Средства и способ получения гемопоэтического белка

Средства и способ получения гемопоэтического белка

Реферат

 

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано в медико-биологической промышленности. Путем скрининга кДНК-библиотеки мыши изолирована нуклеотидная последовательность, кодирующая белок(тромбопоэтин), обладающий способностью стимулировать MPL-зависимую пролиферацию или дифференцировку предшественников клеток миелоидного или лимфоидного ряда. Сконструированы векторы для экспрессии полученной кодирующей последовательности в клетках дрожжей и млекопитающих. Культивирование эукариотических клеток хозяев, трансформированных предложенными экспрессирующими векторами, позволяет получить значительные количества рекомбинантного тромбопоэтина. 8 с. и 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл.

Настоящая заявка представляет собой частично продолжающуюся заявку №08/215,203, поданную 21 марта 1994 года, которая является частичным продолжением заявки №08/203, 197, поданной 25 февраля 1994 года, которая является частичным продолжением заявки №08/196,025, поданной 14 февраля 1994 года. Все эти заявки находятся на рассмотрении и используются в данном документе в качестве ссылок.

Предпосылки к созданию изобретения

Гематопоэзис представляет собой процесс, посредством которого клетки крови растут и развиваются в сторону усложнения из ствольных плюрипотентных клеток. Этот процесс включает в себя сложное взаимодействие факторов роста сложных полипептидов (цитокинез), действующих через мембраносвязанные рецепторы на нужные клетки. Действие цитокинеза приводит к пролиферации (быстрому разрастанию) клеток и их дифференциации как реакции на конкретный цитокин, который, как правило, является рядоспецифическим и/или стадиеспецифическим. Развитие клетки одинарного типа, такой как кровяная пластина (тромбоцид), из ствольной клетки может потребовать скоординированного действия множества цитокинов, действующих в нужной последовательности.

Известные цитокины состоят из интерлейкинов, таких как IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-8 и т.д.; и из факторов, стимулирующих разрастание колоний, таких как G-CSF, M-CSF, GM-CSF, эритропоэтины (ЕРО) и т.д. Как правило, интерлейкины действуют как переносчик иммуной реакции и реакции воспламенения. Факторы, стимулирующие рост колоний, стимулируют пролиферацию клеток костного мозга, приводят в действие созревшие лейкоциты и другими способами создают единую часть реакции реципиента на контрольные заражения воспламеняемостью и инфекцией и иммунологические заражения.

Разнообразные цитокины были выращены, как терапевтические агенты. Например, эритропоэтин, который стимулирует рост эритроцитов, применяется при лечении анемии, возникшей при почечных нарушениях. Некоторые из факторов, стимулирующих рост колоний, применялись в сочетании с химиотерапией рака для ускорения восстановления иммунных систем пациента. Интерлейкин-2,d-интерферон и -интерферон используются при лечении некоторых форм рака. Действия, которые стимулируют мегакариоцитопоэзис и тромбоцитопоээис, были обнаружены в жидкости тела тромбоцитопеничных животных и названы в литературе "тромбопоэтинами" (недавно рассматривались МакДоналдсом в Ехр. Hematol. 16:201-205, 1988 и МакДоналдсом в Am.J.Ped.Hematol.Oncol. 14:8-21, 1992). Несмотря на исследования, проводимые более трех десятилетий, фактор или Факторы, ответственные за эти процессы, не были четко охарактеризованы, частично из-за отсутствия хороших источников, хороших проб для анализов и частично из-за недостатка сведений о месте производства. Слабые нарушения кровотечения (МВР), связанные с дисфункцией тромбоцитов, встречаются сравнительно часто (Бекман, Семинары по Гематологии 17:292-305, 1980), как, например, ряд врожденных нарушений функций тромбоцитов, в том числе синдром бернарда-Сульера (дефицит GРТbтромбоцитов), тромбастения Гланзмана (дефицит GPIIb и GPIIIa), врожденная афибриногенемия (сниженное количество или полное отсутствие фибриногенов в плазме и тромбоцитах) и синдром серых тромбоцитов (отсутствие -гранул). Кроме того, существует еще ряд нарушений, связанных с секрецией тромбоцитов, дефицит пула хранения, аномалии пути аракидоновой тромбоцитной кислоты, дефицит циклооксигеназы тромбоцитов и синтетазы тромбоксана и дефекты активации тромбоцитов (рассматривалось Рао и Холмсеном, Семинар по гематологии 23:102-118, 1986 г.). По сей день молекулярная основа всех этих дефектов не совсем понятна.

