Белок, полученный из neisseria meningitidis, проявляющий свойства антигена, антитело, нуклеиновая кислота (варианты) и содержащая их композиция

Белок, полученный из neisseria meningitidis, проявляющий свойства антигена, антитело, нуклеиновая кислота (варианты) и содержащая их композиция

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии. Представлены иммуногенные белки, полученные из Neisseria, с аминокислотной последовательностью, приведенной в описании, и соответствующие нуклеотидные последовательности. Представлено антитело, полученное с помощью указанного белка, и композиция для лечения, профилактики и диагностики инфекций, вызванных Neisseria. Изобретение позволяет получить эффективные иммуногенные композиции против всех серотипов менингококка. 10 н. и 5 з.п. ф-лы, 53 ил., 1 табл.

Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США серийного №60/132068, поданной 30 апреля 1999 г., заявки PCT/US 99/23573, поданной 8 октября 1999 г. (должна быть опубликована в апреле 2000 г.), и британской патентной заявки серийного №GB-0004695.3, поданной 28 февраля 2000 г.

Настоящее изобретение касается способов получения антигенов и иммуногенов, полученных таким путем антигенов и иммуногенов, а также нуклеиновых кислот от вида бактерий Neisseria meningitidis. В частности, оно касается геномных последовательностей данной бактерии: более конкретно - ее серогруппы В.

Предпосылки

Менингококк Neisseria meningitidis - неподвижная грамотрицательная бактерия-диплококк, являющаяся патогеном человека. Она поселяется в глотке, вызывая менингит, а иногда - сепсис в отсутствие менингита. Она близкородственна гонококку N.gonorrhoeae, хотя важным свойством, отчетливо отличающим менингококк от гонококка, является присутствие полисахаридной оболочки, имеющейся у всех патогенных менингококков.

N.meningitidis вызывает и спорадические, и эпидемические случаи заболевания. В Соединенных Штатах Америки частота заражения составляет 0,6-1 случаев на 100 тысяч человек в год, а в случаях вспышек может существенно возрастать (см. Lieberman et al., 1996, "Safety and Immunogenicity of a serogroups A/C Neisseria meningitidis oligosaccharide-protein conjugate vaccine in young children", JAMA, 275 (19), 1499-1503; Schuchat et al., 1997, "Bacterial meningitis in the United States in 1995", New Engl. J. Med., 337 (14), 970-976). В развивающихся странах частота спорадических случаев существенно выше, а в случае эпидемий заболеваемость может достигать 500 случаев на 100000 человек в год. Смертность исключительно высока и составляет 10-20% в США и значительно больше в развивающихся странах. После внедрения вакцины на основе конъюгата против Haemophilus influenzae менингококк N.meningitidis становится основным возбудителем бактериального менингита во всех возрастных группах в США (Schuchat et al., 1997, цит. выше).

На основе параметров оболочечного полисахарида организма были идентифицированы 12 серогрупп N.meningitidis. Группа А представляет патоген, наиболее часто связанный с эпидемическими заболеваниями в присахарских районах Африки. Серогруппы В и С обусловливают подавляющее большинство случаев в Соединенных Штатах Америки и большинстве развитых стран. Серогруппы W 135 и Y вызывают остальные случаи заболевания в США и развитых странах. Применяемая в настоящее время менингококковая вакцина представляет собой тетравалентную полисахаридную вакцину, составленную серогруппами А, С, Y и W 135. Будучи эффективной у подростков и взрослых людей, она вызывает у них слабый иммунный ответ и кратковременную защиту, а также не может быть использована для детей (например, "Morbidity and Mortality Weekly Report", Vol.46, No. RR-5, 1997). Причиной этого является то, что полисахариды являются независимыми от Т-клеток антигенами, индуцирующими слабый иммунный ответ, который не удается бустировать с помощью повторной иммунизации. После достижения успеха в вакцинации против H.influenzae были разработаны вакцины на основе конъюгата против серогрупп А и С, которые находятся на заключительной стадии клинических испытаний (W.D.Zollinger, "New and improved vaccines against meningococcal disease", In "New Generation Vaccines", цит. выше, pp.469-488; Lieberman et al., 1996, цит. выше; Costantino et al., 1992, "Development and phase I clinical testing of a conjugate vaccine against meningococcus A (menA) and С (menC)", Vaccine, 10, 691-698).

