Палладий-замещенные производные бактериохлорофилла и их применение

Палладий-замещенные производные бактериохлорофилла и их применение

Реферат

 

Изобретение относится к палладийзамещенным производным бактериохлорофилла формулы I, I' или I"

где А представляет собой ОН, OR₁, -O-(CH₂)_n-Y, -S-(CH₂)_n-Y, -NH-(CH₂)_n-Y, -O-(СН₂)₂-ОН, -NH-(CH₂)₂-NH-BOC или -N(CH₂-CH=CH₂)₂, где R₁ представляет собой Na⁺, K⁺, (Са²⁺)_0,5, (Mg²⁺)_0,5, Li⁺, NH⁺₄, ⁺NH₃-C(CH₂OH)₃,⁺NH₃-CH₂-(CHOH)₄-CH₂OH, ⁺NH₂(СН₃)-СН₂-(СНОН)₄-СН₂OH или ⁺N(C_n'H_2n'+1)₄; R₂ представляет собой Н или C₁-C₁₂ алкил для соединения формулы I', и R₂ представляет собой Н, ОН или COOR₄ для соединения формулы I, где R₄ представляет C₁-C₁₂ алкил или С₃-С₁₂ циклоалкил; R₃ представляет собой Н или C₁-C₁₂ алкил для соединения формулы I', и R₃ представляет собой Н, ОН или C₁-C₁₂ алкил или алкокси для соединения формулы I; n равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6, Y представляет собой -NR'₁NR'₂ или -⁺NR'₁R'₂R'₃X^-, где R'₁, R'₂ и R'₃ каждый независимо от другого представляет собой -СН₃ или -С₂Н₅; Х представляет собой F, Cl, Br или I, n' равно 1, 2, 3 или 4, и где * обозначает асимметричный атом углерода и --- обозначает одинарную насыщенную связь или двойную ненасыщенную связь фармацевтической композиции, обладающей способностью детектирования или лечения опухолей, содержащей, по меньшей мере, одно соединение формулы I, I' или I", трем способам получения соединения формулы I. 5 н. и 16 з.п. ф-лы, 5 табл., 11 ил.

Настоящее изобретение относится к палладийзамещенным производным бактериохлорофилла, способам их получения, промежуточным соединениям для их получения и к фармацевтическим композициям, включающим их, а также к их применению в области in vivo фотодинамической терапии и диагностики и in vitro фотодинамического уничтожения вирусов и микроорганизмов.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ И АББРЕВИАТУРЫ

ВСHl=бактериохлорофилл а (Мg-содержащий 7,8,17,18-тетрагидропорфирин, имеющий фитильную или геранилгеранильную группу в положении 17³, группу СООСН₃ в положении 13², атом Н в положении 13², ацетильную группу в положении 3 и этильную группу в положении 8).

BChlide=бактериохлорофиллид а (С-17²-свободная карбоновая кислота, полученная из ВСhlа).

BPhe=бактериофеофитин а (ВСhl, в котором центральный атом Мg замещен на два атома Н).

BPheid=бактериофеофорбид а (С-17²-свободная карбоновая кислота, полученная из BPhe).

Pd-BPheid=Pd-бактериофеофорбид (С-17²-свободная карбоновая кислота, полученная из BPhe, имеющая центральный атом Pd, группу СООСН₃ в положении 13², атом Н в положении 13², ацетильную группу в положении 3 и этильную группу в положении 8).

Во всем описании для производных бактериохлорофилла используют нумерацию IUPAC. По этой номенклатуре природные бактериохлорофиллы имеют два сложных эфира карбоновых кислот в положениях 13² и 17², однако они являются этерифицированными по положениям 13³ и 17³.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Существует повышенный интерес к применению фотосенсибилизаторов для лечения рака. В соответствии с данной методикой, известной как фотодинамическая терапия (PDT), фотосенсибилизаторы помещают, например, в область опухоли, и в процессе фотосенсибилизации in situ продуцируются соединения, которые вызывают интоксикацию злокачественных клеток.