Изоляция и изучение свойств протеинов тромбоцитов дали бы неоценимую возможность разъяснить наличие дефектов при многих дисфункциях тромбоцитов. Главным препятствием на пути к подробному молекулярному анализу является сложность получения mPHK из тромбоцитов или из их предшественников. Тромбоциты лишены ядер и транскрипций. След mPHK, связанный с тромбоцитами, трудно изолировать и он часто подвергается деградации. Создание библиотек до этого требовало большого количества тромбоцитов, обычно от 25 до 250 единиц цельной крови (Ицуми и др. Рrос. Natl. Acad.Sci.USA 87:7477-7481, 1989: Вики и др.. Thrombosis and Haemostasis 61:448-453, 1989; и Венджер и др. Blood 73:1498-1503, 1989) или форезии (кратковременного использования другого организма для передвижения) пациентов с повышенным содержанием тромбоцитов в крови из-за тромбоцитомии (Рот и др. Biochem.Biophys. Res. Соmm. 160:705-710, 1989). В случаях, когда тромбоцито-специфические сДНК были изолированы целиком от образцов mPHK и, вероятно, представляли собой только малые части от всего спектра кодирования тромбоцитов.

Другим путем создания библиотеки сДНК тромбоцитов является изоляция и создание библиотеки из mPHK, изолированного от мегакариоцитов, непосредственных предшественников тромбоцитов. Мегакариоциты являются полиплоидными клетками и, возможно, содержат mPHK, кодирующий весь хромосомный набор тромбоцитных и мегакариоцитных протеинов. Однако оказалось трудно изолировать мегакариоциты, если они в довольно большом количестве, и сохранить относительную их чистоту.

Недавние успехи молекулярной биологии в значительной степени прояснили гематопоэзис, но в то же время показали, что этот процесс чрезвычайно сложен. Хотя свойства многих цитокин уже определены и многие из них уже нашли клиническое применение, сохраняется необходимость в дополнительных агентах, которые могли бы стимулировать пролиферацию и дифференциацию предшественников милоидов и лимпоидов и производство зрелых кровяных клеток. Особая нужда ощущается в веществах, которые стимулируют развитие и пролиферацию клеток мегакариоцитного ряда, включая тромбоциты. Есть также потребность в веществах, которые могли бы быть использованы в лечении разного вида цитопении, в том числе тромбоцитопении, аномально низкого количества циркулирующих тромбоцитов (менее чем 110⁵ тромбоцитов/мм³) и других нарушений в области тромбоцитов. Настоящее изобретение позволяет удовлетворить все эти потребности и предлагает дополнительные преимущества.

Краткое изложение существа изобретения

Задачей настоящего изобретения является обеспечение изолированных протеинов с гематопоэтической активностью.

Другой задачей данного изобретения является предоставление способов производства протеинов с гематопоэтической активностью, а также изолированных молекул ДНК, векторов и клеток, которые можно использовать в осуществлении этих способов.

Другой задачей данного изобретения является обеспечение антителами, которые фиксируют эпитоп (антигенную детерминанту) на гематопоэтическом протеине.

Еще одной задачей данного изобретения является создание способов стимулирования продуцирования мегакариоцитов, тромбоцитов и нейтрофилов у млекопитающих, в том числе и у человека.

Еще одной задачей данного изобретения является обеспечение разноообразных инструментов, которые можно применять при изучении роста клеток костного мозга, дифференциации и пролиферации; и при определении болезней, которые характерны отклонениями в развитии клеток костного мозга, их дифференциации и пролиферации.

Согласно одному аспекту данного изобретения оно предлагает изолированный протеин, отобранный из группы, состоящей из (а) протеинов, содержащих последовательность аминокислот из SEQ BD NO:2 от аминокислотного остатка 45 до аминокислотного остатка 196; (в) протеинов, содержащих последовательность аминокислот из SЕQ ID NO:2 от аминокислотного остатка 45 до аминокислотного остатка 206; (с) протеинов, содержащих последовательность аминокислот из SEQ ID NO:19 от аминокислотного остатка 22 до аминокислотного остатка 173; (d) протеинов, содержащих последовательность аминокислот из SEQ ID NO:19 от аминокислотного остатка 22 до аминокислотного остатка 175; (е) аллельных варинтов (а), (в), (с) и (d); (f) гомологов образцов (а), (в), (с), (d) или (е), в которых протеин стимулирует пролиферацию и дифференциацию предшественников милоидов и липоидов. В определенных вариантах изобретения протеин содержит последовательность аминокислот из SEQ ID NO:2 от аминокислотного остатка 45 до аминокислотного остатка 379 или последовательность аминокислот из SEQ ID NO:19 от аминокислотного остатка 22 до аминокислотного остатка 353.

