Иммуногенный коньюгат полисахарид h. influenzae - порин менингококка группы b (варианты), способ его получения, фармацевтическая композиция и способ индукции иммунного ответа у животного в отношении h.influenzae

Патент 2233172

Авторы

Классы МПК

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении вакцин, применяемых для возникновения иммунного ответа у животного. Предложен иммуногенный конъюгат полисахарида Haemophilus influenzae типа в (Hib) с практически переуложенным зрелым белком наружной мембраны класса 2 или 3 Neisseria meningitidis или его слитой формой, содержащей аминокислоты 1-20 или 1-22 капсидного белка гена Т7 (rPorB). Hib подвергают окислению или селективному гидролизу для получения альдегидных групп. Затем посредством восстановительного аминирования конъюгируют данный полисахарид с rPorB. Полученный конъюгат используют для получения фармкомпозиции и индукции иммунного ответа у животного в отношении Н. influenzae. 6 с. и 7 з.п. ф-лы, 8 ил.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области вакцин, применяемых для возникновения иммунного ответа у животного. В частности, изобретение касается конъюгатов полисахарида Н. influenzae - белка наружной мембраны N. meningitidis, фармацевтических композиций и их использования.

Уровень техники

Микроорганизм Haemophilus influenzae представляет собой маленькие плеоморфные грамотрицательные коккобациллы. Изоляты классифицируют на шесть капсулярных типов (a-f), различающихся по природе антигенов, и неинкапсулированные нетипируемые штаммы. Haemophilus influenzae может вызывать менингит, средний отит (воспаление среднего уха), синусит, эпиглоттит (воспаление надгортанника), септический артрит, лихорадочную скрытую бактериемию, целлюлит, пневмонию и эмпиему, иногда данный организм вызывает менингит новорожденных и септицемию. Другие инфекции Н. Influenzae включают гнойный перикардит, эндокардит, конъюнктивит, остеомиелит, перитонит, эпидидимальный орхит, глоссит, увулит (воспаление язычка мягкого неба) и септический тромбофлебит. В большинстве случаев инвазивные заболевания до внедрения конъюгированной вакцины на основе Н. influenzae типа b (Hib) вызывались типом b. Неинкапсулированные организмы могут вызывать инвазивное заболевание у новорожденных. Неинкапсулированные штаммы вызывают инфекцию верхних дыхательных путей, включая средний отит, синусит и бронхит, и могут вызывать пневмонию.

Источником (микро)организма являются верхние дыхательные пути человека. Способом передачи предположительно является передача от субъекта субъекту при прямом контакте или путем ингаляции капель выделений дыхательных путей, содержащих организм. Часто происходит бессимптомная колонизация неинкапсулированными штаммами, организмы выделяют из горла у 60-90% детей. Однако колонизация организмами типа b встречается редко, находясь в интервале от 2 до 5% детей в эпоху, предшествующую появлению вакцин, и, очевидно, стала еще менее частой в связи с широким распространением вакцинации конъюгатом Hib. Точный период передачи инфекции неизвестен, но его длительность может быть равной периоду нахождения организма в верхних дыхательных путях.

До внедрения эффективных вакцин Hib был наиболее частой причиной бактериального менингита у детей в США и многих других странах. Менингит и другие инвазивные инфекции были наиболее распространены среди детей в возрасте от 3 месяцев до 3 лет, и приблизительно половина случаев приходилась на детей младше 12 месяцев. Зависимость частоты инвазивного заболевания типа b от возраста варьировала в странах в различных популяциях; доля заболеваемости детей в возрасте младше 12 месяцев оказывалась наибольшей в популяциях с самой высокой общей заболеваемостью, что приводило к более низкому проценту заболеваемости среди людей среднего возраста. В противоположность менингиту и большинству других инвазивных Hib-заболеваний эпиглоттит редко возникает у детей в возрасте младше 12 месяцев, пик его возникновения в эпоху, предшествующую появлению вакцин, приходился на возраст от 2 до 4 лет. Эпиглоттит также может возникать у более старших невакцинированных детей и взрослых.

Инвазивные заболевания были более частыми у мальчиков, афроамериканцев, эскимосов Аляски, индейцев племен апачи и навахо, детей, посещающих центры по уходу за ребенком, детей, живущих в условиях перенаселения, и детей, которых не кормили грудью. Иммунизированные дети, в частности дети в возрасте младше 4 лет, которые находятся в длительном тесном контакте (таком, как домашние условия) с ребенком с инвазивным Hib-заболеванием, имеют повышенный риск получения серьезной инфекции от данного организма. Другие факторы предрасположенности к инвазивному заболеванию включают серповидно-клеточную анемию, асплению, ВИЧ-инфекцию, ряд синдромов, связанных с иммунодефицитом, и злокачественные новообразования. Дети в возрасте младше 1 года с документированной инвазивной инфекцией имеют приблизительно 1% риска рецидива, если их впоследствии не вакцинировали.

С 1988, когда были введены конъюгированные вакцины против Hib, частота инвазивных заболеваний Hib снизилась на 95% у младенцев и детей младшего возраста, и частота инвазивных инфекций, вызываемых другими инкапсулированными типами, в настоящее время близка частоте инфекций, вызываемых типом b. Результатом такого успеха было то, что Служба здоровья населения США поставила цель ликвидации в стране заболевания Hib у детей в возрасте младше 5 лет. В настоящее время инвазивное заболевание Hib возникает главным образом у еще невакцинированных детей и младенцев, которые являются слишком маленькими для проведения законченной первичной серии вакцинаций.

В США получены разрешения на четыре конъюгированные вакцины против Hib. Данные вакцины состоят из капсулярного полисахарида Hib (т.е. полирибозилриботолфосфата [PRP] или олигомеров PRP), ковалентно связанного с белком-носителем непосредственно или через промежуточную спейсерную молекулу. Защитные антитела направлены против PRP. Конъюгированные вакцины различаются по составу и иммуногенности, что обусловливает различия в рекомендациях по их применению. Например, PRP-D рекомендуется только для детей в возрасте 12 месяцев и старше, тогда как три другие вакцины HbOC, PRP-T и PRP-OMP рекомендуются для младенцев, начиная с двухмесячного возраста.

