Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный tie-2-лиганд (варианты), химерный или модифицированный tie-2-лиганд и способ его получения, вектор, способ получения системы вектор-хозяин, конъюгат, фармацевтическая композиция

Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный tie-2-лиганд (варианты), химерный или модифицированный tie-2-лиганд и способ его получения, вектор, способ получения системы вектор-хозяин, конъюгат, фармацевтическая композиция

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и может быть использовано для получения химерного или модифицированного TIE-2-лиганда. Химерный TIE-2-лиганд, связывающий и активирующий TIE-2-рецептор, содержит N-концевой домен, спирально скрученный домен и фибриноген-подобный домен, которые выбраны из TIE-2-лиганда 1, TIE-2-лиганда 2, TIE-лиганда 3, TIE-лиганда 4. Модифицированный лиганд может иметь замены нуклеотидов 1102-1104 последовательности на фиг.4, кодирующих цистеин, или нуклеотидов 555-557 последовательности на фиг.6, кодирующих аргинин. Химерный TIE-2-лиганд получают путем культивирования клеток, трансформированных вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую химерный TIE-2-лиганд. Фармацевтическая композиция для индуцирования гематопоэза или неоваскуляризации содержит химерный или модифицированный лиганд. Изобретение позволяет разрабатывать средства, усиливающие гематопоэз. 8 н. и 15 з.п. ф-лы, 44 ил., 1 табл.

Данная заявка заявляет о приоритете U.S. Serial No. 08/740223 filed October 25, 1996 и U.S. Provisional application 60/022999 filed August 2, 1996. Во всей заявке даются ссылки на различные публикации. Описание этих публикаций во всей их полноте включены в качестве ссылок в эту заявку.

Введение

Данное изобретение относится в общем к области генной инженерии и, более конкретно, к генам для рецепторных тирозинкиназ и их родственных лигандов, их встраиванию в рекомбинантные ДНК-векторы и к получению кодируемых белков в реципиентных штаммах микроорганизмов и реципиентных эукариотических клетках. Более конкретно, данное изобретение относится к новому модифицированному TIE-2-лиганду, который связывает TIE-2-рецептор, а также к способам получения и применения этого модифицированного лиганда. Далее данное изобретение обеспечивает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую модифицированный лиганд, и способы генерирования нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный лиганд, и продукт гена. Модифицированный TIE-2-лиганд, а также кодирующая его нуклеиновая кислота могут быть применимы в диагностике и лечении некоторых заболеваний, в которых участвуют эндотелиальные клетки и ассоциированные с ними TIE-рецепторы, таких как неопластические заболевания, вовлекающие в себя ангиогенез опухоли, заживление ран, тромбоэмболические заболевания, атеросклероз и воспалительные заболевания. Кроме того, модифицированный лиганд может быть использован для усиления пролиферации и/или дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток. Более обобщенно, активирующие рецептор модифицированные TIE-2-лиганды, описанные здесь, могут быть использованы для ускорения роста, выживания, миграции и/или дифференцировки и/или стабилизации или дестабилизации клеток, экспрессирующих TIE-рецептор. Биологически активный модифицированный TIE-2-лиганд может быть использован для поддержания in vitro экспрессирующих TIE-рецептор клеток в культуре. Клетки и ткани, экспрессирующие TIE-рецептор, включают в себя, например, сердечные и сосудистые эндотелиальные клетки, эпителий хрусталика и клетки эпикарда сердца и ранние гемопоэтические клетки. Альтернативно такой лиганд человека может быть использован для поддержания клеток, которые сконструированы генной инженерией для экспрессии TIE-рецептора. Кроме того, модифицированный TIE-2-лиганд и родственный ему рецептор могут быть использованы в тест-системах для идентификации дополнительных агонистов или антагонистов этого рецептора.

Предпосылки изобретения

Клеточное поведение, ответственное за развитие, поддержание и репарацию дифференцированных клеток и тканей, регулируется, в значительной части, межклеточными сигналами, передаваемыми через факторы роста и подобные лиганды и их рецепторы. Рецепторы локализованы на клеточной поверхности клеток-респондентов и они связывают пептиды и полипептиды, известные как факторы роста, а также другие гормоноподобные лиганды. Результатом этого взаимодействия являются быстрые биохимические изменения в клетках-респондентах, а также быстрая и долгосрочная корректировка экспрессии клеточных генов. Некоторые рецепторы, связанные с различными клеточными поверхностями, могут связывать специфические факторы роста.

