Иммунодоминантный антигенный белок массой 120 кда и ген ehrlichia canis

Иммунодоминантный антигенный белок массой 120 кда и ген ehrlichia canis

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой ген белка массой 120 кДа Ehrlichia canis, амплифицированный посредством ПЦР с использованием праймеров, происходящих от последовательностей ДНК, фланкирующих ген белка массой 120 кДа Ehrlichia chaffeensis. Рекомбинантный белок массой 120 кДа Е. canis содержит 14 тандемных повторяющихся единиц, каждая из которых состоит из 36 аминокислот. Эти повторяющиеся единицы являются гидрофильными и, как предполагается, поверхностно-экспонированными. Рекомбинантный белок массой 120 кДа Е. Canis также является антигенным и реагирует с сывороткой, продуцированной у собак, выздоравливающих от собачьего эрлихиоза. Данное изобретение позволяет ингибировать инфекцию, вызываемую Ehrlichia canis, путем введения композиции, содержащей антиген Е. canis, 5 с. и 7 з.п.ф-лы, 11 ил., 1 табл.

Область изобретения

В общих чертах настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии бактерий-паразитов, а в частности к агентам, вызывающим заболевания типа риккетсиоза, и к бактериям Ehrlichia. Более конкретно настоящее изобретение относится к молекулярному клонированию и характеризации гена иммунореактивного белка массой 120 кДа Ehrlichia canis.

Описание уровня техники

Ehrlichia spp. представляют собой облигатные внутриклеточные грам-отрицательные бактерии, которые обитают в эндосоме гемопоэтических клеток и инфицируют различных животных-хозяев, включая человека, домашних и диких собак, оленей, лошадей, овец, крупный рогатый скот и диких грызунов. Каждый член рода Ehrlichieae обладает своим собственным тропизмом в отношении клеток-мишеней. Большинство видов Ehrlichia являются либо моноцитотройными (Е. canis, E. chaffeensis, E. sennetsu, E. risticii и E. muris), либо гранулоцитотропными (человеческая гранулоцитарная Ehrlichia, E. eqvi, E. phagocytophila и E. ewingii) за исключением Cowdria ruminatium, которая развивается в эндотелиальных клетках хозяина, и Anaplasma marginale, являющаяся эритроцитарным паразитом.

Хотя бактерии Ehrlichia уже были описаны в начале этого века, однако в Соединенных Штатах вплоть до последнего десятилетия они мало привлекали внимание исследователей, поскольку их считали патогенами, имеющими значение лишь для ветеринарии. Вновь появившийся интерес к эрлихиям обусловлен возникновением эрлихиоза, поражающего человека. В последнее десятилетие в Соединенных Штатах были открыты два новых патогена Ehrlichia (Е. chaffeensis и Е. phagocytophila-подобный микроорганизм человека) (Bakken J.S. 1994, Chen S.M., 1994, J.C.M., Fishbein D.В., 1987, Maeda, К., 1987). Ehrlichia canis, прототипный вид этого рода, представляет собой этиологический фактор эрлихиоза собак, являющийся фактически лишь одним из пяти видов Ehrlichia, который обычно инфицирует собак. Собачий эрлихиоз является заболеванием, широко распространенным во всем мире и переносимым собачьим клещом Rhipicephalus sanguineus (Groves M.G., 1975, Lewis G.E. Jr., 1977). Ehrlichia canis вызывает резкое умеренное и кратковременное повышение температуры, которое может прогрессировать с развитием тяжелого заболевания и синдрома с летальным исходом (тропическая панцитопения собак) (Buhles W.C., 1974, Greene С.Е. & J.W. Harvey, 1984, Walter, J.S. 1970). Во всем мире затраты на лечение домашних и служебных собак, инфицированных Е. canis, составляют миллионы долларов в год. Кроме того, бактерия Е. canis также ставит под угрозу здоровье людей. Ehrlichia canis или антигенно неидентифицируемый микроорганизм был недавно выделен у человека (Perez М., 1996).

Выявление генетического и антигенного состава Е. canis является главным фактором для изучения патогенеза эрлихиоза собак и разработки эффективной вакцины. По своим генетическим и антигенным свойствам бактерия Е. canis является близкородственной бактерии Е. chaffeensis (Anderson В.Е., 1991, 1992, Chen S.M.f Am. J. Trop. Med. Hyg). Поэтому собачий эрлихиоз может быть подходящей моделью для исследования патогенеза моноцитотропных видов Ehrlichia, включая Е. chaffeensis.