Адъюванты представляют собой субстанции, которые усиливают иммунный ответ на антигены, и вследствие этого их используют во многих вакцинах и испытываемых вакцинах. Иммуностимуляторный эффект адъювантов не является антиген-специфическим, поскольку они усиливают иммунные ответы на многие антигены различных типов. Единственными адъювантами, в настоящее время одобренными FDA (Food and Drug Administration, Департамент по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств) для применения человеку, являются соли алюминия, но многие адъюванты, используемые при вакцинациях животных и в более новых испытываемых вакцинах, имеют микробную природу (White R.G. Адъювантный эффект микробных продуктов в отношении иммунного ответа (The adjuvant effect of microbial products on the immune response), 1976, Ann. Rev. Microbiol., 30:579-595), например адъювант Фрейнда, Corynebacterium parvum, мурамилдипептид, токсоид столбняка и т.п. Механизмы иммунопотенцирующей способности микробных субстанций неизвестны.

Главные белки наружной мембраны патогенной Neisseria (Neisseria gonorrhoeae и Neisseria meningitidis) исследованы на адъювантный потенциал [P.O. Livingston. Подходы к усилению ответа антител IgG на вакцины на основе ганглиозидов меланомы (Approaches to augmenting the IgG antibody response to melanoma ganglioside vaccines), 1993, Ann. N.Y.Acad. Sci., 690:204-213; P.O. Livingston, M.J. Calves, F. Helling, W.D. Zollinger, M.S. Blake и G.H. Lowell. GD3/протеосомные вакцины индуцируют стабильные антитела IgM против ганглиозида GD3 (GD3/proteosome vaccines induce consistent IgM antibodies against ganglioside GD3), 1993, Vaccine, 11:1199-1204; G.H. Lowell, W.R. Ballow, L.F. Smith, R.A. Wirtz, W.D. Zollinger и W.T. Hockmeyer. Протеосомно-липопептидные вакцины - повышение иммуногенности малярийных CS-пептидов (Proteosome - lipopeptide vaccines: enchancement of immunogenecity for malaria CS peptides), 1988, Science, 240:800-802; G.H. Lowell, L.F. Smith, R.C. Seid и W.D. Zollinger. Пептиды, связанные с протеосомами посредством гидрофобных ножек, приобретают высокую иммуногенность в отсутствие адъюванта (Peptides bound to proteosomes via hydrophobic feet become highly immunigenic without adjuvant), 1988, J. Exp. Med., 167:658-663; L.M. Wetzler, M.S. Blake, K. Barry и Е.С. Gotschlich. Оценка вакцин на основе порина гонококков - сравнение Роr-протеосом, липосом и пузырьков, выделенных из мутантов с делецией rmp (Gonococcal porin vaccine evaluation: comparison of Por proteosomes, liposomes, and blebs isolated from rmp deletion mutants), 1992, J. Infect. Dis., 166:551-555] и для выяснения механизма, обусловливающего их иммунопотенцирующую способность. Белками, представляющим интерес, являются белок IA (PIA) и белок IB (PIB) гонококка и белки классов 1, 2 или 3 менингококка (С1, С2 и С3 соответственно) [М. Blake и Е. Gotschilich. Функциональные и иммунологические свойства поверхностных белков патогенных нейссерий (Functional and immunological properties of pathogenic neisserial surface proteins), 1986. В монографии М. Inouye Бактериальные наружные мембраны как модельные системы (Bacterial Outer membranes as Model Systems), John Wiley, New York, стр.377-400]. Все они работают как порины [Е.С. Lynch, M.S. Blake, E.C. Gotschlich и A. Mauro. Исследования поринов, самопроизвольно перенесенных из целых клеток и восстановленных из очищенных белков Neisseria gonorrhoeae и Neisseria meningitidis (Studies of porins: Spontaneously transferred from whole cells and reconstituted from purified proteins of Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis), 1984, Biophys., 45:104-107; A. Mauro, M.S. Blake и Р. Labarca. Механизм возникновения под действием напряжения проводимости липидных двухслойных структур, индуцируемый порином из наружных мембран Neisseria gonorrhoeae (Voltage gating of conductance in lipid bilayers induced by porin from outer membranes of Neisseria gonorrhoeae), 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:1071-1075; J.D.E. Young, M.S. Blake, A. Mauro и Z.A. Cohn. Свойства главного белка наружной мембраны Neisseria gonorrhoeae, инкорпорированного в модельные липидные мембраны (Properties of the major outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae incorporated into model lipid membranes), 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:3831-3835], имеют существенную гомологию последовательностей аминокислот относительно друг друга [S. Butcher, M. Sarvas и К. Runeberg-Nyman. Белок порина класса 3 Neisseria meningitidis - Клонирование и структура гена (Class-3 porin protein of Neisseria meningitidis: Cloning and Structure of the gene), 1991, Gene 105:125-128; N. Carbonetti и Р. Sparling. Молекулярное клонирование и характеристики структурного гена белка I главного белка наружной мембраны Neisseria gonorrhoeae (Molecular cloning and characterization of the structural gene of protein I, the major outer membrane protein of Neisseria gonorrhoeae), 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:9084-9088; E.C. Gotschlich, M.E. Seiff, M.S. Blake и J.M. Koomey. Белок порина Neisseria gonorrhoeae - клонирование и структура гена (Porin protein of Neisseria gonorrhoeae: cloning and gene structure), 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:8135-8138; M.J. Ward, P.R. Lambden и J.E. Heckels. Анализ последовательности и взаимосвязи белков менингококков серотипа класса 3 и других поринов из патогенных и непатогенных видов Neisseria (Sequence analysis and relationships between meningococcal class 3 serotype proteins and other porins from pathogenic and non-pathogenic Neisseria), 1992, FEMS Microbiol. Lett., 73:283-289] и, как полагают, являются частью суперсемейства порина грамотрицательных бактерий [D. Jeanteur, J.H. Lakely и Е. Pattus. Суперсемейство бактериальных поринов - определение последовательности и предсказание структуры (The bacterial porin superfamily: sequence alignment and structure prediction), 1991, Molec. Microbiol., 5:2153-2164].

