Пептиды, ингибирующие трансформирующий фактор роста tgfбета1

Пептиды, ингибирующие трансформирующий фактор роста tgfбета1

Реферат

 

Изобретение относится к синтетическим пептидам-антагонистам связывания трансформирующего фактора роста TGF1 с его рецепторами в организме с последовательностью, содержащей от 2 до 15 аминокислот, которые являются идентичными или схожими с аминокислотами природного трансформирующего фактора роста TGF1 и/или его рецепторов. Пептиды могут использоваться в качестве активных соединений для приготовления композиций, используемых при заболеваниях печени, в частности при фиброзе печени (циррозе). 1 н. и 9 з.п. ф-лы, 7 табл., 28 ил.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Рост клеток регулируется различными белками, относящимися к группе факторов роста (Schalch DS et al. (1979) Endocrinolody 104:1143-1151). Наиболее важные факторы роста связаны с развитием клеток и способны оказывать воздействие по аутокринному и паракринному механизмам, с участием трансформирующих факторов роста (TGFs) (Braun L. et al. (1988) Cell Biol. 85:1539-1543; Lyons RM and Moses HL (1990) Eur. J. Biochem. 187:467-473).

Термин "трансформирующий фактор роста TGF" впервые был использован для описания активности, продуцированной линией клеток, трансформированных под действием вируса саркомы у мышей или крыс (deLarco JE and Todaro GJ (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. 75:4001-4005; Mizel SB et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:2205-2208). Супернатант этих клеток обладал способностью индуцировать нормальный рост в мягком агаре таких клеток, для роста которых был необходим твердый носитель. Более детальные исследования выявили два класса трансформирующих факторов роста TGF, названных TGF и TGF, которые, в свою очередь, включают семейства родственных белков. Семейство белков TGF включает 5 изоформ (Brand T. and Schneider MD (1995) J. Mol. Cell Cardiol. 27:5-18) димерной структуры (Schlunneger MP and Grutter MG (1992) Nature 358:430-434; Brand T. and Schneider MD (1995) J. Mol. Cell Cardiol. 27:5-18). Исследования зрелых очищенных белков, происходящих от одного вида, свидетельствуют о высокой степени идентичности последовательностей этих белков (таблица 1).

TGF1, который синтезирован как предшественник из 390 аминокислот, называют Pre-Pro-TGF1. При первом гидролизе высвобождается гидрофобный фрагмент, состоящий из 29 аминокислот, что приводит к появлению Pro-TGF1. Затем при следующем разрыве цепи на участке, который располагается перед С-концом TGF1 и который состоит из двух остатков аргинина, высвобождается зрелый TGF1 - появляется белок, состоящий из 112 аминокислот, с молекулярной массой 12 кДа. Для получения биологически активной формы два из этих мономеров соединяют вместе с помощью дисульфидных мостиков, получая при этом димер с молекулярной массой 25 кДа. Изменения этой структуры приводят к потере биологической функции (Barnard JA et al. (1990) Biochim. Biophys. Acta 1032:79-87).

Как известно, внутри структуры TGF1 существуют различные домены. Один из этих доменов, как обнаружено, располагается между аминокислотами 40 и 82 и участвует в связывании TGF1 с его клеточными рецепторами. (Quian SW et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:6290-6294; Burmester JK et al. (1993). Proc. Natl. Acad. Sci. 90:8628-8632).

Рецепторы трансформирующего фактора роста TGF1 и другие связывавшиеся белки

Охарактеризовано пять типов специфических рецепторов, связывающихся с TGF1 (Cheifetz S et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:17225-17228 and Lopez Casillas F. et al. (1991) Cell 67:785-795). Эти рецепторы обладают различным сродством к различным типам TGF1. До настоящего времени наилучшим образом изучены рецепторы типов I, II и III (обзор приведен Attisano L et. al. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1222:71-80; Derynck R. (1994) Trends Biochem. Sci. 19:548-553; Yingling et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1242:115-136). Также описаны рецепторы IV типа (МасКау К. and Daniel-pour D. (1991) J. Biol. Chem. 266:9907-9911) и рецепторы V типа Ichijo H. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:22459-22464). Также сообщалось, что трансмембранные и цитоплазматические домены эндоглина (Cheifetz S et al. (1993) J. Biol. Chem. 267:19027-19030; Bellon T. et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2340-2345; Yamashita et al. (1995) J. Biol. Chem. 269:1995-2001; Zhang H. et al. (1996) J. Immunol. 156:564-573)) примерно на 70% схожи с рецепторами типа III, как человека, так и крысы.