Другая особенность данного изобретения заключается в том, что оно предлагает изолированную молекулу полинуклеотида, кодирующую протеин, как указывалось выше. В одном из вариантов изобретения молекула полинуклеотида представляет собой молекулу ДНК, содержащую кодирующую цепь, состоящую из последовательности нуклеотидов из SEQ ID NО:1 от нуклеотида 237 до нуклеотида 692 или последовательности нуклеотидов из SEQ ID NO:18 от нуклеотида 64 до нуклеотида 519. В других вариантах изобретения эта молекула содержит нуклеотиды 237-1241, 174-1241, 105-1241, 105-722, 174-722 или 237-722 из SEQ ID NО:1 или соответствующие области из SEQ ID NO:18. Далее данное изобретение предлагает аллельные варианты указанных молекул и молекул ДНК, кодирующих гематопоэтический протеин, молекулы которого кодируют протеин, который, по крайней мере, на 80% идентичен по последовательности аминокислот протеину, кодированному одной из указанных частей из SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:18. Предлагаются также молекулы, комплементарные этим последовательностям.

Относительно другого отличительного признака данное изобретение предлагает изолированную молекулу ДНК, выбираемую из группы, состоящей из (а) вставки Tcj RI-Xho I плазмида pZGmpT-1081 (ATCC 69566), (в) аллельных вариантов молекул ДНК (а) и (с), кодирующих протеин, который, по крайней мере, на 80% идентичен по последовательности аминокислот протеину, закодированному (а) и (в), в которой изолированная молекула ДНК кодирует протеин с гематопоэтической активностью.

Относительно другого отличительного признака данное изобретение предлагает экспрессируюший вектор, состоящий из следующих связанных в действии элементов: стимулятор (промотор) транскрипции; сегмент ДНК, отобранный из группы, состоящей из (а) сегментов ДНК, кодирующих гематопоэтический протеин и содержащих последовательность нуклеотидов, как показано в SEQ ID NO:1 от нуклеотида 237 до нуклеотида 692, (в) сегменты ДНК, кодирующие гематопоэтический протеин и содержащие последовательность нуклеотидов, как показано в SEQ ID NO:18 от нуклеотитда 64 до нуклеотида 519; (с) аллельных вариантов (а) или (в) и (d) сегментов ДНК, кодирующих гематопоэтический протеин, который, по крайней мере, на 80% идентичен последовательности по аминокислотам протеину, закодированному (а), (в) или (с); и терминатор транскрипции.

Относительно другого отличительного признака данное изобретение предлагает культивируемую клетку, в которую был введен экспрессирующий вектор, как указывалось выше, в который эта клетка экспрессирует гематопоэтический протеин, кодируемый сегментом ДНК. В определенных вариантах изобретения эта клетка представляет собой грибную (грибковую) клетку, клетку млекопитающего или бактериальную клетку.

Относительно другого отличительного признака данное изобретение предлагает введение клетки млекопитающего (не человека) в зародышевую линию, в которую был введен гетерологовый сегмент ДНК, кодирующий гематопоэтический протеин, как описано выше, в которой клетка млекопитающего продуцирует гематопоэтический протеин, кодируемый указанным сегментом ДНК.

Относительно другого отличительного признака данное изобретение предлагает способы для стимулирования продуцирования тромбоцитов в клетке млекопитающего. Эти способы состоят во введении в клетку млекопитающего терапевтическим путем эффективного количества гематопоэтического протеина, отобранного из группы, состоящей из (а) протеинов, содержащих последовательность аминокислот SEQ ID NО:1 от аминокислотного остатка 45 до аминокислотного остатка 196; (в) протеины, состоящие из последовательности аминокислот из SEQ ID NO:19 от аминокислотного остатка 22 до аминокислотного остатка 173; (с) аллельные варианты (а) и (в); и (d) гомологи образцов (а), (в) или (с), в которых протеин стимулирует пролиферацию или дифференциацию предшествеников милоидов или лимпоидов, в сочетании с фармацевтически приемлемым вектром.

Эти и другие отличительные признаки данного изобретения станут очевидными после того, как мы обратимся к приведенному ниже подробному описанию и прилагаемым чертежам.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет собой частично суженную карту вектора pDX. Используемые символы SV40 ori, начало репликации из SV40: SV40 Е, SV40 усилитель (участок ДНК вне гена, усиливающий экспрессию этого гена); MLP, основной поздний стимулятор (промотор) аденовируса; L1-3, трехраздельная лидерная последовательность; ss, сигналы сплайсинга; рА, участок полиаденилирования.

