Рекомбинантные антитела против cd4 для терапии человека

Рекомбинантные антитела против cd4 для терапии человека

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и представляет собой химерные антитела, специфические в отношении антигена CD4 человека, ДНК, кодирующие их, а также применение их в качестве терапевтических средств. Эти химерные антитела содержат последовательности вариабельного домена иммуноглобулина низшей узконосой обезьяны и последовательности константного домена иммуноглобулина человека. За счет того, что данные антитела обладают желательными терапевтическими свойствами, в том числе низкой антигенностью, пониженной (или отсутствующей) активностью истощения Т-клеток, хорошей аффинностью (сродством) в отношении CD4 человека и повышенной стабильностью (полупериодом существования в организме in vivo), данное изобретение позволяет выработать более эффективный способ лечения или предотвращения связанного с CD4 состояния. 13 н. и 17 з.п. ф-лы, 25 ил., 5 табл.

Данная заявка является частичным продолжением US Serial № 08/476237, которая является частичным продолжением US Serial № 08/397072, поданной 25 января 1995, которая является продолжением US Serial № 07/912292, поданной 10 июля 1992, которая является частичным продолжением Newman et al., United States patent application Serial № 07/856281, поданной 23 марта 1992, которая является частичным продолжением US patent application Serial № 07/735064, поданной 25 июля 1991, причем все их содержимое, в том числе рисунки, включено этим перечислением в качестве ссылки. Данное изобретение относится к рекомбинантным антителам, специфическим в отношении CD4, которые применимы для терапии человека, и к способам получения таких антител.

CD4 представляет собой поверхностный гликопротеин, первично экспрессируемый на клетках линии дифференцировки Т-лимфоцитов, в том числе на большинстве тимоцитов и субпопуляции периферических Т-клеток. Низкие уровни CD4 экспрессируются также некоторыми нелимфоидными клетками, хотя функциональное значение такого дивергентного клеточного распределения неизвестно. На зрелых Т-клетках CD4 выполняет функцию двойного распознавания через взаимодействие с молекулами МНС (ГКГ) Класса II, экспрессируемыми в антигенпредставляющих клетках. CD4⁺ Т-клетки составляют первично хелперную субпопуляцию, которая регулирует функции Т- и В-клеток во время Т-зависимых ответных реакций на вирусные, бактериальные, грибковые и паразитарные инфекции.

Во время патогенеза аутоиммунных заболеваний, в частности, когда толерантность к аутоантигенам разрушается, CD4⁺ Т-клетки способствуют воспалительным реакциям, которые приводят к разрушению суставов и тканей. Эти процессы облегчаются рекрутингом воспалительных клеток гемопоэтической линии дифференцировки, образованием антител, воспалительных цитокинов и медиаторов и активацией клеток-киллеров.

Ревматоидный артрит (РА), воспалительное заболевание синовиальной оболочки, является одним из проявлений аутоиммунного феномена, который приводит к эрозии, деформации и деструкции суставов. Подобно большинству аутоиммунных заболеваний, этиология РА не выяснена хорошо. Однако известно, что РА характеризуется повышенными уровнями активированных CD4⁺ Т-лимфоцитов в пораженных суставах. В настоящее время не существует способа лечения для РА. Первоочередная терапия для РА предназначена для обеспечения ослабления симптомов РА и улучшения способности функционирования на протяжении короткого времени. Иммуносупрессоры и стероиды второй и третьей очереди, такие как азатиоприн, метотрексат и преднизолон, направленные на лежащее в основе заболевание, вводят в более тяжелых случаях, и они либо слабоэффективны, либо проявляют неприемлемую токсичность для хронической терапии. Кроме того, они не защищают от деструкции суставов.

Кроме РА, CD4⁺ клетки считали также причастными к другим хроническим состояниям, в том числе, к псориазу, инсулин-зависимому сахарному диабету, системной красной волчанке и воспалительным заболеваниям кишечника. Кроме того, возможно, что экспрессия CD4 может принимать участие в других аутоиммунных заболеваниях.

При условии, что Т-клетки участвуют в развитии и поддержании аутоиммунных заболеваний, иммуносупрессия стала важной стратегией лечения. Доступные иммуносупрессивные лекарственные средства, такие как циклоспорин А, успешно использовали для лечения отторжения трансплантата. Однако их токсичные побочные эффекты делают их неприемлемыми для хронической терапии аутоиммунных заболеваний.