Предшествующие работы имеют тот недостаток, что в них ничего не сообщается о клонировании и характеризации иммунореактивного белка массой 120 кДа Ehrlichia canis. Кроме того, в предшествующих работах ничего не сообщается о рекомбинантном гене иммунореактивного белка массой 120 кДа Ehrlichia canis. Настоящее изобретение удовлетворяет этой давно назревшей необходимости и требованиям в данной области техники.

Краткое описание изобретения

В одном из вариантов своего осуществления настоящее изобретение относится к гену, кодирующему иммунореактивный белок массой 120 кДа Ehrlichia canis. Этот белок массой 120 кДа имеет предпочтительно аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, а его ген имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:7.

В предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему ген, кодирующий иммунореактивный белок массой 120 кДа Ehrlichia canis, где указанный экспрессирующий вектор при его введении в клетку способен экспрессировать этот ген.

В другом варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к рекомбинантному белку, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8. Предпочтительной является аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:7. Указанный рекомбинантный белок массой 120 кДа предпочтительно содержит 14 тандемных повторяющихся единиц, каждая из которых содержит 36 аминокислот. Более предпочтительно, если указанные повторяющиеся единицы являются гидрофильными. Еще более предпочтительно, если указанный рекомбинантный белок массой 120 кДа является антигеном.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу продуцирования рекомбинантного белка массой 120 кДа, включающему стадии получения вектора, содержащего экспрессирующую область, имеющую последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, правильно присоединенную к промотору; трансфекции указанного вектора в клетку; и культивирование этой клетки в условиях, эффективных для экспрессии этой экспрессирующей области.

Настоящее изобретение может быть описано на некоторых вариантах его осуществления, относящихся к способу ингибирования инфекции, вызываемой Ehrlichia canis у субъекта, включающему стадии идентификации субъекта, предположительно подверженного воздействию бактерии или инфицированного бактерией Ehrlichia canis; и введения композиции, содержащей антиген массой 120 кДа Ehrlichia canis в количестве, эффективном для ингибирования инфекции, вызываемой Ehrlichia canis. Такое ингибирование может быть достигнуто любыми способами, такими как, например, стимуляция у данного субъекта гуморального или клеточного иммунного ответа, либо какими-либо другими способами, такими как ингибирование нормальной функции антигена массой 120 кДа, или даже конкуренция с данным антигеном за взаимодействие с определенным агентом в организме субъекта.

Другие и дополнительные аспекты, отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего описания предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения, приведенных в целях его описания.

Краткое описание чертежей

Для того чтобы вышеуказанные отличительные признаки, преимущества и цели настоящего изобретения и т.п. были более ясными и понятными в деталях, описание настоящего изобретения, кратко изложенного выше, может быть более конкретно проиллюстрировано на некоторых вариантах его осуществления со ссылками на прилагаемые чертежи. Эти чертежи являются частью настоящего описания. Однако при этом следует отметить, что указанные чертежи иллюстрируют предпочтительные варианты настоящего изобретения, а поэтому не должны рассматриваться как ограничение его объема.

На Фиг.1 показана последовательность ДНК и положения олигонуклеотидных праймеров, происходящих от гена белка массой 120 кДа Е. chaffeensis (незаштрихованная рамка), и последовательности ДНК, фланкирующие этот ген (линия). Положения праймеров указаны как минусы и плюсы для последовательностей ДНК, расположенных выше и ниже от гена белка массой 120 кДа соответственно. Было сконструировано девять пар праймеров путем объединения каждого прямого праймера (SEQ ID NO:1-3) с каждым обратным праймером (SEQ ID NO:4-6), и эти праймеры были использованы для амплификации гена белка массой 120 кДа Е. canis с помощью ПЦР.

На Фиг.2А показан электрофорез в агарозном геле, проведенный для повторяющихся единиц гена белка массой 120 кДа Е. canis. Плазмида рСА120 была сначала гидролизована ферментом EcoRI для выделения вставки, а затем она была гидролизована ферментом SheI через различные интервалы времени. На Фиг.2В показано определение числа повторов методом Саузерн-блоттинга. ДНК, гидролизованную в течение 35 минут ферментом Shel, переносили из геля в панели А на найлоновые мембраны и гибридизовали с олигонуклеотидным зондом, меченным диоксигенином, который гибридизовался с последовательностями ДНК, расположенными выше от области повторов гена белка массой 120 кДа Е. canis. ND = негидролизованная ДНК.

