Белок, полученный из neisseria meningitidis, проявляющий свойства антигена, антитело, фрагмент нуклеиновой кислоты (варианты) и содержащая их композиция

Белок, полученный из neisseria meningitidis, проявляющий свойства антигена, антитело, фрагмент нуклеиновой кислоты (варианты) и содержащая их композиция

Реферат

 

Настоящее изобретение относится к белкам бактерии Neisseria meningitidis (штаммов А и В). Заявлен белок, полученный из Neisseria meningitidis с аминокислотной последовательностью, приведенной в описании, проявляющий свойства антигена; заявлено антитело, которое связывается с указанным белком. Приведены фрагменты нуклеиновой кислоты, кодирующие указанный белок. Белок использован для изготовления вакцины, фармацевтических и диагностических композиций. Изобретение позволяет повысить эффективность препаратов, используемых для диагностики, лечения и предупреждения инфекций, вызываемых Neisseria meningitidis. 5 с. и 7 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл.

Настоящее изобретение относится к антигенам, происходящим от бактерии Neisseria meningitidis.

Предпосылки создания изобретения

Neisseria meningitidis представляет собой неподвижный грам-отрицательный диплоккоковый патоген человека. Он образует колонии в глотке, вызывая менингит, а в некоторых случаях сепсис при отсутствии менингита. Эта бактерия является близкородственной бактерии N. gonorrhoeae, хотя имеется один отличительный признак, который позволяет четко дифференцировать менингококк от гонококка и который заключается в том, что все патогенные менингококки имеют полисахаридную капсулу.

N. meningitidis вызывает как эндемические, так и эпидемические заболевания. В Соединенных Штатах заболеваемость составляет 0,6-1 случаев на 100000 человек в год, а во время эпидемий она может быть гораздо выше (см. Lieberman et al. (1996) Safety and Immunogenicity of a Sero-groups A/C Neisseria meningitidis Oligosaccharide-Protein Conjugate Vaccine in Young Children. JAMA 275(19):1499-1503; Schuchat et al. (1997) Bacterial Meningitidis in the United States in 1995. N. Engl. J. Med. 337(14):970-976). В развивающихся странах частота эндемических заболеваний гораздо выше, а во время эпидемий заболеваемость может достигать 500 случаев на 100000 человек в год. Смертность от этого заболевания чрезвычайно высока, например в Соединенных Штатах она составляет 10-20%, а в развивающихся странах еще выше. После получения конъюгатной вакцины против Haemophilus influenzae N.meningitidis является главным возбудителем бактериального менингита во всех возрастных группах в Соединенных Штатах (Schuchat et al. (1997) см. выше).

Исходя из наличия инкапсулированного полисахарида у данного микроорганизма, были идентифицированы 12 серологических групп N.meningitidis. Микроорганизм Группы А является патогеном, наиболее часто приводящим к эпидемическим заболеваниям в регионах Африки, простирающихся ниже Сахары. Серологические Группы В и С ответственны за подавляющее большинство случаев возникновения данных заболеваний в Соединенных Штатах и в большинстве развитых стран. В остальных случаях возникновения этого заболевания в Соединенных Штатах и в развитых странах ответственны серологические группы W135 и Y. Используемая в настоящее время менингококковая вакцина представляет собой тетравалентную полисахаридную вакцину, представленную серологическими группами А, С, Y и W135. Несмотря на эффективность этой вакцины для подростков и взрослых, она индуцирует недостаточный иммунный ответ и непродолжительное время действия, а поэтому не может быть использована для детей [см., например, Morbidity and Mortality weekly report. Vol. 46, №RR-5 (1997)]. Это обусловлено тем, что полисахариды представляют собой Т-клеточно-независимые антигены, индуцирующие слабый иммунный ответ, который не может быть усилен путем проведения повторной иммунизации. После успешного проведения вакцинации от Н. influenzae были разработаны конъюгатные вакцины против серологических групп А и С, которые были использованы на заключительном этапе клинического испытания (Zollinger WD "New and Improved Vaccines Against Meningococcal Disease" in: New Generation Vaccines, supra, pp 469-488; Lieberman et al. (1996) supra; Costantino et al. (1992) Development and phase I clinical testing of a conjugate vaccine against meningococcus А и С. Vaccine 10:691-698).

