Инактивированная вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76 птиц

Инактивированная вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76 птиц

Реферат

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Вакцина содержит антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса синдрома снижения яйценоскости (ССЯ)-76 птиц, репродуцированного в 9 - 11-суточных утиных эмбрионах (УЭ) или эмбрионах SPF-кур, инактивант аминоэтилэтиленимин и масляный адъювант в эффективном соотношении. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ под регистрационным наименованием “БИСС №113 - ДЕП”. Штамм “БИСС №113” репродуцируется в УЭ или в эмбрионах SPF-кур с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ЭИД 50/0,2 см³ и проявляет в РГА гемагглютинирующую активность (ГА-активность), по меньшей мере, 1:4096. Полученная вакцина представляет собой однородную эмульсию белого цвета. Вакцина способствует образованию у привитой птицы активного иммунитета против ССЯ-76 через 14-21 сутки после однократного введения препарата длительностью не менее 12 месяцев. 11 з.п. ф-лы, 6 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении вакцинных препаратов для профилактики синдрома снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76) птиц.

ССЯ-76 - вирусная болезнь кур-несушек, характеризующаяся резким, но непродолжительным снижением яичной продуктивности, появлением депигментированных яиц, яиц со слабой скорлупой и без скорлупы, а также увеличением процента боя и насечки.

Впервые болезнь была описана в 1976 году в Голландии. Позднее ССЯ-76 регистрировали во многих других странах Европы, Южной Америки, Австралии и Африки. В начале восьмидесятых годов прошлого века были выявлены случаи ССЯ-76 в нашей стране, что было подтверждено обнаружением в крови переболевших птиц антигемагглютининов к вирусу ССЯ-76.

Возбудителем болезни является ДНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Adenoviridae, который в отличие от представителей других аденовирусов птиц способен агглютинировать эритроциты кур. К заболеванию восприимчивы куры-несушки всех пород в период наивысшей яйценоскости (180-240 сут), но возможно поражение птицы в любой период продуктивного цикла. Более восприимчивы к заболеванию куры высокопродуктивных мясояичных и мясных кроссов.

По данным многих зарубежных и отечественных исследователей экономический ущерб при ССЯ-76 складывается из потери от 5 до 30 яиц на курицу-несушку, а в племенных стадах с учетом выбраковки может доходить до 50 яиц.

Ущерб от болезни усугубляется затратами на оздоровительные мероприятия.

В настоящее время основным методом ликвидации ССЯ-76 птиц является специфическая профилактика заболевания инактивированными вакцинами (1).

Однако проблемы повышения их антигенной активности, безвредности и стабильности продолжают оставаться актуальными и являются основными направлениями исследований по совершенствованию указанных препаратов.

Известна инактивированная вакцина против ССЯ-76 птиц, содержащая антигенный материал из штамма CNCM №1043 гомологичного вируса, репродуцированного в чувствительной биологической системе, инактивант и масляный адъювант в эффективном соотношении (2, 3).

Известна инактивированная вакцина против ССЯ-76 птиц, содержащая антигенный материал из штамма "В 8/78" гомологичного вируса, репродуцированного в чувствительной биологической системе, бис-этилениминоэтилоксамид в качестве инактиванта и масляный адъювант в эффективном соотношении (4).

Известна инактивированная вакцина против ССЯ-76 птиц, содержащая антигенный материал из штамма ВГНКИ №98 "Б-93" гомологичного вируса, репродуцированного в чувствительной биологической системе, димер этиленимина в качестве инактиванта и масляный адъювант в эффективном соотношении (5).

Известна инактивированная вакцина против ССЯ-76 птиц, содержащая антигенный материал из штамма ВНИВИП гомологичного вируса, заключенного в липосомальную везикулу, покрытую оболочкой из смеси сахаров и водорастворимых полимеров в соотношении 5-15:1 (6).

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является инактивированная вакцина против ССЯ-76 птиц, содержащая антигенный материал из штамма "В 8/78" гомологичного вируса, репродуцированного в 9 - 11-дневных утиных эмбрионах (УЭ), теотропин в качестве инактиванта и масляный адъювант в эффективном соотношении (7).