Истощение всей популяции Т-клеток, в том числе, CD4⁺ субпопуляции, в клинических ситуациях выполняли способами, включающими дренаж грудного (лимфатического) протока, тотальное облучение лимфоидов и лимфоферез, приводящими к клиническому улучшению у некоторых пациентов. Однако стратегии настоящего времени сосредоточены на более избирательных агентах, которые ингибируют нежелательные иммунные ответы, не индуцируя токсичности для твердых органов или других основных побочных эффектов. Одним из путей, при помощи которого это может быть потенциально достигнуто, является избирательное удаление или инактивация опосредующих заболевание Т-клеток моноклональными антителами (mAb). mAb к CD4 представляют собой одну из таких стратегий. В животных моделях аутоиммунитета и трансплантации mAb против CD4 задерживают или обращают прогрессирование заболевания при профилактическом или терапевтическом введении. Кроме того, первоначальные результаты из некоторых клинических испытаний с mАb против CD4 в случае РА, псориаза, воспалительного заболевания кишечника и системного васкулита дали некоторое предварительное доказательство потенциальной терапевтической эффективности.

По существу, цель терапии с использованием mAb против CD4 состоит в остановке аутодеструктивной активности CD4⁺ клеток, в частности, во время острых фаз аутоиммунного нарушения. Конечной терапевтической задачей является создание состояния иммунологической неотвечаемости (анергии) или долгосрочной толерантности к поражающим антигенам (или специфическим тканям), которые поддерживают лежащее в основе заболевание, без ослабления нормальных защитных сил хозяина против условно-патогенных инфекций. Кроме PA, mAb против CD4 выгодны также для лечения других аутоиммунных заболеваний, например, инсулин-зависимого сахарного диабета, системной красной волчанки, псориаза, воспалительного заболевания кишечника и рассеянного склероза.

Вследствие потенциальной важности mAb против CD4 в качестве иммунотерапевтических средств многочисленные компании и исследовательские группы сообщили о mAb против CD4 как о потенциальных терапевтических агентах. Например, Centocor сообщил о mAb против CD4, названном Centara, который представляет собой химерное мышиное mAb против CD4. Далее, Johnson and Johnson/Ortho сообщил об ОКТ-4а, mAb против CD4, которое представляет собой "очеловеченное" мышиное mAb. Далее Burroughs Wellcome сообщил об mAb против CD4, которое представляет собой "очеловеченное" крысиное mAb к CD4. Кроме того, как Sandoz, так и MedImmune (в сотрудничестве с Merck) разработали mAb "мышь-человек" против CD4, специфическое в отношении CD4. Далее, Becton Dickinson, Immunotech и Boehringer Mannheim независимо получили mAb против CD4.

Кроме mAb против CD4, были описаны различные иммуномодуляторы и лекарственные средства, потенциально применимые для лечения РА. Такие иммуномодуляторы и лекарственные средства включают, например, ингибиторы клеточной адгезии, ингибиторы рецепторов цитокинов, иммунотоксины и антагонисты рецепторов Т-клеток. Конкретные примеры включают гамма-интерферон, anti-ICAM-1 (мышиное mAb против CD54, которое ингибирует направленную миграцию лимфоцитов и адгезию), Campath-lH (крысиное-"очеловеченное" mAb против Cdw52), рецептор IL-1, сА2 (химерное mAb против TNF-), CDP571 (mAb против TNF), anti-IL-2R ("очеловеченное"-мышиное mAb против CD25), SDZ СНН 380 (mAb "мышь-человек" против CD7), DAB486 IL-2 (IL-2-слитый токсин, неспецифический для CD4- и CD8 клеток), Antril (IL-1RA), anti-TCR (mAb и белки, которые нацелены на популяции рецепторов Т-клеток) и XomaZyme-CDS (конъюгат мышиное mAb против CDS-токсин).

Также другие иммуномодуляторы и иммуносупрессоры, имеющие потенциальное применение для лечения аутоиммунных заболеваний, включают Рапамицин (пероральное иммуносупрессивное средство), Терафектин, Лефлуномид (иммуносупрессивное пролекарство), Тенидап (модулятор цитокина/СО-ингибитор), IMM-125 и RS-61443 (пероральное иммуносупрессивное средство).