Однако менингококк-В (МеnВ) остается проблемной серогруппой. В настоящее время на данный серотип приходится приблизительно 50% от всех случаев менингита в США, Европе и Южной Америке. “Полисахаридный подход” не может быть применен потому, что оболочечный полисахарид МеnВ представляет собой полимер (2-8)-сшитой N-ацетилнейраминовой кислоты, который также имеется в тканях млекопитающих. Это обусловливает толерантность к антигену: т.е., если иммунный ответ был вызван, то он окажется аутоиммунным и, следовательно, нежелательным.

С целью исключения индукции аутоиммунитета и обусловливания защитного иммунного ответа оболочечный полисахарид, например, был химически модифицирован путем замены N-ацетильных групп на N-пропионильные группы, в результате чего специфическая антигенность оставалась неизменной (Romero & Outschoorn, 1994, "Current status of Meningococcal group В vaccine candidates: capsular or non-capsular?", Clin. Microbiol. Rev., 7 (4), 559-575).

В альтернативных подходах к вакцинам против МеnВ использовали комплексные смеси белков внешней мембраны (белков ОМР), содержащие как только ОМР, так и ОМР, обогащенные поринами, либо освобожденные от ОМР 4-го класса, которые, как считается, индуцируют выработку антител, блокирующих бактерицидную активность. В указанном подходе получают вакцины, которые пока подробно не исследованы. Они способны защищать от гомологичного штамма, но неэффективны в полном объеме тогда, когда существуют многочисленные антигенные варианты белков внешней мембраны. Для преодоления антигенной вариабельности были сформированы мультивалентные вакцины, содержащие вплоть до девяти различных поринов (например, J.T.Poolman, 1992, "Development of a meningococcal vaccine". Infect. Agents Dis., 4, 13-28). Дополнительными белками, предназначенными для использования в вакцинах с внешнемембранными белками, являются белки “ора” и “орс”, однако ни один из указанных подходов был не способен преодолеть антигенную вариабельность (например, Ala’Aldeen & Borriello, 1996, "The meningococcal transferring-binding proteins 1 and 2 are both surface exposed and generate bactericidal antibodies capable of killing homologous and heterologous strains". Vaccine, 14 (1), 49-53).

По генам и белкам менингококка и гонококка доступен некоторый объем информации о последовательностях (например, европейская патентная заявка ЕР А-0-467714, международная патентная заявка WO 96/29412), однако она ни в коей мере не является полной. Представление новых последовательностей способно дать возможность идентифицировать секретируемые или находящиеся на внешней клеточной поверхности белки, которые являются потенциальными мишенями для иммунной системы и которые не являются вариабельными по антигенным свойствам или по крайней мере оказываются более консервативными антигенами по сравнению с другими более вариабельными сегментами. Таким образом, предпочтительны такие антигенные последовательности, которые в наибольшей степени консервативны. Далее предпочтительными последовательностями являются те последовательности, специфичные для Neisseria meningitidis или Neisseria gonorrhoeae, которые более высококонсервативны. Например, некоторые из идентифицированных белков могут служить компонентами эффективных вакцин против менингококка-В, некоторые - компонентами вакцин против всех серотипов менингококка, а другие - компонентами вакцин против всех патогенных нейссерий. Идентификация последовательностей у бактерии также должна облегчить формирование биологических зондов, в частности зондов, специфичных для организма.

Таким образом, объектом настоящего изобретения является представление последовательностей ДНК нейссерий, которые: (1) кодируют белки, для которых предсказывается и/или демонстрируется антигенность или иммуногенность; (2) могут быть использованы в качестве зондов или праймеров для амплификации;

и (3) могут быть проанализированы биоинформационными методами.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 изображены продукты экспрессии и очистки белка предсказанной ORF 919 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.

На фиг.2 изображены продукты экспрессии и очистки белка предсказанной ORF 279 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.

На фиг.3 изображены продукты экспрессии и очистки белка предсказанной ORF 576-1 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.

На фиг.4 изображены продукты экспрессии и очистки белка предсказанной ORF 519-1 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.

На фиг.5 изображены продукты экспрессии и очистки белка предсказанной ORF 121-1 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.

На фиг.6 изображены продукты экспрессии и очистки белка предсказанной ORF 128-1 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.