Однако использование Meningococcus В связано с определенными проблемами. Этот используемый в настоящее время серотип ответственен приблизительно за 50% всех заболеваний менингита в Соединенных Штатах, в Европе и в Южной Америке. Метод на основе полисахарида не может быть использован, поскольку капсулярный полисахарид menB является полимером (2-8)-связанной N-ацетилнейраминовой кислоты, которая также присутствует в тканях млекопитающих. Это приводит к толерантности к данному антигену; и действительно, при вырабатывании иммунного ответа он может действовать против самого себя, а это является нежелательным фактором. Во избежание индуцирования аутоиммунного ответа и в целях индуцирования защитного иммунного ответа капсулярный полисахарид был, например, химически модифицирован так, что в нем N-ацетильные группы были заменены N-пропионильными группами, но при этом специфическая антигенность оставалась неизмененной (Romero & Outschoorn. (1994) Current status of Meningococcal group В vaccine candidates: capsular or non-capsular? Clin. Microbiol. Rev. 7(4):559-575).

В качестве вакцин, альтернативных вакцинам на основе menB, были использованы комплексные смеси внешних мембранных белков (OMPs), содержащих один ОМР или ОМР, обогащенный поринами, либо не содержащих ОМР класса 4, которые, очевидно, индуцируют антитела, блокирующие бактерицидную активность. Этот подход позволяет продуцировать вакцины, которые еще недостаточно охарактеризованы. Они способны обеспечивать защиту от гомологичного штамма, но в основном они не эффективны в том случае, когда присутствует множество антигенных вариантов внешних мембранных белков. Для преодоления антигенной изменчивости были сконструированы мультивалентные вакцины, содержащие вплоть до девяти различных поринов (см., например, Poolman J.T. (1992) Development of a meningococcal vaccine. Infect. Agents Dis. 4:13-28). Другими белками, используемыми в вакцинах на основе внешних мембран, были белки ора и орс, но ни один из этих вариантов не позволял преодолеть антигенную изменчивость (см., например, Ala’ Aldeen & Borriello (1996) The meningococcal transferrin-binding proteins 1 and 2 are both surface exposed and generated bactericidal antibodies capable of killing homologous and heterologous strains. Vaccine 14 (1):49-53).

Существуют некоторые данные о последовательностях для менингококковых и гонококковых генов и белков (например, ЕР-А-0467714, WO 96/29412), но эти данные являются неполными. Выявление других последовательностей дает возможность идентифицировать секретированный белок или белок, экспонированный на поверхности, которые, предположительно, являются мишенями для иммунной системы и которые не является антигенно вариабельными. Например, некоторые из этих идентифицированных белков могут быть компонентами эффективных вакцин против meningococcus В, некоторые из них могут быть компонентами вакцин против всех серотипов менингококков, а другие белки могут быть компонентами вакцин против всех патогенных Neisseriae.

Настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к белкам, содержащим аминокислотные последовательности N.meningitidis, описанные в примерах.

Настоящее изобретение также относится к белкам, содержащим последовательности, которые являются гомологичными (т.е. имеющие идентичные последовательности) аминокислотным последовательностям N. meningitidis, описанным в примерах. В зависимости от конкретной последовательности степень идентичности последовательности предпочтительно выше 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более). Такими гомологичными белками являются мутанты и аллельные варианты последовательностей, описанных в примерах. Обычно считается, что идентичность двух белков, составляющая 50% или более, является показателем их функциональной эквивалентности. Идентичность белков предпочтительно определяют с помощью алгоритма поиска гомологии Smith-Waterman, выполняемого в программе MPSRCH (Oxford Molecular) с проведением поиска аффинных брешей с параметрами: "штраф на брешь-пропуск" = 12 и "штраф на брешь-удлинение" = 1.

Настоящее изобретение также относится к белкам, содержащим фрагменты аминокислотных последовательностей N.mеningitidis, описанных в примерах. Эти фрагменты могут содержать, по крайней мере, n следующих подряд друг за другом аминокислот из этих последовательностей, и, в зависимости от конкретной последовательности, n равно 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или более). Предпочтительно, чтобы фрагменты содержали эпитоп от этой последовательности.