Было показано, что порины нейссерий при нековалентном комплексообразовании с малярийными пептидами усиливают ответ антител на данные пептиды по сравнению с использованием в качестве иммуногенов одних пептидов или пептидов, ковалентно связанных с другими белками [G.H. Lowell, W.R. Ballow, L.F. Smith, R.A. Wirtz, W.D. Zollinger и W.T. Hockmeyer. Протеосомно-липопептидные вакцины - повышение иммуногенности малярийных CS-пептидов (Proteosome -lipopeptide vaccines: enchancement of immunogenecity for malaria CS peptides), 1988, Science, 240:800-802; G.H. Lowell, L.F. Smith, R.C. Seid и W.D. Zollinger. Пептиды, связанные с протеосомами посредством гидрофобных ножек, приобретают высокую иммуногенность в отсутствие адъюванта (Peptides bound to proteosomes via hydrophobic feet become highly immunigenic without adjuvant), 1988, J. Exp. Med., 167:658-663]. Кроме того, было показано, что пептиды, выделенные из стрептококка группы A [G.H. Lowell. Протеосомы, гидрофобные якори, иском-частицы и липосомы для улучшенной презентации пептидов и белковых вакцин (Proteosomes, hydrophobic anchors, iscoms, and liposomes for improved presentation of peptides and protein vaccines), 1990, стр.141-160 в монографии G.C.Woodrow и М.М. Levine Вакцины нового поколения (New Generation Vaccines), Marcel Dekker, Inc., New York], гемагглютинина вируса гриппа [G.H. Lowell. Протеосомы, гидрофобные якори, иском-частицы и липосомы для улучшенной презентации пептидов и белковых вакцин (Proteosomes, hydrophobic anchors, iscoms, and liposomes for improved presentation of peptides and protein vaccines), 1990, стр.141-160 в монографии G.C.Woodrow и М.М. Levine Вакцины нового поколения (New Generation Vaccines), Marcel Dekker, Inc., New York] или Trypanosome bruceii [G.H. Lowell, L.F. Smith, R.C. Seid и W.D. Zollinger. Пептиды, связанные с протеосомами посредством гидрофобных ножек, приобретают высокую иммуногенность в отсутствие адъюванта (Peptides bound to proteosomes via hydrophobic feet become highly immunigenic without adjuvant), 1988, J. Exp. Med., 167:658-663], являются более иммуногенными у мышей, когда они введены в комплексы, содержащие порины Neisseria, по сравнению с иммунизацией мышей одними пептидами. Пузырьки наружной мембраны (OMV) менингококков, состоящие в основном из белка класса 2, были использованы в качестве носителя для усиления иммунного ответа в отношении полисахаридной капсулы Н. influenzae в недавно разрешенной вакцине против Н. influenzae типа b, разработанной Merck [J.J. Donnelly, R.R. Deck и М.А. Liu. Иммуногенность конъюгированных вакцин на основе комплекса полисахарид Haemophilus influenzae - белок наружной мембраны Neisseria meningitidis (Immunogenicity of Haemophilus influenzae polysaccharide - Neisseria meningitidis outer membrane protein complex conjugate vaccine), 1990, J. Immunol., 145:3071-3079]. Более того, Livingston исследовал применение очищенных поринов нейссерий в качестве адъювантов в вакцинах против меланомы. Клетки меланомы экспрессируют на своей поверхности человеческие ганглиозиды GM2 или GD3 на значительно более высоких уровнях по сравнению с нормальными меланоцитами. Для усиления иммунного ответа в отношении GM2 или GD3 и возможной индукции устойчивости к развитию опухоли у пациентов с меланомой, GM2 или GD3 были нековалентно связаны с очищенными поринами Neisseria, и добровольцев со злокачественной меланомой иммунизировали данными вакцинными конструкциями. Реакции антител против GM2 или против GD3 значительно повышались у пациентов, иммунизированных комплексами порин/GМ2 или порин/GDS, по сравнению с пациентами, иммунизированными одними данными ганглиозидами или данными ганглиозидами, комплексированными с BCG [P.O. Livingston. Подходы к усилению ответа антител IgG на вакцины на основе ганглиозидов меланомы (Approaches to augmenting the IgG antibody response to melanoma ganglioside vaccines), 1993, Ann. N.Y. Acad. Sci., 690:204-213; P.O. Livingston, M.J. Calves, F. Helling, W.D. Zollinger, M.S. Blake и G.H. Lowell. GD3/протеосомные вакцины индуцируют стабильные антитела IgM против ганглиозида GD3 (GD3/proteosome vaccines induce consistent IgM antibodies against ganglioside GD3), 1993, Vaccine, 11:1199-1204]. Кроме того, опухолевая нагрузка у пациентов, иммунизированных порином/СМ2, существенно снижалась (личное сообщение, Р. Livingston).