Фиг.2 показывает конструкцию плазмида pBJ3. Используемые символы промоторы TPIp, ТРII; терминатор TPIt, ТРII; ААТ, -1 сДНК антитрипсин; альфа, лидерная последовательность альфа-фактора; mТРО, кодирующая последовательность ТРО мыши.

Подробное описание изобретения

Перед подробным описанием настоящего изобретения полезно определиться с терминологией.

Аллельный вариант: Альтернативная форма гена, которая возникает благодаря мутации, или измененный полипептид, кодируемый мутированным геном. Генные мутации могут быть молчащими (без изменений в кодированном полипептиде) или могут закодировать полипептиды с измененной аминокислотной последовательностью.

сДНК: Комплементарная ДНК, приготовленная по обратной транскрипции РНК матрицы посредника или клон или увеличенная копия такой молекулы. Комплементарная ДНК может состоять из одной нити или из двух нитей.

Экспрессирующий вектор: Молекула ДНК линейная или круговая, которая содержит сегмент, кодирующий полипептид, в действии связанный с дополнительными сегментами, которые дают ему транскрипцию. Такие дополнительные сегменты включают в себя промоторную и терминаторную последовательности и также могут содержать один или более источники репликации, один или более селектируемые маркеры, усилитель, сигнал полиадениляции и т.д., экспрессирующие векторы обычно ответвляются от плазмида или вирусного ДНК или могут содержать элементы того и другого. Термин "в действии связанный" указывает на то, что эти сегменты расположены так, что могут действовать сообща, то есть транскрипция начинается в промоторе и проходит через кодирующий сегмент до терминатора.

Ген: Сегмент хромосомной ДНК, который кодирует полипептидную цепь. Ген содержит одну или более области, кодирующие аминокислоты, которые в некоторых случаях перемежаются с не кодирующими "вставочными последовательностями" (интронами), вместе с фланкирующими, некодирующими областями, которые обеспечивают транскрипцию кодирующей последовательности.

Молекулы, комплементарные: Молекулы полинуклеотидов с комплементарной последовательностью оснований и с обратной ориентацией по сравнению с эталонной последовательностью. Например, последовательность 5’ATGCACGGG 3’ комплементарна 5’ CCCGTGCAT 3’’.

Промотор: Часть гена, на которой начинаются полимеразовые РНК связи и синтез mPHK.

Как указывалось выше, настоящее изобретение предлагает вещества и способы для применения в продуцировании протеинов с гематопоэтической активностью. В настоящем документе термин "гематопоэтический" означает способность стимулировать пролиферацию и/или дифференциацию предшественников милоидов и лимпоидов, что имеет место в стандартных образцах. См., например, Меткалф. Proc.natl.Acad. USA 77:5327-53306, 1980, Меткалф и др. J. Cell.Physiol. 116: 198-206, 1983; и Меткалф и др. Exp Hematol.15:288-295, 1987. Обычно клетки костного мозга инкубируются в присутствии контрольного образца и испытательного образца. Затем эти культуры выбираются для пролиферации и дифференциации клетки путем визуального обследования и/или окрашивания. Особенно предпочтительным образцом является МТТ калориметрический образец Мосмана (J. Immunol.Meth. 65; 55-63, 1983; упоминается в данном документе для справки), более подробно описанный в приведенном ниже примере.

Настоящее изобретение основано частично на обнаружении активности, которая стимулирует рост клеток через рецептор MPL. Этот рецептор (Союри и др. Cell. 73: 1137-1147, 1990) был до этого открытия "сиротским" рецептором, естественный лиганд которого был неизвестен. Посредством процессов клона и мутагенеза, подробно описанного в примерах, приведенных ниже, авторы изобретения вырастили клеточную линию, которая зависит от стимулирования пути MPL, связанного через рецепторы, на выживание и рост и которая была способна к автокринному стимулированию рецептора. Была найдена кондиционированная среда из этих независимых от интерлейкина-3 (IL-3) клеток, которая поддерживает рост клеток, экспрессированных MPL рецептором и зависимых от IL-3. Эксперименты по нейтрализации антитела продемонстрировали, что эта активность возникала не благодаря IL-3 или IL-4, а что нейтрализация могла происходить посредством растворимого типа рецептора. Затем создавалась сДНК библиотека из клеточной линии, независимой от IL-3. ДНК применялась для трансфекции клеток почки детеныша хомяка (ВНК), и среда трансфектантов была исследована на способность к стимуляции пролиферации клетки, независимой от MPL. Положительный клон был изолирован, и продуцировался рекомбинантный лиганд MPL. Было обнаружено, что рекомбинантный протеин стимулирует пролиферацию широкого спектра предшественников милоидов и лимпоидов и, в частности, стимулирует продуцирование мегакариоцитов и нейтрофилов из недифференцированных клеток-предшественников в клетках костного мозга. Кроме того, оказалось, что рекомбинантный протеин стимулирует продуцирование тромбоцитов в испытуемых животных. В свете сказанного, протеин был назван тромбопоэтином (ТРО).