Как отмечалось, были сообщения о многочисленных моноклональных антителах к CD4, имеющих потенциальные терапевтические применения. В большинстве случаев эти антитела содержат мышиные mAb, химерные или мышиные-"очеловеченные" (мышь-человек) mAb против CD4.

Мышиные моноклональные антитела имеют потенциальную применимость в диагностике заболевания человека, а также в клинических испытаниях в качестве терапевтических средств для лечения как острых, так и хронических заболеваний человека, в том числе, лейкозов, лимфом, твердых опухолей (например, опухолей ободочной кишки, молочной железы, печени), СПИДа и аутоиммунных заболеваний. Однако мышиные антитела являются невыгодными, поскольку они часто приводят к иммунному гуморальному ответу в хозяине, т.е. образованию антител против мышиных моноклональных антител.

Были также сообщения о химерных мышь/человек антителах. Эти антитела имеют характеристики связывания исходного мышиного антитела и эффекторные функции, связанные с константной областью иммуноглобулина человека. См., например, Cabilly et al., US Patent № 4816567; Shoemaker et al., US Patent № 4978775; Beavers et al., US Patent № 4975369 и Boss et al., US Patent № 4816397 (все включены здесь в качестве ссылки). Как правило, эти химерные антитела конструируют при получении геномной генной библиотеки из ДНК, экстрагированной из предсуществующих мышиных гибридом (Nishman et al., 47 Cancer Research, 999 (1987)). Затем библиотеку подвергают скринингу на гены вариабельных областей как из тяжелых, так и из легких цепей, обнаруживающих правильный характер перегруппировки фрагментов антител. Клонированные гены вариабельных областей затем лигируют в экспрессирующий вектор, содержащий клонированные кассеты подходящего гена константной области тяжелой или легкой цепи человека. Затем химерные гены экспрессируют в выбранной клеточной линии, обычно в линии мышиных миеломных клеток.

Однако, хотя такие химерные антитела были использованы в терапии человека, они также создают некоторые проблемы. Подобно тому, как это имеет место в случае мышиных моноклональных антител, индивидуумы-реципиенты могут продуцировать антитела против химерного антитела. Это неблагоприятно для эффективности продолжающейся терапии с использованием химерного антитела.

В качестве усовершенствования общепринятых химерных антител некоторые исследователи описали способы получения человеческих моноклональных антител, которые не должны создавать подобных проблем. См., например, Erlich et al., 34 Clinical Chemistry, 1681 (1988); Erlich et al., 7 Hybridoma, 385 (1988); Erlich et al., 6 Hybridoma, 151 (1987) и Erlich et al., 1 Human Antibody Hybridomas, 23 (1990). Эти ссылки также выдвигают гипотезу, что антитела приматов (кроме человека), например моноклональные антитела шимпанзе, должны хорошо переноситься человеком вследствие их структурного сходства с антителами человека. Однако образование антител в людях имеет очевидные этические неудобства.

Поскольку антитела человека неиммуногенны в макаке Резусе (т.е. не вызывают образования антител), Erlich et al. также предсказывают, что антитела приматов должны быть неиммуногенными в человеке. Erlich et al. (Id.) указывают, что испытание антител в людях является необязательным, если антитело примата имеет константную область, идентичную с константной областью иммуноглобулина человека, или, по меньшей мере, структура не больше отличается от иммуноглобулина человека, чем различные антитела человека отличаются друг от друга. Таким образом, они предполагают, что антитела шимпанзе могут быть использованы в терапии человека.

В качестве усовершенствования известных химерных антител, которые часто являются антигенными в организме человека, родственные заявки US Serial № 08/476237, поданная 7 июня 1995, US Serial № 08/347072, поданная 25 января 1995, и US Serial № 07/912212, поданная 10 июля 1992, 07/856281, поданная 23 марта 1992, и 07/735064, поданная 25 июля 1991, все включенные здесь в качестве ссылки, описывают приготовление моноклональных антител низших узконосых обезьян и химерных антител, произведенных из них, полученных рекомбинантными способами, которые содержат вариабельную область антитела узконосой обезьяны (например, павиана или макака), слитую с клонированной константной областью иммуноглобулина человека, шимпанзе или другой обезьяны или каркасными областями других обезьян. Эти заявки описывают, в частности, приготовление таких антител низшей узконосой обезьяны и произведенных из них химерных антител против человеческих антигенов, а также использование таких химерных рекомбинантных антител в качестве иммунотерапевтических средств для лечения заболевания человека.