На фиг.7 изображены продукты экспрессии и очистки белка предсказанной ORF 206 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.

На фиг.8 изображены продукты экспрессии и очистки белка предсказанной ORF 287 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.

На фиг.9 изображены продукты экспрессии и очистки белка предсказанной ORF 406 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.

На фиг.10 показаны график гидрофильности, антигенный индекс и амфипатичные участки продуктов экспрессии белка предсказанной ORF 919 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.

На фиг.11 показаны график гидрофильности, антигенный индекс и амфипатичные участки продуктов экспрессии белка предсказанной ORF 279 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.

На фиг.12 показаны график гидрофильности, антигенный индекс и амфипатичные участки продуктов экспрессии белка предсказанной ORF 576-1 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.

На фиг.13 показаны график гидрофильности, антигенный индекс и амфипатичные участки продуктов экспрессии белка предсказанной ORF 519-1 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.

На фиг.14 показаны график гидрофильности, антигенный индекс и амфипатичные участки продуктов экспрессии белка предсказанной ORF 121-1 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.

На фиг.15 показаны график гидрофильности, антигенный индекс и амфипатичные участки продуктов экспрессии белка предсказанной ORF 128-1 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.

На фиг.16 показаны график гидрофильности, антигенный индекс и амфипатичные участки продуктов экспрессии белка предсказанной ORF 206 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.

На фиг.17 показаны график гидрофильности, антигенный индекс и амфипатичные участки продуктов экспрессии белка предсказанной ORF 287 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.

На фиг.18 показаны график гидрофильности, антигенный индекс и амфипатичные участки продуктов экспрессии белка предсказанной ORF 406 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.

Изобретение

Первая полная последовательность генома N.meningitidis была заявлена в виде 961 частичных непрерывных нуклеотидных последовательностей, показанных в SEQ ID NO 1-961 в заявке тех же авторов PCT/US 99/23573 (заявка ‘573), поданной 8 октября 1999 г. (должна быть опубликована в апреле 2000 г.).

Полноразмерный геном N. meningitidis в виде единой последовательности также был заявлен в SEQ ID NO 1068 заявки ‘573. Изобретение основывается на полноразмерном геноме N.meningitidis, который приведен в SEQ ID NO 1 настоящей заявки в приложении А к ней. 961 последовательность заявки ‘573 по существу охватывают полный геном N.meningitidis серотипа В (>99,98%). Имеется частичное перекрывание между некоторыми из 961 непрерывной последовательности (“контиги”), показанное в 961 последовательности, причем перекрывание использовали для формирования единой полноразмерной последовательности, показанной в SEQ ID NO 1 в приложении А настоящей заявки, с использованием алгоритма TIGR Assembler [G.S.Sutton et al., 1995, "TIGR Assembler: A new tool for assembling large shotgun sequencing projects", Genome Science & Technology, 1, 9-19]. Некоторые нуклеотиды в указанных контигах ранее были опубликованы (см. международную компьютерную сеть "www" по адресу ftp:llftp.tigr.org/pub/data/n_meningitidis). Координаты 2508 опубликованных последовательностей в представленных контигах приведены в приложении А заявки ‘573. Указанные данные включают номер контига (или идентификатор “ID”), приведенный в первом столбце, название последовательности в соответствии с указанным в Интернете, показано во второй колонке; координаты контигов - в третьей или четвертой колонках, соответственно. Последовательности некоторых ORFs MenB, приведенные в приложении В заявки ‘573, отображены в международной патентной заявке, поданной Chiron SpA 9 октября 1998 г. (PCT/IB 98/01665) и 14 января 1999 г. (РСТ/IB 99/00103), соответственно. Приложение В к настоящей заявке представляет список 2158 открытых рамок считывания, находящихся в пределах полноразмерной последовательности, показанной здесь в SEQ ID NO 1 в приложении А. Информация, включенная в приложение В к настоящей заявке, охватывает наименование последовательности “NMB”, предполагаемый продукт трансляции и положения начального и заключительного нуклеотида в составе SEQ ID NO 1, которые охватывают открытые рамки считывания. В данном тексте указанные открытые рамки считывания обозначены как “открытые рамки считывания NMB”.