Механизмы, с помощью которых порины Neisseria действуют как адъюванты, неизвестны. Группа из Merck [J.J. Donnelly, R.R. Deck и М.А. Liu. Иммуногенность конъюгированных вакцин на основе комплекса полисахарид Haemophilus influenzae - белок наружной мембраны Neisseria meningitidis (Immunogenicity of Haemophilus influenzae polysaccharide - Neisseria meningitidis outer membrane protein complex conjugate vaccine), 1990, J. Immunol., 145:3071-3079; М.А. Liu, A. Friedman, A.I. Oliff и соавт. Носитель для вакцин, выделенный из Neisseria meningitidis, с митогенной активностью в отношении лимфоцитов (A vaccine carrier derived from Neisseria meningitidis with mitogenic activity for lymphocytes), 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4633-4637; J.B. Ulmer, C.J. Burke, C. Shi, A. Friedman, J.J. Donnelly и М.A. Liu. Образование пор и митогенность клеток крови, обусловленные белком класса 2 Neisseria meningitidis (Pore formation and mitogenicity in blood cells by the class 2 protein of Neisseria meningitidis), 1992, J. Biol. Chem., 267:19266-19271], которая разработала конъюгированную вакцину полисахаридная капсула Neisseria - OMV менингококков, считала, что это могло бы происходить вследствие прямой стимуляции Т-клеток белком класса 2. Вначале они показали, что белок класса 2 мог непосредственно стимулировать Т-лимфоциты и вследствие этого переименовали белок класса 2 в усиливающий иммунитет белок менингококков (MIEP) [М.А. Liu, A. Friedman, A.I. Oliff и соавт. Носитель для вакцин, выделенный из Neisseria meningitidis, с митогенной активностью в отношении лимфоцитов (A vaccine carrier derived from Neisseria meningitidis with mitogenic activity for lymphocytes), 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4633-4637]. Однако позднее было показано, что только денатурированный белок класса 2 в высоких концентрациях (>50 мкг) мог стимулировать Т-клетки, тогда как нативный белок не давал такого эффекта [J.B. Ulmer, C.J. Burke, С. Shi, A. Friedman, J.J. Donnelly и М.А. Liu. Образование пор и митогенность клеток крови, обусловленные белком класса 2 Neisseria meningitidis (Pore formation and mitogenicity in blood cells by the class 2 protein of Neisseria meningitidis), 1992, J. Biol. Chem., 267:19226-19271]. Более того, поскольку большинство поринов Neisseria находятся в нативной конфигурации при использовании в качестве кандидатной (испытываемой) вакцины или адъюванта, вероятность того, что неспецифическая стимуляция Т-клеток денатурированными поринами влияет на их иммунопотенцирующую способность, является низкой.

В последние несколько лет были выяснены детали, касающиеся взаимодействия между Т- и В-лимфоцитами, необходимого для распознавания антигена, стимуляции лимфоцитов и образования антител. В современной модели стимуляции Т-лимфоцитов показано, что необходимы две группы сигналов между антиген-презентирующей клеткой (АРС) и Т-лимфоцитом [K.S. Hathcock, G. Laszlo, H.B. Dickter, J. Bradshaw, P.S. Linsley и R.J. Hodes. Идентификация лиганда, альтернативного CTLA-4, костимулирующего активацию Т-клеток (Identification of an alternative CTLA-4 ligand costimulatory for Т cell activation), 1993, Science, 262:905-907; С.A. Janeway, Jr. и К. Bottomly. Сигналы и признаки ответов лимфоцитов (Signals and signs for lymphocyte responses), 1994, Cell, 76:275-285; R.H. Schwartz. Костимуляция Т-лимфоцитов - роль CD28, CTLA-4 и В7/ВВ1 в образовании интерлейкина-1 и иммунотерапии (Costimulation of T lymphocytes: The role of CD28, CTLA-4 and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy), 1992, Cell, 71:1065-1068]. Первый сигнал (сигнал 1) возникает от взаимодействия главного комплекса гистосовместимости (МНС) на антиген-презентирующих клетках (например, на В-лимфоцитах, дендритных клетках, макрофагах и т.п.) и Т-клеточного рецептора на Т-лимфоцитах. Углубление на комплексе МНС обычно занято олигопептидом, происходящим из процессированных антигенов (Т-клеточный эпитоп). Специфичность реакции обеспечивается сигналом 1. Второй или костимуляторный сигнал (сигнал 2) возникает при связывании двух групп противорецепторов во время взаимодействия В- и Т-лимфоцитов (фиг.1). Затем активированные Т-лимфоциты выделяют цитокины, которые, в свою очередь, стимулируют эффекторные клетки, например, являясь причиной того, что В-лимфоциты становятся клетками, продуцирующими антитела. Было показано, что индукция костимуляции посредством взаимодействия данных противорецепторов является важной для появления иммунитета к развитию опухоли [М. Azuma, M. Cayabyab, D. Buck, J.H. Phillips и L.L Lanier. Взаимодействие CD28 с В7 костимулирует первичные аллогенные пролиферативные ответы и цитотоксичность, опосредуемые маленькими покоящимися Т-лимфоцитами (CD28 interaction with B7 costimulates primary allogenic proliferative responses and cytotoxicity mediated by small, resting Т lymphocytes), 1992, J. Exp. Med., 175:353-360; S. Baskar, S. Ostrand-Rosenberg, N. Nabavi, L.M. Nadler, G.J. Freeman и L.H. Glimcher. Конститутивная экспрессия В7 восстанавливает иммуногенность опухолевых клеток, экспрессирующих усеченные молекулы главного комплекса гистосовместимости класса II (Constitutive expression of B7 restores immunogenicity of tumor cells expressing truncated major histocompatibility complex class II molecules), 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5687-5690; L. Chen, S. Ashe, W.A. Brady и соавт. Костимуляция противоопухолевого иммунитета с помощью противорецептора B7 к молекулам CD28 и CTLA-4 Т-лимфоцитов (Costimulation of antitumor immunity by the B7 counterreceptor for the Т lymphocyte molecules CD28 и CTLA-4), 1992, Cell 71:1093-1102; S. Falkow. Что представляет собой патоген? (What is a pathogen?), 1997, ASM News, 63:359-365; R.H. Schwartz. Костимуляция Т-лимфоцитов - роль CD28, CTLA-4 и В7/ВВ1 в образовании интерлейкина-1 и иммунотерапии (Costimulation of Т lymphocytes: The role of CD28, CTLA-4 and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy), 1992, Cell, 71:1065-1068; S.E. Townsend и J.P. Allison. Отторжение опухоли после прямой костимуляции Т-клеток CD8+ В7-трансфицированными клетками меланомы (Tumor rejection after direct costimulation of CD8+ Т cells by B7-transfected melanoma cells), 1993, Science, 259:368-370], профилактики толерантности [C.D. Gimmi, G.J. Freeman, J.G. Gribben, G. Gray и L.M. Nadler. Клональная анергия Т-клеток человека индуцируется презентацией антигена в отсутствие костимуляции В7 (Human T-cell anergy is induced by antigen presentation in the absence of B7 costimuation), 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6586-6590; D.L Mueller, M.K. Jenkins и R.H. Schwartz. Противопоставление клональной экспансии функциональной клональной инактивации - путь костимуляторного сигнала определяет последствия занятости рецептора Т-клеточного антигена (Clonal expansion versus functional clonal inactivation: a costimulatory signaling pathway determines the outcome of Т cell antigen receptor occupancy), 1989, Annu. Rev. Immunol., 7:445-480; P. Tan, C. Anasetti, J.A. Hansen и соавт. Индукция аллоантиген-специфической гипочувствительности у человеческих Т-лимфоцитов посредством блокирования взаимодействия CD28 с его естественным лигандом B7/BB1 (Induction of alloantigen-specific hyporesponsiveness in human Т lymphocytes by blocking interaction of CD28 with its natural ligand B7/BB1), 1993, J. Exp. Med., 177:165-173] и проявления цитотоксической активности лимфоцитов [M. Azuma, M. Cayabyab, D. Buck, J.H. Phillips и L.L. Lanier. Взаимодействие CD28 с В7 костимулирует первичные аллогенные пролиферативные ответы и цитотоксичность, опосредуемые маленькими покоящимися Т-лимфоцитами (CD28 interaction with B7 costimulates primary allogenic proliferative responses and cytotoxicity mediated by small, resting Т lymphocytes), 1992, J. Exp. Med., 175:353-360].