Эти заявки основываются на неожиданном открытии, что эволюционно отдаленные обезьяны (например, павиан или макак), (в том числе cynomolgus и резус)), в противоположность шимпанзе, не только достаточно отличаются от человека, чтобы антитела против человеческих антигенов образовались в этих обезьянах даже против относительно консервативных человеческих антигенов, например, CD4 и CD54, но и достаточно сходны с человеком, чтобы иметь антитела, которые структурно одинаковы с антителами человека, так что не происходит образования антител в хозяине против антител этих обезьян или против произведенных из них рекомбинантных химерных антител при введении их в человека.

Эти заявки описывают, что в противоположность некоторым прежним антителам, используемым для терапии человека, в том числе известным химерным антителам, такие химерные антитела не имеют некоторых недостатков, например, таких как 1) иммуногенность и индукция образования в человеке антител против этих антител (НАА) при повторяемом введении, необходимом для лечения хронических состояний, 2) относительно короткий период полувыведения по сравнению с антителами человека и 3) отсутствие эффекторных функций в отношении клеток или комплемента человека.

Отсутствие этих недостатков является существенным преимуществом для терапии человека. Например, в случае хронических заболеваний человека, в том числе аутоиммунных заболеваний, или любого заболевания, при котором требуется продолжительное введение антитела, одним из главных препятствий для повторяющейся терапии с применением антител является реакция хозяина на терапевтические антитела. НАА-реакции часто непредсказуемы и отличаются от одного пациента к другому. Также, такие ответные реакции преимущественно, хотя и не исключительно, направлены против константной области молекулы антитела, и, если они имеют место, они часто устраняют или снижают эффективность терапии этим антителом или другим антителом того же изотипа. Рекомбинантные химерные антитела, описанные в упомянутых выше заявках, элиминируют эту проблему и делают возможным генерирование антител подходящей специфичности и желаемой эффекторной функции и их использование в получении рекомбинантных антител.

Эти рекомбинантные антитела, как правило, содержат подходящую часть вариабельной области антитела, полученного из иммунизированной обезьяны, которая необходима для связывания антигена, и константную область антитела из человека или шимпанзе. Таким образом, это позволяет сохранить специфичности и высокие аффинности моноклональных антител обезьяны и желательные эффекторные функции путем подходящего выбора константной области антитела человека или шимпанзе.

Некоторые из этих родственных заявок приводят, в частности, примеры химерного антитела обезьяна/человек, специфического для CD4, называемого СЕ9.1, которое содержит вариабельный домен тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела против CD4, образованного в собакоподобной обезьяне (cynomolgus), и константной области легкой цепи лямбда иммуноглобулина человека и константной области тяжелой цепи гамма 1 иммуноглобулина человека. Это антитело обладает некоторой активностью истощения Т-клеток, но эта активность является более низкой в сравнении с предшествующими моноклональными антителами против CD4. Однако желательно получить антитела, которые обладают более низкой истощающей Т-клетки активностью или лишены этой активности, поскольку это потенциально усилило бы их терапевтический потенциал.

Эти заявки описывают также предпочтительные векторные системы для получения таких химерных антител, в частности, ТСАЕ 5.2 и ТСАЕ 6, которые содержат:

1. Четыре транскрипционные кассеты в тандемном порядке:

а) константную область легкой цепи иммуноглобулина человека. В ТСАЕ 5.2 это константная область легкой цепи каппа иммуноглобулина человека (согласно нумерации Kabat аминокислоты 108-214, аллотип Km 3) и в ТСАЕ 6 константная область легкой цепи лямбда иммуноглобулина человека (согласно нумерации Kabat аминокислоты 108-215, генотип Oz минус, аллотип Мcg минус, Ке минус);

b) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека; в обеих конструкциях тяжелой цепью иммуноглобулина человека является константная область гамма (согласно нумерации Kabat аминокислоты 114-478, аллотип Gmla, Gm 12);

c) DHFR, содержащий его собственный эукариотический промотор и район полиаденилирования; и

d) NEO, также содержащий его собственный эукариотический промотор и район полиаденилирования.

2. Кассеты легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина человека содержат синтетические сигнальные последовательности для секреции цепей иммуноглобулина.

3. Кассеты легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина человека содержат специфические ДНК-связи, которые позволяют встраивание вариабельных областей легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина, которые сохраняют трансляционную рамку считывания и не изменяют аминокислоты, в норме обнаруживаемые в цепях иммуноглобулина.