На Фиг.3 показана последовательность ДНК гена белка массой 120 кДа Е. canis (SEQ ID NO: 7) и выведенные аминокислоты (SEQ ID NO:8). Нуклеиновые кислоты повторов 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13 подчеркнуты.

На Фиг.4 показано филогенетическое дерево повторяющихся единиц гена белка массой 120 кДа Е. canis. Шкала представляет % различий в последовательности ДНК.

На Фиг.5 проиллюстрирован сравнительный анализ первичных аминокислотных последовательностей белков массой 120 кДа Е. canis (SEQ ID NO:10) и Е. chaffeensis (SEQ ID NO:9). Черточки указывают на идентичные аминокислоты. Двоеточие указывает на консервативные замены.

На Фиг.6 показаны вероятность экспонирования на поверхности и гидрофобность белков массой 120 кДа Е. canis E. chaffeensis. Область между клинообразными стрелками является доменом повторов. Все повторы в обоих белках являются гидрофильными и поверхностно экспонируемыми. Вторая повторяющаяся единица белка массой 120 кДа Е. canis и пик первой повторяющейся единицы белка массой 120 кДа Е. chaffeensis находятся между двумя стрелками и более крупно показаны на Фиг.7.

На Фиг.7 показано сравнение поверхностно экспонируемых аминокислот в повторяющейся единице белков массой 120 кДа Е. canis и Е. chaffeensis. На Фиг.7А показана вероятность экспонирования аминокислот на поверхности. Соответствующие области указаны двумя клинообразными стрелками на Фиг.6. Буквами жирным шрифтом показаны консервативные аминокислоты для Е. canis и Е. chaffeensis. На Фиг.7В показано сравнение первичной аминокислотной последовательности, представленной на панели А (SEQ ID NO:11-12). Черточки указывают на идентичные аминокислоты. Точками обозначены консервативные замены.

На Фиг.8 показан электрофорез в агарозном геле, проведенный для гена белка массой 120 кДа штамма Е. canis, гидролизованного SреI. Рекомбинантные плазмиды pCR2.1 были сначала гидролизованы EcoRI для выделения вставки из вектора, а затем частично гидролизованы SpeI. Негидролизованы: ДНК гена белка массой 120 кДа штамма Оклахома была гидролизована ферментом EcoRI, но не ферментом SpeI для того, чтобы показать размер вставки.

На Фиг.9А показан ПААГ-СНД-электрофорез белка массой 120 кДа Е. canis, экспрессированного в E. coli. 1, GST-гибридный белок массой 120 кДа; 2, рекомбинактный белок массой 120 кДа Е. canis, отщепленный от GST-гибридного белка тромбином. На Фиг.9В показан электрофорез в агарозном геле для плазмиды pGEX, экспрессирующей белок массой 120 кДа Е. canis. Вставка указана стрелкой.

На Фиг.10 показан Вестерн-блот-анализ мышиной антисыворотки против рекомбинантного белка массой 120 кДа Е. canis, реагирующей с антигеном Е. canis (дорожка 1) и с рекомбинантным белком массой 120 кДа Е. canis (дорожка 2, стрелка).

На Фиг.11 показан Вестерн-блот-анализ сыворотки выздоравливающей собаки, реагирующей с рекомбинантным белком массой 120 кДа Е. canis.

Подробное описание изобретения

В соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы стандартные методы молекулярной биологии, микробиологии и технологии рекомбинатных ДНК, известные специалистам. Эти методы подробно описаны в литературе. Например, Maniatis, Fritish & Sambrook "Molecular Cloning. - A laboratory manual (1982); "DNA-Cloning: A Practical Approach", Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J.Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription and Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells and Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perhal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).

Поэтому нижеследующие термины, если они встречаются, имеют значения, определенные ниже.