RIII мог бы явиться подходящим для связывания с TGF1 и доставки к RII, который, в свою очередь, мог бы образовывать комплекс с RI (Yamashita et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:29172-20178) или к комплексам, в которых различные молекулы RI сочетаются с RII (Weiss G. and Massague J. (1996) EMBO J 15:276-289). RII-RI взаимодействия могли бы вызывать фософрилирование RI и последующую активацию им серин/треонинкиназы, что приводило бы к фософрилированию других молекул, несущих генетическую информацию, такого типа, как молекулы белков MADR2 (Macias-Silva M et al., (1996) Cell 87:1215-1224) (1).

Роль трансформирующего фактора роста TGF1 в дифференцировке и регенерации клеток печени

Оказываемое воздействие различается в зависимости от момента развития и типа клетки.

- Увеличение внеклеточного матрикса при воздействии на звездчатые клетки печени (Ito-клетки), основной источник матриксных белков (Mustce ТА et al. (1987) Science 237:1333-1336).

- Дифференцирование эпителиальных клеток и гепатоцитов (Florini JR et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:16509-16513).

- Ингибирование роста клеток в процессе регенерации печени. Этот эффект имеет огромное значение для сохранения клеточного статуса in vivo (Kato Y. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9552-9556).

- Ингибирование эндоцитоза рецепторов эпителиального фактора роста (EGF), как наблюдали в случае культуры гепатоцитов эмбриона крысы (Noda M. and Rodan GA (1987) J. Cell Physiol. 133:426-437).

Роль трансформирующего фактора роста TGF1 при фибриозе печени

Как было обнаружено, TGF1 связан с процессом фиброза печени (Czaja MJ et al. (1989) J. Cell Biol. 108:2477-2482; Annoni G. et al. (1992) J. Hepatol. 14:259-264), вызывая увеличение образования белков внеклеточного матрикса при участии звездчатых клеток печени (липоциты или Ito-клетки) или их рецепторов и ингибирование синтеза протеолитических ферментов, которые вызывают разрушение матрикса (Ignotz RA and Massague J. (1986) J. Biol. Chem. 261:4337-4345). В печени TGF1 индуцирует синтез коллагена и фибронектина в звездчатых клетках печени (Weiner FR (1990) Hepatology 11:111-117). Происходит также авторегуляция путем повышения его собственного синтеза, посредством индуцирования его под действием мРНК.

Также было обнаружено, что TGF1 связан с повышением образования 2-макроглобулина, синтезируемого гепатоцитами и активированного звездчатыми клетками печени. При связывании с TGF1, вызывая его инактивацию (Bachem MG (1994) Ann NY Acad. Sci. 737:421-424), а2-макроголобулин, как полагают, удаляет TGF1 из межклеточного пространства.

Исследования пациентов с хроническими расстройствами печени показали, что существует корреляция между экспрессией TGF1 и экспрессией мРНК для проколлагена типа I и уровнем в сыворотке пептида типа III проколлагена (Castilla A. et al. (1991) N. Engl. J. Med. 324:933-940).

Продолжительность жизни больных с циррозом печени меньше, чем обычная, вследствие осложнений, которые возникают при течении заболевания, таких, как портальная гипертензия и печеночная недостаточность.

Воздействие трансформирующего фактора роста TGF1 на межклеточный матрикс

Взаимодействие TGF1 с рецепторами клеток вызывает:

- Активацию синтеза проколлагена, фибронектина (Ignotz RA et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:6443-6446) и родственных белков, включая мембранные белки, способные взаимодействовать с компонентами межклеточного матрикса (Carter WG (1982) J. Biol. Chem. 257:13805-13815).

- Ингибирование синтеза протеолитических ферментов, способных вызывать разрушение матрикса (Fukamizu H. and Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190:276-282).

- Стимулирование синтеза ингибиторов протеолитических ферментов (Fukamizu H. and Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190:276-282).

Эти эффекты приводят к росту взаимодействия клеток с межклеточным матриксом, которые сочетаются с более выраженной перестройкой белков, из которых он состоит, и приводит к суммарному повышению количества межклеточного матрикса (Roberts CJ et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:4586-4592). Эти данные подтверждают, что TGF1 участвует в процессах рубцевания (Fukamizu H. and Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190:276-282; Barnard JA et al. (1990) Biochim. Biophys. Acta 1032:79-87).