Однако, несмотря на все описанное ранее, в данной области все еще существует потребность в усовершенствованных антителах, которые являются специфическими в отношении CD4, обладают низкой антигенностью в человеке и которые могут использоваться терапевтически, например, для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит. В частности, существует потребность в получении антител против CD4, которые проявляют улучшенные свойства, например, более длительный период полувыведения, и/или которые по существу лишены истощающей активности.

Для выполнения этой задачи, целью данного изобретения является обеспечение новых моноклональных и химерных антител, специфических в отношении CD4, имеющих улучшенные свойства, например, более продолжительный период полувыведения, низкую иммуногенность в человеке и/или пониженную истощающую Т-клетки активность или ее отсутствие. Более конкретно, целью данного изобретения является получение химерных антител против CD4, которые содержат антиген-узнающую часть иммуноглобулина низшей узконосой обезьяны, специфическую в отношении CD4, и последовательности константной области иммуноглобулина человека или обезьяны, в частности, константную область легких каппа- или лямбда-цепей человека, и последовательности константной области тяжелой гамма-1- или гамма-4- или мутированной гамма-4-цепи с измененными эффекторными функциями и повышенной стабильностью по сравнению с гамма-4-изотипом.

Более конкретной целью данного изобретения является обеспечение моноклональных и химерных антител, содержащих специфическую вариабельную последовательность тяжелой цепи антитела против CD4 обезьяны, показанную на фиг.1, и вариабельную последовательность легкой цепи антитела против CD4 обезьяны, показанную на фиг.2, слитые с последовательностями константного домена обезьяны или человека, предпочтительно последовательностью константного домена легкой каппа- или лямбда-цепи человека или последовательностью константного домена тяжелой гамма-1- или гамма-4-цепи или мутированной гамма-4-цепи с измененными эффекторными функциями и улучшенной стабильностью по сравнению с гамма-4-изотипом.

Другой целью данного изобретения является обеспечение последовательностей ДНК, которые обеспечивают экспрессию таких усовершенствованных химерных антител против CD4, и векторов и клеток-хозяев, которые могут быть использованы для экспрессии таких химерных антител против CD4. Предпочтительно, такие векторы должны включать в себя экспрессирующие векторы, на которые ссылаются в заявках, включенных здесь в качестве ссылок, а предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки СНО. Еще одной целью данного изобретения является обеспечение фармацевтических композиций для применения в лечении или профилактике связанных с CD4 расстройств, в частности, аутоиммунных заболеваний, которые содержат профилактически или терапевтически эффективное количество рассматриваемых усовершенствованных химерных антител против CD4 в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

Еще одной целью данного изобретения является обеспечение способов лечения или профилактики связанных с CD4 нарушений, в частности, аутоиммунных заболеваний и других состояний, в которых желательна иммуносупрессия, посредством введения терапевтически или профилактически эффективного количества рассматриваемых новых химерных антител против CD4 в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

Фиг.1 изображает аминокислотную последовательность и последовательность ДНК вариабельного домена легкой цепи СЕ9.1.

Фиг.2 изображает аминокислотную последовательность и последовательность ДНК вариабельного домена тяжелой цепи СЕ9.1.

Фиг.3 изображает аминокислотную последовательность и последовательность ДНК вариабельного и константного доменов лямбда-цепи, содержащихся в СЕ9.1.

Фиг.4 изображает аминокислотную последовательность и последовательность ДНК, кодирующую вариабельную и константную последовательность тяжелой цепи гамма-4.

Фиг.5 изображает аминокислотную последовательность и последовательность ДНК, кодирующую тяжелую цепь гамма-4-человека, содержащую Е-мутацию.

Фиг.6 изображает аминокислотную последовательность и последовательность ДНК, кодирующую тяжелую цепь гамма-4-человека, содержащую Р- и Е-мутацию.

Фиг.7-1, 7-2 и 8 показывают нуклеотидную последовательность различных лидерных последовательностей, используемых в данном изобретении.

Фиг.9 показывает диаграмму рассеяния связывания СЕ9.1 со свежими PMNC человека, где верхний правый квадрант Панели А показывает лимфоциты, вдвойне окрашенные СЕ9.1 и ОКТЗ, верхний правый квадрант Панели В показывает популяцию, вдвойне окрашенную СЕ9.1 и ОКТ4, верхний правый квадрант Панели С показывает отсутствие клеток, вдвойне окрашенных CD4 и СЕ9.1, и контроль Панели D показывает клетки, окрашенные нормальным и человеческим IgG.