Само собой разумеется, что белки настоящего изобретения могут быть получены различными способами (например, путем экспрессии рекомбинантных последовательностей, очистки из клеточных культур, химического синтеза и т.п.) и в различных формах (например, в нативной, в гибридной форме и т.п.). Предпочтительно эти белки получают, в основном, в чистом виде (т.е. в форме, в основном, не содержащей других белков N.meningitidis или белков клеток хозяина).

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с этими белками. Этими антителами могут быть поликлональные или моноклональные антитела, которые могут быть получены любыми подходящими способами.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидные последовательности N.meningitidis, описанные в примерах. Кроме того, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательности, гомологичные (т.е. имеющие идентичность в последовательности) нуклеотидным последовательностям N.meningitidis, описанным в примерах.

Кроме того, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая может гибридизоваться с нуклеиновой кислотой N.meningitidis, описанной в примерах, предпочтительно в условиях "высокой жесткости" (например, при 65С в растворе 0,1SSC, 0,5% ДСН).

Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, содержащей фрагменты этих последовательностей. Эти фрагменты могут содержать, по крайней мере, n следующих подряд друг за другом нуклеотидов от последовательностей N.meningitidis, и, в зависимости от конкретной последовательности, n равно 10 или выше (например, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 или более).

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей белки и фрагменты белков настоящего изобретения.

Следует также отметить, что настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательности, комплементарные последовательностям, описанным выше (например, для получения антисмысловой последовательности или для зондирования).

Нуклеиновая кислота настоящего изобретения может быть получена различными способами (например, посредством химического синтеза, из геномной или кДНК-библиотек, из самого микроорганизма и т.п.) и может иметь различные формы (например, одноцепочечную, двухцепочечную, векторы, зонды и т.п.).

Кроме того, термин "нуклеиновая кислота" означает ДНК и РНК, а также их аналоги, такие как аналоги, содержащие модифицированные остовы, а также пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК) и т.п.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к векторам, содержащим нуклеотидные последовательности настоящего изобретения (например, экспрессирующие векторы) и клетки-хозяева, трансформированные такими векторами.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композициям, содержащим белок, антитело и/или нуклеиновую кислоту настоящего изобретения. Эти композиции могут быть получены, например, в виде вакцин или в виде диагностических реагентов, либо в виде иммуногенных композиций.

Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, белку или антителу настоящего изобретения для использования в качестве лекарственных препаратов (например, в качестве вакцин) или в качестве диагностических реагентов. Настоящее изобретение также относится к использованию нуклеиновой кислоты, белка или антитела настоящего изобретения в целях изготовления (i) лекарственного средства для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой бактериями Neisserial; (ii) диагностического реагента для обнаружения присутствия бактерии Neisserial или антител, вырабатываемых против бактерии Neisserial; и/или (iii) реагента, который может способствовать продуцированию антител против бактерии Neisserial. Указанными бактериями Neisserial могут быть бактерии любого вида или штамма (такие как N.gonorrhoeae), а предпочтительно N.meningitidis, в частности штамма А, штамма В или штамма С.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения пациента, предусматривающему введение пациенту терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты, белка и/или антитела настоящего изобретения.

В соответствии с другим своим аспектом настоящее изобретение относится к различным способам.

Настоящее изобретение относится к способу продуцирования белков, предусматривающему проведение стадии культивирования клетки-хозяина настоящего изобретения в условиях, благоприятствующих индуцированию экспрессии белка.

Настоящее изобретение относится к способу продуцирования белка или нуклеиновой кислоты, где этот белок или нуклеиновая кислота синтезируются по частям или целиком с использованием химических методов.

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения полинуклеотидов, предусматривающему проведение стадий: (а) контактирования нуклеотидного зонда настоящего изобретения с биологическим образцом в условиях гибридизации с образованием дуплексов и (b) обнаружения этих дуплексов.

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения белков, предусматривающему проведение стадий: (а) контактирования антитела настоящего изобретения с биологическим образцом в условиях, благоприятствующих образованию комплексов антитело-антиген; и (b) обнаружения этих комплексов.