Настоящее изобретение предлагает изолированные молекулы полинуклеотида, кодирующие тромбопоэтин. Полезные для этого молекулы полинуклеотидов содержат mРНК, геномный ДНК, сДНК, синтетический ДНК и молекулы ДНК, вырабатываемые благодаря связи фрагментов от разных источников. Для продуцирования рекомбикантных ТРО предпочтительны молекулы ДНК с недостатком интронов в наиболее экспрессирующих системах. Под словом "изолированный" подразумевается, что молекулы удаляются из своей естественной генетической среды. Таким образом, настоящее изобретение позволяет получить молекулы ДНК, свободные от других генов, с которыми они обычно связаны. В частности, молекулы свободны от периферических или нежелательных кодирующих последовательностей и представлены в виде, удобном для использования внутри созданных генетической инженерией систем, продуцирующих протеин.

Последовательности клонов сДНК, кодирующие типичные протеины мышиного или человеческого ТРО, показаны в SEQ ID NO:1 и в SEQ TD NO:18 соответственно, а соответствующие последовательности аминокислот показаны в SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:19 соответственно. Специалистам в данной области науки будет понятно, что последовательности, показанные в SEQ ID NO:1, 2, 18 и 19 и геномные последовательности, показанные в SEQ ID NO:28 и 29, соответствуют одиночным аллелям мышиного или человеческого гена, и что предполагается существование аллельной вариации. Аллельные вариации последовательностей ДНК, показанные в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:18 и SEQ ID NO:28, в том числе и те, которые содержат молчащие мутации, и те, в которых мутации приводят к изменению последовательности аминокислоты, попадают в объем данного изобретения, так же, как и протеины, которые представляют собой аллельные вариации SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:19. Также будет очевидно, что специалистам в данной области будет нетрудно сконструировать сайты, которые облегчат и упростят манипулирование нуклеотидной последовательностью при помощи альтернативных кодонов.

Мышиные и человеческие последовательности, рассматриваемые в данной заявке, представляют собой очень важные средства для подготовки изолированных молекул полинуклеотидов, кодирующих ТРО протеины из других образцов ("образцов гомологов"). Предпочтительно, чтобы такие образцы гомологов содержали гомологи млекопитающих, такие как протеины коровы, собаки, свиньи, овцы, лошади и, особенно, приматов. В этой области знаний уже известны способы использования последовательной информации от первого образца для клонирования соответствующей полинуклеотидной последовательности из второго образца. См., например, Озабел и др. Current Protocols in Molecular Bioligy, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987. Молекулы ДНК по настоящему изобретению, кодирующие ТРО, как правило, на 60%, а желательно на 80%, а могут на 90-95% и более быть идентичными последовательностям из SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:18 и их аллельным вариантам.

Тромбопоэтиновые молекулы характеризуются способностью специфически связываться с рецептором MPL из того же образца и стимулировать продуцирование тромбоцитов in vivo. В обычном испытуемом животном ТРО способен увеличить уровень тромбоцитов на 100% и более за 10 суток, считая от начала ежедневного введения препарата.