Существенными недостатками известных вакцинных препаратов, в том числе и вакцины-прототипа, являются их низкая антигенная и гемагглютинирующая активность (ГА-активность) по причине нестабильности используемых для их изготовления штаммов вируса при инактивации, а также необходимость культивирования вируса только на развивающихся УЭ.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка инактивированной вакцины против ССЯ-76 птиц на основе нового производственного штамма гомологичного вируса, обладающего высокой антигенной и ГА-активностью, сохраняющего свои нативные иммунобиологические свойства при инактивации и пригодного для изготовления высокоэффективной инактивированной вакцины, для которой антиген можно получать как в развивающихся утиных, так и в куриных эмбрионах (КЭ).

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в повышении антигенной и ГА-активности и стабильности препарата и расширении арсенала средств специфической профилактики ССЯ-76 птиц, обеспечивающих напряженный и длительный иммунитет у привитой птицы.

Указанный технический результат достигнут созданием инактивированной вакцины против ССЯ-76 птиц, охарактеризованной следующей совокупностью признаков:

1. Инактивированная вакцина против ССЯ-76 птиц.

2. Антигенный материал из штамма возбудителя инфекции, репродуцированного в чувствительной биологической системе, в эффективном количестве.

3. В качестве возбудителя инфекции штамм “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц в эффективном количестве.

4. Антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, репродуцированного в 9 - 11-суточных УЭ.

5. Антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, репродуцированного в 9 - 11-суточных УЭ, с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ЭИД 50/0,2 см³.

6. Антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, репродуцированного в 9 - 11-суточных УЭ, с ГА-активностью, по меньшей мере, 1:4096.

7. Антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, репродуцированного в 9 - 11-суточных эмбрионах SPF-кур.

8. Антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, репродуцированного в 9 - 11-суточных эмбрионах SPF-кур, с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ЭИД 50/0,2 см³.

9. Антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, репродуцированного в 9 - 11-суточных эмбрионах SPF-кур, с ГА-активностью, по меньшей мере, 1:4096.

10. Инактивант.

11. Из инактивантов аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ).

12. АЭЭИ в виде 10% водного раствора.

13. АЭЭИ в концентрации 0,2-0,4%.

14. Масляный адъювант.

15. Из масляных адъювантов масляный адъювант “Монтанид ИЗА-70”.

16. Антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, инактивант АЭЭИ и масляный адъювант в соотношении, мас.%:

Антигенный материал 30,0-40,0

АЭЭИ (10% водный раствор) 0,2-0,4

Масляный адъювант До 100,0

Предлагаемое изобретение включает совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Инактивированная вакцина против ССЯ-76 птиц.

2. Антигенный материал из штамма возбудителя инфекции, репродуцированного в чувствительной биологической системе.

3. В качестве возбудителя инфекции штамм “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц в эффективном количестве.

4. Инактивант.

5. Масляный адъювант.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, репродуцированного в 9 - 11-суточных УЭ.

2. Антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, репродуцированного в 9 - 11-суточных УЭ, с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ЭИД 50/0,2 см³

3. Антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, репродуцированного в 9 - 11-суточных УЭ, с ГА-активностью, по меньшей мере, 1:4096.

4. Антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, репродуцированного в 9 - 11-суточных эмбрионах SPF-кур.

5. Антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, репродуцированного в 9 - 11-суточных эмбрионах SPF-кур, с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ЭИД 50/0,2 см³.

6. Антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, репродуцированного в 9 - 11-суточных эмбрионах SP-кур, с ГА-активностью, по меньшей мере, 1:4096.

7. Из инактивантов АЭЭИ.

8. АЭЭИ в виде 10% водного раствора.

9. АЭЭИ в концентрации 0,2-0,4%.

10. Из масляных адъювантов масляный адъювант “Монтанид ИЗА-70”.

11. Антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, инактивант АЭЭИ и масляный адъювант в соотношении, маc.%:

Антигенный материал 30,0-40,0

АЭЭИ (10% водный раствор) 0,2-0,4

Масляный адъювант До 100,0

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Инактивированная вакцина против ССЯ-76 птиц.

2. Антигенный материал из возбудителя инфекции, репродуцированного в чувствительной биологической системе.

3. Инактивант.

4. Масляный адъювант.

По сравнению с вакциной-прототипом предлагаемая вакцина обладает существенными отличительными признаками, заключающимися в том, она содержит антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, репродуцированного в 9 - 11-суточных УЭ.

2. Антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, репродуцированного в 9 - 11-суточных УЭ, с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ЭИД 50/0,2 см³

3. Антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, репродуцированного в 9 - 11-суточных УЭ, с ГА-активностью, по меньшей мере, 1:4096.

4. Антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, репродуцированного в 9 - 11-суточных эмбрионах SPF-кур.

5. Антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, репродуцированного в 9 - 11-суточных эмбрионах SPF-кур, с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ЭИД 50/0,2 см³.

6. Антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, репродуцированного в 9 - 11-суточных эмбрионах SPF-кур, с ГА-активностью, по меньшей мере, 1:4096.

7. Из инактивантов АЭЭИ.

8. АЭЭИ в виде 10% водного раствора.

9. АЭЭИ в концентрации 0,2-0,4%.

10. Из масляных адъювантов масляный адъювант “Монтанид ИЗА-70”.

11. Антигенный материал из штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, инактивант АЭЭИ и масляный адъювант в соотношении, мас.%:

Антигенный материал 30,0-40,0

АЭЭИ (10% водный раствор) 0,2-0,4

Масляный адъювант До 100,0

Предлагаемая вакцина обладает более высокой антигенной и ГА-активностью и стабильностью по сравнению с вакциной-прототипом и расширяет арсенал средств специфической профилактики ССЯ-76 птиц.

Достижение технического результата от использования предлагаемой вакцины объясняется тем, что в ее состав введен антигенный материал из нового штамма “БИСС №113” вируса ССЯ-76 птиц, обладающего высокой биологической, антигенной и ГА-активностью и стабильностью, способного размножаться как в развивающихся утиных, так и в куриных эмбрионах и обеспечивающего получение вакцины, создающей напряженный и длительный иммунитет у привитой птицы.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого изобретения достигается за счет того, что вакцина содержит АЭЭИ в качестве инактиванта, что позволяет значительно снизить трудо- и энергозатраты на изготовление вакцины и повысить качество антигенного материала. Дополнительный технический результат от использования предлагаемого изобретения в чти повышения антигенной и ГА-активности целевого продукта достигается также за счет использования в его составе масляного адъюванта “Монтанид ИЗА-70”.

Исходный вирус для получения штамма “БИСС №113” выделен из органов репродуктивной системы курицы с признаками острой формы ССЯ-76 в 1999 г. в Ульяновской области. Производственный штамм “БИСС №113” вируса ССЯ-76 получен путем проведения 4-х последовательных пассажей на развивающихся УЭ.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) МСХ РФ 5 октября 2000 г. под регистрационным наименованием "БИСС №113-ДЕП". Штамм "БИСС №113" вируса ССЯ-76 обладает высокой биологической и антигенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для приготовления инактивированной вакцины против ССЯ-76 птиц, создающей эффективную защиту кур против указанного возбудителя заболевания.

Штамм "БИСС №113" вируса ССЯ-76 птиц характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Штамм "БИСС №113" вируса ССЯ-76 относится к семейству Adenoviridae, роду Aviadenovirus, к 3 серологической группе. При электронно-микроскопическом исследовании штамм "БИСС№113" представлен вирионами икосаэдрической формы, которые лишены суперкапсидной оболочки и не содержат липидов. Диаметр нуклеокапсида 708 нм.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм “БИСС №113” относится к 3 серологической группе птичьих аденовирусов. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. В перекрестной реакции торможения гемагглютинации (РТГА) со специфическими сыворотками к штаммам “В 8/78”, ВГНКИ №98 “Б-93” и “БИСС №113” вируса ССЯ-76 и с гетерологичными сыворотками к парамиксовирусу-1 (ПМВ-1), вызывающему болезнь Ньюкасла, и ортомиксовирусам 5-7 серотипов штамм “БИСС №113” был идентифицирован как вирус, аналогичный эталонному “В 8/78” и известному отечественному ВГНКИ №98 “Б-93” штаммам вируса ССЯ-76, и отнесен к аденовирусам птиц 3 серологической группы.