В отличие от последовательностей, описанных в PCT/IB 98/01665, последовательности, описанные в настоящей заявке, очевидно, не имеют какой-либо значительной гомологии с последовательностями в N.gonorrhoeae. В соответствии с этим последовательности настоящего изобретения также могут быть использованы в целях получения реагентов для дифференциации N.meningitidis от N.gonorrhoeae.

Ниже приводится краткое описание стандартной техники и методов, которые могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения (например, для использования описанных последовательностей в целях вакцинации или в диагностических целях). Это краткое описание на должно рассматриваться как ограничение изобретения и представляет собой лишь примеры, которые могут быть использованы, но которые не являются необходимыми.

Общее описание

Для осуществления настоящего изобретения, если это не оговорено особо, могут быть использованы стандартные методы молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммунологии, известные специалистам. Такие методы полностью описаны в литературе, например Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second edition (1989); DNA Cloning, Volumes I and ii (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especially volumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.) and Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds. 1986).

В этом описании используются стандартные сокращения для нуклеотидов и аминокислот.

Все публикации, патенты и патентные заявки во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. В частности, настоящее описание включает содержание заявок на патенты Великобритании 9800760.2, 9819015.0 и 9822143.5.

Определения терминов

Термин композиция, содержащая X" означает "композицию, в основном, не содержащую Y", если в этой композиции содержание Х составляет, по крайней мере, 85% по общей массе X+Y. Предпочтительно, если в данной композиции Х составляет, по крайней мере, около 90% по общей массе X+Y, a более предпочтительно, по крайней мере, 95% или даже 99 мас.%.

Термин "содержащий" означает "включающий", а также "заключающий в себя", например композиция, "содержащая" X, может состоять исключительно из X либо она помимо X может содержать еще какой-либо компонент, такой как X+Y.

Термин "гетерологичный" означает два биологических компонента, которые вместе в природе не обнаружены. Этими компонентами могут быть клетки-хозяева, гены или регуляторные области, такие как промоторы. Хотя эти гетерологичные компоненты в сочетании друг с другом не обнаруживаются в природе, однако они могут функционировать вместе тогда, когда промотор, гетерологичный гену, функционально присоединен к этому гену. В другом примере последовательность Neisserial является гетерологичной последовательности клетки-хозяина мыши. Другими примерами могут быть два эпитопа от одинаковых или различных белков, которые были ассоциированы в один белок с образованием такой структуры, которая не была обнаружена в природе.

Термин "сайт инициации репликации" означает полинуклеотидную последовательность, которая инициирует и регулирует репликацию полинуклеотидов, такую как экспрессирующий вектор. Сайт инициации репликации ведет себя как автономная единица репликации полинуклеотидов внутри клетки, способной к репликации, под своим собственным контролем. Сайт инициации репликации может быть необходим вектору для его репликации в конкретной клетке-хозяине. С помощью некоторых сайтов инициации репликации экспрессирующий вектор может быть репродуцирован с большим числом копий в присутствии соответствующих белков внутри этой клетки. Примерами сайтов инициации репликации могут служить автономно реплицирующиеся последовательности, которые являются эффективными в дрожжах; и вирусный Т-антиген, эффективный в клетках COS-7.

Термин "мутантная" последовательность означает ДНК-, РНК- или аминокислотную последовательность, отличающуюся от нативной или описанной последовательности, но имеющей идентичные с ней последовательности. В зависимости от конкретной последовательности степень идентичности нативной или описанной последовательности и мутантной последовательности предпочтительно превышает 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или выше, как было вычислено с использованием алгоритма Smith-Waterman, описанного выше). Используемый в настоящем описании термин "аллельный вариант" молекулы нуклеиновной кислоты или области, для которой была получена нуклеотидная последовательность, означает молекулу нуклеиновой кислоты или область, которая находится, в основном, в том же самом локусе в геноме другого или второго изолята и которая, вследствие природных изменений, вызванных, например, мутацией или рекомбинацией, имеет аналогичную, но не идентичную нуклеотидную последовательность. Аллельный вариант кодирующей области обычно кодирует белок, имеющий активность, аналогичную активности белка, кодируемого геном, с которым этот белок сравнивается. Аллельный вариант может также содержать альтерацию в 5’- или 3’-нетранслируемых областях гена, таких как регуляторные контрольные области (см., например, патент США №5753235).