Пептиды в качестве ингибиторов взаимодействия лиганд-рецепторов

Существует возможность использования небольших молекул, синтетических пептидов, в качестве аналогов молекул, которые присутствуют в организме, в целях имитирования их действия. Исследования, проведенные ЛеСате с сотр. (LeSateur), показывают возможность использования циклических аналогов факторов роста нервов (NGF), имитирующих кольцевой фрагмент, обусловливающий связывание факторов роста нервов с рецептором (LeSateur L. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:1120-1122). Также возможно использовать пептиды в качестве антагонистов этих молекул, предотвращая взаимодействие природного белка со своим рецептором блокировкой участия пептида (La-sarte JJ et al. (1994) J. Acquired Immune Deficiency Sydromes 7:129-134; LeSateur et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:6564-6569). Предшествующие исследования показали возможность использования синтетических пептидов в качестве ингибиторов взаимодействия лиганд-рецептор, даже в случае, когда распознающий эпитоп не является непрерывным (Daniels AJ et al. (1995) Mol. Pharmacol. 48:425-432). Другие исследования, проведенные в отношении рецептора TGF1 типа II и в отношении фетуина-гликопротеина, относящегося к группе рецепторов типа II, показали возможность использования циклических пептидов в качестве ингибиторов взаимодействия TGF1 с RII (Demetriou М. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:12755-12761). При такой циклизации возможно получить пептиды, обладающие структурой, сходной со структурой, которая могла бы существовать in vivo.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с указанными выше причинами авторы настоящего изобретения полагали, что пептиды, полученные как из TGF1, так и из его рецепторов, или из белков, обладающих способностью к связыванию с TGF1, могли бы ингибировать действие TGF1. Таким образом, авторы настоящего изобретения решили рассмотреть эту возможность.

Выбор пептидов, которые необходимо синтезировать

Пептиды для синтеза выбирали различными способами, в зависимости от того, являлись ли они производными TGF1 или производными его рецепторов.

В случае последовательности TGF1, пептиды синтезировали из 15 аминокислот, которые входят в полную последовательность TGF1. Каждый пептид содержал 10 аминокислот подобно двум его ближайшим соседям.

В случае последовательности его рецепторов пептиды выбирали с использованием программного обеспечения, разработанного в лаборатории авторов настоящего изобретения. Одна из компьютерных программ позволяла сравнить две аминокислотные последовательности с целью предсказания частично комплементарных областей. Другие программы, которые также использовались, позволяли предсказать области белков, которые могли бы быть наиболее подвержены воздействию, исходя из гидрофобности и гидрофильности аминокислот, образующих их аминокислотную последовательность.

Синтез пептидов

Пептиды синтезировали твердофазным методом (Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-54), используя флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc) в качестве временной защитной группы для альфа-аминогруппы (Atherton et al. (1989) Journal of Chemical Society Perkins Transactions 1: 538-546). Для синтеза в небольшом количестве большого числа пептидов использовали многопозиционный синтезатор, позволяющий одновременно синтезировать 96 пептидов (Borras-Cuesta et al. (1991) Biologi-cals 19: 187-190). До использования пептиды хранили при температуре -80С в твердом состоянии.

Очистка пептидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Синтезированные пептиды анализируют и очищают методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), используя систему Waters 600Е-900 (Millipore Corp., Bedford, USA).

Для анализа пептидов методом аналитической ВЭЖХ используют колонку Waters Radial-Pak C₁₈ 300 , 15 мкм, 8100 мм (Millipore Corp., Bedford, USA). Пептид растворяют в 0,1% растворе трифторуксусной кислоты (TFA) в дистиллированной воде, до максимальной концентрации 1 мг/мл. Раствор пептида (100 мкл) вводят в колонку и элюируют градиентом вода/ацетонитрил (фиг.15) (Romil Ltd., Cambridge, USA), оба в 0,1% растворе TFA при скорости потока 1 мл/мин. Фракции, содержащие пептид, определяют по их поглощению при 220 нм и 280 нм (матричный фотодиодный детектор. Waters 991, Millipore Corp., Bedford, USA).

Для очистки пептидов используют колонку Waters DeltaPak C₁₈ 300 , 15 мкм, 25100 мм (Millipore Corp., Bedford, USA). Пептид растворяют и вводят (2 мл) в тех же самых условиях, как и в предыдущем случае, используя тот же самый градиент при скорости потока 5 мл/мин. Фракцию, которая содержит чистый пептид, собирают в колбу.

