Способ получения биоматериала для использования в офтальмологии

Способ получения биоматериала для использования в офтальмологии

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины. Изобретение характеризуется тем, что используют соединительную ткань животных или человека, которую после механической обработки нарезают на полоски длиной от 1,0 до 3,0 см, шириной от 0,5 до 2,0 см и вырезают сквозные отверстия диаметром 1-2 мм с плотностью не менее 1-3 на 1 см², помещают последовательно в 6% раствор перекиси водорода от 1 до 3 ч, в раствор 4 М мочевины от 15 до 24 часов, затем в 2 М раствор хлорида натрия от 15 до 24 ч, отмывают водой очищенной от 10 до 24 ч и трижды обрабатывают в смеси хлороформа и этилового спирта в соотношении 1:1 от 10 до 24 часов, отмывают водой очищенной от 1 до 10 ч при постоянной смене и перемешивании, высушивают, лиофилизируют и стерилизуют дозой от 1,7 до 2,5 Мрад. Изобретение позволяет повысить качество биоматериала для использования в офтальмологии путем снижения его антигенных свойств и повышения биосовместимости. 1 табл.

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к офтальмологии, и может быть использовано для изготовления материалов при оперативном лечении миопии средней и высокой степени для получения биоматериала для склеропластики, для получения дренажей при оперативном лечении глаукомы и получении растворов коллагена при лечении миопии легкой и средней степени и оперативном лечении пресбиопии.

Известен способ получения биоматериала для использования в офтальмологии, который осуществляется путем обработки биоматериала - перикарда сельскохозяйственных животных, который механически очищают, заливают 0,9% раствором хлорида натрия и дистиллированной водой, после чего помещают в раствор аммиака и этилового спирта, затем отмывают водой и заливают этиловым спиртом (Патент РФ №2054283 от 20 февраля 1996 г.), который выбран за прототип, поскольку наиболее близок по своему техническому решению к предлагаемому изобретению.

Недостатками указанного способа является то, что такая обработка не обеспечивает полное освобождение ткани от антигенов коллагена, липидов, фосфолипидов, липопротеидов и других жиросодержащих веществ, которые присутствуют в указанных тканях в больших количествах и снижают его биосовместимость.

Задачей изобретения является повышение качества биоматериала для использования в офтальмологии путем снижения его антигенных свойств и повышения биосовместимости.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является получение биосовместимого низкоантигенного материала, который может широко использоваться для получения ряда изделий медицинского назначения, таких как материал для склеропластики, антиглаукоматозные дренажи и изделий для хирургического лечения пресбиопии.

Технический результат достигается тем, что используют соединительную ткань животных или человека, которую после механической обработки нарезают на полоски длиной от 1,0 до 3,0 см и шириной от 0,2 до 2,0 см, вырезают сквозные отверстия диаметром 1-2 мм с плотностью не менее 1-3 на 1 см² и помещают последовательно в 6% раствор перекиси водорода от 1 до 3 ч, в раствор 4 М мочевины от 5 до 10 часов, затем в 2 М раствор хлорида натрия от 2 до 10 ч, отмывают водой очищенной от 10 до 24 ч и трижды обрабатывают в смеси хлороформа и этилового спирта в соотношении 1:1 от 10 до 24 ч, отмывают водой очищенной от 1 до 10 ч при постоянной смене и перемешивании, высушивают, лиофилизируют и стерилизуют дозой от 1,7 до 2, 5 Мрад.

Материалом для получения изделий является соединительная ткань ряда органов - твердая мозговая оболочка, перикард, склеральная оболочка глаза человека или животных, перитонеальная оболочка, кожа, кость или интерстициальная оболочка тонкого кишечника. Эти ткани в основном состоят из коллагена I или II типа, который характеризуется низкой растворимостью и высокой коллагенолитической устойчивостью. Этот тип коллагена является наиболее распространенным в изделиях медицинского назначения, имплантируемых в ткани.

Технология приготовления таких биоимплантатов требует начальной механической обработки ткани, когда ткань первоначально очищается от остатков мягких тканей и крови.

