий по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из OCIF, его аналогов и его вариантов, которое связано с по меньшей мере одним веществом, выбранным из группы, состоящей из полисахаридов и их производных. В частности, оно обеспечивает такую фармацевтическую композицию для лечения или профилактики костных метаболических заболеваний.

Данное изобретение обеспечивает также способ лечения или профилактики костных метаболических заболеваний, предусматривающий введение пациенту эффективного количества комплекса, содержащего по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из OCIF, его аналогов и его вариантов, которое связано с по меньшей мере одним веществом, выбранным из группы, состоящей из полисахаридов и их производных.

Данное изобретение обеспечивает также применение комплекса, содержащего по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из OCIF, его аналогов и его вариантов, которое связано с по меньшей мере одним веществом, выбранным из группы, состоящей из полисахаридов и их производных, в приготовлении лекарственного средства для профилактики или лечения костных метаболических заболеваний.

Подробное описание изобретения

Авторы обнаружили, что посредством инкубирования по меньшей мере одного вещества, выбранного из OCIF, его аналогов и вариантов, с по меньшей мере одним веществом, выбранным из полисахаридов и их производных, в условиях, которые приводят к образованию комплекса, в котором указанное одно или несколько веществ, выбранных из OCIF, его аналогов и вариантов, связаны с указанным по меньшей мере одним веществом, выбранным из полисахаридов или их производных, образуется посредством этого агента, в котором действие указанного OCIF или его аналога или варианта в лечении и профилактике костных метаболических заболеваний, опосредованных остеокластами, таких как гиперкальциемия, остеопороз и ревматизм, является усиленным или пролонгированным. Это обусловлено тем фактом, что продолжительность времени, в течение которого указанный OCIF или его аналог или вариант удерживается в кровотоке после введения, пролонгируется в сравнении с комбинациями OCIF и полисахаридов предыдущего уровня техники, описанными в WO-A-2000/24416 и ЕР-А-112578.

Как отмечалось выше, комплексы данного изобретения содержат по меньшей мере одно вещество, выбранное из OCIF, его аналогов и вариантов, которые связаны с по меньшей мере одним веществом, выбранным из полисахаридов и их производных. В указанном комплексе OCIF и полисахарид связаны друг с другом химической связью, такой как ковалентная связь (например, с образованием оснований Шиффа), ионная связь или координатная связь, или нехимической связью, например гидрофобным взаимодействием, водородной связью, электростатическим взаимодействием или аффинным связыванием.

OCIF, его аналог или вариант, используемый в данном изобретении, может быть природного типа или он может быть рекомбинантного типа, и его происхождение не является особо ограничиваемым. OCIF природного типа обозначает OCIF, который получают в виде природно продуцируемого белка экстракцией, очисткой и/или выделением из органа, жидкости тела, клеточной культуры, полученных из человека или животного, не являющегося человеком. OCIF рекомбинантного типа, его аналог или его вариант является рекомбинантным белком, полученным экстракцией, очисткой и/или выделением указанного белка из хозяина, обычно используемого в таких способах, такого как прокариотическая клетка-хозяин (например, Escherichia coli) или эукариотическая клетка, такая как линия клеток человека или не человека, которая была трансформирована вектором, содержащим полинуклеотид, который кодирует OCIF, его аналог или его вариант [например, см. рекомбинантные способы, описанные в ЕР-А-0816380 (WO-A-96/26217) и WO-A-97/23614].

Происхождение OCIF, его аналогов и его вариантов, используемых в данном изобретении, не является особо ограничиваемым, и они, могут быть получены от человека или животного (не человека). Предпочтительно, они могут быть получены из млекопитающего, такого как человек, крыса, мышь, кролик, собака, кошка, корова, свинья, овца или коза; или из птиц, таких как домашняя птица, гусь, курица или индейка. Более предпочтительно, их получают из млекопитающих и наиболее предпочтительно их получают из человека.