Описанные здесь аминокислоты имеют предпочтительно "L"-изомерную форму. Однако L-аминокислотные остатки могут быть заменены "D"-изомерными формами при условии, что нужные функциональные свойства данного полипептида в отношении связывания с иммуноглобулином останутся неизменными. NH₂ означает свободную аминогруппу, присутствующую у амино-конца полипептида. СООН означает свободную карбоксигруппу, присутствующую у карбоксиконца полипептида. В соответствии со стандартной номенклатурой полипептов, J.Biol.Chem. 243:3552-59 (1969), обозначения аминокислотных остатков представлены в таблице соответствий.

Следует отметить, что все последовательности аминокислотных остатков представлены здесь формулами, левая и правая ориентация которых имеет обычное направление от амино-конца к карбокси-концу. Кроме того, следует отметить, что черточка в начале или в конце последовательности аминокислотных остатков указывает на пептидную связь с другой последовательностью одного или нескольких аминокислотных остатков. Таблица представлена для идентификации трехбуквенных и однобуквенных кодов, которые встречаются в этом описании.

Термин "репликон" означает любой генетический элемент (например, плазмиду, хромосому, вирус), который функционирует как автономная единица репликации ДНК in vivo; т.е. способен к репликации под своим собственным контролем. Термин "вектор" означает репликон, такой как плазмида, фаг или космида, к которому может быть присоединен другой сегмент ДНК, так чтобы осуществлялась репликация этого присоединенного сегмента.

Термин "молекула ДНК" означает полимерную форму дезоксирибонуклеотидов (аденина, гуанина, тимина или цитозина) либо в их одноцепочечной форме, либо в виде двухцепочечной спирали. Этот термин относится только к первичной и вторичной структуре молекулы и не ограничивается какими-либо конкретными третичными формами. Таким образом, этот термин включает двухцепочечную ДНК, обнаруженную, inter alia, в линейных молекулах ДНК (например, рестрикционных фрагментах), вирусах, плазмидах и хромосомах. При обсуждении структуры в соответствии со стандартными условными обозначениями указывается только последовательность в направлении 5’3’ вдоль нетранскрибируемой цепи ДНК (т.е., цепи, имеющей последовательность, гомологичную последовательности мРНК).

Термин "сайт инициации репликации" означает последовательности ДНК, которые участвуют в синтезе ДНК. "Кодирующая последовательность" ДНК представляет собой двухцепочечную последовательность ДНК, которая, находясь под контролем соответствующих регуляторных последовательностей, транскрибируется и транслируется in vivo с образованием полипептида. Границы кодирующей последовательности определяются старт-кодоном у 5’ амино-конца и кодоном терминации трансляции у 3’ карбокси-конца. Кодирующей последовательностью могут быть, но не ограничиваются ими, последовательности прокариотов, кДНК от мРНК эукариотов, геномные последовательности ДНК от ДНК эукариотов (например, млекопитающего) и даже синтетические последовательности ДНК. Сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции обычно расположены с 3’-конца по отношению к кодирующей последовательности.

Транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности представляют собой регуляторные последовательности ДНК, такие как промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, терминаторы и т.п., которые обеспечивают экспрессию кодирующей последовательности в клетке-хозяине.

"Промоторная последовательность" представляет собой регуляторную область ДНК, способную связываться с РНК-полимеразой в клетке и инициировать транскрипцию кодирующей последовательности в прямом направлении (3’). В соответствии с настоящим изобретением эта промоторная последовательность ограничена у своего 3’-конца сайтом инициации транскрипции и простирается выше (в 5’-направлении) так, что она включает минимальное число оснований или элементов, необходимых для инициации транскрипции на уровнях, детектируемых выше фонового уровня. Внутри этой промоторной последовательности находится сайт инициации транскрипции, а также белок-связывающие домены (консенсусные последовательности), ответственные за связывание с РНК-полимеразой. В большинстве случаев, но не всегда эукариотические промоторы содержат "ТА-ТА"-боксы и "САТ"-боксы. Помимо консенсусных последовательностей -10 и -35 прокариотические промоторы содержат последовательности Шайна-Дальгарно.

"Последовательность регуляции экспрессии" представляет собой последовательность ДНК, которая обеспечивает контроль и регуляцию транскрипции и трансляции другой последовательности ДНК. Кодирующая последовательность "находится под контролем" транскрипционной и трансляционной регуляторных последовательностей в клетке в том случае, если РНК-полимераза транскрибирует кодирующую последовательность в мРНК, которая затем транслируется с образованием белка массой 120 кДа, кодированного этой кодирующей последовательностью.

