Способ лечения млекопитающего, нуждающегося в противораковом лечении и способ получения производных 13- дезоксиантрациклина

Способ лечения млекопитающего, нуждающегося в противораковом лечении и способ получения производных 13- дезоксиантрациклина

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и касается лечения рака у млекопитающего. Для этого предлагают использовать определенные производные антрациклина, в частности, содержащие 13-кетогруппу, например 13-дезоксидаунорубицин. Введение таких веществ осуществляют без ограничения суммарной кумулятивной дозы. Такой прием обеспечивает возможность лечения рака без побочных эффектов, в частности кардиотоксических. Предложены также способы получения указанных веществ. 2 н. и 14 з.п.ф-лы, 14 табл., 22 ил.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение касается производных 13-дезоксиантрациклина как производных, которые не проявляют кардиотоксические побочные эффекты, и способов получения данных производных 13-дезоксиантрациклина.

Уровень техники

Антрациклины обладают самым широким спектром активности в отношении форм рака человека в сравнении со всей остальной химиотерапией рака. Наиболее хорошо известными антрациклиновыми противораковыми лекарственными веществами являются доксорубицин и даунорубицин, которые содержат 13-кетогруппу. Среди указанных лекарственных веществ доксорубицин, описанный в патенте США № 3590028, имеет широкий спектр противоракового применения в качестве одного из наиболее эффективных лекарственных веществ при саркомах и карциномах в дополнение к лейкозам, лимфомам и массивным опухолям.

Близкий структурный аналог, даунорубицин, описанный в патенте США № 3616242, не является эффективным при саркомах и карциномах и данное различие, по-видимому, обусловлено отсутствием группы 14-ОН в молекуле даунорубицина. Однако даунорубицин применяют при лечении острых лейкозов.

Тем не менее, кумулятивная кардиотоксичность ограничивает применение данных лекарственных веществ. В этом плане кардиотоксичность обыкновенно ограничивает продолжительность лечения доксорубицином до приблизительно 9 месяцев при обычныхдозах. Суммарная кумулятивная доза доксорубицина или даунорубицина обычно не может превышать 550 мг/м² (см. статью Е.А.Lefrak и соавт., Cancer, 32:302, 1973). Даже при рекомендованной максимальной суммарной кумулятивной дозе или около нее (430-650 мг/м²) у 60% пациентов имеется значительная и постоянная сердечная дисфункция и у 14% развивается застойная сердечная недостаточность (см. статью A. Dresdale и соавт., Cancer, 52:51, 1983). Таким образом, при использовании данных лекарственных веществ для ингибирования роста раковых опухолей пациент может умереть от застойной сердечной недостаточности вследствие сильного кардиотоксического побочного эффекта лекарственных веществ.

Кроме кардиотоксических эффектов самих соединений известные процессы получения антрациклиновых соединений имеют относительно низкие выходы порядка приблизительно 30% (см. статью Smith и соавт., J. Med. Chem., 21:280-283, 1978).

Успешное действие доксорубицина при ликвидации опухолей и ограничения его клинического применения явилось основой для исследователей всего мира в попытках создания улучшенного доксорубицина. В этом плане существовала давняя ощутимая необходимость в аналоге доксорубицина, у которого отсутствовали бы ограничения по кумулятивной необратимой кардиотоксичности. Несмотря на то, что в течение последних более чем 25 лет было синтезировано более 2000 аналогов, ни один из них не обеспечивал существенного преимущества относительно доксорубицина (см. работу R.D. Weiss. Антрациклины. Будет ли когда-нибудь найден улучшенный доксорубицин? (The anthracyclines: Will we ever find a better doxorubicin?), Seminars in Oncology, 19:670-686, 1992).

В последние более чем 25 лет были проведены обширные исследования по выяснению механизма кардиотоксичности антрациклинов. Популярной теорией, которая была разработана, является свободно-радикальная теория. Согласно данной теории кардиотоксичность антрациклинов является результатом образования свободных радикалов хиноновой структурой молекулы антрациклина (см. статьи J. Dorowshow и соавт., J. Clin. Invest., 68:1053, 1981; D.V.Unverferth и соавт., Cancer Treat. Rev., 9:149, 1982; J. Goodman и соавт., Biochem. Biophys. Res. Commun., 77:797, 1977; J.L.Zweier, J. Biol. Chem, 259:6056, 1984).