Экспрессирующие системы

Нуклеотидные последовательности Neisserial могут быть экспрессированы в ряде различных экспрессирующих систем; например, такими экспрессирующими системами являются клетки млекопитающих, бакуловирусы, растения, бактерии и дрожжи.

i. Системы млекопитающих

Экспрессирующие системы млекопитающих хорошо известны специалистам. Промотором млекопитающих является любая ДНК-последовательность, способная связываться с РНК-полимеразой млекопитающих и инициировать прямую транскрипцию (в направлении 5’3’) кодирующей последовательности (например, структурного гена) с образованием мРНК. Промотор может иметь сайт инициации транскрипции, который обычно расположен с 5’-конца кодирующей последовательности, и ТАТА-бокс, который обычно расположен на 25-30 пар оснований (п.о.), выше (в направлении 5’3’) от сайта инициации транскрипции. ТАТА-бокс, очевидно, обеспечивает ориентацию РНК-полимеразы II, инициируя синтез РНК в нужном сайте. Промотор млекопитающих может также содержать расположенный выше промоторный элемент, обычно локализованный в области 100-200 п.о., расположенной выше ТАТА-бокса. Локализованный выше промоторный элемент определяет степень инициации транскрипции и может действовать в любой ориентации [Sambrook et al.(1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 nd ed.].

Вирусные гены млекопитающих часто являются высокоэкспрессируемыми и имеют широкий круг хозяев; а поэтому последовательности, кодирующие вирусные гены млекопитающих, имеют особенно ценные промоторные последовательности. Примерами таких последовательностей являются: ранний промотор SV40, промотор LTR вируса опухоли молочной железы мыши, главный поздний промотор аденовируса (Ad MLP) и промотор вируса простого герпеса. Кроме того, последовательности, происходящие от невирусных генов, таких как ген металло-теионеина мыши, также имеют ценные промоторные последовательности. Экспрессия может быть конститутивной или регулируемой (индуцибельной) в зависимости от промотора, который может быть индуцирован глюкокортикоидом в восприимчивых к гормону клетках.

Присутствие энхансерного элемента (энхансера), объединенного с промоторными элементами, описанными выше, обычно способствует увеличению уровней экспрессии. Энхансер представляет собой регуляторную ДНК-последовательность, которая, при присоединении с гомологичными или гетерологичными промоторами, может стимулировать транскрипцию вплоть до в 1000 раз, при этом синтез инициируется в нормальном старт-сайте РНК. Энхансеры также являются активными в том случае, если они расположены выше или ниже от сайта инициации транскрипции либо в нормальной или во флип-ориентации или на расстоянии более чем 1000 нуклеотидов от промотора [Maniatis et al. (1987) Science 236:1237; Alberts et al. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2nd ed.]. Энхансерные элементы, происходящие от вирусов, могут быть особенно ценными, поскольку они обычно имеют широкий круг хозяев. Примерами таких энхансерных элементов являются энхансер раннего гена SV40 [Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761] и энхансеры/промоторы, происходящие от длинного концевого повтора (LTR) вируса саркомы Рауса [Gorman et al. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6777] и от цитомегаловируса человека [Boshart et al. (1985) Cell, 41:521]. Помимо этого, некоторые энхансеры являются регулируемыми и становятся активными только в присутствии индуктора, такого как гормон или ион металла [Sassone-Corsi and Borelli, (1986) Trends Genet. 2:215; Maniatis et al. (1987) Science 236:1237].

ДНК-молекула может быть экспрессирована в клетках млекопитающих. Промоторная последовательность может быть непосредственно присоединена к ДНК-молекуле; причем в этом случае первая аминокислота у N-конца рекомбинантного белка всегда является метионином, который кодируется старт-кодоном ATG. Если это необходимо, то N-конец может быть отщеплен от белка путем in vitro-инкубирования с бромистым цианом.