"Сигнальная последовательность" может присутствовать возле кодирующей последовательности. Эта последовательность кодирует сигнальный пептид, который находится у N-конца по отношению к полипептиду и сообщает клетке-хозяину способность направлять этот полипептид к клеточной поверхности клетки или секретировать его в среду, и этот сигнальный пептид отщепляется в клетке-хозяине, после чего белок массой 120 кДа покидает эту клетку. Сигнальные последовательности могут присутствовать в комбинации с различными нативными белками прокариотов и эукариотов.

Используемый здесь термин "олигонуклеотид" означает зонд настоящего изобретения и представляет собой молекулу, состоящую из двух или более, а предпочтительно из более трех дезоксирибонуклеотидов. Точный его размер зависит от многих факторов, которые, в свою очередь, зависят от конечной функции и цели использования этого олигонуклеотида.

Используемый здесь термин "праймер" означает олигонуклеотид, который независимо от того, встречается ли он в природе в виде очищенного рестрикционного гидролизата или он был получен синтетически, способен действовать как участок инициации синтеза при помещении его в условия, при которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера, являющегося комплементарным нуклеотидной цепи, то есть в присутствии нуклеотидов и индуцирующего агента, такого как полимераза ДНК, и при подходящих температуре и рН. Этот праймер может быть либо одноцепочечным, либо он должен быть достаточно длинным для того, чтобы инициировать синтез нужного продукта удлинения в присутствии индуцирующего агента. Точная длина этого праймера зависит от многих факторов, включая температуру, источник происхождения этого праймера и способ его использования. Так, например, для диагностических целей в зависимости от вариабельности целевой последовательности олигонуклеотидный праймер обычно содержит 15-25 или более нуклеотидов, хотя он может содержать и меньшее количество нуклеотидов.

Используемые здесь праймеры выбирают так, чтобы они были существенно комплементарными различным цепям конкретной целевой последовательности ДНК. Это означает, что указанные праймеры должны быть достаточно комплементарными для того, чтобы они могли гибридизоваться с их соответствующими цепями. Поэтому праймерная последовательность не должна обязательно иметь последовательность, идентичную последовательности матрицы. Так, например, некомплементарный нуклеотидный фрагмент может быть присоединен к 5’-концу праймера, а остальная праймерная последовательность должна быть комплементарна этой цепи. Альтернативно, некомплементарные основания или более длинные последовательности могут быть встроены в праймер при условии, что эта праймерная последовательность имеет достаточную комплементарность с этими последовательностями или гибридизуется с ними, образуя тем самым матрицу для синтеза продукта удлинения.

Используемые здесь термины "рестрикционные эндонуклеазы" и "рестрикционные ферменты" означают ферменты, каждый из которых разрезает двухцепочечную ДНК в специфической нуклеотидной последовательности или возле нее.

Клетка является "трансформированной" экзогенной или гетерологичной ДНК при введении этой ДНК в клетку. Трансформирующая ДНК может быть, а может и не быть, интегрированной (ковалентно присоединенной) в геном этой клетки. Например, в клетках прокариотов, дрожжей и млекопитающих эта трансформирующая ДНК может быть расположена на эписомном элементе, таком как плазмида. Что касается эукариотических клеток, то стабильно трансформированной клеткой является клетка, в которой эта трансформирующая ДНК интегрируется в хромосому так, что она наследуется дочерними клетками посредством хромосомной репликации. Эта стабильность продемонстрирована способностью эукариотической клетки создавать клеточные линии или клоны, составляющие популяцию дочерних клеток, содержащих эту трансформирующую ДНК. "Клон" представляет собой популяцию клеток, происходящих от одной клетки или ее предшественника посредством митоза. "Клеточная линия" представляет собой клон первичной клетки, которая способна стабильно расти in vitro с продуцированием множества генераций.

Две последовательности ДНК являются "в основном, гомологичными", если на протяжении определенной длины этих последовательностей ДНК имеется, по крайней мере, примерно 75%-ное (предпочтительно, по крайней мере, примерно 80%-ное, а наиболее предпочтительно, по крайней мере, примерно 90%-ное или 95%-ное) соответствие нуклеотидов. Последовательности, которые являются в основном гомологичными, могут быть идентифицированы путем сравнения этих последовательностей с использованием стандартного программного обеспечения, имеющегося в банке данных последовательностей, или в эксперименте по Саузерн-гибридизации, например в строгих условиях, определенных для этой конкретной системы. Соответствующие условия гибридизации могут быть определены каждым специалистом. Например, Maniatis et al., см. выше; DNA-Cloning, A Practical Approach", Vols. I & II, см. выше; "Nucleic Acid Hybridization", см. выше.