После такой обработки ткань нарезают острым инструментом на полоски длиной не менее 1,0, шириной не менее 0,2 см, поскольку эти размеры являются наиболее оптимальными при обработке ткани растворами.

Максимальные размеры полосок или кусочков длиной до 3,0 см и шириной 2,0 см определены опытным путем при обработке тканей с целью отмывки от белков. При завышении размеров возникают трудности с доступностью химических агентов к субстрату и неполное удаление белков и других активных молекул.

После нарезки в ткани вырезают сквозные отверстия диаметром 1-2 мм с плотностью не менее 2-3 на 1 см². Эти отверстия способствуют как лучшей отмывки ткани, так и лучшему ее врастанию в орган или место имлантации.

При диаметре отверстия в ткани менее 1 мм доступность растворов в нее затрудняется или становится невозможной, а при диаметре более 2,0 см механическая прочность ткани снижается. Число отверстий или их плотность должна быть не менее 2-3 отверстий на 1 см², поскольку является оптимальной для обработки и, что самое основное, для лучшей фиксации материала в том органе, куда этот материал помещается. В случае высокой твердости ткани отверстия высверливаются сверлом соответствующего диаметра.

Любая биологическая ткань, которая используется при изготовлении имплантатов, потенциально содержит то или иное количество патогенных бактерий (FISHMAN J. А. (1998). Infection and Xenotransplantation: Developing Strategies to Minimize Risk. Annals NYAS Online 862:52-66). В другом случае биологическая ткань имеет естественную окраску, обусловленную наличием пигментов. С целью первичной деконтаминации и обесцвечивания ткань помещают в 6% раствор перекиси водорода от 1 до 3 ч. При обработке ткани менее 1 ч проходит неполная деконтаминация исходного сырья и неполное обесцвечивание ткани, например склеры. При обработке ткани свыше 3 ч могут начаться структурные изменения стромального коллагена, что может затем отразиться на основных свойствах конечного продукта.

Устойчивость различных типов соединительной ткани, содержащих коллаген к действию растворов, различна по месту воздействия или по доступности белков, или протеогликанов, которые являются основными антигенами ткани. Кроме того, многие из них нарушают или разрушают структуру ткани. К веществам, расщепляющим белки без разрушающего действия на коллаген, относится мочевина, которая применена в качестве протеолитического вещества. Гидролитическая концентрация мочевины 4 М установлена для многих типов белков экспериментально (Hakamata et al "HIFV" 1986 28(5) 71525). При низкой плотности соединительной ткани - склера, твердая мозговая оболочка, перикард, а также при небольших размерах плотной костной пластинки время обработки ткани занимает не менее 15 ч. Меньшее время обработки материала будет недостаточным. Большая плотность ткани и ее большие размеры требуют большего времени обработки до 24 ч. Обработка свыше 24 ч, может приводить к деструкции коллагена.

Для удаления белковых субстратных комплексов применяют обработку материала гипертоническим 2 М раствором хлорида натрия от 15 до 24 ч. Минимальная и максимальная экстракция белков по времени установлена экспериментально по биохимическим анализам.

Вода очищенная - деионизованная вода высокой степени очистки от солей металлов и других примесей является предпочтительнее других типов воды. Время отмывки в воде очищенной определено по определению иона хлорида в смывной порции. Минимальное время отмывки от избытка хлорида натрия определено в 10 ч. Это время выхода комплекса из материала, заметно разбухающего при обработке и соответственно менее плотного по своей структуре. Через 24 ч после отмывки выход соли и белка прекращается.

Качество обработки материала определяли для протегликанов методом Frndel спектрофотометрически по окрашиванию 1,9-диметиленовым синим при длине волны 535 нм.

Выход белка определяли фармакопейным методом по Lowry спектроскопически при длине волны 400 нм и наличие остатков коллагена в смывах методом определения оксипролина по Кьельдалю. Избыток соли определяли качественной реакцией на СГ.