Однако данная теория не подтвердилась, поскольку не удалось предотвратить кумулятивную кардиотоксичность с помощью ловушек свободных радикалов и антиоксидантов (см. работы D. Ргоррег и Е. Maser, Восстановление карбонила даунорубицина в печени и сердце кролика (Carbinyl reduction of daunorubicin in rabbit liver and heart), Pharmacology and Toxicology, 80:240-245, 1997; J.F.VanVleet и соавт., Am. J. Pathol., 99:13, 1980; D.V.Unverferth и соавт., Am. J. Cardiol., 56:157, 1985; С. Myers и соавт., Seminars in Oncology, 10:53, 1983; R.H.M. Julicher и соавт., J. Pharm. Parmacol., 38:277, 1986 и Е.А.Porta и соавт., Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol., 41:125, 1983).

Другими словами было обнаружено, что ингибирование образования свободных радикалов не устраняет кардиотоксичность данных антрациклинов (см. статью P.S.Mushlin и соавт., Fed. Proc., 45:809, 1986). Dr. Richard D. Olson и Dr. Phillip S. Mushlin последние 15 лет посвятили изучению механизма антрациклининдуцированной кардиотоксичности и разработали "теорию метаболитов", которая, как ожидается, теперь станет превалирующей теорией (см. работу R.D.Olson и P.S.Mushlin, Кардиотоксичность доксорубицина. Анализ превалирующих гипотез (Doxorubicin cardiotoxicity: Analysis of prevailing hypotheses), FASEB Journal, 4:3076-3086, 1990). Согласно данной теории кардиотоксичность антрациклинов опосредуется 13-ОН-метаболитом исходного соединения.

Данное исследование показывает, что кардиотоксичность доксорубицина и даунорубицина, проявляющаяся как уменьшение сократимости миокарда, зависит от метаболического восстановления 13-кетоструктуры до 13-дигидрометаболита. В тест-системах, где доксорубицин не метаболизируется в значительной степени до 13-дигидросоединения, кардиотоксические эффекты наблюдаются только при очень высоких концентрациях (200-400 мкг/мл) (см. статьи P.S.Mushlin и соавт., Fed. Proc., 44:1274, 1985; R.D.Olson и соавт. Fed. Proc., 45:809, 1986).

Если доксорубицину позволяют оставаться в тест-системах даже в течение коротких периодов времени, происходит некоторое метаболическое превращение и образуется 13-дигидрометаболит в достаточном количестве для того, чтобы начинала развиваться кардиотоксичность (см. статьи L. Rossini и соавт., Arch. Toxicol. suppl., 9:474, 1986; M. Del Tocca и соавт., Pharmacol. Res. Commun., 17:1073, 1985). Таким образом, накоплены фактические доказательства того, что кардиотоксичность таких лекарственных веществ, как доксорубицин и даунорубицин, является результатом сильных кардиотоксических эффектов, оказываемых их 13-дигидрометаболитами (см. статьи Р. Mushlin и соавт., Rational Drug Therapy, 22:1, 1988; S. Kuyper и соавт., FASEP Journal, 2:A1133, 1988; R. Boucek и соавт., J. Biol. Chem., 262:15851, 1987 и R. Olson и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci., 85:3585, 1988).

В противоположность вышеизложенному 13-дигидрометаболиты доксорубицинол и даунорубицинол вызывают кардиотоксичность в тех же самых тест-системах при относительно низких концентрациях (1-2 мкг/мл, R.D.Olson и соавт., Proceed. Am. Assoc. Cancer Res., 26:227, 1985; R.D. Olson и соавт., Proceed. Am. Assoc. Cancer Res., 28:441, 1987).

В свете вышеизложенного доксорубицин под действием внутриклеточной карбонилредуктазы превращается в доксорубицинол, в котором 13-кетогруппа восстановлена до спирта, как показано ниже:

Данная теория предлагает объяснение отсроченной природы кардиотоксичности антрациклинов. Недавно вышел обзор исследований Olson и Mushlin и показан ряд точек зрения (D. Рrорреr и Е. Maser, Восстановление карбонила даунорубицина в печени и сердце кролика (Carbonyl reduction of daunorubicin in rabbit liver and heart, Pharmacology and Toxicology, 80:240-245, 1997).

Например, исследования подтверждают наличие прямой связи между внутрисердечным накоплением С 13-спиртового метаболита и нарушением как сократимости, так и расслабления сердечной мышцы. Кроме того, при регулярном длительном введении доксорубицина его 13-спиртовой метаболит, доксорубицинол, селективно накапливается в сердечной ткани крысы или кролика. Исследования дополнительно демонстрируют, что кардиотоксический эффект даунорубицинола in vitro значительно превышает кардиотоксический эффект исходного лекарственного вещества.