Анализ распределения mРНК показал, что кодирующий ТРО присутствует в некоторых тканях человека и мыши, и особенно его много в легких, печени, сердце, скелетных мышцах и в почках. Таким образом, для того чтобы изолировать гомологи от других образцов, создается библиотека сДНК, желательно из одной из тканей, которая обнаружила свойства продуцировать особенно много mРНК. В данной области науки существуют хорошо известные способы создания библиотеки сДНК. См., например, Самбрук и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е издание. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 и приведенные там ссылки. Для того чтобы определить ТРО, кодирующий молекулы, эта библиотека опробуется на сДНК мыши или человека, рассмотренной в данной заявке, или на его фрагменте, или на одном или более зондах ДНК на основе рассмотренных последовательностей. Особенно полезным являются зонды, содержащие полигонуклиотиды из, по крайней мере, 14 или более нуклеотидов и по длине до 25 и более нуклеотидов, которые, по крайней мере, на 80% идентичны части SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:28 или им комплеметнарным последовательностям той же длины. Желательно зондировать библиотеку с небольшими ограничениями по гибридизации, т.е. при примерно 2SSC (раствор хлорида и нитрата натрия) и при температуре гибридизации примерно 50%. Молекулы, с которыми зонд скрещивается, обнаруживаются по стандартной процедуре обнаружения. Позитивные клоны подтверждаются анализом последовательности и активности, такой как способность фиксировать рецептор гомологового MPL (т.е. рецептора MPL из того же образца, что и сДНК) или стимулировать гематопоэзис из гомологовых клеток костного мозга. Специалисту будет очевидно, что можно использовать и другие способы клонирования.

Полинуклеотидные молекулы, кодирующие ТЗО (включая аллельные варианты и образцы гомологов молекул, рассматриваемых в данном изобретении) можно также изолировать клонированием из клеточной линии, которая продуцирует лиганд MPL и стимулирует рост отокрина. Короче говоря, зависимая от факторов клеточная линия, трансфексируется для экспрессии рецептора MPL (Вигон и др., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:5640-5644, 1992; Шкода и др., EMBO J. 12:2645-2653, 1993; и SEQ ID NО:17), затем мутагенизируется и отбираются фактор-независимые клетки. Затем эти клетки используются в качестве источника ТРО mРНК. Соответствующие линии фактор-независимых клеток содержат линию IL-3-независимых BaF3 клеток (Паласиус и Стейнмец, Cell 41%727-734, 1985; Матей-Прево и др., Mol.Cell.Biol.6: 4133-4135, 1986), FDC-P1 (Хапел и др. Blood 64:786-790, 1984) и МО7Е (Кисc и др. Leukemia 7:235-240, 1993). Линии клеток, зависимых от фактора роста, можно организовать по опубликованным способам (т.е. Гринберг и др., Leukemia Res., 8:363-375, 1984; Декстер и др. и Баум и др. Experimental Hematology Today, 8-th Ann.Mtg. Int. Soc.Exp.Hematol. 1979, 145-156, 1980). Типичная процедура предусматривает извлечение клеток из ткани (костного мозга, селезенки, печени) и культивирование в обычной сывороточной среде, такой как RPMI 1640 с 10% коровьей сывороткой, 15% лошадиной сывороткой и 10^-6 М гидрокортизона. С интервалом в 1-2 недели получаются неприкрепленные клетки и культуры питаются свежей средой. Выращенные, неприкрепленные клетки промываются и культивируются в среде с дополнительным источником фактора роста (т.е. RPMI 1640+5-20% WEHI-3 кондиционная среда в качестве источника IL-3). Эти клетки питаются свежей средой с интервалом в 1-2 недели и увеличиваются по мере роста культуры. По прошествии нескольких недель или нескольких месяцев индивидуальные клоны изолируются высеванием клеток на полутвердую среду (т.е. среду, содержащую метилцеллулозу) или путем ограничения расширения. Фактор-зависимость клонов подтверждается культивированием отдельных клонов при отсутствии фактора роста. Для достижения более частого выращивания фактор-зависимых клеток можно использовать ретровирусную инфекцию или химический мутагенез. Эти фактор-зависимые клетки трансфектируются для экспрессирования рецептора MPL, затем мутагенизируются, скажем, путем химической обработки, облучением УФ-лучами, облучением рентгеновскими лучами или ретровирусным мутагенезом. Мутагенезированные клетки затем культивируются в условиях, в которых выживание клетки зависит от продуцирования фактора роста отокрина, то есть в отсутствии экзогенного фактора роста, который требуется для родительской клетки. Предуцирование ТРО подтверждается результатами скрининг (массовой проверки), например проверкой кондиционированной среды на клетках, экспрессируощих и неэкспрессирующих рецепторы MPL, или проверкой деятельности кондиционной среды в присутствии растворимого рецептора MPL или антител в отличие от известных цитокинов.