Фосфорилирование остатков тирозина в белках тирозинкиназами является одним из ключевых способов, при помощи которых сигналы трансдуцируются (переносятся) через цитоплазматическую мембрану. Некоторые известные в настоящее время гены протеинтирозинкиназ кодируют трансмембранные рецепторы для полипептидных факторов роста и гормонов, таких как эпидермальный фактор роста (EGF), инсулин, инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), тромбоцитарные факторы роста (PDGF-A и -В) и фибробластные факторы роста (FGF) (Heldin et al., Cell Regulation, 1:555-566 (1990); Ullrich, et al., Cell, 61:243-254 (1990)). В этом случае эти факторы роста проявляют их активность путем связывания с внеклеточной частью из родственных рецепторов, что приводит к активации внутренней тирозинкиназы, присутствующей на цитоплазматической части этого рецептора. Рецепторы факторов роста эндотелиальных клеток представляют особый интерес вследствие возможного участия факторов роста в некоторых важных физиологических и патологических процессах, таких как образование и развитие сосудов, ангиогенез, атеросклероз и воспалительные заболевания (Folkman, et al., Science, 235:442-447 (1987)). Рецепторы некоторых гемопоэтических факторов роста также являются тирозинкиназами; они включают в себя c-fms, который представляет собой рецептор колониестимулирующего фактора роста, Sherr, et al., Cell, 41:665-676 (1985), и c-kit, рецептор недифференцированного гемопоэтического фактора роста, сообщенный в Huang, et al., Cell, 63:225-233 (1990).

Рецепторные тирозинкиназы были подразделены на эволюционные подсемейства на основе характерной структуры их эктодоменов (Ullrich, et al., Cell, 61:243-254 (1990)). Такие подсемейства включают в себя EGF-рецептор-подобную киназу (подкласс I) и инсулиновый рецептор-подобную киназу (подкласс II), каждая из которых содержит повторяющиеся гомологичные обогащенные цистеином последовательности в их внеклеточных доменах. Одна обогащенная цистеином область была также обнаружена во внеклеточных доменах eph-подобных киназ. Hirai, et al., Science, 238:1717-1720 (1987); Lindberg, et al., Mol. Cell. Biol., 10:6316-6324 (1990); Lhotak, et al., Mol. Cell. Biol., 11:2496-2502 (1991). PDGF-рецепторы так же, как и c-fms- и c-kit-рецепторные тирозинкиназы, могут быть сгруппированы в подкласс III; тогда как FGF-рецепторы образуют подкласс IV. Типичными для членов обоих этих подклассов являются внеклеточные единицы укладки, стабилизированные внутрицепочечными дисульфидными связями. Эти так называемые иммуноглобулин-(Ig)-подобные укладки обнаружены в белках суперсемейства иммуноглобулинов, которое содержит большое разнообразие других рецепторов клеточной поверхности, имеющих клеточносвязанные или растворимые лиганды. Williams, et al., Ann. Rev. Immunol., 6:381-405 (1988).

Рецепторные тирозинкиназы различаются по их специфичности и аффинности. Как правило, рецепторные тирозинкиназы являются гликопротеинами, которые состоят из (1) внеклеточного домена, способного связывать специфический фактор (факторы) роста; (2) трансмембранного домена, который обычно находится в альфа-спиральной части этого белка; (3) юкстамембранного (околомембранного) домена, где рецептор может регулироваться, например, фосфорилированием белка; (4) тирозинкиназного домена, который является ферментативным компонентом рецептора; и (5) карбоксиконцевого хвоста, который во многих рецепторах участвует в распознавании и связывании субстратов для тирозинкиназы.

Сообщалось, что такие процессы, как альтернативный сплайсинг экзонов и альтернативный выбор промотора гена или сайтов полиаденилирования, способны производить несколько отличающихся полипептидов из одного и того же гена. Эти полипептиды могут содержать или не содержать различные домены, перечисленные выше. Вследствие этого некоторые внеклеточные домены могут экспрессироваться в виде отдельных, секретируемых белков и некоторые формы рецепторов могут не иметь тирозинкиназного домена и содержат только внеклеточный домен, встроенный в цитоплазматическую мембрану через трансмембранный домен плюс короткий карбоксиконцевой хвост.

Ген, кодирующий трансмембранную тирозинкиназу эндотелиальных клеток, первоначально идентифицированный при помощи RT-PCR как гомологичный неизвестной тирозинкиназе кДНК-фрагмент из лейкозных клеток человека, был описан Partanen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8913-8917 (1990). Этот ген и кодируемый им белок были названы "TIE", что является аббревиатурой для "тирозинкиназы с доменами гомологии Ig и EGF". Partanen, et al., Mol. Cell. Biol., 12:1698-1707 (1992).