ТЕСТЫ IN VITRO, ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕПТИДОВ

Линии клеток

Используют линию, полученную из легочного эпителия норки, MV-1-Lu, (CCL-64, American Type Cell Culture, Virginia, USA). Клетки выращивают в колбах для культур площадью 162 см² (Costar Corporation, Cambridge, USA) в термостате при 37С и с 5% CO₂, до слияния. Используют полную среду: RPMI 1640 с L-глутамином (CibcoBRL, Life Technologies Ltd., Paisley, Scotland), содержащую 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS, Biological Industries, Kubbutz Beit Haemek, Israel), 10 мМ N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты, HEPES (1 М HEPES Buffer, Bio-Whittaker, Verviers, Belgium) и антибиотики (100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина).

Тест на ингибирование роста клеток MV-1-Lu

Клетки линии MV-1-Lu, выращенные, как показано выше, удаляют со дна колбы с культурой, используя 5 мл смеси трипсин-ЭДТА (Biological Industries, Kubbitz Beit Haemek, Israel), ресуспендируют в полной среде и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 8 минут. После центрифугирования клетки ресуспендируют в полной среде до концентрации 50000 клеток в 1 мл. Для проведения теста берут 10 мл суспензии клеток и распределяют в 96-луночном плоскодонном планшете для культур клеток, помещая по 100 мкл в лунку (Costar Corporation, Cambridge, USA), и инкубируют в течение ночи при 37С и 5% CO₂, что приводит к адгезии клеток ко дну лунок. К концу указанного промежутка времени пептиды, которые необходимо исследовать, вносят в RPMI, до конечной концентрации 200 мкг/мл в присутствии TGF1 в RPMI в концентрации 200 пг/мл (R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, UK). Окончательная концентрация эмбриональной телячьей сыворотки в лунке составляет 2,5%. Через 24 часа инкубирования в каждую лунку добавляют 1 мкКи содержащего тритий тимидина (25 Ки/ммоль [метил-³H]-тимидин, производство фирмы "Amersham Life Science", Buckinghamshire, UK) и далее инкубируют в течение 12 часов (Grubeck-Loebenstein В. et al. (1989) J. Clin. Invest. 83:764-770; Brennan FM et al. (1990) Clin. Exp. Immunol. 81:278-285).

После окончания периода инкубирования клетки удаляют со дна лунок, используя смесь трипсин-ЭДТА, и собирают, используя ручной харвестер клеток (Titertek cell harvester, Skatron Instruments Inc., Sterling, USA), который разрушает клетки, собирая ДНК на нитроцеллюлозные фильтры (Filter MAT 11731, Skatron Instruments Inc., Sterling, USA), где осуществляют фиксацию. Фильтры помещают по отдельности в 5 мл полипропиленовые пробирки, в которые добавляют по 4 мл сцинтиллирующей жидкости (Biogreen-11, Reactivos Scharlau S.A., Barcelona, Spain). Активность каждой пробирки подсчитывают в течение 90 секунд с помощью сцинтилляционного счетчика LKB (Beta plate system, LKB, Uppsala, Sweden).

Исследование ингибирования связывания трансформирующего фактора роста TGF1 с рецепторами клеток

Введение селективных меток в рецепторы клеток (введение аффинных меток)

Клетки линии MV-1-Lu удаляют со дна колбы с культурой, инкубируя их при 37С в течение 10 минут с 10 мл раствора 1 (128 мМ NaCl, 5 мМ КСl, 25 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-этансульфоната при рН 7,5, 5 мМ глюкозы и 1 мМ ЭДТА). Удаленные таким образом клетки ресуспендируют в растворе 2 (128 мМ NaCl, 5 мМ КСl, 50 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-этансульфоната при рН 7,5, 1,2 мМ CaCl₂, 1,2 мМ MgSO₄ и 5 мг/мл БСА) и затем собирают центрифугированием при 1000g в течение 5 минут. После центрифугирования клетки ресуспендируют в растворе 2 до концентрации 10⁶ клеток на 1 мл.

Из полученной суспензии клеток отбирают аликвоты по 0,5 мл и помещают на 24-луночные планшеты (Greider GmbH, Frickenhausen, Germany), добавляют пептиды, в 50 мкл раствора концентрации 0,8 мг/мл, затем полученный продукт инкубируют в течение 2 часов при 4С при перемешивании. Затем добавляют ¹²⁵I-TGF1 (2 мкКи) до окончательной концентрации 277,2 пМ (рекомбинантный ¹²⁵I-TGF1 человека, 800-2200 Ки/ммоль, производство фирмы "Amersham Life Science", Buckinghamshire, UK) и далее инкубируют в течение двух часов при 4С при перемешивании.