OCIF или его аналог, используемый в данном изобретении, может быть OCIF мономерного типа (например, в людях мономером, имеющим молекулярную массу, измеренную при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ при невосстанавливающих условиях, около 60000) или димерного типа (например, в людях димером, имеющим молекулярную массу около 120000, измеренную при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ при невосстанавливающих условиях) [см. ЕР-А-0816380 (WO-A-96/26217)].

Известно, что OCIF транслируется в клетках в виде полипептида, содержащего сигнальный пептид на его аминоконце, и что затем он созревает с использованием процессинга, включающего в себя удаление указанного сигнального пептида [например, см. рекомбинантные способы, описанные в ЕР-А-0816380 (WO-A-96/26217)]. OCIF, его аналог или его вариант, используемый в данном изобретении, включает в себя как полипептид, содержащий сигнальный пептид, так и его созревшую форму. Предпочтительные примеры включают в себя OCIF с сигнальным пептидом, имеющий аминокислоты -21 - +380 SEQ ID NO:1 списка последовательностей, и зрелый OCIF без сигнального пептида, имеющий аминокислоты +1 - +380 SEQ ID NO: списка последовательностей. Из них особенно предпочтительным является зрелый OCIF.

Известно также, что метионин может быть добавлен к такой зрелой форме OCIF, его аналога или его варианта, когда он экспрессируется в виде рекомбинантного белка в клетке-хозяине, в частности в прокариотической клетке-хозяине, такой как Escherichia coli. Это достигается добавлением триплета нуклеотидов, имеющего последовательность ATG (AUG) к 5’-концу полинуклеотида, кодирующего зрелую форму OCIF, его аналога или его варианта, и встраиванием полученного полинуклеотида в подходящий экспрессирующий вектор. Затем этот желаемый зрелый белок, имеющий метионин на его аминоконце, может экспрессироваться подходящей клеткой-хозяином, которая была трансформирована указанным рекомбинантным экспрессирующим вектором. Кроме того, одна или несколько аминокислот могут быть добавлены к указанному белку в положении, смежном с триплетом нуклеотидов ATG, добавленным на 5’-конце полинуклеотида, кодирующего зрелую форму OCIF, его аналога или его варианта.

В данном изобретении аналог OCIF обозначает белок, кодируемый полинуклеотидом, который существует природно в клетках, жидкости тела и/или органах человека или животных (не человека), таких как приведенные в виде примеров выше. Конкретные предпочтительные примеры таких аналогов включают в себя OCIF2, OCIF3, OCIF4 и OCIF5 [см. ЕР-А-0816380 (WO-A-96/26217)]. Такие аналоги OCIF или их активные фрагменты могут быть получены с использованием следующего способа: РНК экстрагируют из клетки, органа, ткани или жидкости тела человека или животного (не человека); первую цепь кДНК, которая комплементарна указанной РНК, синтезируют с использованием обратной транскриптазы, а затем вторую цепь указанной кДНК синтезируют с использованием первой цепи в качестве матрицы с использованием ДНК-полимеразы; полученную таким образом двухцепочечную кДНК встраивают в подходящий, обычно используемый экспрессирующий вектор; затем подходящую, обычно используемую клетку-хозяина трансформируют полученным таким образом вектором; затем клетки-хозяева, продуцирующие желаемый пептид, подвергают скринингу с использованием способа гибридизации, такого как гибридизация бляшек или фаговая гибридизация, с использованием кДНК OCIF или ее фрагмента в качестве зонда при строгих условиях гибридизации [см. ЕР-А-0816380 (WO-A-96/26217)]; и затем, наконец, желаемый аналог OCIF экспрессируется общепринятым способом полученной таким образом клеткой-хозяином.