Противорецепторами Т-лимфоцитов являются CD28 и CTLA-4. Оба они представляют собой члены суперсемейства иммуноглобулинов [T.D. Connell, D. Shaffer и J.G. Cannon. Характеристики репертуара гипервариабельных участков семейства генов белка II (ора) Neisseria gonorrhoeae (Characterization of the repertoire of hypervariable regions in the protein II (opa) gene family of Neisseria gonorrhoeae), 1990, Molec. Microbiol., 4:439-449]. CD28 присутствует на покоящихся и активированных Т-клетках [М. Azuma, М. Cayabyab, D. Buck, J.H. Phillips и L.L. Lanier. Взаимодействие CD28 с B7 костимулирует первичные аллогенные пролиферативные ответы и цитотоксичность, опосредуемые маленькими покоящимися Т-лимфоцитами (CD28 interaction with B7 costimulates primary allogenic proliferative responses and cytotoxicity mediated by small, resting Т lymphocytes), 1992, J. Exp. Med., 175:353-360; L. Chen, S. Ashe, W.A. Brady и соавт. Костимуляция противоопухолевого иммунитета с помощью противорецептора B7 к молекулам CD28 и CTLA-4 Т-лимфоцитов (Costimulation of antitumor immunity by the B7 counterreceptor for the Т lymphocyte molecules CD28 и CTLA-4), 1992, Cell 71:1093-1102; M.K. Jenkins и J.G. Johnson. Молекулы, участвующие в костимуляции Т-клеток (Molecules involved in T-cell costimulation), 1993, Curr. Opin. Immunol., 5:361-367; C.H. June, J.A. Bluestone, L.M. Nadler и С.В. Thompson. Семейства рецепторов В7 и CD28 (The B7 and CD28 receptor families), 1994, Immunol. Today, 15:321-331; P.S. Linsley, W. Brady, L. Grosmaire, A. Aruffo, N.K. Damle и J.A. Ledbetter. Связывание антигена активации В-клеток B7 с CD28 костимулирует пролиферацию Т-клеток и накопление мРНК интерлейкина-2 (Binding of the В cell activation antigen B7 to CD28 costimulates Т cell proliferation and interleukin 2 mRNA accumulation), 1991, J., Exp. Med., 173:721-730; P.S. Linsley, E.A. Clark и J.A. Ledbetter. Т-клеточный антиген CD28 опосредует адгезию к В-клеткам путем взаимодействия с антигеном активации В7/ВВ-1 (T-cell antigen CD28 mediates adhesion with B cells by interacting with activation antigen B7/BB-1), 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:5031-5035; S.D. Norton, L. Zuckerman, K.B. Urdahl, R. Shefner, J. Miller и M.K. Jenkins. Лигaнд CD28, B7, повышает образование ИЛ-2 путем генерации костимуляторного сигнала для Т-клеток (The CD28 ligand, B7, enhances IL-2 production by providing a costimulatory signal to Т cells), 1992, J. Immunol., 149:1556-1561], тогда как СТLА-4 экспрессируется только на активированных Т-клетках [G.J. Freeman, D.B. Lombard, C.D. Gimmi и соавт. мРНК CTLA-4 и CD28 коэкспрессируются в большинстве Т-клеток после активации. Экспрессия мРНК CTLA-4 и CD28 не коррелирует со способом продукции лимфокинов (CTLA-4 and CD28 mRNA are coexpressed in most Т cells after activation. Expression of CTLA-4 and CD28 mRNA does not correlate with the pattern of lymphokine production), 1992, J. Immunol., 149:3795-3801; К. Harper, С. Balzano, E. Rouvier, M.G. Mattei, M.F. Luciani и Р. Golstein. CTLA-4- и CD28-активированные молекулы лимфоцитов, очень близкие у мыши и человека по последовательности, экспрессии информации, структуре генов и положению на хромосомах (CTLA-4 and CD28 activated lymphocyte molecules are closely related in both mouse and human as to sequence, message expression, gene structure, and chromosomal location), 1991, J. Immunol., 147:1037-1044; Т. Lindsten, K.P. Lee, E.S. Harris и соавт. Характеристики структуры и экспрессии CTLA-4 на человеческих Т-клетках (Characterization of CTLA-4 structure and expression on human Т cells), 1993, J. Immunol., 151:3489-3499; P.S. Linsley, W. Brady, M. Urnes, L.S. Grosmaire, N.K. Damle и J.A. Ledbetter. CTLA-4 - второй рецептор антигена активации В-клеток В7 (CTLA-4 is a second receptor for the В cell activation antigen B7), 1991, J., Exp. Med., 174:561-569; R.H. Schwartz. Костимуляция Т-лимфоцитов - роль CD28, CTLA-4 и В7/ВВ1 в образовании интерлейкина-1 и иммунотерапии (Costimulation of Т lymphocytes: The role of CD28, CTLA-4 and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy), 1992, Cell, 71:1065-1068]. Уровень CD28 на активированных Т-клетках в 20 раз выше, чем CTLA, но аффинность CD28 в отношении его В-клеточного противорецептора значительно ниже [Т. Lindsten, K.P. Lee, E.S. Harris и соавт. Характеристики структуры и экспрессии CTLA-4 на человеческих Т-клетках (Characterization of CTLA-4 structure and expression on human Т cells), 1993, J. Immunol., 151:3489-3499; P.S. Linsley, W. Brady, M. Urnes, L.S. Grosmaire, N.K. Damle и J.A. Ledbetter. CTLA-4 - второй рецептор антигена активации В-клеток B7 (CTLA-4 is a second receptor for the В cell activation antigen B7), 1991, J., Exp. Med., 174:561-569]. Противорецепторами В-лимфоцитов являются B7 [G.J. Freeman, A.S. Freedman, J.M. Segil, G. Lee, J.F. Whitman и L.M. Nadler. B7 - новый член суперсемейства Ig с уникальной экспрессией на активированных В-клетках и В-клетках новообразований (В7, a new member of the Ig superfamily with unique expression on activated and neoplastic В cells), 1989, J. Immunol., 143:2714-2722; C.D. Gimmi, G.J. Freeman, J.G. Gribben и соавт. Поверхностный антиген В7 В-клеток обеспечивает костимуляторный сигнал, который индуцирует пролиферацию Т-клеток и секрецию ими интерлейкина-2 (B-cell surface antigen B7 provides a costimulatory signal that induces Т cells to proliferate and secrete interleukin 2), 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:6575-6579; P.S. Linsley, W. Brady, L. Grosmaire, A. Aruffo, N.K. Damle и J.A. Ledbetter. Связывание антигена активации В-клеток B7 с CD28 костимулирует пролиферацию Т-клеток и накопление мРНК интерлейкина-2 (Binding of the В cell activation antigen B7 to CD28 costimulates Т cell proliferation and interleukin 2 mRNA accumulation), 1991, J., Exp. Med., 173:721-730; Z. Razi-Wolf, G.J. Freeman, F. Galvin, B. Benacerraf, L. Nadler и Н. Reiser. Экспрессия и функция мышиного антигена B7, главной костимуляторной молекулы, экспрессируемой клетками перитонеального эксудата (Expression and function of the murine B7 antigen, the major costimulatory molecule expressed by peritoneal exudate cells), 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4210-4214; H. Reiser, G.J. Freeman, Z. Razi-Wolf, C.D. Gimmi, B. Benacerraf и L.M. Nadler. Мышиный антиген В7 обеспечивает эффективный костимуляторный