Через 14-21 сут после заражения 120-суточных кур вирусом штамма “БИСС №113” отмечают появление вируснейтрализующих и ГА-антител. ГА-титр штамма достигает 18,0-21,0 лог₂. Пробы экстраэмбриональной жидкости (ЭЭЖ) после расплодки штамма на УЭ исследовали в реакции гемагглютинации (РГА). Исследуемые пробы ЭЭЖ имели ГА-активность в разведении 1:32768-1:262144.

Биотехнологические характеристики

Штамм "БИСС №113" предназначен для изготовления инактивированной вакцины против ССЯ-76 птиц. Штамм хорошо размножается в 9 - 11-суточных УЭ, зараженных в аллантоисную полость. Инфекционная активность штамма через 120 ч при температуре 37,00,5С достигает 6,750,31 Ig ЭИД₅₀/0,2 см³.

Штамм культивируется также в КЭ и первичной культуре клеток утиных фибробластов, вызывая цитопатическое действие (ЦПД). Результаты культивирования вируса ССЯ-76 штамма "БИСС №113" представлены в табл. 1. Штамм является генетически стабильным и сохраняет свои свойства на протяжении 10 пассажей.

Гемагглютинирующие свойства

Штамм "БИСС №113" обладает выраженными гемагглютинирующими свойствами. Агглютинирует эритроциты кур и уток, вызывая образование среднезернистой РГА с предельным титром 21,0 лог₂.

Инфекционные свойства

К штамму "БИСС №113" восприимчивы куры, утки и гуси при интратрахеальном, оральном и внутримышечном заражениях. Начиная с 14 сут после введения вируса 120-суточным цыплятам, отмечают появление депигментированных лишенных скорлупы яиц. В течение четырех недель процент яиц с мягкой скорлупой и бесскорлупных составляет около 30% и более.

Вирус не вызывает клинических признаков болезни при экспериментальном и естественном заражениях. Патологоанатомические изменения не выражены и определяются только гистологически по изменениям в репродуктивных органах.

Хемогенотаксономическая характеристика

Сердцевина вириона содержит двухцепочечную молекулу ДНК и два внутренних белка. Масса нуклеиновой кислоты достигает 17,3% массы вириона.

Основная масса белков вируса ССЯ-76 птиц сосредоточена в капсидной оболочке вириона. На долю сердцевинных белков приходится до 20% всех протеинов вируса. Сердцевинный белок "1" с молекулярной массой 4610³ г/моль легко отделяется от внутреннего нуклеотида, содержащего ДНК в комплексе с богатым аргинином сердцевинным белком "2".

Гексон, основание пептона и его нить (фибер) вируса "БИСС №113" построены из полипептидов с молекулярными массами 12010³, 7010³, 6210³ г/моль соответственно.

Белковые структуры вируса штамма "БИСС №113" формируют несколько антигенов. В составе структурного вирусного антигена у них обнаружены типоспецифические, группоспецифические, подгруппоспецифические антигены нити пептона. В составе структурного вирусного антигена выявлено три основных компонента, обозначенных А, В и С. Антиген А структурно связан с гексоном, антиген В - с пептоном, антиген С - с нитями вириона (фибера). Связанный с гексоном компонент А содержит группоспецифический антиген (а) и типоспецифический антиген (). Антигенный фактор, связанный с пептоном, назван антигеном , а с нитью вириона (фибер) - антигеном .

С помощью ПЦР и секвенирования амплифицированных учтков генома установлено, что аллантоисная жидкость от УЭ, зараженных штаммом “БИСС №113”, содержала геном вируса ССЯ-76.