В данном изобретении вариант OCIF обозначает белок, который имеет аминокислотную последовательность, в которой один или несколько аминокислотных остатков были заменены, делегированы, добавлены или инсертированы в аминокислотную последовательность OCIF или его аналога, и все еще имеет по меньшей мере часть активности OCIF. Такие варианты OCIF могут быть получены, например, при помощи следующего способа: заменой, делецией, добавлением и/или инсертированием одного или нескольких нуклеотидов в нуклеотидную последовательность, кодирующую OCIF или его аналог, с использованием способа полимеразной цепной реакции (называемого далее ПЦР), способа генетической рекомбинации или способа расщепления нуклеазами с использованием экзонуклеазы или эндонуклеазы, такой как рестрикционный фермент; трансформации эукариотической клетки-хозяина, такой как клетка животного, или прокариотической клетки-хозяина, такой как Escherichia coli, экспрессирующим вектором, в который был встроен полученный нуклеотид, кодирующий желаемый вариант OCIF; и затем экстракции, очистки и/или выделения желаемого пептида из содержащей белок фракции, продуцируемой культурой клеток указанного трансформированного хозяина, в соответствии со способом, хорошо известным специалисту в данной области.

Известно, что укороченные формы OCIF, в которых значительная часть аминокислотной последовательности была делегирована из карбоксиконца полипептида OCIF, также сохраняют по меньшей мере часть активности OCIF [например, см. ЕР-А-0816380 (WO-A-96/26217) и WO-A-97/23614]. Такие укороченные типы OCIF, сохраняющие по меньшей мере часть активности полного полипептида OCIF, также включены в варианты OCIF данного изобретения.

Кроме того, известны OCIF или его укороченная форма, которые слиты с доменом иммуноглобулина, таким как Fc-домен (например, слитый полипептид, в котором Fc-домен IgG человека присоединен к карбоксиконцу OCIF), и которые сохраняют по меньшей мере некоторую часть активности полного полипептида OCIF (см. WO-A-97/23614), и такие слитые белки также включены в варианты OCIF данного изобретения.

Было также показано, что OCIF или его аналог или его вариант могут быть химически модифицированы и все еще сохраняют применимую активность и, в некоторых случаях, могут проявлять преимущества, например увеличенную стабильность или уменьшенную иммуногенность. Такая химическая модификация может включать в себя дериватизацию всего лишь в единственном сайте в молекуле OCIF или его аналога или его варианта или в более чем одном сайте. Например, было показано, что OCIF и его варианты (производные), такие как укороченная форма, могут быть химически модифицированы одним или несколькими водорастворимыми полимерами, такими как полиэтиленгликоль, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза и поливиниловый спирт, и могут обнаруживать в результате улучшенную биологическую активность (например, см. WO-A-97/23614). Такие химически модифицированные типы OCIF или его аналога или его варианта также включены в варианты OCIF данного изобретения.

Примеры известных вариантов OCIF, которые пригодны для применения в приготовлении комплексов данного изобретения, включают в себя: OCIF-C19S, OCIF-C20S, OCIF-C21S, OCIF-C22S, OCIF-C23S, OCIF-DCR1, OCIF-DCR2, OCIF-DCR3, OCIF-DCR4, OCIF-DDD1, OCIF-DDD2, OCIF-CL, OCIF-CC, OCIF-CDD2, OCIF-CDD1, OCIF-CCR4, OCIF-CCR3, OCIF-CBst, OCIF-CSph, OCIF-CBsp, OCIF-CPst [см. EP-A-0816380 (WO-A-96/26217)], muOPG[22-401]-Fc, muOPG[22-194]-Fc, muOPG[22-185]-Fc, muOPG[22-180]-Fc, muOPG[22-401], muOPG[22-401]C195, muOPG[22-401]C202, muOPG[22-401]C277, muOPG[22-401]C319, muOPG[22-401]C400, muOPG[22-185], muOPG[22-194], muOPG[22-200], muOPG[22-212], muOPG[22-293], muOPG[22-355], huOPG[22-401]-Fc, huOPG[22-201]-Fc, huOPG[22-401]-Fc P26A, huOPG[22-401]-Fc Y28F, huOPG[22-401], huOPG[27-401]-Fc, huOPG[29-401]-Fc, huOPG[32-401]-Fc, muOPG met[22-194], muOPG met[22-194] 5k PEG, muOPG met[22-194] 20k PEG, huOPG met[22-194]P25A, huOPG met[22-194]P25A 5k PEG, huOPG met[22-194]P25A 20k PEG, huOPG met[22-194]P25A 31k PEG, huOPG met[22-194]P25A 57k PEG, huOPG met[22-194]Р25А 12k PEG, huOPG met[22-194]P25A 20k разветвленный PEG, huOPG met[22-194]P25A 8k димер PEG, huOPG met[22-194]P25A с дисульфидной поперечной связью (WO-A-97/23614), OPG[22-194]-Fc, OPG[22-201]-Fc, OPG[22-194]-Fc C, OPG [22-201]-Fc C, OPG [22-194]-FcG₁₀, metFc C-OPG[22-194] (WO-A-2001/17543), OPG[22-194]-Fc C, OPG[22-194]-FcG₁₀, Fc C-OPG[22-194], metFc C-OPG[22-194], metFc C-22-194, OPG[22-194]-Fc, OPG[22-194]-Fc C, metOPG[22-194], metOPG[22-201], OPG[22-293], OPG[22-401] и metFc C-22-194 (WO-A-2001/18203).