Более того, исследования показывают, что доксорубицинол был в 30 раз более активным, чем доксорубицин при ингибировании сердечной сократимости в папиллярных мышцах кролика. Более того, исследования продемонстрировали, что механизм сердечной дисфункции связан с ингибированием АТФазы, поскольку доксорубицинол, но не доксорубицин является сильным ингибитором Са²⁺- Мg²⁺-АТФазы саркоплазматического ретикулюма, Мg²⁺-АТФазы митохондрий и Na⁺-K⁺-ATФaзнoй активности сарколеммы. Кроме того, даунорубицинол, но не даунорубицин был обнаружен в сердечной ткани через два дня после введения даунорубицина в исследованиях на животных.

Недавно механизм, лежащий в основе индуцируемой спиртовыми метаболитами антрациклинов кардиотоксичности, был объяснен в работе Minotti и соавт. Вторичный спиртовой метаболит доксорубицина необратимо инактивирует аконитазу/железорегуляторный белок-1 в цитозольных фракциях миокарда человека (The secondary alcohol metabolite of doxorubicin-1 irreversibly inactivates aconitase/iron regulatory protein-1 in cytosolic fractions from human myocardium), FASEB Journal, 12, в печати, 1998. Minotti и соавт. продемонстрировали, что доксорубицинол, но не доксорубицин нарушает метаболизм железа и необратимо инактивирует железорегуляторный белок-1 (IRP-1). В результате этого железо становится недоступным для ферментов, которым необходимо железо. Инактивация данных ферментов приводит к кардиотоксичности.

С данными открытиями согласуется факт использования хелатора дексразоксана для снижения кардиотоксичности доксорубицина (см. статью G. Weiss и соавт., Модуляция экспрессии рецептора трансферрина с помощью дексразоксана (ICRF-187) посредством активации железорегуляторного белка (Modulation of transferrin receptor expression by dexrazoxane (ICRF-187) via activation of iron regulatory protein, Biochemical Pharmacology, 53:1419-1424, 1997). Дексразоксан, по-видимому, стимулирует активность IRP-1, который противодействует эффекту доксорубицинола.

Olson и Mushlin сформулировали идею, заключающуюся в том, что аналог 13-кетоантрациклина, который не может образовывать спиртовой метаболит, не должен быть кардиотоксичным. Наиболее привлекательной возможностью было восстановление 13-кетогруппы до метиленовой группы. Не имеется известных ферментов, которые будут метаболизировать данную группу до спирта. Результаты, полученные с антрациклином акларубицином, согласовывались с данной идеей.

Акларубицин имеет множество модификаций по сравнению с доксорубицином, включая отсутствие 14-ОН-группы. Данное лекарственное вещество не было эффективным в отношении сарком или карцином, что согласуется с отсутствием 14-ОН-группы. Однако оно было эффективным в отношении острых лейкозов. Акларубицин также не содержит 13-кетоструктуры, но при этом включает 13-метиленовую группу.

Данное лекарственное вещество коммерчески используют во Франции и Японии. У акларубицина, по-видимому, отсутствует необратимая кумулятивная кардиотоксичность. Пациенты получали до 3,000 мг/м² при отсутствии проявлений сердечной дисфункции или кардиомиопатии (см. статью D.C. Case и соавт. Фаза II исследований акларубицина при остром миелобластном лейкозе (Phase II study of aclarubicin in acute myeloblastic leukemia, American Journal of Clinical Oncology, 10:523-526, 1987). Специалисты в данной области не имели правильных представлений об отсутствии кардиотоксичности акларубицина и некорректно предположили, что данный эффект обусловлен его распределением и фармакокинетикой. Однако Olson и Mushlin считали это подтверждением важности отсутствия 13-кетоструктуры для кардиотоксичности.

На фигуре 1 представлена схема, которая иллюстрирует путь, приводящий к кардиотоксичности.

Сущность изобретения

Целью данного изобретения является получение доказательств того, что производные 13-дезоксиантрациклина не проявляют кардиотоксичность.

Другим объектом данного изобретения является разработка усовершенствованных способов получения таких производных 13-дезоксиантрациклина.

Следующим объектом данного изобретения является получение предшественников определенных производных 13-дезоксиантрациклина и способы получения предшественников.

В соответствии с данными и другими целями и преимуществами, объекты данного изобретения представляют производные 13-дезоксиантрациклина, имеющие формулу I:

где R¹ - Н или ОН; R² - Н, ОН или ОМе; R³ - Н или ОН; R⁴ - Н или ОН и R⁵ -углевод или замещенный углевод. Настоящее изобретение также представляет фармацевтически приемлемые соли соединений формулы I. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, полученные из фармацевтически приемлемых неорганических и органических кислот и оснований. Примеры подходящих кислот включают хлористоводородную (соляную), бромистоводородную, серную, азотную, перхлорную, фумаровую, яблочную, фосфорную, гликолевую, молочную, салициловую, янтарную, толуол-р-сульфоновую, винную, уксусную, лимонную, метансульфоновую, муравьиную, бензойную, малоновую, нафталин-2-сульфоновую, трифторуксусную и бензолсульфоновую кислоты. Соли, полученные из соответствующих оснований, включают щелочи, такие как натриевая и аммиачная.