Фиг.10а,10b и 10с показывают характеристики связывания рецептора Fc CE9.1, где измерения показывают агглютинацию CD4⁺ проточно-цитометрической гистограммы связывания фибробластов с: а) индуцированными IFN свежими моноцитами, где в негативном контроле использовали F(ab')2-фрагменты CE9.1, b) свежими моноцитами с индукцией IFN или без нее и с) в присутствии sCD4 или в отсутствие антитела.

Фиг.11 показывает ингибирование реакции смешанных лимфоцитов человека СЕ9.1, где а) свежие PBL человека использовали в качестве респондеров, а обработанные митомицином С клетки из неродственного донора использовали для тестирования ингибирующих свойств диапазона концентрацией СЕ 9.1 и ингибирование измеряли количеством включения тимидина при образовании IL-1 и b) MLR с применением клеток-респондеров шимпанзе и неродственных шимпанзе стимуляторов, где Leu3a, мышиные антитела против CD4 человека, использовали в качестве контроля.

Фиг.12 показывает антитела-зависимые клеточные цитотоксические свойства СЕ9.1, где лизис клеток-мишеней SupT-18 в присутствии -интерферона стимулировал эффекторные клетки и где 4D9 представляет собой мышиное моноклональное антитело IgG2a против CD4.

Фиг.13 показывает гистограмму проточной цитометрии связывания Clq с клетками SupTl-18 в присутствии и в отсутствие СЕ9.1, где зарегистрированы 10000 событий и результаты выражены в виде гистограммы, PRO945 представляет собой поликлональные антитела из обезьяны с высоким титром антител сыворотки против CD4 и негативным контролем был Clq+anti-Clq в отсутствие СЕ9.1.

Фиг.14 показывает тест комплемент-зависимой цитотоксичности СЕ9.1, где лизис клеток SupT-18 проводят в присутствии СЕ9.1 и кроличьего комплемента, где 4D9 представляет собой контроль в виде мышиных антител против CD4 подкласса IgG2a, которые способны фиксировать комплемент, и где PRO965 представляет собой поликлональную смесь антител из сыворотки обезьяны cynomolgus с высоким титром антител против CD4.

Фиг.15 показывает фармакологическое исследование с высокими дозами в шести шимпанзе, где также показаны уровни CD4, CD8 в периферической крови, экспрессируемых на протяжении периода 150-300 дней, и кривые CD4-CD8, показывающие число CD4-модулированных клеток; верхняя панель: Группа 1 - наблюдаемые числа шимпанзе. Стрелки указывают дозы СЕ9.1. (2) группа солевого контроля, Средняя Панель: Группа 2 - шимпанзе (2), получающие 10 мг/кг СЕ9.1. Дозирование повторяли при возврате чисел CD4 в пределы 30% фона. Нижняя Панель: Группа 3 - шимпанзе (2), получающие 10 мг/кг СЕ9.1. Дозирование повторяли при возвращении чисел CD4 в пределы 70% фона.

Фиг.16 изображает праймеры ПЦР, пригодные для получения константного района 4 человека.

Фиг.17 изображает последовательность тяжелой цепи СЕ9. 14РЕ.

Фиг.18 изображает невосстанавливающий электрофорез в ДСН-полиакриламидном геле СЕ9.1, CE94(G4), CE94E(G4E) и СЕ9РЕ(G4PE). Половина молекулы имеет молекулярную массу приблизительно 80 кД.

Фиг.19 содержит данные для фаз ассоциации и диссоциации кривых прогрессирования SPR.

Фиг.20 показывает действие конструкций mAb против CD4 в первичных MLR.

Фиг.21 показывает адгезию индуцированной IFN линии моноцитов ТНР-1 с CD4⁺ фибробластными трансфектантами.

Фиг.22 изображает FcR- и CD4^--мeдииpyeмyю адгезию СЕ9.1, СЕ94, СЕ94Е и СЕ94К.

Фиг.23 показывает результаты CDC и ADCC с СЕ94РЕ, СЕ9.1 и мышиными фиксирующими mAb с HuCD4.