"Гетерологичная область" конструкции ДНК представляет собой идентифицируемый сегмент ДНК в более крупной молекуле ДНК, который не встречается в природе в ассоциации с этой более крупной молекулой. Таким образом, если эта гетерологичная область кодирует ген млекопитающего, то этот ген обычно фланкирован ДНК, которая не фланкирует геномную ДНК млекопитающего в геноме организма-источника. В другом примере кодирующая последовательность представляет собой конструкцию, где сама кодирующая последовательность не встречается в природе (например, кДНК, где геномная кодирующая последовательность содержит интроны или синтетические последовательности, имеющие кодоны, отличающиеся от нативного гена). Аллельное разнообразие или природные мутации не приводят к образованию гетерологичной области ДНК, определенной в настоящем описании.

Метками, наиболее часто используемыми в этих исследованиях, являются радиоактивные элементы, ферменты, химические вещества, которые флуоресцируют при их облучении ультрафиолетовым светом, и другие. Известен ряд флуоресцентных материалов, которые могут быть использованы в качестве меток. Такими материалами являются, например, флуоресцеин, родамин, аурамин, техасский красный, синий АМСА и люциферовый желтый. Конкретным детектирующим материалом является антикроличье антитело, вырабатываемое у коз и конъюгированное с флуоресцеином посредством изотиоцианата.

Белки могут быть также помечены радиоактивным элементом или ферментом. Радиоактивная метка может быть детектирована любыми существующими в настоящее время методами подсчета. Предпочтительный изотоп может быть выбран из ³Н, ¹⁴С, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I и ¹⁸⁶Re.

Могут быть также использованы ферментные метки, которые могут быть детектированы любыми из используемых в настоящее время колориметрических, спектрофотометрических, флуороспектрофотометрических, амперометрических или газометрических методов. Этот фермент конъюгируют с выбранной частицей путем реакции с мостикобразующими молекулами, такими как карбодиимиды, диизоцианаты, глутаральдегид и т.п. Известно множество ферментов, которые могут быть использованы в этих процедурах. Предпочтительными являются пероксидаза, -глюкуронидаза, -D-глюкозидаза, -D-галактозидаэа, уреаза, глюкозооксидаза + пероксидаза и щелочная фосфатаза. Описание альтернативных материалов и методов мечения можно найти, например, в патентах США №№ 3654090, 3850752 и 4016043.

Специалистами была разработана и использована конкретная аналитическая система, известная как рецепторный анализ. В рецепторном анализе анализируемый материал соответствующим образом метят, а затем некоторое количество клеточных тестируемых колоний инокулируют определенным количеством этой же метки, после чего проводят исследование на связывание для определения степени, с которой этот меченый материал связывается с клеточными рецепторами. Этим способом могут быть определены различия в аффинности данных материалов.

Специалистами используется анализ, известный как "цис/транс"-анализ. Короче говоря, в этом анализе используются две генетических конструкции, одна из которых обычно представляет собой плазмиду, непрерывно экспрессирующую нужный конкретный рецептор при ее трансфекции в соответствующую клеточную линию, а вторая представляет собой плазмиду, экспрессирующую репортер, такой как люцифераза, под контролем рецептор/лигандного комплекса. Так, например, если необходимо определить, является ли данное соединение лигандом для конкретного рецептора, то одна из этих плазмид должна быть сконструирована так, чтобы она обеспечивала экспрессию рецептора в выбранной клеточной линии, а вторая плазмида должна содержать промотор, присоединенный к гену люциферазы, в который был встроен реактивный элемент для данного конкретного рецептора. Если тестируемое соединение является агонистом для данного рецептора, то данный лиганд будет образовывать комплекс с этим рецептором и образовавшийся комплекс будет связываться с данным реактивным элементом и инициировать транскрипцию гена люциферазы. Затем индуцированную хемилюминесценцию измеряют фотометрически, строят кривые зависимости "доза-ответ" и сравнивают их с кривыми, полученными для известных лигандов. Вышеуказанный протокол подробно описан в патенте США № 4981784.