Объект настоящего изобретения также представляет способы лечения млекопитающего-хозяина, которому требуется противораковое лечение. Эффективное противораковое количество, по меньшей мере, одного соединения формулы I, приведенной ниже, вводят хозяину в эффективном количестве.

где R¹ - Н или ОН; R² - Н, ОН или ОМе; R³ - Н или ОН; R⁴ - Н или ОН и R⁵ -углевод или замещенный углевод.

Другие объекты данного изобретения представляют способ получения производных 13-дезоксиантрациклина. Способ включает образование кислого раствора 13-тозилгидразонантрациклина с цианборгидридом в качестве восстанавливающего агента. Раствор осторожно нагревают в колбе с обратным холодильником. Реакционную смесь охлаждают. К раствору добавляют насыщенный водный NаНСО₃, а затем растворитель, представленный галогензамещенным углеводородом. Смесь фильтруют. Фильтрат подкисляют. Фильтрат подвергают препаративной хроматографии для выделения производных 13-дезоксиантрациклина.

Кроме того, целью данного изобретения является преодоление вышеописанных недостатков известных процессов получения производных 13-дезоксиантрациклина.

Соответственно другим объектом данного изобретения является разработка усовершенствованных способов получения производных 13-дезоксиантрациклина, которые обеспечивают повышенный выход по сравнению с известными процессами.

Согласно этому дальнейшие аспекты данного изобретения представляют способ получения производных 13-дезоксиантрациклина.

В общем виде антрациклины имеют формулу I,

в которой R¹, R², R³, R⁴ и R⁵ такие, как описано выше. Антрациклины легко превращаются в 13-тозилгидразоны в соответствии с известными способами. 13-тозилгидразоны антрациклинов восстанавливают до производных 13-дезоксиантрациклина цианборгидридом натрия в кислых условиях. Продукты очищают препаративной хроматографией без стадий экстракции. Было показано, что способы имеют выход от приблизительно 70% до приблизительно 80%.

Дополнительные объекты данного изобретения представляют способ получения производных 13-дезоксиантрациклина. Способ включает образование кислого раствора 13-тозилгидразонантрациклина с цианборгидридом. Раствор осторожно нагревают в колбе с обратным холодильником. Реакционную смесь охлаждают. К раствору добавляют насыщенный водный раствор NаНСО₃, а затем растворитель, представленный галогензамещенным углеводородом. Смесь фильтруют. Фильтрат подкисляют, Фильтрат подвергают препаративной хроматографии для выделения производных 13-дезоксиантрациклина.

Следующие объекты данного изобретения представляют способ получения производных 13-дезоксиантрациклина. Способ включает получение раствора путем растворения приблизительно 1 г гидрохлорида 13-тозилгидразондоксорубицина и приблизительно 2,4 г р-толуолсульфокислоты в приблизительно 50 мл безводного метанола. В раствор добавляют приблизительно 0,8 г цианборгидрида натрия. Раствор нагревают до температуры от приблизительно 68С до приблизительно 72С. Раствор осторожно кипятят в колбе с обратным холодильником в течение приблизительно одного часа под атмосферой азота. Реакционную смесь концентрируют до приблизительно 20 мл. Реакционную смесь охлаждают в замораживателе до температуры от приблизительно 0С до приблизительно 4С. Приблизительно 2 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия добавляют в реакционную смесь. В реакционную смесь добавляют приблизительно 200 мл хлороформа. В реакционную смесь добавляют безводный сульфат натрия. Соли отфильтровывают. Фильтрат подкисляют хлоридом водорода в диэтиловом эфире. Раствор пропускают через колонку с силикагелем. Затем колонку промывают хлороформом/метанолом до тех пор, пока элюат не станет бесцветным. Фракцию, содержащую продукт, элюируют метанолом. Метанольный элюат выпаривают. Остаток, полученный при выпаривании, растворяют в 30% ацетонитриле в аммоний-формиатном буфере. Продукт выделяют препаративной ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией), используя колонку, содержащую фенильные группы. Продукт отделяют от других примесей, используя градиент ацетонитрила/формиата аммония. Фракцию, очищенную с помощью ВЭЖХ, затем лиофилизируют, получая приблизительно 600 мг 13-дезоксидоксорубицина гидрохлорида.