После инкубирования клетки переносят в пробирки для центрифугирования и центрифугируют на холоде при 12000хg в течение 1 минуты. Затем дважды промывают холодным раствором 2 и ресуспендируют в 0,5 мл холодного раствора 2 с 5 мкл диметил-сульфоксида (DMSO 99,5%, производство фирмы "Sigma Chemical Co.", St. Louis, USA) и дисукцимидилсуберата (DSS, производство фирмы "Pierce Chemical Co.", Rockford, USA), устанавливая при этом окончательную концентрацию, равную 0,25 мМ DSS. Реакцию останавливают через 15 минут путем разбавления, центрифугируют и промывают раствором, содержащим 0,25 мМ сахарозы, 10 мМ Tris и 1 мМ ЭДТА при рН 7,4. Осадок клеток ресуспендируют в 0,5 мл Тритона Х-100 (производство фирмы "Bio-Rad Laboratories", Hercules, USA), 1% об./об., содержащем 10 мМ Tris при рН 7,0, 1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторида, 1 мкг/мл пепстатина и 1 мкг/мл лейпептина (производство фирмы "Sigma Chemical Co.", St. Louis, USA), и инкубируют в течение 40 минут при 4С. Фракцию, которая нерастворима в детергенте, отделяют центрифугированием при 12000g в течение 15 минут. Фракцию, которая растворима в детергенте (супернатант), и фракцию, которая нерастворима (осадок), замораживают при -20С (Massague J. and Like В. (1985) J. Biol. Chem. 260:2636-2645).

Электрофорез белков в геле полиакриламида с додецилсульфатом

Фракции, растворимые и нерастворимые в детергенте, использовали для анализа методом электрофореза в гелях акриламид/бисакриламид с концентрацией 7,5% в течение 5-6 часов при напряжении 220 вольт.

Белки визуализируют окрашиванием раствором красителя кумасси бриллиантового голубого (comassie brilliant blue (производство фирмы "Serva Feinbiochemica GmbH", Heidelberg, Germany)) в метаноле (50%), уксусной кислоте (10%) и дистиллированной воде в течение 30 минут. Последующее промывание осуществляют раствором метанола (50%), уксусной кислоты (10%) и дистиллированной воды в течение 15 минут для первого промывания, и с дальнейшими последовательными промываниями метанолом (2,5%), уксусной кислотой (0,5%) и дистиллированной водой до удаления окраски фона.

Проточная цитометрия

Ингибирование связывания TGF1 с рецепторами клеток при посредничестве пептидов измеряют методом прямой флуоресценции. Для этого используют флуоресцентный набор (Fluorokine rh TGF-biotin, R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, UK). Эта методика основана на способности биотинилированного TGF1 связываться с рецепторами клеток особым образом и последующем взаимодействии биотина с авидином, содержащим флуоресцентную метку, так что интенсивность сигнала будет зависеть от количества TGF1, связанного с рецепторами клеток.

Клетки линии MV-1-Lu, выращенные в колбах с площадью 162 см², удаляют, используя раствср 1 (описанный выше) и ресуспендируют в физиологическом растворе для последующего центрифугирования при 500g в течение 5 минут. После центрифугирования клетки опять ресуспендируют в физиологическом растворе при концентрации клеток 410⁶ клеток в 1 мл. По 25 мкл этой суспензии клеток добавляют в боросиликатные пробирки размером 1275 мм, в которые затем добавляют пептид, который необходимо исследовать, в 40 мкл среды RPMI 1640, получая при этом окончательную концентрацию 0,42 мкг/мкл, и 10 мкл биотинилированного TGF1. Для контроля специфичности добавляют 10 мкл биотинилированного реагента из набора, 10 мкл биотинилированного TGF1 добавляют в качестве положительного контроля и 20 мкл анти-TGF1 блокирующих антител добавляют в качестве отрицательного контроля. Физиологический раствор добавляют во все контрольные образцы до получения суммарного объема, равного 75 мкл. Все пробирки инкубируют в темноте в течение 1 часа при 4С.

В конце периода инкубирования добавляют 10 мкл авидина, содержащего флуоресцентную метку, инкубируют в течение 30 минут в темноте при 4С, после чего добавляют 2 мл промывочного раствора (RDF1), после чего центрифугируют при 500g в течение 6 минут. Осадок клеток ресуспендируют в 0,2 мл холодного PBS для цитометрии (FACScan, Becton Dickinson Immummocytometry Systems, California, USA). Эта методика позволяет измерить флуоресценцию, излучаемую каждой клеткой в тех случаях, когда лазерный луч падает на нее, с помощью компьютерной программы (Lisys II, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, California, USA). На фиг.16 показано типичное изображение, получаемое при анализе методом проточной цитометрии.