В первом аспекте настоящее изобретение представляет нуклеиновую кислоту, включающую нуклеотидную последовательность N.meningitidis, показанную здесь в SEQ ID NO 1 в приложении А. Также оно представляет нуклеиновую кислоту, включающую последовательности, характеризующиеся идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, заявленной здесь. В зависимости от конкретной последовательности степень идентичности последовательностей предпочтительно превышает 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или больше). Указанные последовательности охватывают, например, мутантные и аллельные варианты. Степень идентичности последовательностей, упоминавшуюся здесь, определяют по всей длине последовательности с применением алгоритма поиска гомологии по Смиту-Уотерману, использованного в программе MPSRCH (Oxford Molecular), в которой ведется поиск аффинных пробелов при следующих установках: штраф за открытие пробела - 12, штраф за продолжение пробела - 1.

Также настоящее изобретение представляет нуклеиновую кислоту, включающую фрагмент одной или нескольких нуклеотидных последовательностей, приведенных здесь, включая открытые рамки считывания NMB, показанные в приложении В к настоящей заявке. Фрагмент должен включать по крайней мере “n” расположенных подряд нуклеотидов из состава последовательностей: в зависимости от конкретной последовательности n равно 10 или больше (например, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 75, 100 или больше). Предпочтительно фрагмент уникален для генома N.meningitidis, т.е. он, например, отсутствует в геноме другого организма. Более предпочтительно фрагмент уникален для генома N.meningitidis штамма В. Также настоящее изобретение представляет нуклеиновую кислоту, которая гибридизует с тем, что предусмотрено в данном тексте. Условия гибридизации описаны в настоящей заявке.

Также настоящее изобретение представляет нуклеиновую кислоту, включающую последовательности, комплементарные тем последовательностям, которые были описаны выше (например, для антисмысловых конструкций, для зондов или для амплификационных праймеров).

Понятно, что нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть получена различными путями (например, с помощью химического синтеза, из ДНК-библиотек, непосредственно от организма и т.п.) и может принимать различные формы (например, одноцепочечную, двухцепочечную, форму векторов, зондов, праймеров и т.п.). Термин “нуклеиновая кислота” охватывает ДНК и РНК, а также их аналоги, такие как те, которые включают модифицированный скелет, а также пептид-нуклеиновая кислота (ПНК) и т.п.

Должно быть понятно, что, с учетом охвата последовательностями SEQ ID NO 1-961 заявки ‘573 по существу полного генома организма и некоторого перекрывания, обращение к SEQ ID NO 1-961 заявки ‘573 включает в объем указанной ссылки полную геномную последовательность, т.е. SEQ ID NO 1 из настоящей заявки. Например, когда две SEQ ID NO перекрываются, изобретение охватывает единую последовательность, которая образована в результате сочетания двух перекрывающихся последовательностей, причем полную последовательность можно будет найти в SEQ ID NO 1. Следовательно, например, нуклеотидная последовательность, которая объединяет две SEQ ID NO, но в своей полноте не присутствует в любой из SEQ ID NO, также попадает в объем настоящего изобретения. Такая последовательность будет присутствовать полностью в составе единой полноразмерной последовательности SEQ ID NO 1 в соответствии с настоящей заявкой.

Настоящее изобретение также предусматривает векторы, включающие нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению (например, экспрессирующие векторы, секвенационные векторы, клонирующие векторы и т.п.), и клетки-хозяева, трансформированные указанными векторами.

В соответствии со следующим аспектом изобретение представляет белок, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую приведенной здесь нуклеотидной последовательностью N.meningitidis. Также оно предусматривает белки, включающие последовательности, которые проявляют идентичность по последовательности с указанными белками. В зависимости от конкретной последовательности степень идентичности последовательностей предпочтительно превышает 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или больше). Идентичность последовательностей определяют в соответствии с описанным здесь выше. Такие гомологичные белки охватывают мутантные и аллельные варианты, кодируемые приведенными в данном тексте нуклеотидными последовательностями N.meningitidis.

Далее настоящее изобретение представляет белки, включающие фрагменты аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью N.meningitidis, приведенной в списке последовательностей. Фрагменты должны включать по крайней мере “n” расположенных подряд аминокислот из последовательностей: в зависимости от конкретной последовательности n составляет 7 или больше (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или больше). Предпочтительно фрагменты включают эпитоп из состава последовательности.