сигнал для активации мышиных Т-лимфоцитов посредством комплекса Т-клеточный рецептор/CD3 (Murine B7 antigen provides an efficient costimulatory signal for activation of murine Т lymphocytes via the T-cell receptor/CD3 complex), 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:271-275] и совсем недавно открытый В7-2 [М. Azuma, D. Ito, H. Yagita и соавт. Антиген В70 - второй лиганд для CTLA-4 и CD28 (В70 antigen is a second ligand for CTLA-4 and CD28), 1993, Nature, 366:76-79; G.J. Freeman, F. Borriello, R.J. Hodes и соавт. Открытие функционального альтернативного противорецептора CTLA-4 у В7-дефицитных мышей (Uncovering of functional alternative CTLA-4 counter-receptor in B7-deficient mice), 1993, Science, 262:907-909; G.J. Freeman, F. Borriello, R.J. Hodes и соавт. Мышиный В7-2 -альтернативный противорецептор CTLA4, который костимулирует пролиферацию Т-клеток и продукцию интерлейкина-2 (Murine B7-2, an alternative CTLA-4 counter-receptor that costimulates Т cell proliferation and interleukin-2 production), 1993, J. Esp. Med., 178:2185-2192; G.J. Freeman, J.G. Gribben, V.A. Boussiotis и соавт. Клонирование B7-2 - противорецептора CTLA-4, костимулирующего пролиферацию Т-клеток человека (см. комментарии) (Cloning of B7-2: a CTLA-4 counter-receptor that costimulates human Т cell proliferation), 1993, Science, 262:909-911; K.S. Hathcock, G. Laszlo, H.B. Dickter, J. Bradshaw, P.S. Linsley и R.J. Hodes. Идентификация лиганда, альтернативного CTLA-4, костимулирующего активацию Т-клеток (Identification of an alternative CTLA-4 ligand costimulatory for T cell activation), 1993, Science, 262:905-907]. B7 и B7-2 являются представителями суперсемейства иммуноглобулинов [G.J. Freeman, F. Borriello, R.J. Hodes и соавт. Мышиный B7-2 - альтернативный противорецептор CTLA4, который костимулирует пролиферацию Т-клеток и продукцию интерлейкина-2 (Murine B7-2, an alternative CTLA-4 counter-receptor that costimulates Т cell proliferation and interleukin-2 production), 1993, J. Esp. Med., 178:2185-2192; G.J. Freeman, A.S. Freedman, J.M. Segil, G. Lee, J.F. Whitman и L.M. Nadler. B7 - новый член суперсемейства Ig с уникальной экспрессией на активированных В-клетках и В-клетках новообразований (В7, a new member of the Ig superfamily with unique expression on activated and neoplastic В cells), 1989, J. Immunol., 143:2714-2722; G.J. Freeman, G.S. Gray, C.D. Gimmi и соавт. Структура, экспрессия и Т-клеточная костимуляторная активность мышиного гомолога человеческого антигена В7 активации В-лимфоцитов (Structure, expression, and Т cell costimulatory activity of the murine homologue of the human b lymphocyte activation antigen B7), 1991, J. Esp. Med., 174:625-631] и присутствуют только на активированных В-лимфоцитах [G.J. Freeman, A.S. Freedman, J.M. Segil, G. Lee, J.F. Whitman и L.M. Nadler. B7 - новый член суперсемейства Ig с уникальной экспрессией на активированных В-клетках и В-клетках новообразований (B7, a new member of the Ig superfamily with unique expression on activated and neoplastic В cells), 1989, J. Immunol., 143:2714-2722]. Ряд косвенных данных свидетельствует о взаимосвязи нового лиганда, В7-2, с костимуляцией Т-лимфоцитов: 1) связывание CTLA-4 с активированными В-клетками только частично ингибируется моноклональным антителом (mAb) против B7 [K.S. Hathcock, G. Laszlo, H.B. Dickter, J. Bradshaw, P.S. Linsley и R.J. Hodes. Идентификация лиганда, альтернативного CTLA-4, костимулирующего активацию Т-клеток (Identification of an alternative CTLA-4 ligand costimulatory for Т cell activation), 1993, Science, 262:905-907]; 2) лимфоциты, выделенные у мышей, дефектных по экспрессии B7, могут тем не менее костимулировать Т-клетки [G.J. Freeman, F. Borriello, R.J. Hodes и соавт. Открытие функционального альтернативного противорецептора CTLA-4 у В7-дефицитных мышей (Uncovering of functional alternative CTLA-4 counter-receptor in B7-deficient mice), 1993, Science, 262:907-909; G.J. Freeman, F. Borriello, R.J. Hodes и соавт. Мышиный В7-2 - альтернативный противорецептор CTLA4, который костимулирует пролиферацию Т-клеток и продукцию интерлейкина-2 (Murine B7-2, an alternative CTLA-4 counter-receptor that costimulates Т cell proliferation and interleukin-2 production), 1993, J. Esp. Med., 178:2185-2192]; 3) трансфектанты, экспрессирующие только B7-2, могут костимулировать Т-клетки [G.J. Freeman, F. Borriello, R.J. Hodes и соавт. Мышиный B7-2 - альтернативный противорецептор CTLA4, который костимулирует пролиферацию Т-клеток и продукцию интерлейкина-2 (Murine B7-2, an alternative CTLA-4 counter-receptor that costimulates Т cell proliferation and interleukin-2 production), 1993, J. Esp. Med., 178:2185-2192; G.J. Freeman, J.G. Gribben, V.A. Boussiotis и соавт. Клонирование B7-2 - противорецептора CTLA-4, костимулирующего пролиферацию Т-клеток человека (см. комментарии) (Cloning of B7-2: a CTLA-4 counter-receptor that costimulates human Т cell proliferation), 1993, Science, 262:909-911] и 4) mAb, специфическое в отношении B7-2, может ингибировать костимуляцию Т-лимфоцитов В-клетками [K.S. Hathcock, G. Laszlo, H.B. Dickter, J. Bradshaw, P.S. Linsley и R.J. Hodes. Идентификация лиганда, альтернативного CTLA-4, костимулирующего активацию Т-клеток (Identification of an alternative CTLA-4 ligand costimulatory for Т cell activation), 1993, Science, 262:905-907] или трансфектантами B7-2 [G.J. Freeman, F. Borriello, R.J. Modes и соавт. Мышиный B7-2 - альтернативный противорецептор CTLA4, который костимулирует пролиферацию Т-клеток и продукцию интерлейкина-2 (Murine B7-2, an alternative CTLA-4 counter-receptor that costimulates Т cell proliferation and interleukin-2 production), 1993, J. Esp. Med., 178:2185-2192]. Значение изначально описанного антигена В7 как костимуляторного противорецептора является спорным, поскольку экспрессия В7-2 происходит раньше, чем экспрессия В7, и на поверхности активированных В-лимфоцитов присутствует больше антигенов В7-2, чем В7 [K.S. Hathcock, G. Laszlo, H.B. Dickter, J. Bradshaw, P.S. Unsley и R.J. Modes. Идентификация лиганда, альтернативного CTLA-4, костимулируюнщего активацию Т-клеток (Identification of an alternative CTLA-4 ligand costimulatory for Т cell activation), 1993, Science, 262:905-907]. Схематическое представление костимуляции Т-лимфоцитов и костимуляторных противорецепторов проиллюстрировано на фиг.1.