Перечень чертежей и иных материалов

На фиг.1 представлена схема, иллюстрирующая пути биосинтеза, приводящие к кардиотоксичности.

На фиг.2 приведен график, представляющий концентрацию доксорубицинола в препаратах правого предсердия и желудочка, инкубированных в 175 мкМ варианта соединения, соответствующего данному изобретению, или доксорубицина в зависимости от времени.

На фиг.3 приведен график, представляющий поглощение [³H]-тимидина клетками HL-60 в присутствии варианта соединения, соответствующего данному изобретению, или доксорубицина и показывающий ингибирование роста клеток.

На фиг.4 приведен график, представляющий поглощение [³H]-тимидина клетками Р388 в присутствии варианта соединения, соответствующего данному изобретению, или доксорубицина и показывающий ингибирование роста клеток.

На фиг.5 приведен график, представляющий поглощение [³H]-тимидина клетками MCF7 в присутствии варианта соединения, соответствующего данному изобретению, или доксорубицина и показывающий ингибирование роста клеток.

На фиг.6 приведен график, представляющий поглощение [³H]-тимидина клетками MDA-MB-231 в присутствии варианта соединения, соответствующего данному изобретению, или доксорубицина и показывающий ингибирование роста клеток.

На фиг.7 приведен график, иллюстрирующий эффект Соединения В, соответствующего данному изобретению, и даунорубицина на сократительную функцию.

На Фигурах 8.1, 8.2 и 8.3 представлены соответственно микрофотографии при 200х увеличении, иллюстрирующие гистопатологию ткани левого желудочка, полученной у кроликов, которых лечили в течение 20-23 недель вариантом соединения, соответствующего данному изобретению, кроликов, которых лечили доксорубицином, или контрольного образца и показывающие вакуолизацию миоцитов и потерю миофибрилл в образце с использованием доксорубицина, не отмечаемую при использовании Соединения А, соответствующего данному изобретению, или в контрольных образцах.

На Фигурах 9-13 приведены графики, представляющие процент выживания мышей, больных лейкемией, при введении им соединений, соответствующих изобретению, в различных дозах.

На Фигурах 14-20 приведены графики и диаграммы, отражающие показатели состояния кроликов при изучении на данных моделях кардиотоксичности доксорубицина, GPX-150 и GPX-100.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В данном изобретении используется тот факт, что 13-дезоксиформы доксорубицина, даунорубицина и других подобных антрациклинов не будут метаболически превращаться в кардиотоксические 13-дигидроформы, представляя таким образом возможность введения соединений, соответствующих данному изобретению, в некардиотоксических количествах без ограничения суммарной кумулятивной дозы.

Данное изобретение включает улучшенный доксорубицин, имеющий формулу А:

далее обозначаемый как Соединение А.

Улучшенное Соединение А было синтезировано из доксорубицина путем восстановления 13-кетоструктуры до метиленовой группы. Эксперименты in vitro продемонстрировали, что улучшенное Соединение А не метаболизировалось сердечной тканью до доксорубицинола в тех же условиях, при которых доксорубицин превращался в данный метаболит.

В нижеописанных экспериментах in vitro исследовали биотрансформацию улучшенного доксорубицина, соответствующего данному изобретению. Целью исследования было установить, метаболизируется ли Соединение А, соответствующее данному изобретению, до С-13 гидроксиметаболита в изолированных препаратах сердечной мышцы кролика. Доксорубицин, доксорубицинол и Соединение А тестировали на полосках наружной стенки правого предсердия и правого желудочка, выделенных у новозеландских белых кроликов, с использованием методик на основе флуоресцентной ВЭЖХ. Тонкие полоски предсердия и желудочка инкубировали в ванночках для мышц (30С), содержащих оксигенированный бикарбонатный буфер Кребса. Доксорубицин (175 мкМ) или Соединение А (175 мкМ) добавляли в ванночки и удаляли из них полоски предсердия или желудочка с интервалами 30 минут в течение 210 минут. Каждую полоску быстро промывали в нормальном физиологическом растворе, высушивали промоканием, разрезали пополам и взвешивали. Ткани хранили во флаконах при -70С для определения тканевых концентраций доксорубицина, доксорубицинола и Соединения А. Тканевые концентрации доксорубицина, доксорубицинола и Соединения А определяли по стандартным кривым в трех независимых экспериментах и выражали как среднее значение ±SEM (стандартная ошибка). Было отмечено времязависимое повышение концентрации Соединения А и доксорубицина в предсердии и желудочке. Через 210 минут инкубирования между концентрациями Соединения А и доксорубицина (нг/мг сырой массы) в ткани предсердия не было значительных различий (Соединение А: 743±89; доксорубицин: 617±35). Концентрации Соединения А в желудочке были значительно выше, чем концентрации доксорубицина в желудочке через 210 минут инкубирования (Соединение А: 626±31; доксорубицин: 407±30; Р<0,05). Однако только доксорубицин метаболизировался до С-13-гидроксиметаболита доксорубицинола. Никакой метаболизм Соединения А не был определен. Данные эксперименты указывают, что Соединение А не образует С-13-гидроксиметаболит в изолированных сердечных препаратах.