Из них предпочтительные примеры включают в себя: OCIF-C19S, OCIF-C20S, OCIF-C21S, OCIF-C22S, OCIF-C23S, OCIF-DCR1, OCIF-DCR2, OCIF-DCR3, OCIF-DCR4, OCIF-DDD1, OCIF-DDD2, OCIF-CL, OCIF-CC, OCIF-CDD2, OCIF-CDD1, OCIF-CCR4, OCIF-CCR3, OCIF-CBst, OCIF-CSph, OCIF-CBsp, OCIF-CPst, muOPG[22-401]-Fc, muOPG[22-194]-Fc, muOPG[22-185]-Fc, muOPG[22-401]C195, muOPG[22-401]C202, muOPG[22-401]C319, muOPG[22-401]C400, muOPG[22-194], muOPG[22-200], muOPG[22-293], muOPG[22-355], huOPG[22-401]-Fc, huOPG[22-201]-Fc, huOPG[22-401]-Fc P26A, huOPG[22-401]-Fc Y28F, huOPG[22-401], huOPG[27-401]-Fc, huOPG[29-401]-Fc, huOPG[32-401]-Fc, muOPG met[22-194]5k PEG, muOPG met[22-194]20k PEG, huOPG met[22-194]P25A 5k PEG, huOPG met[22-194]P25A 20k PEG, huOPG met[22-194]P25A 31k PEG, huOPG met[22-194]P25A 57k PEG, huOPG met[22-194]P25A 12k PEG, huOPG met[22-194]P25A 20k разветвленный PEG, huOPG met[22-194]P25A 8k PEG димер, huOPG met[22-194]P25A с дисульфидной поперечной связью, OPG[22-194]-Fc, OPG[22-201]-Fc, OPG [22-194 ]-Fc С, OPG[22-201]-Fc C, OPG [22-194]-FcG₁₀, metFc C-OPG[22-194], OPG[22-194]-Fc C, OPG [22-194]-FcG₁₀, Fc C-OPG[22-194], metFc C-OPG[22-194], metFc C-22-194, OPG[22-194]-Fc, OPG[22-194]-Fc C, metOPG[22-194], metOPG[22-201], OPG[22-293], OPG[22-401] и metFc C-22-194.

OCIF или его аналог или вариант данного изобретения может содержать сахарную цепь в качестве части молекулы. Любой природно продуцируемый OCIF или его аналог или рекомбинантный OCIF или его аналог или вариант может содержать сахарную цепь, которая присоединена к OCIF или его аналогу или варианту посттрансляционно. Природно продуцируемый OCIF или его аналог, содержащий сахарную цепь, может быть получен из культур клеток, тканей, органов, жидкостей тела или клеточных линий, полученных от человека или животных (не человека) при помощи общепринятых способов. Рекомбинантный OCIF или его аналог или вариант, содержащий сахарную цепь, может быть получен из культуры эукариотической клетки-хозяина, трансформированной вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую OCIF или его аналог или вариант, такой как аналоги и варианты, описанные и приведенные в качестве примеров выше. Примеры подходящих клеток-хозяев, которые могут быть использованы, которые способны к посттрансляционной модификации OCIF или его аналога или варианта таким образом, чтобы присоединить сахарную цепь, включают в себя клетки яичника китайского хомячка и клетки COS [Yasuda, H. et al., Endocrinology, 139, 1329-1337 (1998)]. OCIF или его аналог или вариант, содержащий такую сахарную цепь, пригоден для применения в образовании комплексов данного изобретения.