Нуклеотидная последовательность амплифицированного консервативного фрагмента гена гексона штамма “БИСС №113” имела полную гомологию с референтными штаммами вируса ССЯ-76.

Физические свойства

Масса вириона - 25210³ г/моль. Плавучая плотность 1,32-1,35 г/мл в градиенте CsCl. Константа седиментации зрелого вириона составляет 8^-1010^-13 - 9^-1010^-13 с.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм "БИСС №113" стабилен при рН в пределах 6,0-9,0. Устойчив к жирорастворителям. Инактивируется при 56С.

Дополнительные признаки и свойства

Антигенная активность - 100%.

Патогенность выражена.

Вирулентность выражена.

Контагиозность выражена.

Онкогенность отсутствует.

Свободен от контаминации бактериальной и грибковой флоры, микоплазмами и гемагглютинирующими вирусами.

На основании полученных данных можно утверждать, что штамм "БИСС№113" по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным изолятом вируса ССЯ-76 птиц.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности существенных признаков аналога позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности “новизна”.

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности “изобретательский уровень” проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную чть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияния предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемая вакцина соответствует условию патентоспособности “изобретательский уровень”.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения.

Пример 1

Исходный вирус для получения штамма "БИСС №113" выделен из органов репродуктивной системы курицы с признаками острой формы ССЯ-76 в 1999 году в Ульяновской области. Вакцинный штамм получен во ВНИИ защиты животных путем проведения последовательных пассажей на развивающихся УЭ 9 - 11-суточного возраста. Для получения вируса первого пассажа зараженные эмбрионы инкубировали в термостате в течение 120 ч при температуре 37,00,5С. Гибель эмбрионов в течение первых 24 ч после введения вируса считали неспецифичной. Через 120 ч инкубации все эмбрионы охлаждали при температуре 4-8С в течение 12-18 ч и вскрывали. ЭЭЖ из полости эмбриона отбирали пипеткой и собирали в стеклянные флаконы. Вируссодержащую жидкость подвергали низкоскоростному центрифугированию для освобождения от крупнодисперсных чтиц. Осветленную суспензию использовали для последующего пассирования.

Полученный вирус был подвергнут всестороннему контролю в соответствии с руководством МЭБ по стандартным диагностическим методам и вакцинам (1996) и на уровне 4 пассажа заложен на хранение в качестве матровой расплодки. Вирус матровой расплодки с титром инфекционной активности 6,750,31 Ig ЭИД₅₀/0,2 см³, представленный в виде вируссодержащей ЭЭЖ, хранят при температуре минус 40С.

Полученному штамму вируса ССЯ-76 птиц присвоено авторское наименование "БИСС".

Пример 2

Для изготовления инактивированной эмульсионной вакцины используют производственный штамм "БИСС №113" вируса ССЯ-76, получаемый из ВГНКИ. Указанный штамм используют для получения матровой расплодки. Для этого 3 ампулы лиофилизированного вируса растворяют в 30 см³ стерильного 0,9% раствора хлорида натрия, содержащего 200 Ед/см³ стрептомицина.

Приготовленным вирусом заражают 150 УЭ или эмбрионов SPF-кур 9 - 11-суточного возраста путем его введения в аллантоисную полость 0,2 см³. Зараженные эмбрионы инкубируют при температуре 37,40,5С и относительной влажности 60-70% в течение 96-120 ч. Каждые 24 ч эмбрионы овоскопируют. Через 96-120 ч после заражения и инкубации эмбрионы используют для получения вируса. Перед вскрытием эмбрионы охлаждают при 4-8С в течение 12-24 ч. После этого из них через прокол в хориоаллантоисной оболочке стерильной пипеткой отбирают вируссодержащую жидкость. Собранную жидкость центрифугируют при 1000 об/мин в течение 15 мин и сливают по 50-100 см³ в стерильные флаконы емкостью по 100-200 см³. В стерильных условиях из каждого флакона отбирают по 3-5 см³ жидкости для контроля стерильности и ГА-активности. Полученная матровая расплодка должна быть стерильной и иметь ГА-активность не ниже 1:4096. Матровую расплодку хранят в замороженном виде при температуре не выше минус 40С.