Сообщалось, что мРНК присутствует во всех фетальных тканях человека и эмбриональных тканях мышей. При исследовании мРНК была локализована в сердечных и сосудистых эндотелиальных клетках. Конкретно, мРНК была локализована в эндотелиях кровеносных сосудов и эндокарде 9,5-18,5-дневных мышиных эмбрионов. Усиленная экспрессия была обнаружена во время образования новых сосудов, связанного с развитием овариальных фолликулов и грануляционной (зернистой) ткани в кожных ранах. Korhonen, et al., Blood, 80:2548-2555 (1992). Таким образом, предполагалось, что TIE играют роль в ангиогенезе, что является важным для разработки способов лечения твердых опухолей и некоторых других ангиогенеззависимых заболеваний, таких как диабетическая ретинопатия, псориаз, атеросклероз и артрит.

Сообщалось, что два структурно родственных крысиных TIE-рецепторных белка кодируются отличающимися генами с близкими профилями экспрессии. Один ген, названный -1, является крысиным гомологом человека. Maisonpierre, et al., Oncogene, 8:1631-1637 (1993). Другой ген, -2, может быть крысиным гомологом мышиного гена tek, который, как сообщалось, подобно , экспрессируется в мышах исключительно в эндотелиальных клетках и их предполагаемых клетках-предшественниках. Dumont, et al., Oncogene, 8:1293-1301 (1993). Человеческий гомолог -2 описан в Ziegler, U.S. Patent No. 5447860, issued September 5, 1995 (где он называется как "ork"), который включен во всей полноте здесь в качестве ссылки.

Было обнаружено, что оба гена в большом масштабе экспрессируются в эндотелиальных клетках эмбриональных и постнатальных тканей. Значительные уровни -2-транскриптов присутствовали также в других популяциях эмбриональных клеток, в том числе в эпителии хрусталика, эпикарде сердца и участках мезенхимы. Maisonpierre, et al., Oncogene, 8:1631-1637 (1993).

Преобладающая экспрессия TIE-рецептора в васкулярном эндотелии предполагает, что TIE играет роль в развитии и поддержании сосудистой системы. Это могло бы играть роль в определении эндотелиальных клеток, пролиферации, дифференцировке и миграции клеток и превращении в васкулярные элементы. Анализы мышиных эмбрионов, недостаточных по TIE-2, иллюстрируют его важное значение в ангиогенезе, в частности для образования сети кровеносных сосудов в эндотелиальных клетках. Sato T.N., et al., Nature 376:70-74 (1995). В зрелой сосудистой системе TIE могли бы функционировать в выживании эндотелиальных клеток, поддержании и ответных реакциях на патогенные воздействия.

TIE-рецепторы экспрессируются также в незрелых гемопоэтических стволовых клетках, В-клетках и подсерии мегакариоцитов, что предполагает, таким образом, роль лигандов, которые связывают эти рецепторы, в раннем гематопоэзе, в дифференцировке и/или пролиферации В-клеток и в пути дифференцировки мегакариоцитов. Iwama, et al., Biochem. Biophys. Research Communications 195:301-309 (1993); Hashiyama, et al., Blood 87:93-101 (1996); Batard, et al., Blood 87:2212-2220 (1996).

Сущность изобретения

Данное изобретение обеспечивает композицию, содержащую модифицированный TIE-2-лиганд, по существу не содержащий других белков. В применении здесь модифицированным лигандом TIE-2 называют лиганд TIE-семейства лигандов, характерные представители которого включают в себя лиганды TL1, TL2, TL3 и TL4, описанные здесь, которые были изменены добавлением, делецией или заменой одной или нескольких аминокислот или посредством мечения, например, Fc-частью человеческого IgG-1, но которые сохраняют их способность связывать TIE-2-рецептор. Модифицированный TIE-2-лиганд включает в себя также химерный TIE-2-лиганд, содержащий, по меньшей мере, часть первого TIE-2-лиганда и часть второго TlE-2-лиганда, который отличается от первого. В качестве неограничительного примера первый TIE-2-лиганд является TL1, а второй TIE-2-лиганд является TL2. Данное изобретение рассматривает другие комбинации с использованием дополнительных членов семейства лигандов TIE-2. Например, возможны другие комбинации для создания химерного TIE-2-лиганда, в том числе, но не только, комбинации, в которых первый лиганд выбран из группы, состоящей из TL1, TL2, TL3 и TL4, и второй лиганд, отличающийся от первого лиганда, выбран из группы, состоящей из TL1, TL2, TL3 и TL4.