Если, с другой стороны, желательно получить рекомбинантный OCIF или его аналог или вариант, который не имеет сахарной цепи, которая была присоединена в качестве посттрансляционной модификации, то предпочтительными клетками-хозяевами являются прокариотические клетки, такие как Escherichia coli.

Полисахарид, используемый в образовании комплексов данного изобретения, является полимером (гликаном), получаемым при помощи гликозидной связи двух или нескольких моносахаридов, и предпочтительно является гетерополисахаридом (гетерогликаном), состоящим из по меньшей мере двух различных типов моносахарида. Любой полисахарид, природно встречающийся или синтетический, потенциально может быть использован в комплексе данного изобретения.

В данном изобретении производным полисахарида является полисахарид, в котором по меньшей мере часть молекулы указанного полисахарида заменена одной или несколькими молекулами и/или остатками, иными, чем сахарид или сахар. Предпочтительные производные включают в себя кислые эфиры полисахаридов и особенно предпочтительными являются сульфатные эфиры полисахаридов.

Примеры природных полисахаридов, пригодных для применения в образовании комплексов данного изобретения, включают в себя гиалуроновую кислоту, хондроитинсерную кислоту, дерматан-кислоту, гепаран-кислоту, кератан-кислоту, каррагенан, пектин и гепарин. Примеры синтетических полисахаридов, пригодных для применения в образовании комплексов данного изобретения, включают в себя декстран, тогда как примеры подходящих производных синтетических полисахаридов включают в себя декстрансульфат. Из полисахаридов и их производных наиболее предпочтительным для применения в образовании комплексов данного изобретения является декстрансульфат.

В данном изобретении полисахариды и их производные, такие как декстрансульфат, включают в себя и их соли. Наиболее предпочтительной солью декстрансульфата является его натриевая соль. Примеры натриевых солей декстрансульфата включают в себя натриевую соль декстрансульфата сера 5 (далее называемую DS5: производимую Meito Sangyo Co., Ltd.) и натриевую соль декстрансульфата 5000 и натриевую соль декстрансульфата 10000 (обе производятся Waco Pure Chemical Industries, Ltd.).

Молекулярную массу декстрансульфата рассчитывают следующим образом.

1) Измерение молекулярной массы декстрана

Молекулярная масса декстрана может быть рассчитана согласно рецептуре Sato, приведенной ниже [например, см. Manual for Pharmacopoeia of Japan, the thirteenth revision, published by Hirokawashoten (1998), статья, касающаяся декстрана 40], основанной на измерении предельной вязкости указанного декстрана.

Предельная вязкость = 9,0010^-4 молекулярная масса⁰’⁵⁰

2) Измерение содержания серы

Содержание серы в представляющем интерес декстрансульфате может быть измерено в виде мас.% при помощи любого общепринятого способа, известного в данной области, например способа, описанного в статье, касающейся натриевой соли декстрансульфата сера 5 в Pharmacopoeia of Japan [14^th revision, published by Jihou (2001)].