Понятно, что белки по настоящему изобретению могут быть получены различными путями (например, в результате рекомбинантной экспрессии, очистки из клеточной культуры, химического синтеза и т.п.) и в различных формах (например, нативной, в форме химер и т.п.). Предпочтительно их получают в существенно изолированной форме (т.е. по существу свободными от других белков клетки-хозяина N.meningitidis).

Различные тесты могут быть использованы для оценки in vivo иммуногенности белков по настоящему изобретению. Например, белки могут быть экспрессированы рекомбинантным путем или химически синтезированы с последующим использованием для скрининга сывороток пациентов с помощью иммуноблоттинга. Положительное взаимодействие между белком и сывороткой пациента указывает на то, что пациент ранее сформировал иммунный ответ на анализируемый белок: т.е. белок иммуногенен. Данный способ также можно использовать для идентификации иммунодоминантных белков.

Также настоящее изобретение предусматривает нуклеиновую кислоту, кодирующую белок по настоящему изобретению.

В следующем аспекте изобретение представляет компьютер, компьютерную память, компьютерный носитель (например, дискету, винчестер, CD-ROM и т.п.) и/или компьютерную базу данных, содержащие информацию о нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Предпочтительно имеется информация об одной или большем числе приведенных в данной заявке нуклеотидных последовательностей N.meningitidis.

Указанное можно использовать для анализа приведенных здесь нуклеотидных последовательностей N.meningitidis. Например, указанное можно использовать для идентификации открытых рамок считывания (ORF) или кодирующих последовательностей в составе последовательности.

Еще в одном аспекте изобретение предусматривает способ идентификации аминокислотной последовательности, включающий стадию поиска потенциальных открытых рамок считывания или кодирующих белок последовательностей в пределах приведенной здесь нуклеотидной последовательности N.meningitidis. Сходным образом изобретение предусматривает использование приведенной здесь нуклеотидной последовательности N.meningitidis в поиске потенциальных открытых рамок считывания или последовательностей, кодирующих белок.

Анализ открытой рамки считывания или кодирующей белок последовательности обычно осуществляют на компьютере с использованием стандартных биоинформационных технологий. Типичными алгоритмами или программами для такого анализа являются ORFFINDER (NCBI), GENMARK [Borodovsky & McIninch, 1993, Computers Chem., 17, 122-133] и GLIMMER [Salzberg et al., 1998, Nucl. Acids Res., 26, 544-548].

Поиск открытой рамки считывания или кодирующей белок последовательности может включать стадии поиска в приведенной здесь нуклеотидной последовательности N.meningitidis старт-кодона и поиска в последовательности внутрирамочного стоп-кодона. Расположенные между ними кодоны представляют собой потенциальную кодирующую белок последовательность. Обычно поиску должны быть подвергнуты все шесть возможных открытых рамок.

Идентифицированную таким путем аминокислотную последовательность можно проэкспрессировать с использованием любой подходящей системы для получения белка. Такой белок можно использовать для формирования антител, которые распознают эпитопы в пределах идентифицированной аминокислотной последовательности. Такие антитела могут быть использованы для скрининга N.meningitidis с выявлением присутствия белка, включающего идентифицированную аминокислотную последовательность.

Кроме того, после идентификации ORF или кодирующей белок последовательности можно провести сравнение последовательности с базами данных по последовательностям. Средства для анализа последовательностей можно найти у NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), например, алгоритмы BLAST, BLAST2, BLASTn, BLASTp, tBLASTn, BLASTx и tBLASTx [см. также Altschul et al., 1997, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Research, 25, 2289-3402]. Подходящими для сравнения базами данных являются недублированные последовательности из GenBank, EMBL, DDBJ и PDB и недублированные последовательности из CDS-трансляций GenBank, PDB, SwissProt, Spupdate и PIR. Данное сравнение может указывать на функцию белка.

Гидрофобные домены в аминокислотной последовательности могут быть предсказаны с использованием таких алгоритмов, как основанные на статистических анализах алгоритмы от Esposti et al. ["Critical evaluation of the hydropathy of membrane proteins" (1990), Eur. J. Biochem., 190, 207-219]. Гидрофобные домены представляют собой потенциальные трансмембранные участки или гидрофобные сигнальные последовательности: это предполагает, что белки могут секретироваться или выноситься на поверхность клетки. Указанные свойства обычно характерны для эффективных иммуногенов.