Матровую расплодку используют для получения производственной расплодки вируса. Для этого флаконы с матровым вирусом размораживают в водяной бане при 18-20С, содержимое флаконов очищают хлороформом и центрифугируют при 2500 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отбирают в стерильные флаконы. Активность вируса определяют в РГА и производят корректировку объема путем разведения 0,9% раствором хлорида натрия до активности 2048-4096 ГАЕ/0,2 см³. Подготовленный таким образом матровый вирус используют для получения производственной расплодки вируса.

Полученным вирусом заражают партию УЭ или эмбрионы SPF-кур в количестве, обеспечивающем изготовление планируемого объема серии вакцины. Зараженные эмбрионы инкубируют при температуре 37,00,5C и относительной влажности 60-70% в течение 96-120 ч. Через 96-120 ч после заражения эмбрионы охлаждают при 4-8С в течение 12-24 ч, производят вскрытие зараженных эмбрионов и сбор вируссодержащего материала. Полученный вируссодержащий материал подвергают первичной очистке путем центрифугирования. Центрифугирование проводят в течение 7-10 мин при 1000 об/мин и температуре 2-6С. При этом аллантоисную жидкость освобождают от осколков скорлупы, клеток и эритроцитов. Очищенную вируссодержащую ЭЭЖ сливают в стеклянные 20 дм³ стерильные бутыли. Полученную ЭЭЖ подвергают инактивации аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ). Для этого вируссодержащую ЭЭЖ нагревают в водяной бане до 37,00,5С и рН 7,4-7,8. При перемешивании в суспензию добавляют 10% раствор АЭЭИ до конечной концентрации 0,2-0,4%. Инактивацию ведут в течение 48 ч после добавления инактиванта при 37,00,5С с периодическим перемешиванием. По окончании инактивации бутыли с полученным антигеном охлаждают при 4-8С в течение 2 сут, периодически перемешивая суспензию. Затем из каждой бутыли отбирают пробу в количестве 20 см³ для определения титра в РГА, контроля, авирулентности, стерильности и рН. Инактивированный антиген должен быть стерильным и авирулентным, иметь ГА-титр не менее 1:8192 и рН в пределах 7,4-7,8. Антиген хранят при 4-8С. Полученный антиген подвергают дополнительной очистке от балластных примесей на проточной ультрацентрифуге и фильтровальной установке с элементом ЭПРС. После этого антигенный материал соединяют с масляным адъювантом в соотношении 3:7-2:3 по весу. Перед составлением вакцины проводят корректировку объема инактивированного антигена по титру гемагглютининов. ГА-активность инактивированного антигена в РГА должна быть не меньше 1:4096. Для изготовления эмульсионной вакцины можно использовать как отечественные, так и зарубежные масляные адъюванты. В данном случае используют масляный адъювант фирмы "Сеппик" (Франция) "Монтанид ИЗА-70".

Изготовление инактивированной эмульсионной вакцины проводят следующим образом. В реактор со стерильным масляным адъювантом при включенной мешалке (250-300 об/мин) подают необходимый объем инактивированного материала со скоростью 2-3 дм³/мин (стадия предэмульсии). Затем предэмульсию пропускают через гомогенизатор в течение 3 ч, получая в результате стабильную эмульсию типа "вода-масло". Учитывая термолабильность вирусного антигена, процесс эмульгирования проводят при температуре 4-8С. При получении эмульсии контролируют некоторые ее характеристики: тип эмульсии, стабильность, вязкость и другие свойства. Готовую вакцину разливают во флаконы объемом 200-450 см³, которые герметично укупоривают и закатывают алюминиевыми колпачками. Полученную вакцину контролируют по следующим показателям: по внешнему виду и цвету, наличию посторонней примеси и дефектов флаконов, стабильности эмульсии, определению относительной вязкости, плотности инактивации вакцины и ее антигенной активности.