Данное изобретение обеспечивает также выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую модифицированный TIE-2-лиганд. В одном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует TIE-2-лиганд TIE-семейства лигандов, характерные представители которого включают в себя лиганды TL1, TL2, TL3 и TL4, описанные здесь, которые были изменены добавлением, делецией или заменой одной или нескольких аминокислот или посредством мечения, например, Fc-частью человеческого IgG-1, но которые сохраняют их способность связывать TIE-2-рецептор. В другом варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует модифицированный TIE-2-лиганд, который представляет собой химерный TIE-2-лиганд, содержащий, по меньшей мере, часть первого TIE-2-лиганда и часть второго TIE-2-лиганда, который отличается от первого. В качестве неограничительного примера первый TIE-2-лиганд является TL1, а второй TIE-2-лиганд является TL2. Данное изобретение рассматривает другие комбинации с использованием дополнительных членов семейства лигандов TIE-2. Например, возможны другие комбинации, в том числе, но не только, комбинации, в которых выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует модифицированный TIE-2-лиганд, который представляет собой химерный TIE-2-лиганд, содержащий часть первого лиганда, выбранного из группы, состоящей из TL1, TL2, TL3 и TL4, и часть второго лиганда, отличающегося от первого лиганда, выбранного из группы, состоящей из TL1, TL2, TL3 и TL4.

Выделенная молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой ДНК, кДНК или РНК. Данное изобретение обеспечивает также вектор, содержащий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую модифицированный TIE-2-лиганд. Данное изобретение обеспечивает также систему вектор - хозяин для продуцирования в подходящей клетке-хозяине полипептида, имеющего биологическую активность модифицированного TIE-2-лиганда. Походящей клеткой-хозяином могут быть клетки бактерий, насекомых или млекопитающего. Данное изобретение обеспечивает также способ получения полипептида, обладающего биологической активностью модифицированного TIE-2-лиганда, который предусматривает выращивание клеток системы хозяин - вектор в условиях, позволяющих продуцирование этого полипептида и извлечение полученного таким образом полипептида.

Описанное здесь изобретение, касающееся выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный TIE-2-лиганд, обеспечивает далее разработку этого лиганда в качестве терапевтического средства для лечения пациентов, страдающих от нарушений, в которых участвуют клетки, ткани или органы, экспрессирующие TIE-2-рецептор. Данное изобретение обеспечивает также антитело, которое специфически связывает такую терапевтическую молекулу. Это антитело может быть моноклональным или поликлональным. Данное изобретение обеспечивает также способ применения такого моноклонального или поликлонального антитела для измерения количества терапевтической молекулы в пробе, взятой из пациента, для целей мониторинга хода терапии.

Данное изобретение обеспечивает также антитело, которое связывает модифицированный TIE-2-лиганд, описанный выше. Это антитело может быть моноклональным или поликлональным. Таким образом, данное изобретение обеспечивает, кроме того, терапевтические композиции, содержащие антитело, которое специфически связывает модифицированный TIE-2-лиганд, в фармацевтически приемлемом носителе. Данное изобретение обеспечивает также способ ингибирования роста кровеносных сосудов в млекопитающих введением эффективного количества терапевтической композиции, содержащей антитело, которое специфически связывает модифицированный TIE-2-лиганд, описанный здесь, в фармацевтически приемлемом носителе.

Данное изобретение обеспечивает далее терапевтические композиции, содержащие модифицированный TIE-2-лиганд, описанный здесь, в фармацевтически приемлемом носителе. Данное изобретение обеспечивает также способ усиления образования новых сосудов в пациенте введением эффективного количества терапевтической композиции, содержащей активирующий рецептор модифицированный TIE-2-лиганд, описанный здесь, в фармацевтически приемлемом носителе. В одном варианте этот способ может быть применен для лечения ишемии. Еще в одном в варианте активирующий рецептор модифицированный TIE-2-лиганд, описанный здесь, используют отдельно или в сочетании с другими гемопоэтическими факторами для стимуляции пролиферации или дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток, В-клеток или мегакариоцитов.

Альтернативно данное изобретение обеспечивает конъюгирование модифицированного TIE-2-лиганда с цитотоксическим агентом и терапевтическую композицию, приготовленную на основе этого конъюгата. Далее, изобретение обеспечивает слитый белок рецептортело (receptorbody), который специфически связывает модифицированный TIE-2-лиганд, в фармацевтически приемлемом носителе. Данное изобретение обеспечивает также способ ингибирования роста кровеносных сосудов в млекопитающем введением эффективного количества рецептортела, которое специфически связывает модифицированный TIE-2-лиганд, в фармацевтически приемлемом носителе.

Данное изобретение обеспечивает также антагонист TIE-2-рецептора, а также способ ингибирования биологической активности TIE-2 в млекопитающем, предусматривающий введение этому млекопитающему эффективного количества антагониста TIE-2. Согласно данному изобретению антагонистом может быть модифицированный TIE-2-лиганд, описанный здесь, который связывается с TIE-2-рецептором, но не активирует его.