Для того, чтобы получить данные, относящиеся к связыванию TGF1 с рецепторами, применяемый в тесте положительный контроль используют для установления границ областей, соответствующих меченным клеткам, которые связаны с TGF1-биотином (М2), и областей, которые соответствуют немеченым клеткам (M1). Как только границы областей установлены, рассчитывают процентное содержание клеток, содержащихся в каждой из них. Ту же самую процедуру осуществляют с данными, полученными в тех случаях, когда пептиды инкубируют с TGF1-биотином или с клетками, в зависимости от того, получены ли пептиды из рецепторов или от TGF1 соответственно. Используя эти данные, вычисляют величину ингибирования в процентах для каждого из пептидов, используя следующую формулу: 100-((М2 Пептид - М2 "Отрицательный контроль")100/(М2 "Положительный контроль" - М2 "Отрицательный контроль")).

ЭКСПЕРИМЕНТЫ IN VIVO. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ФИБРОЗА

Использовали белых крыс-самцов (альбиносы линии Вистар) одного возраста (5 недель ± 1,5 недели) для того, чтобы получить группу, однородную по возрасту и исходному весу. В течение всего эксперимента животных содержали при постоянной температуре (22С) и 12-часовом цикле освещение-темнота. Животным был предоставлен свободный доступ к воде и пище.

Цирроз печени (НС) вызывали путем ингаляций четыреххлористого водорода в течение 11 недель, два раза в неделю ( Novoa JM et al. (1976) Patologia IX:223-240; Camps J. et al. (1987) Gastroenterology 93:498-505). Выдержку под действием ССl₄ осуществляли путем пропускания сжатого воздуха со скоростью 3 л/мин через промывную склянку для газов. Первоначально использовали выдержку, равную одной минуте, увеличивая затем выдержку на одну минуту в неделю, достигая 4 минут на четвертой неделе. В течение пятой недели ССl₄ не вводили, а на шестой неделе начинали опять с выдержки, равной 5 минутам. Это время выдержки сохраняли вплоть до недели 11. К питьевой воде добавляли 400 мг/мл фенобарбитала (Luminal, Bayer, Leverkusen, Germany), начиная за одну неделю до начала выдержки под действием ССl₄ и вплоть до конца проведения эксперимента.

Перед началом лечения была оставлена одна неделя, в течение которой крысам не вводили ССl₄. Во время лечения крысам вводили еженедельную дозу ССl₄, как указано (фиг.2).

Распределение животных по группам

Перед началом индуцирования цирроза печени животные были распределены на 4 группы.

Контрольная группа здоровых животных (Со): животные, которых не подвергали процессу фиброза.

Контрольная группа здоровых животных, которых подвергали лечению (Со+Р144): животные, которых не подвергали процессу фиброза и которым вводили пептид Р144 в течение последних 3 недель (совпадающих по времени со временем лечения крыс в группе Tto₂).

Контрольные группы 1 животных, подвергнутых циррозу (Ci₁): животные, которых подвергали индуцированию процесса фиброза путем ингаляций ССl₄ два раза в неделю. По достижению пятой недели этих животных разбили на 2 группы:

Контрольная группа 1 животных, подвергнутых циррозу (Ci₁): животные, которых продолжали подвергать процессу индуцирования фиброза вплоть до недели 11 и которым не вводили пептид Р144. Этим животным на протяжении процесса индуцирования через день вводили сыворотку в солевом растворе (недели от 5 до 11).

Группа 1 животных, подвергнутых циррозу и лечению (Tto₁): животные, которым вводили пептид Р144, полученный из последовательности рецептора типа III, через день, во время процесса индуцирования фиброза, недели от 5 до 11. Контрольные группы 2 животных, подвергнутых циррозу (Сi₂): животные, которых продолжали подвергать процессу индуцирования фиброза, и не получавшие ни пептид Р144, ни сыворотку в солевом растворе. Эту группу по достижении недели 11 разделили на две другие группы.

Контрольная группа 2 животных, подвергнутых циррозу (Ci₂): животные, подвергнутые циррозу, которые не получали какое-либо лечение, сохранялись в качестве контрольной группы. Эти животные получали инъекции сыворотки в солевом растворе в течение 3 недель (недели от 13 до 15).

Группа 2 животных, получавших лечение (Tto₂): животные, подвергнутые циррозу, получавшие пептид, полученный из последовательности рецептора типа III (Р144) в течение 3 недель (недели от 13 до 15).