Фиг.24 показывает концентрации в плазме после болюсной инъекции 1 мг/кг СЕ94Е и СЕ94РЕ в крысах Sprague-Dawley.

Фиг.25 изображает действие обработки mAb на образование специфических для овальбумина антител в HuСD4-трансгенных мышах.

Данное изобретение обеспечивает новые моноклональные химерные антитела, специфические в отношении CD4, которые содержат антигенсвязывающую часть вариабельной области моноклонального антитела против CD4 низшей узконосой обезьяны, слитую с желаемыми последовательностями константного домена обезьяны или человека, предпочтительно константным доменом тяжелой цепи гамма 1 человека, гамма 4 человека или мутированной тяжелой цепи гамма 4 человека, и с последовательностью константного домена легкой каппа- или лямбда-цепи человека. Эти антитела проявляют улучшенные свойства относительно обычных моноклональных антител против CD4, например, высокую аффинность в отношении человеческого CD4 и низкую иммуногенность или отсутствие иммуногенности в человеке. Варианты гамма 4 обнаруживают пониженную эффекторную функцию или отсутствие эффекторной функции, например, активности связывания Fc рецептора или фиксации комплемента, и низкую активность истощения Т-клеток или ее отсутствие.

Способы получения моноклональных антител, специфических для CD4, узконосой обезьяны и клоны, которые продуцируют моноклональные антитела, специфические для CD4, узконосой обезьяны могут быть найдены в вышеупомянутых родственных патентных заявках, включенных здесь в качестве ссылки.

В общем виде, такой способ предусматривает иммунизацию узконосой обезьяны против человеческого антигена CD4 при таких условиях, что узконосая обезьяна образует антитела против CD4, иммортализацию клеток этой обезьяны, ответственных за продуцирование антител против CD4, например, посредством гибридомного слияния, вирусной трансформации Herpes papio, клонирование отдельной В-клетки (также называемое "временной иммортализацией") и получение библиотеки рекомбинантных иммуноглобулинов. В предпочтительных вариантах этот способ включает выбор В-клетки из обезьяны либо из лейкоцита периферической крови, селезенки, костного мозга, либо из лимфатического узла; выбор основы, которая продуцирует подходящее антитело; "спасение" генов иммуноглобулинов, кодирующих это антитело, из иммортализованной клеточной линии; и экспрессию этих генов в линии клеток-продуцентов (т.е. клеточной линии, которая позволяет получить достаточное количество антител для использования для терапии человека). Как определено в вышеупомянутых заявках, низшие узконосые обезьяны включают павианов и макаков (в том числе макака Резуса и собакоподобную обезьяну cynomolgys).

Как обсуждалось supra, в предпочтительном варианте рассматриваемые химерные антитела будут содержать вариабельную тяжелую и вариабельную легкую последовательности антитела против CD4 узконосой обезьяны, показанные на фиг.1 и 2, слитые с последовательностями константного домена антитела человека. Подходящие способы для получения этих специфических последовательностей вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей детально описаны в US application Serial № 08/476237, поданной 7 июня 1990 и 08/397072, поданной 25 января 1995, а также в 07/912292, поданной 10 июля 1992, включенных здесь в качестве ссылки в их полном виде. Кроме того, эти заявки описывают полную нуклеотидную и аминокислотную последовательность этих последовательностей.

Эти последовательности вариабельного домена тяжелой и легкой цепей могут быть слиты с любыми желательными последовательностями константного домена человека. Конкретный выбор будет влиять на эффекторную функцию полученного химерного антитела против CD4. Предпочтительно, константный домен тяжелой цепи будет содержать константный домен гамма 1, гамма 4 или мутированный гамма 4, называемый здесь гамма 4Е, или мутированный гамма 4, называемый гамма 4РЕ. Выбор гамма 4 является предпочтительным, поскольку было обнаружено, что гамма 4 приводит к химерным антителам, не имеющим или почти не имеющим истощающей Т-клетки активности (80-100% относительно гамма 1). Считают, что это связано с тем, что константный домен гамма 4 не способен связывать комплемент. Константный район может быть также мутированным для усиления свойств получаемого химерного антитела, например, стабильности, и/или для элиминации истощающей активности. В частности, модификации Р и Е домена гамма 4, описанные infra, являются модификациями гамма 4 в шарнирной области, которые придают активность повышенной стабильности и исключают истощающую активность. Кроме того, ожидается, что другие модификации должны также обеспечивать химерные антитела, имеющие усиленные свойства.