Краткое описание чертежей

Фиг.1А и 1В - TIE-2-рецептортело (TIE-2-RB) ингибирует развитие кровеносных сосудов в эмбриональной куриной хориоаллантоисной мембране (САМ). Один кусочек ресорбируемого желатина (Gelfoam), пропитанного 6 мкг RB вставляли непосредственно под САМ 1-дневных куриных эмбрионов. После 3 дополнительных дней инкубирования 4-дневные эмбрионы и окружающие их САМ удаляли и исследовали. Фиг.1А: эмбрионы, обработанные EHK-1-RB (rEHK-1 ecto/hIgG1 Fc), были жизнеспособными и обладали нормально развитыми кровеносными сосудами в окружающей их САМ. Фиг.1В: все эмбрионы, обработанные TIE-2-RB (r TIE-2-RB ecto/hIgG1 Fc), были мертвыми, уменьшенными в размере и почти полностью лишены окружающих кровеносных сосудов.

Фиг.2 - вектор pJFE14.

Фиг.3 - рестрикционная карта gt10.

Фиг.4 - последовательность нуклеиновой кислоты и расшифрованная аминокислотная последовательность (однобуквенный код) человеческого TIE-2-лиганда 1 из клона gt10, кодирующего htie-2-лиганд 1.

Фиг.5 - последовательность нуклеиновой кислоты и расшифрованная аминокислотная последовательность (однобуквенный код) человеческого TIE-2-лиганда 1 из клона T98G.

Фиг.6 - последовательность нуклеиновой кислоты и расшифрованная аминокислотная последовательность (однобуквенный код) человеческого TIE-2-лиганда 2 из клона pBluescript KS, кодирующего человеческий TIE-2-лиганд 2.

Фиг.7 - вестерн-блот, показывающий активацию TIE-2-рецептора TIE-2-лигандом 1 (Дорожка L1), но не TIE-2-лигандом 2 (Дорожка L2) или контроль.

Фиг.8 - вестерн-блот, показывающий, что предварительная обработка клеток НАЕС избытком TIE-2-лиганда 2 (Дорожка 2) препятствует последующей способности разведенного TIE-2-лиганда 1 активировать TIE-2-рецептор (TIE2-R) по сравнению с предварительной обработкой клеток НАЕС средой MOCK (Дорожка 1).

Фиг.9 - вестерн-блот, демонстрирующий способность TL2 конкурентно ингибировать активацию TL1 TIE-2-рецептора, с использованием линии гибридных клеток человека, EA.hy926.

Фиг.10 (a, b, c, d) - представление в виде гистограммы связывания поверхности с иммобилизованным TIE-2-IgG TIE-2-лигандом в кондиционированной С2С12 ras, Rat2 ras, SHEP и T98G концентрированной (10х) среде. Специфическое связывание крысиного TIE-2 (rTIE) продемонстрировано значимым уменьшением активности связывания в присутствии 25 мкг/мл крысиного TIE-2-RB в сравнении с небольшим уменьшением в присутствии растворимого trkB-RB.

Фиг.11 a, b - связывание рекомбинантного человеческого TIE-2-лиганда 1 (hTL1) и человеческого TIE-2-лиганда 2 (hTL2) в супернатантах клеток COS, с поверхностью с иммобилизованным человеческим TIE-2-"рецептортелом" (RB). Специфическое для человеческого TIE-2 связывание определяли инкубированием проб с 25 мкг/мл либо растворимого hTIE-2-RB, либо trk-RB; значимое уменьшение активности связывания наблюдали только для проб, инкубированных с hTIE-2-RB.

Фиг.12 - вестерн-блот, показывающий, что TIE-2-рецептортело (обозначаемое TIE-2-RB или, как здесь, TIE-2-Fc) ингибирует активацию TIE-2-рецепторов TIE-2-лигандом 1 (TL1) в клетках HUVEC, тогда как постороннее рецептортело (TRKB-Fc) не ингибирует эту активацию.

Фиг.13 - агарозные гели, показывающие серийные разведения [неразведенные (1) – 10^-4] продуктов RT-PCR TL1 и TL2, полученных из мышиной эмбриональной печени Е14,5 (Дорожки 1 - общие, Дорожки 3 - стромально обогащенные и Дорожки 4 - гемопоэтические клетки-предшественники c-kit⁺TER119) и мышиного фетального тимуса (Дорожки 2 - общие).

Фиг.14 - агарозные гели, показывающие серийные разведения [неразведенные (1) – 10^-3] продуктов RT=PCR TL1 и TL2, полученных из мышиных фетальных стромальных корковых клеток тимуса (Дорожки 1 - CDR1+/A2B5-) и медуллярных стромальных клеток (Дорожка CDR1-/A2B5+).