Альтернативно, чужеродные белки могут быть также секретированы из клетки в культуральнуго среду путем создания химерных ДНК-молекул, кодирующих гибридный белок, который состоит из фрагмента лидерной последовательности, обеспечивающий секрецию чужеродного белка в клетках млекопитающих. При этом предпочтительно, чтобы присутствовали сайты процессинга, локализованные между фрагментом лидерной последовательности и чужеродным геном, которые могут быть расщеплены либо in vivo, либо in vitro. Фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые обеспечивают направленную секрецию белка из клетки. Примером лидерной последовательности, которая обеспечивает секрецию чужеродного белка в клетках млекопитающих, является трехкомпонентная лидерная последовательность аденовируса.

Обычно последовательностями терминации транскрипции и последовательностями полиаденилирования, распознаваемыми клетками млекопитающих, являются регуляторные области, расположенные с 3’-конца от кодона терминации трансляции, и, таким образом, эти области, взятые вместе с промоторными элементами, фланкируют кодирующую последовательность. 3’-конец зрелой мРНК образуется благодаря сайт-специфическому посттранкрипционному расщеплению и полиаденилированию [Birnstiel et al. (1985) Cell, 41:349; Proudfoot and Whitelaw (1988) "Termination and 3’ end processing of eucaryotic RNA" в Transcription and splicing (ed. B.D. Hames and D.M. Glover); Proudfoot. (1989) Trends Biochem. Sci. 14:105). Эти последовательности обеспечивают направленную транскрипцию мРНК, которая может транслироваться с образованием полипептида, кодируемого ДНК. Примерами сигналов терминации транскрипции/полиаденилирования являются сигналы, происходящие от SV40 [Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Обычно вышеуказанные компоненты, содержащие промотор, сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции, помещают вместе в экспрессирующие конструкции. Если необходимо, то в экспрессирующую конструкцию могут быть также введены энхансеры, интроны с донорными и акцепторными сайтами функционального сплайсинга и лидерные последовательности. Экспрессирующие конструкции часто встраивают в репликон, такой как внехромосомный элемент (например, плазмида), который может стабильно поддерживаться в хозяине, таком как клетки млекопитающих или бактерии. Системами репликации млекопитающих являются системы, происходящие от вирусов животных, для репликации которых требуются трансдействующие факторы. Так, например, плазмиды, содержащие системы репликации паповавирусов, таких как SV40 [Gluzman (1981) Cell, 23:175], или полиомавирусов, реплицируются с чрезвычайно высоким числом копий в присутствии соответствующего вирусного Т-антигена. Другими примерами реп-ликонов млекопитающих являются репликоны, происходящие от коровьих папиломавирусов и вируса Эпштейна-Барра. Кроме того, этот репликон может иметь две системы репликации, что позволяет его использовать, например, для экспрессии в клетках млекопитающих и для клонирования и амплификации в прокариотическом хозяине. Примерами таких челночных векторов, происходящих от млекопитающего и от бактерии, являются рМТ2 [Kaufman et al. (1989) Mol. Cell Biol. 9:946] и pHEBO [Shimizu et al. (1986) Mol. Cell Biol. 6:1074].

Используемый способ трансформации зависит от трансформируемого хозяина. Методы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих известны специалистам, и такими методами являются декстран-опосредованная трансфекция, преципитация фосфатом кальция, полибрен-опосредованная трансфекция, слияние протопластов, электропорация, инкапсулирование полинуклеотида(ов) в липосомы и прямая микроинъекция ДНК в ядра клеток.

Линии клеток млекопитающих, пригодных для использования в качестве хозяев, известны специалистам, и такими клетками являются многие иммортализованные линии клеток, депонированные в Американской коллекции типовых культур (АТСС), включая, но не ограничиваясь ими, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки HeLa, клетки почки детеныша хомяка (ВНК), клетки почек обезьян (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Нер G2) и ряд других клеточных линий.

(ii) Бакуловирусные системы

Полинуклеотид, кодирующий белок, может быть также встроен в подходящий экспрессирующий вектор насекомого и функционально присоединен к регуляторным элементам, присутствующим в этом векторе. При конструировании вектора используют известные методы. В основном компонентами экспрессирующей системы являются вектор переноса, обычно бактериальная плазмида, которая содержит как фрагмент бакуло-вирусного генома, так и стандартный сайт рестрикции для встраивания гетерологичного гена или генов, предназначенных для экспрессии; бакуловирус дикого типа, имеющий последовательность, гомологичную бакуловирус-специфическому фрагменту в векторе переноса (что позволяет осуществлять гомологичную рекомбинацию гетерологичного гена в бакуловирусном геноме); а также подходящие клетки-хозяева насекомых и среда для культивирования.