Хотя молекулярная масса глюкозы, которая является элементарным звеном декстрана, равна 180, фактическая молекулярная масса глюкозного звена в молекуле декстрана равна 162, причем эта величина получена вычитанием молекулярной массы воды из 180, так как соседние глюкозные звенья связаны друг с другом -1,6-гликозидной связью в молекуле декстрана. Атом водорода заменен натрий-сульфатной группой (SO₃Na: один грамм-эквивалент = 103) в каждом глюкозном звене декстрансульфата, который замещен таким образом. С использованием этой информации степень замещения молекулы декстрансульфата (называемая далее “степень замещения”) может быть определена из следующей формулы:

Содержание серы (мас.%)=[32 степень замещения/(162+102 степень замещения)]100

3) Расчет молекулярной массы декстрансульфата

Поскольку, как отмечалось выше, действительная молекулярная масса глюкозного звена в декстрансульфате равна 162, молекулярная масса декстрансульфата может быть рассчитана на основании этой информации и степени замещения, определенной, как описано в (2) выше, с использованием следующей формулы:

Молекулярная масса декстрансульфата = молекулярная масса декстрана (162+102 степень замещения)/162

Известно, что полисахариды проявляют молекулярно-массовое распределение, например каждый отличающийся тип декстрансульфата проявляет определенное молекулярно-массовое распределение. Молекулярная масса любого полисахарида, используемого в образовании комплексов данного изобретения, дается в виде средней молекулярной массы. Средняя молекулярная масса полисахаридов, используемых в данном изобретении, никаким образом не ограничивается. Диапазон средней молекулярной массы наиболее предпочтительного полисахаридного производного данного изобретения, декстрансульфата, равен обычно 1500-12000 и более предпочтительно равен 1800-6000. Молекулярная масса (среднее±стандартное отклонение) DS5 равна приблизительно 1950±70 (n=7). Степень замещения серы (среднее±стандартное отклонение) DS5, рассчитанная, как описано выше, равно приблизительно 0,32±0,01 (n=7). Средние молекулярные массы натриевой соли декстрансульфата 5000 и натриевой соли декстрансульфата 10000 равны приблизительно 5000 и приблизительно 10000 соответственно. Полисахариды, используемые для получения комплексов данного изобретения, могут быть использованы без какой-либо дополнительной очистки и/или фракционирования или с дополнительной очисткой и/или фракционированием их перед применением. В данном изобретении полисахариды или их производные не включают в себя какую-либо сахарную цепь, которая присоединена к рекомбинантному OCIF или его аналогам или вариантам или к природно продуцируемому OCIF или его аналогам или вариантам посттрансляционно и/или эндогенно в клетках или тканях или теле человека или животных, иных, чем человек.

Молярное отношение вещества, выбранного из группы, состоящей из OCIF, его аналогов и вариантов, к веществу, выбранному из группы, состоящей из полисахаридов и их производных, в комплексах данного изобретения будет варьироваться в зависимости от различных факторов, в том числе идентичности компонентов указанного комплекса и условий, при которых получают этот комплекс. Нет особого ограничения в отношении молярного отношения вещества, выбранного из группы, состоящей из OCIF, его аналогов и вариантов, к веществу, выбранному из группы, состоящей из полисахаридов и их производных, в комплексах данного изобретения. В предпочтительных комплексах данного изобретения, содержащих вещество, выбранное из группы, состоящей из OCIF, его аналогов и его вариантов, и декстрансульфат, молярное отношение указанного вещества, выбранного из группы, состоящей из OCIF, его аналогов и его вариантов, к декстрансульфату равно от 1:1 до 1:10; более предпочтительно это молярное отношение равно от 1:1 до 1:8; еще более предпочтительно это молярное отношение равно от 1:1 до 1:5 и наиболее предпочтительно это молярное отношение равно от 1:1 до 1:4,5.

Как уже упоминалось выше, OCIF или его аналог или вариант могут существовать в виде мономера или могут образовывать димеры, так что OCIF или его аналог или вариант, присутствующие в комплексах данного изобретения, могут быть гомодимером или гетеродимером или они могут быть гомоолигомером, гетероолигомером, гомополимером или гетерополимером, содержащим более чем две мономерные единицы OCIF, его аналога или его варианта (например, см. патент США US 6369027). Молярное отношение вещества, выбранного из группы, состоящей из OCIF, его аналогов и вариантов, к веществу, выбранному из группы, состоящей из полисахаридов и их производных, в комплексе, содержащем OCIF или его аналог или вариант и полисахариды или их производное, рассчитывают в виде числа молекул полисахарида или его производного на мономерное звено OCIF, его варианта или его аналога.