Сходным образом трансмембранные домены или сигнальные последовательности могут быть предсказаны с использованием алгоритма PSORT (http://www.psort.nibb.ac.jp), а функциональные домены могут быть предсказаны с использованием программы MOTIFS (GCG Wisconsin & PROSITE).

Также настоящее изобретение представляет нуклеиновую кислоту, которая включает открытую рамку считывания или кодирующую белок последовательность, имеющуюся в приведенной здесь нуклеотидной последовательности N.meningitidis. Кроме того, изобретение предусматривает белок, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую данной открытой рамкой считывания или кодирующей белок последовательностью.

В соответствии со следующим аспектом настоящее изобретение представляет антитела, которые связываются с указанными белками. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными и могут быть получены с помощью любого подходящего способа, известного специалистам в данной области техники.

Антитела по настоящему изобретению можно использовать различным образом, например, для подтверждения экспрессированности белка или для установления того, где белок экспрессируется. Помеченное антитело (например, флуоресцентно помеченное для метода FACS) можно проинкубировать с интактными бактериями: присутствие метки на поверхности бактерии подтверждает, например, локализацию белка.

В соответствии со следующим аспектом настоящее изобретение представляет композиции, содержащие белок, антитело и/или нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Указанные композиции могут быть пригодными в качестве вакцин, в качестве иммуногенных композиций или в качестве диагностических реагентов.

Также настоящее изобретение предусматривает нуклеиновую кислоту, белок или антитело по настоящему изобретению для использования в качестве лекарственных средств (например, в качестве вакцин) или в качестве диагностических реагентов. Также оно предусматривает использование нуклеиновой кислоты, белка или антитела по настоящему изобретению в производстве: (i) лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции нейссериями и (ii) диагностического реагента для установления присутствия бактерий Neisseria или антител, образовавшихся к нейссериям. Упомянутые бактерии Neisseria могут относиться к любому виду или штамму (такому как N.gonorrhoeae), но предпочтительно N.meningitidis, особенно штамму А, штамму В или штамму С.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение представляет композиции, содержащие белки, молекулы нуклеиновых кислот или антитела. Более предпочтительные аспекты настоящего изобретения связаны с иммуногенными композициями белков. Далее предпочтительные аспекты настоящего изобретения предусматривают фармацевтические иммуногенные композиции белков или вакцины, а также их использование в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции нейссериями, предпочтительно инфекции МеnВ.

Также изобретение представляет способ лечения пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты, белка и/или антитела по настоящему изобретению.

В соответствии со следующими аспектами изобретение предусматривает различные способы.

Представляется способ получения белков по настоящему изобретению, включающий стадию культивирования клетки-хозяина в соответствии с настоящим изобретением в условиях, при которых индуцируется экспрессия белка. Способ, который может дополнительно включать химический синтез белков и/или химический синтез (по крайней мере отчасти) нуклеотидов.

Представляется способ выявления полинуклеотидов по настоящему изобретению, включающий стадии: (а) контактирование нуклеотидного зонда по настоящему изобретению с биологическим образцом в условиях гибридизации с образованием дуплексов и (b) выявление упомянутых дуплексов.

Представляется способ выявления белков по настоящему изобретению, включающий стадии: (а) контактирование антитела по настоящему изобретению с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплексов “антиген-антитело” и (b) выявление упомянутых комплексов.

В другом аспекте настоящее изобретение представляет способ выявления антител, которые избирательным образом связываются с антигенами или полипептидами, или белками, специфичными для какого-либо вида или штамма бактерий Neisseria и предпочтительно для штаммов N.gonorrhoeae, но более предпочтительно для штаммов N.meningitidis, особенно для штамма А, штамма В или штамма С, более предпочтительно МеnВ, причем способ включает стадии: (а) контактирование антигена или полипептида, или белка по настоящему изобретению с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплексов “антиген-антитело”, и (b) выявление упомянутых комплексов.

Имея общее описание изобретения, указанное может быть более полно понято путем отсылки к нижеследующим примерам, которые приведены с иллюстративной целью и не призваны ограничить настоящее изобретение, за исключением специально оговариваемых случаев.