Используемый здесь термин "хозяин" означает не только прокариоты, но также и эукариоты, такие как клетки дрожжей, растений и животных. Рекомбинантная молекула ДНК или ген, которые кодируют иммунореактивный белок массой 120 кДа Ehrlichia canis настоящего изобретения, могут быть использованы для трансформации хозяина любым методом, хорошо известным каждому специалисту. Для трансформации прокариотов особенно предпочтительным является использование вектора, содержащего кодирующие последовательности гена, кодирующего иммунореактивный белок массой 120 кДа Ehrllchia canis настоящего изобретения.

Прокариотическими хозяевами могут быть E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescenns, Mycobaсtrium vaccae и Bacillus subtllis. Эукариотическими хозяевами являются дрожжи, такие как Pichia pastoris, клетки млекопитающих и клетки насекомых.

В основном вместе с этим хозяином используются экспрессирующие векторы, содержащие промоторные последовательности, которые способствуют эффективной транскрипции встроенного фрагмента ДНК. Экспрессирующий вектор обычно содержит сайт инициации репликации, промотор(ы), терминатор(ы), а также специфические гены, способные обеспечивать фенотипический отбор в трансформированных клетках. Для достижения оптимального клеточного роста эти трансформированные хозяева могут быть ферментированы и культивированы способами, известными специалистам.

Настоящее изобретение относится в основном к чистой ДНК, кодирующей иммунореактивный белок массой 120 кДа Ehrlichia canis, цепь ДНК которой гибридизуется в условиях высокой строгости с зондом, содержащем последовательность, по крайней мере, из 15 следующих друг за другом нуклеотидов (SEQ ID NO: 6). Этот белок массой 120 кДа, кодируемый ДНК настоящего изобретения, может иметь последовательность, по крайней мере, на 80% идентичную (предпочтительно на 85%, более предпочтительно на 90%, а наиболее предпочтительно на 95%) последовательности нуклеиновых кислот, перечисленных на Фиг.3 (SEQ ID NO: 7). Более предпочтительно, чтобы эта ДНК включала кодирующую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8 или вырожденный вариант такой последовательности.

Зонд, с которым гибридизуется ДНК по настоящему изобретению, предпочтительно состоит из последовательности, по крайней мере, в 20 следующих друг за другом нуклеотидов, более предпочтительно 40 нуклеотидов, еще более предпочтительно 50 нуклеотидов, а наиболее предпочтительно в 100 нуклеотидов или более (вплоть до 100%) кодирующей последовательности нуклеотидов, перечисленных в SEQ ID NO: 8, или комплементарных нуклеотидов. Такой зонд может быть использован для детекции экспрессии гена иммунореактивного белка массой 120 кДа Ehrlichia canis в клетке человека методом, включающим стадии: а) взаимодействие мРНК, полученной из этой клетки, с меченым зондом для гибридизации; и (b) детектирования гибридизации этого зонда с мРНК.

Настоящее изобретение также относится в основном к чистой ДНК, содержащей последовательность, по крайней мере, из 15 следующих друг за другом нуклеотидов (предпочтительно 20, более предпочтительно 30, еще более предпочтительно 50, а наиболее предпочтительно, всех нуклеотидов) области, состоящей из нуклеотидов, перечисленных в SEQ ID NO: 8.

Термин "высокая жесткость" относится к гибридизации ДНК и условиям промывок, характеризующимся высокой температурой и низкой концентрацией соли, например, к условиям промывок при 65С при концентрации соли приблизительно 0,1 SSC или их функционального эквивалента. Так, например, условия высокой строгости могут включать гибридизацию при около 42С в присутствии приблизительно 50% формамида; первую промывку приблизительно при 65С примерно 2 SSC, содержащим 1% ДСН; а затем вторую промывку приблизительно 0,1 SSC при около 65С.