Целью исследования было определить, метаболизируется ли Соединение А до С-13-гидроксиметаболита в изолированных препаратах сердечной мышцы кролика.

Тесты проводили с использованием Соединения А, соответствующего данному изобретению, и доксорубицина.

Анализы выполняли с использованием целого желудочка кролика, ткани правого и левого предсердия, наружной стенки правого желудочка, бикарбонатного буфера Кребса (рН 7,4), нормального (0,9%) физиологического раствора, (NH₄)₂SO₄, изопропилового спирта, хлороформа, даунорубицина, доксорубицина, доксорубицинола и метанола.

Протокол теста включал инкубирование тонких полосок (каждая по 80-100 мг) наружной стенки правого желудочка и предсердия NZW (новозеландских) кроликов в ванночках для изолированных мышц (30С), содержащих оксигенированный бикарбонатный буфер Кребса (рН 7,4) следующего состава: 127 мМ NaCl, 2,5 мМ СаСl₂, 2,3 мМ KCl, 25 мМ NаНСО₃, 1,3 мМ KH₂PO₄, 0,6 мМ MgSO₄ и 5,6 мМ глюкоза, как было опубликовано ранее (см. статью P.S. Mushlin и соавт., Br. J. Pharmacol., 110:975-982, 1993).

В соответствии с синтезом доксорубицинола доксорубицинол синтезировали способом Takanashi и Bachur (см. статью S. Takanashi и N.R.Bachur, Drug Metab. Disp., 4:17-87, 1976) с незначительной модификацией (см. статью P.S.Mushlin и соавт., Br.J.Pharmacol., 110:975-982, 1993).

Согласно статистическому анализу результатов экспериментов концентрации в тканях (нг/мг сырой массы) доксорубицина, доксорубицинола и Соединения А определяли в трех различных экспериментах и выражали как среднее значение ±SEM (стандартная ошибка). Двухфакторный анализ (ANOVA) использовали для оценки эффектов лечения при различных интервалах времени с помощью программы Prizm (GraphPad).

Результаты наблюдений и исследований включают наблюдение времязависимого повышения концентрации Соединения А и доксорубицина в тканях наружной стенки как предсердия (таблица 1), так и правого желудочка кролика (таблица 2) (фигура 1). Концентрации Соединения А как в предсердиях, так и в желудочках были равны или превышали концентрации доксорубицина в предсердиях и в желудочках. Однако только доксорубицин метаболизировался до С-13-гидроксиметаболита доксорубицинола и времязависимая кумуляция доксорубицинола наблюдалась в тканях как предсердия (таблица 1), так и желудочка (таблица 2) кролика (фигура 2). Никакой метаболизм Соединения А не был отмечен (фигура 2).

На основании обсуждения и выводов из экспериментов заключают, что результаты экспериментов показывают, что Соединение А не образует С-13-гидроксиметаболит в изолированных препаратах сердца кролика. Однако доксорубицин, структурно близкое соединение, метаболизировалось до доксорубицинола, С-13-гидроксиметаболита. Кроме того, результаты экспериментов указывают на то, что метаболизм доксорубицина до доксорубицинола, по-видимому, выше в ткани предсердия, чем желудочка.

Фиг.2 иллюстрирует концентрацию доксорубицинола в препаратах правого предсердия (А) и желудочка (V), инкубированных в 175 мкМ Соединения А, соответствующего данному изобретению, или доксорубицина в течение времени. Как можно видеть из фиг.2, соединение, соответствующее данному изобретению, присутствует в значительно более низких концентрациях по сравнению с известным доксорубицином.

Другие исследования in vitro показали, что Соединение А, соответствующее данному изобретению, обладало такой же эффективностью, как доксорубицин при ингибировании роста раковых клеток человека.

В экспериментах, демонстрирующих эффективность соединения, соответствующего данному изобретению, в плане ингибирования роста раковых клеток сравнивали эффекты Соединения А, соответствующего данному изобретению, и доксорубицина на пролиферацию клеток in vitro.