По внешнему виду препарат представляет собой однородную эмульсию белого цвета. При хранении допускается отслоение масла в верхней чти флакона. При встряхивании однородность эмульсии восстанавливается.

Полученная вакцина против ССЯ-76 птиц имеет оптимальный компонентный состав:

Антигенный материал 30,0-40,0

АЭЭИ (10% водный раствор) 0,2-0,4

Масляный адъювант До 100,0

Содержание антигена в предлагаемой вакцине в указанных выше пределах является его эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата.

Предлагаемая вакцина предназначена для профилактической иммунизации молодняка кур против ССЯ-76. Вакцинации подлежит клинически здоровая птица в возрасте 90-120 сут, но не позднее, чем за один месяц до начала яйцекладки. Вакцину в дозе 0,5 см³ вводят птице однократно подкожно в среднюю треть шеи, внутримышечно в область груди или в жировую складку хвоста. Вакцина вызывает иммунитет к инфекции не менее чем у 80% вакцинированных цыплят, индуцируя накопление в сыворотке крови антител к вирусу ССЯ-76 в титре 5 лог₂ и выше в РТГА или более двух минимальных значений в ИФА. Продолжительность поствакцинального иммунитета составляет не менее 12 месяцев.

Пример 3

Проведены исследования по изучению антигенной активности предлагаемой вакцины против ССЯ-76 птиц, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:

Антигенный материал

из штамма “БИСС №113”,

репродуцированного в УЭ

9 - 11-суточного возраста,

с биологической активностью

6,5 Ig ЭИД 50/0,2 см³ и

ГА-активностью 1:4096 30,0

АЭЭИ (10% водный раствор) 0,2

Масляный адъювант До 100,0

Были изготовлены три опытных образца препарата на основе масляного адъюванта "Монтанид ИЗА-70". Инактивированный вирус ССЯ-76 перед компановкой вакцины разводили 1:2 стерильным ФБР. В качестве контроля использовали образец серийной инактивированной вакцины против ССЯ-76, приготовленной из штамма "В 8/78". Все вакцины вводили цыплятам опытных и контрольных групп (в каждой группе по 20 голов). Результаты исследований по определению антигенной активности представлены в табл. 2.

Из данных табл. 2 видно, что все три образца инактивированной вакцины против ССЯ-76, приготовленной из штамма "БИСС №113", индуцировали у привитых цыплят образование антител к вирусу ССЯ-76 в высоких титрах. Вакцина из штамма "В 8/78" вызывала у иммунизированных цыплят образование антител к вирусу ССЯ-76 в титрах аналогичного уровня.

Пример 4

Проведены исследования по изучению напряженности и длительности поствакцинального иммунитета, создаваемого инактивированной вакциной против ССЯ-76 птиц, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас%:

Антигенный материал

из штамма “БИСС №113”,

репродуцированного в УЭ

9 - 11-суточного возраста,

с биологической активностью

6,5 Ig ЭИД 50/0,2 см³ и

ГА-активностью 1:4096 40,0

АЭЭИ (10% водный раствор) 0,4

Масляный адъювант До 100,0

Начиная с 30 по 120 сут после прививки птицы полученной вакциной, с периодичностью 1 раз в месяц оценивали напряженность гуморального иммунитета в РТГА. Полученные результаты представлены в табл. 3.

Согласно представленным в табл. 3 данным следует, что в интервале от 1 до 6 месяцев вакцинированная птица обеих групп имела антитела к вирусу ССЯ-76 в высоких титрах. Существенных различий в уровне поствакцинального иммунитета, вызванного вакцинами из штаммов "БИСС №113" и "В 8/78", не было установлено. Полученные данные позволили сделать заключение, что однократная вакцинация цыплят инактивированным препаратом из штамма "БИСС №113" в дозе 0,5 см³ обеспечивала формирование напряженного уровня антител к вирусу ССЯ-76 в течение всего срока исследования.