Фиг.15 - схематическое представление гипотетической роли ТIЕ-2/ТIЕ-лигандов в ангиогенезе. TL1 представлен (), TL2 представлен (*), TIE-2 представлен (Т), VEGF представлен ([]) и flk-1 (VEGF-рецептор) представлен (V).

Фиг.16 - слайды гибридизации in situ, показывающие характер временной экспрессии TIE-2, TL1, TL2 и VEGF во время ангиогенеза, связанного с фолликулярным развитием и образованием corpus luteum (желтого тела) в яичнике крысы, которая получала сыворотку жеребой кобылы. Колонка 1: ранний преовуляторный фолликул; Колонка 2: преовуляторный фолликул; Колонка 3: ранний corpus luteum; и Колонка 4: атретичный фолликул; Ряд А: блестящая зона; Ряд В: VEGF; Ряд С: TL2; Ряд D: TL1 и Ряд Е: TIE-2-рецептор.

Фиг.17 - сравнение аминокислотных последовательностей зрелого белка TL1 и зрелого белка TL2. Последовательность TL1 является такой же, какая представлена на Фиг.4, за исключением того, что предполагаемая лидерная последовательность была удалена. Подобным образом, последовательность TL2 является такой же, какая представлена на Фиг.6, за исключением того, что предполагаемая лидерная последовательность была удалена. Стрелки указывают остатки Arg49, Cys245 и Аrg264 TL1, которые соответствуют остаткам в положениях аминокислот 69, 265 и 284, соответственно TL1, представленного на Фиг.4.

Фиг.18 - вестерн-блот ковалентной мультимерной структуры TL1 и TL2 (Панель А) и взаимопревращения TL1 в TL2 мутацией одного цистеина (Панель В).

Фиг.19 - типичная кривая связывания TIE-2-IgG с иммобилизованным TL1 в количественном бесклеточном тесте связывания.

Фиг.20 - типичная кривая, показывающая связывание "лигандтела" TIE-2-лиганда 1, содержащего фибриноген-подобный домен лиганда, связанный с Fc-доменом IgG (TL1-fFc), с иммобилизованным эктодоменом TIE-2, в количественном бесклеточном тесте связывания.

Фиг.21 - нуклеотидная и расшифрованная (однобуквенный код) аминокислотная последовательности TIE-лиганда-3. Кодирующая последовательность начинается в положении 47. Фибриноген-подобный домен начинается в положении 929.

Фиг.22 - сравнение аминокислотных последовательностей членов семейства TIE-лигандов. mTL3 = мышиный TIE-лиганд-3; hTL1 = человеческий TIE-2-лиганд 1; chTL1 = куриный TIE-2-лиганд 1; mTL1 = мышиный TIE-2-лиганд 1; mTL2 = мышиный TIE-2-лиганд 2; hTL2 = человеческий TIE-2-лиганд 2. Заключенные в блоки районы указывают консервативные районы гомологии среди членов этого семейства.

Фиг.23 - нуклеотидная и расшифрованная аминокислотная последовательности (однобуквенный код) ТIЕ-лиганда-4. Стрелка показывает положение нуклеотида 569.

Фиг.24 - нуклеотидная и расшифрованная аминокислотная (однобуквенный код) последовательности химерного TIE-лиганда, обозначенного 1N1C2F (химера 1). Предполагаемая лидерная последовательность кодируется нуклеотидами 1-60.

Фиг.25 - нуклеотидная и расшифрованная аминокислотная (однобуквенный код) последовательности химерного TIE-лиганда, обозначенного 2N2C1F (химера 2). Предполагаемая лидерная последовательность кодируется нуклеотидами 1-48.

Фиг.26 - нуклеотидная и расшифрованная аминокислотная (однобуквенный код) последовательности химерного TIE-лиганда, обозначенного 1N2C2F (химера 3). Предполагаемая лидерная последовательность кодируется нуклеотидами 1-60.

Фиг.27 - нуклеотидная и расшифрованная аминокислотная (однобуквенный код) последовательности химерного TIE-лиганда, обозначенного 2N1C1F (химера 4). Предполагаемая лидерная последовательность кодируется нуклеотидами 1-48.