Лечение животных

- Группа Tro₁: этих животных подвергали лечению во время процесса фиброза. Лечение с использованием пептида начали на пятой неделе (перед выдержкой под действием ССl₄ в течение 5 минут) и продолжали вплоть до конца одиннадцатой недели процесса индуцирования цирроза.

- Группа Tto₂: этих животных подвергали лечению после завершения процесса индуцирования цирроза (11 недель). Лечение начали через одну неделю после последней ингаляции ССl₄ и продолжали в течение 21 дня.

Перед началом лечения и после его завершения у всех животных, получавших пептид, брали кровь. Пептид вводили путем подкожных инъекций в абдоминальную область в дозе 70 мкг на животное в 500 мкл физиологического раствора.

Сакрификация животных и иссечение печени

После завершения введения пептида животным, как в случае модели на крысах, так и в случае модели на мышах, животных сакрифицировали декапитацией, после взятия у них крови из заглазничного сплетения с помощью капилляра.

Сразу же после этого иссекали печень и собирали образцы.

Образцы разрезали и помещали в фиксирующий раствор - формалин для последующих гистологических исследований. Другие фрагменты помещали в криопробирки, которые помещали в жидкий азот и хранили затем при -80С. Анатомопатологические исследования печени

Для гистологических исследований использовали фрагменты печени, предварительно зафиксированные в формалине по меньшей мере в течение 24 часов, после чего помещенные в этанол (70%).

После дегидратации препараты заделывали в парафиновые блоки. Из полученных блоков готовили последовательные срезы толщиной 3 мкм, используя дисковый микротом Лейтца и стальные лезвия. Перед окрашиванием срезы депарафинировали в ксилоле (AnalaR, BDH, Poole, UK) в течение 15 минут, после нагревания их при 60С в термошкафу в течение 15 минут и затем гидратировали последовательными обработками спиртом понижающейся концентрации: 100%, 96%, 80% и 70%, и окончательно - водой. Использовали следующие красители:

- Гематоксилин-эозин.

- Трихромовый Мэссона (Locquin M. and Langeron, (1985) in Manual de Microscopia Ed. Labor S.A. Barcelona): Uses a specific dye for collagen proteins (green light).

- Сириус красный: краситель, специфичный для коллагена.

Подтверждение фиброза печени: анализ изображений

Для анализа изображений полученных образцов использовали оптический микроскоп (Olympus BH-2, Tokyo, Japan), соединенный с видеокамерой (Sony DXP-950P, Sony Co., Tokyo, Japan), с помощью которой получали фотографические снимки различных участков препарата. Шесть участков каждого из препаратов, выбранные случайным образом, окрашивали красителем сириус красный. Различные полученные изображения анализировали с использованием компьютерных программ (Visilog 4.1.5, Noesis, Orsay, France), которые позволяли рассчитать площадь участков, подвергнутых фиброзу, и общую площадь препарата. Из этих данных для каждого участка вычисляли показатель фиброза (площадь участков, подвергнутых фиброзу/общая площадь). Для того, чтобы использовать указанную программу, было необходимо модифицировать систему получения изображений путем использования поляризационных светофильтров (Olympus U-POT, Tokyo, Japan), и светло-зеленых фильтров (Olympus IF550, Tokyo, Japan), что позволило автоматизировать процесс анализа образцов.

Определение коллагена в срезах тканей, обработанных парафином, толщиной 14 мкм

Срезы толщиной 14 мкм, которые использовали для анализа этим методом, получали таким же способом, как и описанные выше срезы толщиной 3 мкм. Эти срезы подвергали депарафинированию в течение 12 часов в ксилоле. После того, как парафин был удален, образцы гидратировали последовательным пропусканием через спирт понижающейся концентрации: 96%, 80%, 50% и окончательно - дистиллированную воду.

После гидратации образцы подвергали предварительному окрашиванию в растворе 160 мг зеленого красителя Fast Green FCF (Fluka Chemica-BioChemica, Buchs, Switzerland) в 160 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты (Merck, Darmstadt, Germany) в течение 15 минут в темноте. Образцы промывали, погружая в воду до тех пор, пока они не перестанут окрашивать промывные воды. После того, как избыток красителя был удален, образцы окрашивали в течение 30 минут в темноте в растворе красного красителя 160 мг Direct Red 80 (Fluka Chemica-BioChemica, Buchs, Switzerland) и 64 мг зеленого красителя Fast Green, оба красителя в 160 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты. Образцы опять промывали, погружая в воду до тех пор, пока они не перестанут окрашивать промывные воды, и затем образцы снимали с предметного стекла, соскабливая небольшим шпателем. Снятые таким образом срезы помещали в отдельные пробирки, содержащие 3 мл 0,1 н раствора NaOH (Quimon, Montplet&Esteban S.A., Barcelona, Spain) и метанол (1:1). Отбирали аликвоты из различных пробирок для спектрофотометрического исследования (Lambda 2 UV/VIS spectrophotometer, Perkin-Elmer, Norwalk, USA) при длине волны 540 нм и 630 нм, используя в качестве раствора сравнения аликвоту смеси 0,1 н. раствора NaOH и метанола (Lopez de Leon A. and Rojkind (1985) Histochem. Cytochem. 33:737-743; Gaudio E. et al. (1993) Int. J. Exp. Path. 74:463-469).