После встраивания ДНК-последовательности, кодирующей белок, в вектор переноса этот вектор и вирусный геном дикого типа трансфецируют в клетки-хозяева насекомых, где указанный вектор и вирусный геном подвергаются рекомбинации. Упакованный рекомбинантный вирус экспрессируется, после чего рекомбинантные бляшки идентифицируют и очищают. Материалы и методы для экспрессирующих систем "бакуловирус/клетка насекомого" являются коммерчески доступными в виде набора, поставляемого, среди прочих, фирмой Invitrogen, San Diego СА (набор "МахВас"). Эти методы известны специалистам и подробно описаны в работе Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No 1555 (1987) (цитируемой далее как "Summers and Smith").

Перед встраиванием ДНК-последовательности, кодирующей белок, в бакуловирусный геном вышеописанные компоненты, включающие промотор, лидерную последовательность (если это необходимо), нужную кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, обычно объединяют с получением промежуточной конструкции для замены генов (вектор переноса). Эта конструкция может содержать единичный ген и функционально присоединенные регуляторные элементы; множество генов, каждый из которых имеет свой собственный набор функционально присоединенных регуляторных элементов; или множество генов, регулируемых теми же самыми регуляторными элементами. Промежуточные конструкции для замены генов часто встраиваются в репликон, такой как внехромосомный элемент (например, плазмиды), который может стабильно поддерживаться в хозяине, таком как бактерия. Этот репликон имеет систему репликации, которая позволяет его использовать для клонирования и амплификации в подходящем хозяине.

В настоящее время вектором переноса, наиболее часто используемым для введения чужеродных генов в AcNPV, является рАс373. Может быть также использовано множество других векторов, известных специалистам. Такими векторами являются, например, pVL985, который заменяет полиэдриновый старт-кодон ATG на АТТ и который вводит BamHI-сайт клонирования в положение, находящееся на 32 пары оснований ниже кодона АТТ; см. Luckow and Summers, Virology (1989) 17:31.

Эта плазмида обычно содержит полиэдриновый сигнал полиаденилирования (Miller et al. (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42:177), а также прокариотический ген резистентности к ампициллину [аmр] и сайт инициации репликации для осуществления отбора и размножения в E.coli.

Бакуловирусные векторы переноса обычно содержат бакуловирусный промотор. Бакуловирусный промотор представляет собой любую ДНК-последовательность, способную связываться с бакуловирусной РНК-полимеразой и инициировать транскрипцию кодирующей последовательности (например, структурного гена) в прямом направлении (5’3’) с образованием мРНК. Промотор может иметь область инициации транскрипции, которая обычно находится с 5’-конца от кодирующей последовательности. Эта область инициации транскрипции обычно включает сайт связывания с РНК-полимеразой и сайт инициации транскрипции. Бакуловирусный вектор переноса может также иметь второй домен, называемый энхансером, который, если он присутствует, обычно расположен далеко от структурного гена. Экспрессия может быть либо регулируемой, либо конститутивной.

Структурные гены, которые в избытке транскрибируются в заключительных стадиях инфекционного цикла вируса, имеют особенно ценные промоторные последовательности. Примерами таких последовательностей являются последовательности, происходящие от гена, кодирующего вирусный белок полиэдрон, Friesen et al. (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression", в "The Molecular Biology of Baculoviruses" (ed. Walter Doerfler); EPO Publ. Nos. 127839 and 155476; и гена, кодирующего белок р10, Vlak et al. (1988) J. Gen. Virol. 69:765.