Настоящее изобретение также предлагает изолированные протеины, которые по существу гомологичны протеинам из SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:19 и их образцов последовательностей. Под "изолированный" следует понимать протеин, который оказывается в условиях, отличных от своей естественной жизненной среды, от крови или животной ткани. Предпочтительно, чтобы изолированный протеин был по существу свободен от других протеинов, особенно от других протеинов животного происхождения. Желательно получать протеины высокого уровня чистоты, т.е. с более чем 95% чистоты, и еще более предпочтительно с уровнем чистоты более 99%. Термин "по существу гомологичны" используется здесь для указания на то, что протеины с 50% последовательной идентичностью, а более предпочтительно с 60% и еще более предпочтительно с 80% последовательной идентичностью последовательности, показанной в SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:19 или образцам их гомологов. Последовательная идентичность, выраженная в процентах, определяется известными способами. СМ., например, Алтшул и др. Bull. Math. Bio.48:603-616, 1986 и Хеникоф и Хеникоф, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89: 10915-10919, 1992. Короче говоря, две аминокислотные последовательности выравниваются для опитимизации выравнивания с использованием счета, как в спорте, промежутку 10 соответствует выступ 1 и матрицы Хеникофа и Хеникофа "цветение 62", как показано в Таблице 1 (аминокислоты обозначаются стандартными однобуквенными кодами).

Затем следующим образом подсчитывается идентичность, выраженная в процентах:

Фактически гомологические протеины характеризуются тем, что имеют одну или более замен, делиций или добавлений аминокислот. Такие изменения желательно иметь минорными (побочными) по своей природе, то есть быть консервативными заменами аминокислот, что не сильно влияет на укладку или деятельность протеина (см. Таблицу 2); с малыми делициями, обычно от одной до примерно 30 аминокислот; и малая протяженность амино- или карбоксил-терминала, как, например, остаток метионина амино-терминала, малое количество линкерного пептида до 20-25 остатков или малая протяженность, что упрощает процесс очищения, такие как полигистидиновый путь (пространство) антигенный эпитоп или связывающая область. См. в основном Форд и др. Protein Expression and Purification 2:95-107, 1991, что используется в данной заявке в качестве ссылки.

Аминокислоты в ТРО можно обнаружить с помощью методики, известной в данной области науки, например сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (Каннингэм и Уэллс, Science 244, 1081-1085, 1989). В последнем методе одно-аланинная мутация вводится в каждый остаток молекулы и получаемые молекулы-мутанты испытываются на биолгическую активность (например, связывание рецептора, in vitra или in vivo пролиферативная дейтельность) для обнаружения аминокислотных остатков, которые важны для активности молекул. Сайты взаимодействия лиганда и рецептора также могут быть определены путем анализа кристаллической структуры, которая определяется такими методами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография или фотоаффинное мечение. См., например, де Во и др. Science 255:306-312, 1992; Смит и др. J.Mol.Biol. 224:899-904, 1992; Влодавер и др. FEBS Lett. 309:59-64, 1992.

Обычно предсказывают цитокинам 4-альфа спиральную структуру, в которой первая и четвертая спирали являются наиболее важными во взаимодействии лиганда и рецептора и из всех членов семейства лучше всего сохраняются. Взглянув на человеческую аминокислотную ТРО последовательность, показанную в SEQ ID NO:19, можно сказать, что выравнивание цитокиновых последовательностей предполагает, что эти спирали связаны аминокислотными остатками от 29 до 53, 80 и 99, 108 и 130 и 144 и 168 соответственно (границами являются +4 остатка). Границы спиралей мышиных (SEQ ID NO:2) и других нечеловеческих ТРО можно определить выравниванием с человеческой последовательностью. Другая важная структурная особенность ТРО заключается в том, что ТРО содержит цистеиновые остатки в точках 51, 73, 129 и 195 SEQ ID NO:2 (в соответствии с точками 28, 50, 106 и 172 SEQ ID NO:19).

Кроме того, протеины по настоящему изобретению (или их полипептидные фрагменты) могут быть соединены с другими биоактивными молекулами, особенно с другими цитокинами, для создания многофункциональных молекул. Например, область с-терминала тромбопоэтина может быть соединена с другими цитокинами для усиления их биологических свойств или повышения эффективности производства. Молекула тромбопоэтина оказалась составленной из двух областей. Первая (амино-терминальная) область из примерно 150 аминокислот похожа по размеру эритропоэтину и некоторым другим гематопоэтичным цитокинам и напоминает их по структуре. За этой первой областью идет вторая примерно из 180 аминокислот, структура которой не совсем аналогична какой-либо известной в базе данных структуре протеина. Эта вторая область сильно обогащается в гликосиляционных сайтах с N-связями и в остатках серина, пролила и трионина, которые являются отметкой гликосиляционных сайтов с O-связями. Это очевидно высокое содержание карбогидрата предполагает, что эта область должна участвовать в создании более растворимой первой гидрофобной области. Эксперименты указывают на то, что карбогидрат, связанный со второй областью, входит в нужную межклеточную упорядоченную структуру и секрецию протеина во время биосинтеза. Вторая область также может участвовать в стабилизации первой области против протеолитической деградации и/или продления полупериода жизни молекулы и может сделать возможной передачу биологического сигнала или специфическую активность протеина.