Согласно работам Гаудио и сотр. (1993) Int. J. Exp. Path. 74:463-469), для определения количества коллагена и суммарного белка использовали следующие формулы:

Статистический анализ полученных результатов

Данные, полученные в экспериментах in vivo, были подвергнуты статистическому анализу. Соответствие количественных значений переменных нормальному распределению проверяли с помощью теста Шапиро-Вилкса.

В тех случаях, когда данные не соответствовали нормальному распределению, применяли непараметрический статистический анализ. Сравнение между группами осуществляли, используя Н критерий по Крускал-Валлис (Kruskal-Wallis) с последующим сравнением с U критерием по Манн-Уитни (Mann-Whitney). Полученные данные представлены графически в виде прямоугольников, с изображением среднего значения полученных данных (жирная линия внутри каждого прямоугольника) наряду с интерквартильной широтой (высота прямоугольника), где "усы" каждого из прямоугольников представляют наибольшее и наименьшее значение, относящееся к данной интерквартильной широте.

Связь между переменными изучали, используя точный критерий Фишера. Для определения независимости этих переменных использовали логистическую регрессию.

Значения Р, равные или меньшие 0,05, рассматривали как статистически значимые.

Все указанные методы статистического анализа осуществляли, используя программу SPSS для Windows версии 6.1.3.

ИНГИБИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА TGF1 IN VITRO

Исследование ингибирования роста клеток линии MV-1-Lu

Трансформирующий фактор роста TGF1 представляет собой цитокин, который способен ингибировать рост клеток линии MV-1-Lu in vitro (Grubeck-Loebenstein В. et al. (1989) J. Clin. Invest. 83:764-770; Brennan FM et al. (1990) Clin. Exp. Immunol. 81:278-285), поэтому эту линию использовали для исследования блокирующего действия пептидов на TGF1. После различного комбинирования среды, клеток и тимидина авторы настоящего изобретения исследовали влияние различных концентраций TGF1 на связывание [метил-³Н] тимидина клетками линии MV-1-Lu в культуре, для того, чтобы определить наиболее подходящие условия для проведения теста. Эти условия показаны на фиг.3.

После того, как была определена оптимальная концентрация клеток линии MV-1-Lu (5000 клеток на лунку) и наименьшая концентрация TGF1, способная вызывать ингибирование, равное около 90% (200 пг/мл, фиг.18), ингибирующий эффект синтетических пептидов исследовали при концентрации 200 мкг/мл. Ингибирование активности трансформирующего фактора роста TGF1 in vitro синтетическими пептидами

Синтетические пептиды, которые являются потенциальными ингибиторами активности TGF1, выбранные таким образом, как показано выше в разделе "Выбор пептидов, которые необходимо синтезировать" (как пептиды, полученные из белков, которые связываются с TGF1, так и пептиды, полученные из самого TGF1) были исследованы с использованием линии клеток MV-1-Lu. Пептиды растворяли в забуференной среде RPMI, не содержащей эмбриональную телячью сыворотку, и использовали следующую методику:

пептиды, принадлежащие последовательности рецептора или комплементарные максимумам гидрофильности TGF1, инкубируют в течение 30 минут в присутствии этого цитокина и соединяют с культурой клеток. Пептиды, полученные из последовательности TGF1, добавляют к культуре клеток перед добавлением TGF1, поскольку они взаимодействуют с рецепторами поверхности клеток.

Это инкубирование осуществляют в 100 мкл той же самой среды, которую использовали при добавлении клеток. Активные пептиды воздействуют на рост клеток в большей или меньшей степени в зависимости от их способности ингибировать TGF1.

Ингибирование активности TGF1 пептидами, полученными из TGF1

На первой стадии были синтезированы пептиды с перекрывающимися последовательностями, полученные из TGF1. Эти пептиды (таблиц