ДНК, кодирующая подходящие сигнальные последовательности, может состоять из генов, кодирующих секретируемые белки насекомых или бакуловирусов, таких как бакуловирусный ген полиэдрина (Carbonell et al. (1988) Gene, 73:409). Альтернативно, поскольку сигналы для посттрансляционной модификации в клетках млекопитающих (таких как отщепление сигнального пептида, протеолитическое отщепление и фосфорилирование), очевидно, распознаются клетками насекомых, а сигналы, необходимые для секреции и аккумуляции в ядрах, очевидно, также являются консервативными для клеток беспозвоночных и позвоночных, то для обеспечения секреции в клетках насекомых могут быть также использованы лидерные последовательности, не происходящие от насекомых, такие как последовательности, происходящие от генов, кодирующих -интерферон человека, Maeda et al. (1985), Nature 315:592; гастрин-высвобождающий пептид человека, Lebacq-Verheyden et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3129; IL-2 человека, Smith et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:8404; IL-3 мыши (Miyajima et al. (1987) Gene, 58:273 и глюкоцереброзидазу человека, Martin et al. (1988) DNA, 7:99.

Рекомбинантный полипептид или полипротеин могут экспрессироваться внутриклеточно, либо, если они экспрессируются с собственными регуляторными последовательностями, то они могут быть секретированы. Для хорошей внутриклеточной экспрессии негибридных чужеродных белков обычно требуется присутствие гетерологичных генов, которые в идеальном случае имеют короткую лидерную последовательность, содержащую подходящие сигналы инициации трансляции перед старт-сигналом ATG. Если это необходимо, то метионин у N-конца может быть отщеплен от зрелого белка путем in vitro-инкубирования с бромцианом.

Альтернативно, рекомбинантные полипротеины или белки, которые не секретируются в природных условиях, могут быть секретированы из клеток насекомых путем создания химерных ДНК-молекул, кодирующих гибридный белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, которая обеспечивает секрецию чужеродного белка у насекомых. Фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые способствуют транспорту белка в эндоплазматический ретикулум.

После введения ДНК-последовательности и/или гена, кодирующего предшественник продукта экспрессии белка, клетка-хозяин насекомого ко-трансформируется гетерологичной ДНК вектора переноса и геномной ДНК бакуловируса дикого типа обычно посредством ко-трансфекции. Промоторная последовательность и последовательность терминации транскрипции этой конструкции обычно содержит 2-5 т.п.о.-область генома бакуловируса. Методы встраивания гетерологичной ДНК в нужный сайт бакуловируса известны специалистам (см. Summers and Smith, см. выше; Ju et al. (1987); Smith et al. Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156 и Luckow and Summers (1989)). Например, такая инсерция может быть введена в ген, такой как ген полиэдрина, путем гомологичной рекомбинации посредством двойного кроссинговера; эта инсерция может быть также введена в рестрикционный сайт, сконструированный в нужном бакуловирусном гене. Miller et al. (1989) Bioessays, 4:91. ДНК-последовательность при ее клонировании в экспрессирующий вектор вместо гена полиэдрина фланкирована по обоим 5’- и 3’-концам полиэдринспецифическими последовательностями и расположена ниже промотора полиэдрина.

Затем, вновь сконструированный бакуловирусный экспрессирующий вектор упаковывают в инфекционный рекомбинантный бакуловирус. Гомологичная рекомбинация происходит при низкой частоте (в пределах от около 1% до около 5%), а поэтому большинство вирусов, продуцированных после ко-трансфекции, все еще являются вирусами дикого типа. Следовательно, необходимо разработать метод для идентификации рекомбинантных вирусов. Преимущество данной экспрессирующей системы заключается в том, что она позволяет идентифицировать рекомбинантные вирусы методом визуального скрининга. Белок полиэдрина, продуцируемый нативным вирусом, продуцируется в ядрах инфецированных клеток в очень больших количествах на поздних стадиях после инфекционного цикла вируса. Аккумулированный белок полиэдрина образует тельца включения, которые также содержат встроенные частицы. Эти тельца включения размером вплоть до 15 мкм обладают в высокой степени преломляющими свойствами, что придает им блестящий яркий вид, который легко визуализируется с помощью оптического микроскопа. Клетки, инфицированные рекомбинантными вирусами, не обнаруживают телец включения. Для дифференциации рекомбинантного вируса от вируса дикого типа трансфекционный супернатант наносят пятнами на монослой клеток насекомых с помощью техники, известной специалистам. А именно, бляшки скринируют с помощью оптического микроскопа на присутствие (указывающее на вирус дикого типа) и