Существует представленное различными исследователями предварительное доказательство того, что микробные продукты могут стимулировать В-лимфоциты. Liu и соавт. показали, что липолисахарид (LРS), митогенный вирус гриппа и антиген, который имитирует вирусную инфекцию (полиинозиновая-полицитидиловая кислота), стимулируют В-лимфоциты, которые, в свою очередь, костимулируют Т-лимфоциты [С.A. Janeway, Jr. и К. Bottomly. Сигналы и признаки ответов лимфоцитов (Signals and signs for lymphocyte responses), 1994, Cell, 76:275-285]. Vordermeier продемонстрировал, что очищенные порины Salmonella typhi (не содержащие LPS) являются сильными стимуляторами В-клеток, но оказывают минимальное воздействие на Т-лимфоциты [Н. Vordermeier и W.G. Bessler. Поликлональная активация мышиных В-лимфоцитов in vitro поринами Salmonella typhimurium (Polyclonal activation of murine В lymphocytes in vitro by Salmonella typhimurium porins), 1987, Immunobiol., 175:245-251; H. Vordermeier, H. Drexler и W.G. Bessler. Поликлональная активация человеческих лимфоцитов периферической крови бактериальными поринами и определенными фрагментами поринов (Polyclonal activation of human peripheral blood lymphocytes by bacterial porins and defined porin fragments), 1987. Immunol. Lett., 15:121-126]. Кроме того, препараты наружной мембраны менингококков, в основном состоящие из поринов менингококков, действуют как В-клеточные митогены и не стимулируют Т-лимфоциты [J. Melancon, R.A. Murgita и I.W. DeVoe. Активация мышиных В-лимфоцитов с помощью Neisseria meningitidis и выделенных поверхностных антигенов менингококков (Activation of murine В lymphocytes by Neisseria meningitidis and isolated meningococcal surface antigens), 1983, Infect. Immun., 42:471-479; B.G. Sparkes. Иммуномодулирующая активность антигенов менингококков (Immunomodulating activity of meningococcal antigens), 1983, Can. J. Micribiol., 29:1611-1618; B.G. Sparkes. Двойной эффект антигенов менингококков на зависимый от Т-клеток иммунный ответ (Dual effect of meningococcal antigens on Т cell dependent immune response), 1983, Can. J. Micribiol., 29:1619-1625]. Данное доказательство предполагает, что порины нейссерий и, возможно, порины других грамотрицательных бактерий могли бы быть способными стимулировать В-лимфоциты и повышать экспрессию В7-2. Повышенная экспрессия В7-2 может опосредовать костимуляцию Т-лимфоцитов, что могло бы являться механизмом, которым порины усиливают иммунный ответ на другие антигены, такие как представленный в данном контексте полисахарид PRP.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение направлено на конъюгат полисахарида Н. influenzae типа b (Hib) с практически очищенным переуложенным зрелым белком наружной мембраны класса 2 или 3 Neisseria meningitidis или его слитой формой, содержащей аминокислоты 1-20 или 1-22 капсидного белка 10 гена Т7 (rРоrВ).