Подробное описание изобретения

Как описано более детально ниже, заявители создали новые модифицированные TIE-2-лиганды, которые связывают TIE-2-рецептор. Данное изобретение обеспечивает композицию, содержащую модифицированный TIE-2-лиганд, по существу не содержащий других белков. В применении здесь TIE-2-лигандом называют лиганд TIE-семейства лигандов, характерные представители которого включают в себя лиганды ТL1, TL2, TL3 и TL4, описанные здесь, которые были изменены добавлением, делецией или заменой одной или нескольких аминокислот или мечением, например, Fc-частью человеческого IgG-1, но которые сохраняют их способность связывать TIE-2-рецептор. Модифицированный TIE-2-лиганд включает в себя также химерный TIE-2-лиганд, содержащий, по меньшей мере, часть первого TIE-2-лиганда и часть второго TIE-2-лиганда, который отличается от первого. В качестве неограничительного примера первым TIE-2-лигандом является ТL1 и вторым лигандом является TL2. Изобретение рассматривает также другие комбинации с использованием дополнительных членов семейства TIE-2-лигандов. Например, возможны другие комбинации для создания химерного TIE-2-лиганда, в том числе, но не только, комбинации, в которых первый лиганд выбран из группы, состоящей из ТL1, TL2, TL3 и TL4, и второй лиганд, отличающийся от первого лиганда, выбран из группы, состоящей из TL1, TL2, TL3 и TL4.

Данное изобретение обеспечивает также выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую модифицированный TIE-2-лиганд. В одном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует TIE-2-лиганд TIE-семейства лигандов, характерные представители которого включают в себя лиганды TL1, TL2, TL3 и TL4, описанные здесь, которые были изменены добавлением, делецией или заменой одной или нескольких аминокислот или посредством мечения, например, Fc-частью человеческого IgG-1, но которые сохраняют их способность связывать TIE-2-рецептор. В другом варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует модифицированный TIE-2-лиганд, который представляет собой химерный TIE-2-лиганд, содержащий, по меньшей мере, часть первого TIE-2-лиганда и часть второго TIE-2-лиганда, которая отличается от первой. В качестве неограничительного примера, первый TIE-2-лиганд является TL1, а второй TIE-2-лиганд является TL2. Данное изобретение рассматривает другие комбинации с использованием дополнительных членов семейства лигандов TIE-2. Например, возможны другие комбинации, в том числе, но не только, комбинации, в которых выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует модифицированный TIE-2-лиганд, который представляет собой химерный TIE-2-лиганд, содержащий часть первого лиганда, выбранного из группы, состоящей из TL1, TL2, TL3 и TL4, и часть второго лиганда, отличающегося от первого лиганда, выбранного из группы, состоящей из TL1, TL2, TL3 и TL4.

Данное изобретение включает в себя модифицированные TIE-2-лиганды и их аминокислотные последовательности, а также их функционально эквивалентные варианты, а также белки или пептиды, включающие в себя мутанты с заменами, делеционные или инсерционные мутанты описанных последовательностей, которые связывают TIE-2-рецептор и действуют как его агонисты или антагонисты. Такие варианты включают в себя варианты, в которых аминокислотные остатки заменены на остатки в последовательности, приводящей к молчащему изменению. Например, один или несколько аминокислотных остатков в этой последовательности могут быть заменены другой аминокислотой (аминокислотами) одинаковой полярности, которая действует как функциональный эквивалент, что приводит к молчащему изменению. Замены для аминокислот в этой последовательности могут быть выбраны из других членов того класса, к которому принадлежит эта аминокислота. Например, класс неполярных (гидрофобных) аминокислот включает в себя аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярные нейтральные аминокислоты включают в себя глицин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают в себя аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают в себя аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту.

В объем данного изобретения включены также белки или их фрагменты или производные, которые проявляют ту же самую или сходную активность, что и модифицированные TIE-2-лиганды, описанные здесь, и производные, которые дифференциально модифицированы во время или после трансляции, например гликозилированием, протеолитическим расщеплением, связью с молекулой антитела или другим клеточным лигандом и т.д. Функционально эквивалентные молекулы включают в себя также молекулы, которые содержат модификации, в том числе N-концевые модификации, которые возникают вследствие экспрессии в определенном рекомбинантном хозяине, такие как, например, N-концевое метилирование, которое имеет место в некоторых бактериальных системах экспрессии (например, Е.соli).

Данное изобретение включает в себя также нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки, описанные здесь в качестве модифицированных TIE-2-лигандов, а также клетки-хозяева, в том числе дрожжи, бактерии, вирусы и клетки млекопитающих, которые сконструированы генетически для получения этих белков, например, трансфекцией, трансдукцией, инфекцией, электропорацией или микроинъекцией нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированные TIE-2-лиганды, описанные здесь, в подходящем экспрессирующем векторе. Данное изобретение включает в себя также введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированные TIE-2-лиганды, с применением способов генной терапии, как описано, например, в Finkel and Epstein FASEB J. 9:843-851 (1995); Guzman, et al., PNAS (USA) 91:10732-10736 (1994).