Число молекул полисахарида или его производного в комплексе данного изобретения предпочтительно может быть определено следующим образом. Содержание нейтрального сахара испытуемого комплекса [обозначенного как (х)] и это же содержание ссылочной пробы, которая содержит не находящийся в комплексе, свободный OCIF или его аналог или вариант [обозначенной как (y)], количественно определяют с использованием способа с применением фенола и серной кислоты (который описан подробно в другом месте данной заявки). Затем количество полисахарида или его производного, которое связано с OCIF или его аналогом или вариантом в испытуемом комплексе, определяют вычитанием (y) из (х). С использованием полученного таким образом числа число молекул полисахарида или его производного, которые связаны с OCIF или его аналогом или вариантом, рассчитывают согласно (I) или (II), как указано ниже:

(I) Полученное число для количества полисахарида или его производного, которое связано с OCIF или его аналогом или вариантом, делят на среднюю молекулярную массу указанного полисахарида или его производного. Полученное число представляет общее число молекул полисахарида или его производного в испытуемом комплексе.

(II) Полученное число для количества полисахарида или его производного, которое связано с OCIF или его аналогом или вариантом, делят на количество (мг) указанного OCIF, его аналога или варианта в указанном комплексе. Затем полученное число, которое является количеством полисахарида или его производного на 1 мг OCIF, его аналога или варианта в этом комплексе, используют для расчета числа молекул полисахарида или его производного на одну молекулу OCIF, его аналога или варианта на основе молекулярной массы указанного OCIF, его аналога или варианта [например, в соответствии с примером 4(d), ниже].

Число молекул OCIF или его аналога или варианта в комплексе данного изобретения предпочтительно может быть определено с использованием способа иммунологического анализа, такого как способы, описанные в другом месте данной заявки.

Предпочтительным признаком комплексов данного изобретения, который может быть использован для их характеристики, является их аффинность в отношении гепарина. Гепарин является полисахаридом, содержащим D-глюкозамин, D-глюкуроновую кислоту и D-идуроновую кислоту, который частично или полностью модифицирован сульфатными и ацетильными группами. Предпочтительным признаком комплексов данного изобретения является то, что прочность адсорбции указанного комплекса OCIF или его аналога или варианта с гепарином является более низкой, чем прочность адсорбции свободного, не находящегося в комплексе OCIF или его аналога или варианта. Степень адсорбции может быть определена с использованием колонки, упакованной гранулами сшитой в высокой степени агарозы, на которых был иммобилизован гепарин (например, гепарин, полученный из слизистой оболочки бычьего кишечника). Подходящие колонки этого типа включают в себя колонку HiTrap heparin HP, HiPrep 16/10 Heparin и Heparin Sepharose (все могут быть получены из Amersham Pharmacia). Прочность адсорбции (аффинность) комплекса может быть определена согласно любому подходящему способу, который хорошо известен квалифицированному специалисту в данной области, для определения аффинности белков в отношении полисахаридов. Предпочтительно степень адсорбции может быть определена сравнением количества комплекса, который связывается с колонкой гепарина в условиях низкой ионной силы, но который элюируется из указанной колонки в условиях высокой ионной силы, с количеством комплекса, который не связывается с колонкой гепарина в условиях низкой ионной силы (ионная сила может устанавливаться с использованием соли сильной кислоты, такой как хлорид натрия). Таким образом, степень адсорбции комплекса на гепарине может быть определена следующим образом:

(a) Колонку, упакованную носителем, таким как гранулы сшитой агарозы, на которых был иммобилизован гепарин, уравновешивают буфером, имеющим относительно низкую ионную силу (например, натрий-фосфатным буфером, содержащим 0,1-0,8 М хлорида натрия).

(b) Комплекс данного изобретения, который тестируется, растворяют в том же самом буфере низкой ионной силы, который используют в (а), и наносят на колонку и затем соб