В соединительной ткани содержится значительное количество липидов и их соединений с белками и углеводами. В обработанной ткани могут находиться эндотоксины - липополисахариды активные антигены, которые могут обуславливать различные воспалительные осложнения. Это явилось основой для введения в способ обработку в смеси хлороформа и этилового спирта в соотношении 1:1 на той стадии, когда основная строма материала уже обработана и очищена. Обработку ткани в смеси проводят от 10 до 24 ч, что определяется по количеству содержания липидов на 1 г ткани по сухому весу. Материал обрабатывают в смеси не менее 10 ч поскольку за это время липиды выходят из менее плотной ткани, а через 24 часа от начала обработки их выход из ткани прекращается.

Отмывание материала от смеси проводят трижды водой очищенной при постоянной смене воды на новую и с перемешиванием материала на магнитной мешалке, что позволяет обеспечить лучшую доступность раствору. Для материала с меньшей плотностью - твердая мозговая оболочка, перикард, склера - достаточно отмывать ткань в течение 1 ч, а более плотную ткань, хрящ, кость до 10 ч, поскольку после этого времени спирт в промывной воде не определяется.

После этого материал высушивают при комнатной температуре, лиофилизируют и стерилизуют радиационным способом дозой от 1,7 до 2,5 Мрад.

Краткая технология получения материала

Биологическую ткань очищают от механических примесей и крови, отмывают холодной водой и нарезают на полоски нужного размера, специальной прокаткой делают сквозные перфорации и помещают в 6% раствор перекиси водорода, затем 4 М мочевины, инкубируют в 2 М растворе хлорида натрия, отмывают водой. Отмытый материал помещают в смесь хлороформ : этанол, отмывают водой очищенной, высушивают, лиофилизируют и стерилизуют радиационным методом дозой 1,7-2,5 Мрад.

Приведенные выше действия приводят к снижению антигенности. Доказательства снижения антигенности получали при иммунизации животных материалами, полученными предлагаемым способом.

Кроликов породы шиншилла, 15 животных, иммунизировали внутривенно и внутрибрюшинно водно-солевым экстрактом, выделенным из твердой мозговой оболочки человека (4 животных), перикарда быка (4 животных), склера свиньи (4 животных). В качестве контроля использовали материалы, обработанные по прототипу (8 животных).

На 15 день после иммунизации у животных брали кровь, получали антисыворотку. Материал исследовали по методу Кунса-Уэллера, путем непрямой иммунофлуоресценции на флуоромикроскопе Оптон (Германия), для чего материал резали на криостате и помещали срезы на стекло, наносили антисыворотку в различных разведениях и меченные флуоресцеином антикроличьи Ig овцы, инкубировали в течение 15-30 мин и тщательно отмывали фосфатным буфером, заключали в глицерин и просматривали в микроскопе через отсекающий фильтр при длине волны 440 нм. Результаты этих исследований приведены в таблице.

Таким образом видно, что предлагаемый способ обработки ткани позволяет снизить антигенность материала и таким образом повысить его биосовместимость и уменьшить число послеоперационных осложнений при применении данного материала в хирургической практике.

Для лучшего понимания сущности изобретение поясняется примерами конкретного исполнения.

Пример 1. Приготовление материала для склеропластических операций и хирургического лечения миопии.

Склеру свиньи механически очищают от примесей крови и пигмента и промывают холодной водой. Нарезают на полоски длиной 1,0 см, шириной 0,2 см и прокатывают специальным валиком, которым делают сквозные отверстия диаметром 1 мм с числом не менее 2 на 1 см², споласкивают водой очищенной и помещают в 6% раствор перекиси водорода на 3 ч, споласкивают водой очищенной и помещают в 4 М раствор мочевины при комнатной температуре на 15 ч, отмывают водой очищенной и инкубируют в 2 М растворе хлорида натрия 2 ч и вновь отмывают водой очищенной до 10 ч.

Проводят качественный контроль материала и после этого помещают материал в смесь хлороформ : этанол в соотношении 1:1 на 10 ч.