Согласно экспериментам, демонстрирующим эффективность соединения, соответствующего данному изобретению, антипролиферативный эффект Соединения А сравнивали с доксорубицином на культивируемых клеточных линиях, полученных из человеческих и мышиных лейкозных клеток (HL60 и Р388) и рака молочной железы человека (MCF7 и MDA-MB 231).

Ингибирование пролиферации раковых клеток изучали путем измерения включения в клетки [³Н]-тимидина. Антипролиферативный эффект Соединения А сравнивали с доксорубицином в одних и тех же условиях культивирования. Концентрацию, приводящую к 50%-ному максимальному ингибированию (IC₅₀), получали с помощью анализа с использованием вычерчивания эмпирической кривой. Средние значения IC₅₀ (в нМ) и 95%-ные доверительные интервалы представлены ниже. Средние значения определяли по 3 или 4 независимым анализам в трех повторностях (см. таблицу А).

Оба, Соединение А и доксорубицин, полностью прекращали включение [³H]-тимидина в клетки каждой из четырех изученных клеточных линий. Данные исследования демонстрируют, что как Соединение А, так и доксорубицин являются сильными ингибиторами пролиферации раковых клеток in vitro, хотя, как показано по соотношению значений IC₅₀ (соотношение активностей), доксорубицин был несколько более активным, чем Соединение А при ингибировании включения [³H]-тимидина в клетки всех четырех линий (Р<0,05).

50) для тест-соединения в каждой из четырех клеточных линий и для сравнения данного значения со значением, полученным для доксорубицина.

Разведения тест-соединений делали в специфических для клеток средах в следующих интервалах (см. таблицу В).

Разведения вносили во все лунки в трех повторностях в виде аликвот по 50 мкл и клетки выращивали в присутствии тест-соединений в течение 24 часов.

Статистический анализ включал непарный t-критерий, где это было приемлемо. Был выбран уровень значимости Р<0,05.

3H]-тимидина. Концентрации, обеспечивающие 50%-ные значения максимальных реакций получали с помощью анализа с использованием вычерчивания эмпирической кривой. Значения IС₅₀ (в нМ) представлены ниже и отражают среднее значение (95%-ные доверительные интервалы приведены в скобках) по 3-4 анализам в трех повторностях (см. таблицу С).

Результаты показывают, что Соединение А является менее активным, чем доксорубицин в плане ингибирования пролиферации клеток во всех четырех клеточных линиях in vitro. Однако оба соединения являются в равной степени эффективными.

Обсуждение и выводы из результатов исследований in vitro показывают, что как Соединение А, так и доксорубицин полностью блокируют включение [³H]-тимидина в клетки каждой из четырех изученных клеточных линий. Как показано, по соотношению значений IC₅₀ (соотношение активностей) доксорубицин был более активным, чем Соединение А при ингибировании включения [³H]-тимидина в клетки всех четырех линий (Р<0,05) (см. фиг.3-6). Данные исследования демонстрируют, что как Соединение А, так и доксорубицин представляют собой сильные ингибиторы пролиферации раковых клеток in vitro. На фиг.8.1-8.3 представлены микрофотографии, которые иллюстрируют эффекты в отношении сердечной мышцы соединения, соответствующего данному изобретению, по сравнению с известным соединением доксорубицином и контрольным образцом.

Исследования in vivo показали, что Соединение А было эффективным в плане увеличения продолжительности жизни на модели мышиного лейкоза при более низкой системной токсичности, чем у доксорубицина, как показано ниже.

Эффекты Соединения А в отношении лейкоза Р388 на мышах описаны ниже.

Самцам мышей CDF1 внутрибрюшинно инокулировали 10⁶ клеток мышиного лейкоза Р388 в день 0. В дни 1-9 мышам внутрибрюшинно вводили доксорубицин или соединение А. Ежедневно измеряли массы тел и регистрировали выживаемость. В одном из таких исследований мышам вводили доксорубицин или Соединение А в дозе 0,8 мг/кг/день. В день 22 было 0/8 выживших животных в группе, которой вводили носитель, 7/8 в группе, которой вводили доксорубицин, и 5/8 в группе, которой вводили соединение А. Значения, полученные для доксорубицина и Соединения А, существенно отличались от значений, полученных для носителя, но не друг от друга.

В другом исследовании на той же модели мышиного лейкоза доксорубицин инъецировали в дозе 0,8 мг/кг/день, а Соединение А инъецировали в дозе 1,6, 2,4 или 3,2 мг/кг/день (см. таблицу 3).