Константным доменом легкой цепи человека, содержащимся в рассматриваемых химерных антителах против CD4, предпочтительно является константный домен легкой каппа- или лямбда-цепи человека, более предпочтительно константный район легкой лямбда-цепи человека. Аминокислотные и ДНК-последовательности, кодирующие константные домены гамма 1, гамма 4, каппа- и лямбда-цепей человека, известны в данной области. Также, аминокислотные и последовательности нуклеиновых кислот для константного домена гамма 4 и Е и РЕ мутантов и лямбда могут быть найдены на фиг.4-6 и 3, соответственно.

Приведенные в качестве примеров варианты данного изобретения включают специфическое химерное моноклональное антитело против CD4, называемое СЕ9.1, которое содержит антигенсвязывающие домены, полученные из иммунизированного sCD4 человека макака cynomolgus (показанные на фиг.1 и 2), в сочетании с константными доменами человеческого IgG, и моноклональные химерные антитела, произведенные из него, например, СЕ94, СЕ94К и СЕ94Е, СЕ94РЕ, которые имеют те же самые антиген-связывающие домены СЕ9.1, но были сконструированы генетически с каркасом Fc-связывающего домена IgG4 человека. Моноклональное антитело СЕ94Е содержит мутацию лейцин-глутаминовая кислота (L236E) вблизи шарнирного района антитела (Е-модификация). Моноклональное антитело СЕ94РЕ содержит ту же самую мутацию лейцин-глутаминовая кислота плюс мутацию серин-пролин (S229P) (Е- и Р-модификация). Антитело СЕ94К отличается от СЕ94 заменой его константного домена легкой цепи с подтипа К на подтип человека.

Эти переключения и мутации константного домена были произведены, поскольку известно, что биологические ответы антител IgG зависят от состава их карбокси-концевых доменов, т.е. их изотипа. Таким образом, путем изменения изотипа антитела конструированием белков потенциально возможно модифицировать биологический ответ антитела IgG и, более конкретно, рассматриваемых химерных моноклональных антител против CD4.

Желательным результатом этой стратегии конструирования было достижение того, чтобы переключение изотипа Fc-части антитела не уменьшало аффинность связывания связывающих антиген CD4 Fab районов. Однако изначально это неизвестно. Возможно, что изменение константного района или его модификации могли бы иметь неблагоприятное влияние на связывание CD4. Поэтому, полученные антитела тестировали для определения влияния модификации на свойства антител, в частности, на связывание антигена CD4. Для измерения возможных влияний переключения изотипа константного домена на связывание антигена можно использовать известные способы анализа. В частности, исследование взаимодействия между CD4 и СЕ9.1, СЕ94, СЕ94К, СЕ94Е, СЕ94РЕ выполняли анализом Скетчарда и поверхностным плазмонным резонансом (SPR). Результаты этих анализов показали, что связывание CD4 с каждым из тестируемых антител было равноценным. При помощи SPR было найдено, что все константы равновесной диссоциации при 25С для связывания CD4 с антителами равны приблизительно 1,0 нМ. Кроме того, эти измерения показывают, что:

1) связывание CD4 с антителами происходит согласно двухсайтной независимой и идентичной модели связывания и

2) функциональные свойства связывания антигенсвязывающих доменов не зависят от структурных модификаций Fc-части антитела, в том числе изотипов гамма 1, гамма 4 или мутированного гамма 4. Таким образом, данное изобретение обеспечивает доказательство того, что переключение изотипа между IgGl и IgG4 может быть ценной стратегией для конструирования антител без потери антигенсвязывающей аффинности и, более конкретно, антител к CD4.

Как описано infra, было также обнаружено, что замена константного домена гамма 1 доменом гамма 4 существенно уменьшала связывание Fc-рецептора, фиксацию комплемента и активность истощения Т-клеток, и что модификации Е и Р, соответственно, дополнительно элиминируют связывание Fc-рецептора и истощающую Т-клетки активность и обеспечивают повышенную стабильность антител. Таким образом, резонно предположить, что другие химерные антитела, получаемые в соответствии с данным изобретением (сконструированные таким образом, чтобы они содержали константный домен гамма 4 человека или его мутированные формы), могут быть выбраны с измененной Fc-эффекторной функцией, которые почти не имеют истощающей Т-клетки активности или полност