"В основном чистая ДНК" означает ДНК, которая не является частью среды, в которой обычно присутствует эта ДНК благодаря отделению (частичной или полной очистке) некоторых или всех молекул из этой среды, или благодаря модификации последовательностей, фланкирующих эту рассматриваемую ДНК. Этот термин, кроме того, включает, например, рекомбинантную ДНК, которую вводят в вектор, в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус, или в геномную ДНК прокариота или эукариота; или которая существует в виде отдельной молекулы (например, кДНК или геномная ДНК или кДНК-фрагмент, продуцированный с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или расщепления эндонуклеазой) независимо от других последовательностей. Этот термин также означает рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего другую полилептидную последовательность, например гибридный белок. Этот термин также означает рекомбинантную ДНК, которая включает часть нуклеотидов, перечисленных в SEQ ID NO: 8, и которая кодируют альтернативный вариант сллайсинга гена, кодирующего иммунореактивный белок массой 120 кДа Ehrlichia canis.

Эта ДНК может иметь последовательность, которая, по крайней мере, примерно на 70%, предпочтительно, по крайней мере, на 75% (например, по крайней мере, на 80%), а наиболее предпочтительно, по крайней мере, на 90% идентична кодирующей последовательности нуклеотидов, перечисленных в SEQ ID NO:8. Идентичность этих двух последовательностей непосредственно зависит от числа соответствий или идентичных положений. Если положение субъединицы в обеих двух последовательностях занято аналогичной мономерной субъединицей, например, если данное положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином, то в этом положении они являются идентичными. Так, например, если 7 положений в последовательности из 10 нуклеотидов идентичны соответствующим положениям во второй 10-нуклеотидной последовательности, то эти две последовательности являются идентичными на 70%. Длина сравниваемых последовательностей в основном составляет, по крайней мере, 50 нуклеотидов, предпочтительно, по крайней мере, 60 нуклеотидов, более предпочтительно, по крайней мере, 75 нуклеотидов, а наиболее предпочтительно, 100 нуклеотидов. Идентичность последовательности обычно определяют с использованием программного обеспечения для анализа последовательности (например, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705).

Настоящее изобретение относится к вектору, включающему последовательность ДНК, которая кодирует ген, кодирующий иммунореактивный белок массой 120 кДа Ehrlichia cants, и где указанный вектор способен реплицироваться в хозяине и включает при его правильном присоединении: а) сайт инициации репликации; b) промотор; и с) последовательность ДНК, кодирующую указанный белок массой 120 кДа. Предпочтительно, чтобы вектор по настоящему изобретению содержал часть последовательности ДНК, показанной в SEQ ID NO: 8. "Вектор" может быть определен как реплицируемая нуклеотидная конструкция, например плазмида или вирусная нуклеиновая кислота. Векторы могут быть использованы для амплификации и/или экспрессии нуклеотидной кислоты, кодирующей иммунореактивный белок массой 120 кДа Ehrlichia canis. Экспрессирующий вектор представляет собой реплицируемую конструкцию, в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, правильно присоединена к подходящим регуляторным последовательностям, способными осуществлять экспрессию этого полипептида в клетке. Такие регуляторные последовательностях должны быть выбраны в зависимости от выбранных клеток и способа трансформации. В основном регуляторными последовательностями являются транскрипционный промотор и/или энхансер, подходящие сайты связывания с рибосомной мРНК и последовательности, которые регулируют терминацию транскрипции и трансляции. Для конструирования экспрессирующих векторов, содержащих соответствующие сигналы регуляции транскрипции и трансляции, могут быть использованы методы, хорошо известные специалистам. Например, методы, описанные Сэмбруком и др., 1989, в работе Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Cold Spring Harbor Press, N.Y. Ген и его последовательности регуляции транскрипции считаются "правильно присоединенными" в том случае, если эти последовательности регуляции транскрипции эффективно осуществляют регуляцию транскрипции этого гена. Векторами по настоящему изобретению являются, но не ограничиваются ими, плазмидные векторы и вирусные векторы. Предпочтительными вирусными векторами по настоящему изобретению являются векторы, происходящие от ретровирусов, аденовируса, аденоассоциированного вируса, вируса SV40 или вируса герпеса.

Термин "в основном чистый белок" означает белок, который был выделен, по крайней мере, из некоторых компонентов, с которыми он обычно ассоциирован. Обычно этот белок является в основном чистым в том случае, если он, по крайней мере, на 60%, по массе не содержит белков и других природных органических молекул, с которыми он обычно ассоциирован in vivo. Предпочтительно, чтобы чистота этого препарата составляла, по крайней мере, 75%, более предпочтительно, по крайней мере, 90%, а наиболее предпочтительно, по крайней мере, на 99% по массе. В основном чистый иммунореактивный белок мас