Пример 5

Проведена сравнительная оценка антигенной активности инактивированной вакцины на основе штамма “В 8/78” и инактивированной вакцины против ССЯ-76 птиц, изготовленной на основе штамма "БИСС №113" так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:

Антигенный материал

из штамма “БИСС №113”,

репродуцированного в УЭ

9 - 11-суточного возраста,

с биологической активностью

6,5 Ig ЭИД 50/0,2 см³ и

ГА-активностью 1:4096 30,0

АЭЭИ (10% водный раствор) 0,2

Масляный адъювант До 100,0

Вакцины готовили на основе масляного адъюванта "Монтанид ИЗА-70" в соотношении адъюванта с антигеном 7:3 по весу. Антиген предварительно разводили ФБР в соотношении 1:3.

Активность цельного антигена в РГА была следующей:

штамм "БИСС" - 21 лог₂;

штамм "В 8/78" (образец №9) - 19 лог₂;

штамм "В 8/78" (образец №11) - 19 лог₂;

штамм "В 8/78" (образец №16) - 19 лог₂;

штамм "В 8/78" (образец №17) - 19 лог₂.

Вакцины эмульгировали в течение 3 мин при 3000 об/мин.

Вакцины проверяли на антигенную активность, прививая птиц в возрасте 100 сут внутримышечно в дозе 0,5 см³, а при проверке безвредности вакцины вводили в дозе 1,5 см³ и птиц выдерживали в течение 10-12 сут. Все вакцины не вызывали никаких отклонений у птицы как в поведении, так и в местах введения препаратов. Сыворотки крови отбирали через 7, 11, 30, 60 и 90 сут после вакцинации и исследовали в РТГА, а результаты выражали в лог₂. Результаты исследований приведены в табл. 4.

Согласно данным табл. 4 следует, что наиболее высокой антигенной активностью обладают вакцина из штамма "БИСС №113" и образцы №9 и 17 вакцины из штамма "В 8/78".

Пример 6

Проведены исследования по определению динамики формирования поствакцинальных антител после применения инактивированной эмульсионной вакцины против ССЯ-76 птиц, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:

Антигенный материал

из штамма “БИСС №113”,

репродуцированного в УЭ

9 - 11 -суточного возраста,

с биологической активностью

6,5 Ig ЭИД 50/0,2 см³ и

ГА-активностью 1:4096 30,0

АЭЭИ (10% водный раствор) 0,4

Масляный адъювант До 100,0

Результаты исследований приведены в табл. 5.

Пример 7

Проведены исследования по оценке антигенной активности инактивированной вакцины против ССЯ-76 птиц, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:

Антигенный материал

из штамма “БИСС №113”,

репродуцированного в КЭ

9 - 11-суточного возраста,

с биологической активностью

6,5 Ig ЭИД 50/0,2 см³ и

ГА-активностью 1:4096 30,0

АЭЭИ (10% водный раствор) 0,2

Масляный адъювант До 100,0

Результаты исследований приведены в табл. 6.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:

- инактивированная вакцина против ССЯ-76 птиц, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- при использовании предлагаемой вакцины против ССЯ-76 птиц достигнут технический результат, заключающийся в повышении антигенной и ГА-активности и стабильности препарата и расширении арсенала средств специфической профилактики ССЯ-76 птиц, обеспечивающих напряженный и длительный иммунитет у привитой птицы.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности “промышленная применимость”.

Источники информации

1. Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 1998, с. 846-870.

2. Пат. Франции №2382500, С 12 К 5/00, А 61 К 39/32, 29.09.1978 г.

3. Baxendale W., Lutticken D. et al. The results of field trials conducted with an inactivated vaccine against the Egg Drop Syndrome-76 (EDS-76). Avian Pathology, 1980, v.9, №1, р. 77-91.

4. Пат. РФ №1809836, С 12 N 7/00, А 61 К 39/00, 15.04.1993 г.

5. Пат. РФ №2097066, А 61 К 39/12, С12 N 7/00, А 61 К 39/235, 27.11.1997 г.

6. Пат. РФ №2155030, А 61 К 9/127, 39/00, 39/235, 27.08.2000 г.

7. Пат. РФ №2183968, А 61 К 39/12, 26.06.2002 г. (прототип).