Методология. Краткое описание стандартных процедур и методов

Общие замечания

Настоящее изобретение представляет нуклеотидные последовательности Neisseria meningitidis MenB и кодируемые ими аминокислотные последовательности. На основе описанных последовательностей могут быть сформированы тесты с нуклеотидными зондами, а также экспрессионные кассеты и векторы. Также белки могут быть синтезированы химическим путем. Экспрессирующими векторами можно трансформировать клетки-хозяева с целью выработки белков. Очищенные или изолированные полипептиды можно использовать для получения антител, предназначенных для выявления белков МеnВ. Также клетки-хозяева или экстракты могут быть использованы в биотестах для выделения агонистов или антагонистов. Кроме того, с помощью указанных последовательностей можно идентифицировать открытые рамки считывания и идентифицировать аминокислотные последовательности. Также белки могут быть использованы в иммуногенных композициях и в качестве компонентов вакцин.

В практике настоящего изобретения будут использованы, если это специально не оговаривается, стандартные методы молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые известны специалистам в данной области техники. Такие методы полностью охарактеризованы в литературе, например, у Sambrook, 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2d Edition; "DNA Cloning" Volumes I and II (D.N.Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J.Gait ed., 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B.D.Hames & S.J.Higgins eds., 1984); "Transcription and Translation" (B.D.Hames & S.J.Higgins eds., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I.Freshney ed., 1986); "Immobilized Cells and Enzymes" (IRL Press, 1986); B.Perbal, 1984, "A Practical Guide to Molecular Cloning"; периодические выпуски "Methods in Enzymology" (Academic Press Inc.), в частности, тома 154 и 155; "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.H.Miller & M.P.Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer & Walker eds., 1987, "Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology" (Academic Press, London); Scopes, 1987, "Protein Purification: Principles and Practice", 2d Edition (Springer-Verlag, NY); и "Handbook of Experimental Immunology", Volumes I-IV (D.M.Weir & C.C.Blackwell, 1986).

В настоящей заявке для нуклеотидов и аминокислот используются стандартные аббревиатуры.

Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в данном тексте, в полном объеме включены в виде библиографических ссылок.

Экспрессионные системы

Нуклеотидные последовательности Neisseria MenB могут быть экспрессированы в ряде различных экспрессионных систем: например, для этой цели используются клетки млекопитающих, растительные клетки, бакуловирусы, бактерии и дрожжи.

i. Системы клеток млекопитающих

Экспрессионные системы на основе клеток млекопитающих хорошо известны в данной области техники. Промотором для клеток млекопитающих может служить любая последовательность ДНК, способная связывать РНК-полимеразу млекопитающих, инициируя тем самым транскрипцию нижерасположенной (т.е. в 3’-сторону) кодирующей последовательности (например, структурного гена) с образованием мРНК. Промотор должен включать сайт инициации транскрипции, который обычно располагается проксимально по отношению к 5’-концу кодирующей последовательности, а также бокс ТАТА, обычно находящийся в 25-30 парах нуклеотидах (п.н.) выше сайта инициации транскрипции. Считается, что бокс ТАТА обеспечивает контролируемое РНК-полимеразой II начало синтеза РНК в правильном участке. Промотор клеток млекопитающих также должен включать расположенный выше промоторный элемент, обычно находящийся в 100-200 п.н. выше бокса ТАТА. Верхний промоторный элемент определяет скорость, с которой инициируется транскрипция, и может быть активен в любой ориентации (Sambrook et al., 1989, "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells", In "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2d ed.).

Гены вирусов млекопитающих обычно характеризуются интенсивной экспрессируемостью и характеризуются широким кругом хозяев: следовательно, последовательности, кодирующие гены вирусов млекопитающих, представляют особенно полезные промоторные последовательности. Примерами являются промотор ранних генов вируса SV40, промотор LTR вируса опухоли молочной железы мыши, промотор главного позднего гена аденовируса (AdMLP) и промотор вируса простого герпеса. Кроме того, последовательности, производные от невирусных генов, таких как ген металлотионеина мыши, также представляют полезные промоторные последовательности. Экспрессия может быть как конститутивной, так и регулируемой (индуцибельной). В зависимости от выбранного промотора многие промоторы могут быть индуцированы с использованием известных субстратов, например, используя промотор вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV) с элементом взаимодействия с глюкокортикоидами (GRE), который индуцируется глюкокортикоидом в реагирующих на гормоны трансформированных клетках (см., например, патент США №5783681).