Затем материал трижды промывают водой очищенной в течение 1 ч, при постоянной смене раствора на новый и постоянном перемешивании.

Проводят контроль на липиды по окраске суданом.

Обработанный таким образом материал высушивают при комнатной температуре, лиофилизируют, упаковывают и стерилизуют дозой 1,7 Мрад.

Аналогично обрабатывают и донорскую склеру человека после соответствующих серологических тестов.

Материал используют для склеропластики при хирургическом лечении миопии и пресбиопии, а также в качестве антиглаукоматозных дренажей.

Пример 2. Приготовление материала для склеропластических операций и операций при макулярной дистрофии

Перикард быка механически очищают от примесей крови и жира и промывают холодной водой, обработки нарезают на полоски длиной 2 см, шириной от 1,0 см и вырезают сквозные отверстия диаметром 1,5 мм с плотностью не менее 2 на 1 см², помещают последовательно в 6% раствор перекиси водорода на 2 ч, промывают водой очищенной и помещают в раствор 4 М мочевины на 16 ч, затем в 2 М раствор хлорида натрия на 16 ч, отмывают водой очищенной от натрия и белка 16 ч. Проводят качественный контроль материала и после этого и трижды обрабатывают в смеси хлороформа и этилового спирта в соотношении 1:1 16 ч. Проводят контроль на липиды по окраске суданом, трижды отмывают водой очищенной 5 ч при постоянной смене и перемешивании, высушивают, лиофилизируют и стерилизуют дозой от 2,0 Мрад. Материал используют для склеропластики при хирургическом лечении миопии и макулярной дистрофии.

Пример 3. Приготовление материала для склеропластических операций.

Твердую мозговую оболочку донора человека после проведения соответствующих серологических тестов механически очищают от примесей крови и жира и промывают холодной водой, обработки нарезают на полоски длиной 3,0 см, шириной 2,0 см и прокатывают специальным валиком, которым делают сквозные отверстия диаметром 1,0 мм с числом не менее 2 на 1 см², споласкивают водой очищенной, помещают последовательно в 6% раствор перекиси водорода на 3 ч, в раствор 4 М мочевины на 24 ч, затем в 2 М раствор хлорида натрия на 24 ч, отмывают водой очищенной до 24 ч и Проводят качественный контроль материала, затем трижды обрабатывают в смеси хлороформа и этилового спирта в соотношении 1:1 до 24 ч, отмывают водой очищенной до 10 ч при постоянной смене и перемешивании. Проводят контроль на липиды по окраске суданом, высушивают, лиофилизируют и стерилизуют дозой 2, 5 Мрад.

Материал используют для склеропластики при хирургическом лечении миопии и для антиглаукоматозных дренажей.

Использование предлагаемого способа позволяет унифицировать технологии по получению высококачественных низкоантигенных биоматериалов для офтальмологии с повышенной биосовместимостью. Применение таких биоматериалов значительно снизит безопасность их применения особенно при длительном нахождении имплантатов в организме.

Формула изобретения

Способ получения биоматериала для использования в офтальмологии, включающий механическую обработку биологической соединительной ткани растворами хлорида натрия и дистиллированной воды, аммиака и этилового спирта, отличающийся тем, что используют соединительную ткань животных или человека, которую после механической обработки нарезают на полоски длиной от 1,0 до 3,0 см, шириной от 0,5 до 2,0 см и вырезают сквозные отверстия диаметром 1-2 мм с плотностью не менее 1-3 на см² помещают последовательно в 6%-ный раствор перекиси водорода от 1 до 3 ч, в раствор 4М мочевины от 15 до 24 ч, затем в 2М раствор хлорида натрия от 15 до 24 ч, отмывают водой очищенной от 10 до 24 ч и трижды обрабатывают в смеси хлороформа и этилового спирта в соотношении 1:1 от 10 до 24 ч, отмывают водой очищенной от 1 до 10 ч при постоянной смене и перемешивании, высушивают, лиофилизируют и стерилизуют дозой от 1,7 до 2,5 Мрад.