На день 19 Соединение А в дозе 1,6 мг/кг/день было настолько же эффективным, как доксорубицин в плане супрессии набора массы тела, происходящего в результате роста лейкозных клеток в сочетании с ассоциированным асцитом. Обе дозы Соединения А, 2,4 и 3,2 мг/кг/день, были более эффективными, чем доксорубицин в плане супрессии набора массы тела. На день 25 все дозы Соединения А были настолько же эффективны, как доксорубицин в плане поддержания выживания. На день 32 только Соединение А в дозе 3,2 мг/кг/день было эффективным в плане пролонгирования выживания по сравнению с носителем и доксорубицином. Доза доксорубицина, использованная в данном исследовании, является максимально эффективной дозой для данной модели. Более высокие дозы доксорубицина в действительности снижали выживаемость. Таким образом, хотя Соединение А является менее активным, чем доксорубицин, оно более эффективно при более высоких дозах, чем доксорубицин в плане увеличения продолжительности жизни.

Было также показано, что у Соединения В, 13-дезоксианалога даунорубицина, отсутствуют кардиотоксические свойства даунорубицина в отношении сократительной функции сердца in vitro на модели с использованием сердца кролика, описанной Mushlin и соавт., supra. Это проиллюстрировано на фиг.7.

Было также показано, что у Соединения В, 13-дезоксианалога даунорубицина, отсутствуют кардиотоксические свойства даунорубицина на модели in vivo на крысах, описанной ниже. Приведенное ниже обсуждение демонстрирует отсутствие кардиотоксических эффектов Соединения В, соответствующего данному изобретению, у крыс после внутривенного введения.

Даунорубицина гидрохлорид или Соединения В гидрохлорид в воде инъецировали внутривенно в дозе 5 мг/кг/день в течение трех дней с интервалом в один день (общая доза 15 мг/кг) самцам крыс Spraque Dawley. Для каждого соединения изучали группу, которой вводили только носитель. На седьмой день после введения первой дозы крыс наркотизировали внутрибрюшинным введением 50 мг/кг фенобарбитала натрия. В трахею вводили трубку, и крысы дышали 100%-ным кислородом. Температуру тела поддерживали на уровне 37С с помощью нагревательной лампы и температурного датчика. Катетер помещали в правую сонную артерию и вводили в аорту с целью регистрации среднего артериального давления (САД) и частоты сердечных сокращений (ЧС), используя датчик давления Statham и регистрирующее устройство Gould. Затем катетер продвигали в левый желудочек, чтобы зарегистрировать систолическое давление в левом желудочке (ЛЖСД), максимальное значение dP/dt левого желудочка (dP/dt) и конечное диастоличекое давление в левом желудочке (КЛЖДД).

У крыс, леченных даунорубицином, MAP, ЛЖСД и dP/dt были значительно и существенно подавлены по сравнению с контролями с введением носителя (таблица 4). У крыс, леченных даунорубицином, была также значительно понижена масса тела. Напротив, MAP, ЛЖСД, dP/dt и масса тела были близкими у крыс, леченных носителем и Соединением В (таблица 5). Данные показывают, что у Соединения В отсутствует кардиотоксичность при дозе, в которой даунорубицин вызывает значительное снижение сократимости и деятельности сердца. Результаты иллюстрируют возможность введения Соединения В в терапевтической дозе без возникновения кардиотоксичности, тогда как такая же терапевтическая доза даунорубицина вызывает нарушение сердечной функции.

Значения, приведенные в таблице 4, представляют собой средние значения ± стандартные ошибки; крысам внутривенно инъецировали соединение в дозе 5 мг/кг/день в течение 3 дней с интервалом в один день; измерения проводили на день 7 после первой инъекции. BW1 = масса тела в день 0, BW2 = масса тела в день 7. *р<0,05 относительно носителя.

Крысам внутривенно инъецировали соединение в дозе 5 мг/кг/день в течение 3 дней с интервалом в один день; измерения проводили на день 7 после первой инъекции. BW1 = масса тела в день 0, BW2 = масса тела в день 7.

Соединение А также оценивали на модели кардиотоксичности при регулярном введении доксорубицина кроликам. В данной модели доксорубицин вызывал нарушение функции сердца и гистопатологические изменения, аналогичные наблюдаемым у людей при регулярном длительном лечении доксорубицином. Гистопатологическое и/или функциональное нарушения в сердце кролика наблюдались у 5/6 кроликов, леченных доксорубицином. В тех же самых условиях Соединение А не вызывало соответствующей клинической кардиотоксичности.

Некардиотоксическая природа соединения, соответствующего данному изобретению, подтверждается следующим исследованием, в котором оценивают кардиотоксичность доксорубицина и Соединения А на модели непрерывного введения на кроликах.

В соответствии с данным исследованием двадцать четыре самца новозеландских белых кроликов случайным образом разделили на четыре группы. Шести кроликам инъецировали 1 мг/кг доксорубици