Присутствие “усиливающего” элемента (энхансера), объединенного с промоторными элементами, описанными выше, обычно должно усиливать экспрессию. Энхансер - это регуляторная последовательность ДНК, которая способна стимулировать транскрипцию до тысячекратного усиления в случае соединения с гомологичными или гетерологичными промоторами, при том, что синтез РНК начинается в нормальном инициирующем сайге. Энхансеры также активны тогда, когда они помещаются или выше, или ниже сайта инициации транскрипции, как в нормальной, так и в инвертированной ориентации, или на расстоянии больше 1000 п.н. от самого промотора (Maniatis et al., 1987, Science, 236, 1237; Alberts et al., 1989, "Molecular Biology of the Cell", 2d ed.). В частности, могут быть использованы энхансерные элементы, происходящие от вирусных геномов, поскольку они обычно характеризуются более широким кругом потенциальных хозяев. Примерами являются энхансер раннего гена вируса SV40 (Dijkema et al., 1985, EMBO J., 4, 761) и система “энхансер+промотор”, производная от участка длинных концевых повторов (LTR) вируса саркомы Рауса (German et al., 1982b, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6777) и цитомегаловируса человека (Boshart et al., 1985, Cell, 41, 521). Кроме того, некоторые энхансеры являются регулируемыми и становятся активными только в присутствии индуктора, такого как гормон или ион металла (Sassone-Corsi & Borelli, 1986, Trends Genet., 2, 215; Maniatis et al., 1987, Science, 236, 1237).

Молекула ДНК может быть экспрессирована внутри клеток млекопитающих. Промоторная последовательность может быть напрямую присоединена к молекуле ДНК: в этом случае первая с N-конца аминокислота в составе рекомбинантного белка всегда должна быть метионином, который кодируется старт-кодоном ATG. Если желательно, N-концевая часть может быть отщеплена от белка путем инкубации in vitro с бромцианом.

Как альтернатива, чужеродные белки также могут секретироваться из клетки в питательную среду в результате создания химерных молекул ДНК, которые кодируют химерный белок, включающий лидерный (сигнальный) сегмент, обеспечивающий секрецию чужеродного белка клетками млекопитающих. Предпочтительным является наличие сайтов процессинга между лидерным сегментом и чужеродным геном, которые могут быть расщеплены либо in vivo, либо in vitro. Лидерная последовательность обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот и обеспечивающий секрецию белка из клетки. Аденовирусный трехраздельный лидерный сегмент является примером лидерной последовательности, обеспечивающей секрецию чужеродного белка клетками млекопитающих.

Обычно терминаторы транскрипции и полиадениловые последовательности, распознаваемые клетками млекопитающих, являются регуляторными сегментами, расположенными с 3’-стороны от стоп-кодона, т.е., наряду с промоторными элементами, фланкируют кодирующую последовательность. 3’-Конец зрелой мРНК образуется в результате сайт-специфичного посттранскрипционного расщепления и полиаденилирования (Birnstiel et al., 1985, Cell, 41, 349; Proudfoot & Whitelaw, 1988, "Termination and 3’ end processing of eukaryotic RNA", In "Transcription and splicing", eds. B.D.Hames & D.M.Glover; Proudfoot, 1989, Trends Biochem. Sci., 14, 105). Указанные последовательности обеспечивают транскрипцию мРНК, которая затем может быть транслирована в полипептид, кодируемый исходной ДНК. Примерами сигналов терминации транскрипции и полиаденилирования являются мотивы, происходящие из генома вируса SV40 (Sambrook et al., 1989, "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells". In "Molecular Cloning: A Laboratory Manual").

Обычно описанные выше компоненты, включая промотор, сигнал полиаденилирования и сайт терминации транскрипции, встраивают в состав экспрессирующих конструкций одновременно. Энхансеры, интроны, включающие функциональные донорные и акцепторные сайты сплайсинга, и лидерные последовательности могут быть также включены в экспрессирующую конструкцию, если это желательно. Экспрессирующие конструкции часто поддерживаются в виде репликона, т.е. внехромосомного элемента (например, плазмиды), способного стабильно сохраняться в организме-хозяине, таком как клетки млекопитающего или бактерия. Репликационные системы для млекопитающих включают системы, происходящие от вирусов животных, для репликации которых необходимо участие транс-регулирующих факторов. Например, плазмиды, включающие репликационные систем