Таким образом, настоящее изобретение предлагает серию новых, гибридных молекул, в которых вторая область ТРО соединена по вторым цитокином. Предпочтительно соединение области С-терминала ТРО с С-концом второго цитокина. Желательно соединение осуществлять путем сплайсинга на уровне ДНК, чтобы допустить экспрессию химеровых молекул в системах рекомбинантного продуцирования. Получаемые при этом молекулы затем анализируются на проверку таких свойств, как улучшенная растворимость, повышенная стабильность, продленный полупериод времени жизни или повышенные уровни экспрессии и секреции и фармакодинамики. В конкретные примеры таких химеровых цитокинов входят те, в которых вторая область ТРО соединяется с С-концом ЕРО, G-CSF, GM-CSF, IL-6, IL-3, IL-11. Как указывалось выше, это обычно делается слиянием ДНК. Слитая сДНК затем сабклонируется в соответствующий экспрессирующий вектор и преобразуется или трансфектируется в клетки-хозяева или организмы обычными способами. Получаемые после слияния протеины очищаются обычными хроматографическими методами очистки (например, способом хроматографии), и их свойства сравниваются со свойствами собственного, неслитого родительского цитокина. Далее такие гибридные молекулы могут содержать дополнительные аминокислотные остатки (например, линкеры полипептида) между компонентами протеинов или полипептидов.

Помимо гематопоэтических протеинов, рассмотренных выше, настоящее изобретение касается фрагментов этих протеинов и изолированных полинуклеотидовых молекул, кодирующих этих фрагменты. Особый интерес представляют фрагменты длиной, по крайней мере, в 10 аминокислот, которые связаны с рецепторами MPL, и полипуклеотидные молекулы длиной, по крайней мере, в 30 нуклеотидов, которые кодируют такие полипептиды. Полипептиды такого типа обнаруживаются известными методами скрининга, например переваривание интактных (целых) протеинов или синтезирование небольших, перекрывающихся полипептидов или полинуклеотидов (и экспрессия последних), по желанию в сочетании с методами структурного анализа, рассмотренного выше. Полученные полипептиды затем испытываются на способность специфически связать рецептор MPL и стимулировать пролиферацию клетки через рецептор MPL. Наличие связки определяется известными способами, например такими, которые описаны у Клотца, Science 217:1247, 1982 ("Scatchard analysis"). Короче говоря, радиомеченный испытуемый полипептид инкубируется (выращивается) вместе с MPL клетками, несущими рецептор, при увеличении концентрации немеченных ТРО. Меченый, с граничными клетками, полипептид отделяется от неграничного меченого полипептида центрифугированием через фталатовое масло. Родство испытуемого полипептида определяется вычерчиванием графика зависимости границы со свободными метками (по оси ординат) от граничной метки (по оси абсцисс). Специфичность связи определяется в сравнении с цитокином, отличным от ТРО. Связывание рецепторов также может быть определено путем осаждения испытуемого состава с помощью лишенного движения рецептора MPL (или связанного с лигандом экстрацеллюлярной области). Короче говоря, рецептор или его протеин лишен подвижности на нерастворимой опоре. Испытуемый состав помечается, например, метаболическим способом мечения клетки-хозяина в случае рекомбинантного испытуемого состава, или обычным in vitro способом мечения (например, радио-иодирование). Затем меченый состав комбинируется с лишенным подвижности рецептором, несвязанное вещество удаляется и обнаруживается связанный, меченый состав. В данной области науки известны методы обнаружения разнообразных меток. Стимулирование пролиферации определяется обычным способом путем калориметрического МТТ анализа клеток с рецептором MPL. Полипептиды анализируются на предмет активности при разных концентрациях, обычно в пределах диапазона от 1 нм до 1 мМ.

Предлагаются также более крупные полипептиды вплоть до 50 и более остатков, желательно 100 или более остатков, еще более предпочтительно 140 и более остатков, размером со зрелый протеин. Например, результаты анализа и моделирования аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:2 от остатка 51 до остатка 195 включительно, или в SEQ ID NO:19 от остатка 28 до остатка 172 включительно, предполагают, что эти части молекул представляют собой области, подобные цитокину, способные самоупорядочиваться. Предст