Специалисту в данной области будет также понятно, что данное изобретение включает в себя последовательности ДНК и РНК, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, кодирующей TIE-2-лиганд, в условиях умеренной строгости, определенных, например, в Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 Ed., Vol.1, pp. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Так, молекула нуклеиновой кислоты, рассматриваемая данным изобретением, включает в себя молекулу, имеющую нуклеотидную последовательность, расшифрованную из аминокислотной последовательности модифицированного TIE-2-лиганда, полученного, как описано выше, а также молекулу, имеющую последовательность нуклеотидов, которая гибридизуется с такой нуклеотидной последовательностью, и также нуклеотидную последовательность, которая является вырожденной последовательностью вышеуказанных последовательностей как результат вырожденности генетического кода, но которая кодирует лиганд, связывающий TIE-2-рецептор и имеющий аминокислотную последовательность и другие первичные, вторичные и третичные характеристики, которые достаточно дублируют модифицированный TIE-2-лиганд, описанный здесь, так что эта молекула имеет ту же самую биологическую активность, что и активность модифицированного TIE-2-лиганда, описанного здесь.

Данное изобретение обеспечивает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую модифицированный TIE-2-лиганд, который связывает и активирует TIE-2-рецептор, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую TIE-2-лиганд 1, в которой часть нуклеотидной последовательности, которая кодирует N-концевой домен TIE-2-лиганда 1, заменена нуклеотидной последовательностью, которая кодирует N-концевой домен TIE-2-лиганда 2. Данное изобретение обеспечивает также такую молекулу нуклеиновой кислоты с дополнительной модификацией, так что часть нуклеотидной последовательности, кодирующей скрученный спирально домен TIE-2-лиганда 1, заменена нуклеотидной последовательностью, кодирующей скрученный спирально домен TIE-2-лиганда 2.

Данное изобретение обеспечивает также выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую модифицированный TIE-2-лиганд, который связывает и активирует TIE-2-рецептор, включающую в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую TIE-2-лиганд 1, в которой часть нуклеотидной последовательности, кодирующая N-концевой домен TIE-2-лиганд 1, заменена нуклеотидной последовательностью, кодирующей N-концевой домен TIE-2-лиганд 2, и которая дополнительно модифицирована таким образом, что она кодирует отличающуюся аминокислоту вместо остатка цистеина, кодируемого нуклеотидами 784-787, как показано на Фиг.27. Остаток цистеина предпочтительно заменен остатком серина. В другом варианте молекула нуклеиновой кислоты дополнительно модифицирована для кодирования другой аминокислоты вместо остатка аргинина, кодируемого нуклеотидами 199-201, как показано на Фиг.27. Остаток аргинина предпочтительно заменен остатком серина.

Данное изобретение обеспечивает также выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую модифицированный TIE-2-лиганд, который связывает и активирует TIE-2-рецептор, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую TIE-2-лиганд 1, которая модифицирована таким образом, чтобы кодировать другую аминокислоту вместо остатка цистеина в положении аминокислоты 245. Остаток цистеина предпочтительно заменен остатком серина.

Данное изобретение обеспечивает далее выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую модифицированный TIE-2-лиганд, который связывает, но не активирует TIE-2-рецептор, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую TIE-2-лиганд 1, в которой часть нуклеотидной последовательности, кодирующей N-концевой домен TIE-2-лиганда 1, делетирована. Данное изобретение обеспечивает также такую молекулу нуклеиновой кислоты, дополнительно модифицированную таким образом, что часть нуклеотидной последовательности, кодирующая скрученный спирально домен TIE-2-лиганда 1, делетирована и часть, кодирующая фибриноген-подобный домен, слита в рамке считывания с нуклеотидной последовательностью, кодирующей константную область человеческого иммуноглобулина гамма-1 (Fc IgG1).

Данное изобретение обеспечивает далее выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую модифицированный TIE-2-лиганд, который связывает, но не активирует, TIE-2-рецептор, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую TIE-2-лиганд 2, в которой часть нуклеотидной последовательности, кодирующей N-концевой домен TIE-2-лиганда 2, делетирована. Данное изобретение обеспечивает также такую молекулу нуклеиновой кислоты, дополнительно модифицированную таким образом, что часть нуклеотидной последовательности, кодирующей скрученный спирально домен TIE-2-лиганда 2, делетирована и часть, кодирующая фибриноген-подобный домен, слита в рамке считывания с нуклеотидной последовательностью, кодирующей константную область человеческого иммуноглобулина гамма-1 (Fc IgG1).

Данное изобретение обеспечивает далее выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую модифицированный TIE-2-лиганд, который связывает, но не активирует, TIE-2-рецептор, содержащу