Данное изобретение предлагает также способ получения конъюгата полисахарид Hib - rРоrВ, предусматривающего

(a) получение полисахарида Hib;

(b) окисление или селективный гидролиз указанного полисахарида с целью создания альдегидных групп;

(d) конъюгирование полисахарида, содержащего альдегидные группы, с rРоrВ путем восстановительного аминирования (гидроаминирования).

Данное изобретение относится также к конъюгатам, полученным согласно способам, соответствующим изобретению. Необязательно конъюгаты, соответствующие данному изобретению, могут быть в комбинации с DTaP (вакцина против дифтерии, столбняка, бесклеточного коклюша).

Данное изобретение касается также фармацевтических композиций, содержащих конъюгаты, соответствующие изобретению, необязательно содержащие DTaP и фармацевтически приемлемый носитель.

Данное изобретение предлагает способ индукции иммунного ответа у животных в отношении Н. influenzae, предусматривающий введение конъюгатов, соответствующих изобретению, животному в количестве, эффективном для индукции указанного иммунного ответа.

Изобретение частично касается неожиданного открытия, что конъюгаты Hib-rPorB, соответствующие изобретению, индуцируют значительно более сильные иммунные ответы у животных по сравнению с использованием в качестве антигенного белка токсоида столбняка и рекомбинантным образом полученного белка наружной мембраны Р2 Н. influenzae. Значительно более сильные иммуногенные ответы также были получены сравнительно с конъюгатом Hib-CRM, который серийно выпускается компанией Lederle Laboratories, Division of American Cyanamid Company, Pearl River, NY. CRM₁₉₇ представляет собой полученный направленной мутацией нетоксичный вариант дифтерийного токсина, который выделен из культур Corynebacterium diphtheriae С7(197) [см. статью Seid R.C.Jr. и соавт. Glycoconj. J., (1989) 6:489-498].

Более того, конъюгат, соответствующий данному изобретению, особенно применим в композициях, содержащих также DTaP, поскольку иммунологические взаимодействия между компонентами, а также эпитопная супрессия наблюдаются при использовании принятых белков-носителей, таких как токсоид столбняка. Конъюгаты, соответствующие данному изобретению, преодолевают данное серьезное ограничение в комбинированных вакцинных композициях.

Перечень фигур чертежей и иных материалов

На фиг.1 представлено графическое изображение костимуляции Т-лимфоцита.

На фиг.2 представлен график, показывающий ферментационный профиль В1НВ1030.

На фиг.3 представлен окрашенный гель SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия) очищенного rРоrВ, использованного для конъюгирования.

На фиг.4 представлен график в виде столбиков, показывающий специфический в отношении полисахарида Hib ответ IgG у крыс на конъюгаты Hib с различными белками-носителями.

На фиг.5-1 - 5-8 представлены таблицы, показывающие сывороточные антитела у крыс Sprague-Dawley, иммунизированных Hib-TT, Hib-rPorB и Hib-rP2, определенные с помощью ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа).

На фиг.6-1 и 6-2 представлены данные, показывающие PRP-специфический ответ IgG у крыс на конъюгированные вакцины против Hib с различными белками-носителями, полученные с помощью ELISA. Были тестированы два различных препарата Hib-rPorB (-1 и -2). На фиг.6-1 в графической форме представляют табличные данные, показанные на фиг.6-2.

На фиг.7 представлен график, показывающий полисахарид-специфический IgG, вызываемый конъюгированными вакцинами против Hib у мышей CD-1.

На фиг.8 представлен график, показывающий полисахарид-специфический IgG, вызываемый конъюгированными вакцинами против Hib у крыс.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Данное изобретение касается вакцины для индукции иммунного ответа у жив