Фотодинамическая терапия, использующая порфирины и родственные соединения, к настоящему времени имеет довольно продолжительную историю, ранние работы в 1940-х годах показали, что в облученной опухолевой ткани можно вызвать флюоресценцию порфирина. Оказалось, что порфирины накапливаются в данных тканях и являются способными к абсорбции света in situ, обеспечивая способ детектирования опухоли путем определения локализации флюоресценции. Препаратом, широко использующимся на ранних стадиях фотодинамической обработки как с целью детекции, так и с целью лечения, является неочищенное производное гематопорфирина, также называемое гематопорфириновое производное, HpD или производное Lipson, полученное по способу, описанному Lipson с соавторами в J. Natl. Cancer Inst. (1961) 26:(1-8). С данным препаратом была проделана большая работа, и Dougherty и соавторы описали применение данного производного в лечении злокачественных образований (Cancer Res. (1978) 38:2628-2635; J. Natl. Cancer Inst (1979) 62:231-237).

Dougherty и соавторы получили более эффективную форму гематопорфиринового производного, которая включает фрагмент HpD, имеющий аггрегативный вес >10 кДа. Данная форма лекарственного препарата, применимая в фотодинамической терапии, представляет собой заявленный объект патента США 4649151, является коммерчески доступной и проходит клинические испытания.

Установлено, что основные принципы применения светопоглощающих соединений, особенно относящихся к порфиринам, состоят в лечении опухолей при системном введении. Характерная способность данных препаратов разрушать опухоль в противоположность нормальной ткани является результатом эффекта самонаведения данных препаратов на нежелательные клетки. (См., например, Dougherty, T.J. et al., "Cancer: Principles and Practice of Oncology" (1982), V.T. de Vita, Jr., et al., eds. pp 1836-1844). Были сделаны попытки улучшить эффект самонаведения путем образования конъюгатов гематопорфиринового производного с антителами. (См., например, Mew, D., et al., J. Immunol (1983) 130:1473-1477). Механизм умерщвления клеток этими лекарственными препаратами, по-видимому, включает образование синглетного кислорода при облучении (Weishaupt, K.R., et al., Cancer Research (1976) pp. 2326-2329).

Применение гематопорфиринового производного или его активных компонентов при лечении кожных заболеваний с помощью местного введения также было описано в патенте США 4753958. Кроме того, данные лекарственные препараты использовали для стерилизации биологических образцов, содержащих инфекционные организмы, такие как бактерии и вирусы (Matthews, J.L., et al., Transfusion (1988):81-83). Для этой цели также использовали различные другие фотосенсибилизирующие соединения, как изложено, например, в патенте США. №4727027.

В основном способы применения радиационных сенсибилизаторов с разными структурами для избирательного повреждения функционирования биологических субстратов как in vivo, так и in vitro, известны в данной области. Соединения, использующиеся в данных методиках, должны иметь разное сродство к целевым биологическим субстратам, подлежащим повреждению или разрушению, и должны быть способны к абсорбции света так, чтобы облученный лекарственный препарат активировался таким образом, чтобы оказывать повреждающий эффект на находящиеся по соседству композиции и вещества.

Так как всегда желательно оптимизировать проведение лечения и диагностики, проводят поиск различных форм порфириновых лекарственных препаратов, традиционно использующихся в лечении и диагностике. Полагают, что существует множество основных классов фотосенсибилизаторов, включая фталоцианины, соединения, относящиеся к псораленам, и мультициклические соединения, имеющие в общем случае резонансные системы. Наиболее близкими к соединениям, раскрытым в данном документе, являются различные феофорбидные производные, применение которых в фотодинамической терапии было описано в заявке ЕРО 220686, Nihon Metaphysics Company; этилендиаминовые производные, предназначенные для данной цели, описаны в заявке Японии J85/000981, Таmа Seikayaku, К.К., и в заявке Японии J88/004805, которая направлена на 10-гидроксифеофорбид-а. Кроме того, Beems, Е.М., et al., in Photochemistry and Photobiology (1987) 46:639-643 раскрывают применение в качестве фотосенсибилизаторов двух производных бактериохлорофилла-а -бактериохлорофиллин-а (также известный как бактериофеофорбид-а, который утратил остаток фитилового спирта, присутствующего в бактериохлорофилле-а), и бактериохлорин-а (который утратил и фитильную группу и ион Mg). Авторы направили свои усилия на данные производные, так как они имеют преимущества, состоящие в увеличении растворимости в воде по сравнению с бактериохлорофиллом-а.

ЕР 584552 и W0 97/19081, обе от Yeda Research and Development Co. Ltd., описывают производные хлорофилла и бактериохлорофилла и их применение в качестве агентов PDT, а также металлированные бактериохлорофиллы и их получение путем трансметаллирования соответствующих Cd-BChl производных соответственно.

Остается проблема поиска подходящих фотосенсибилизаторов, применимых в фотодинамической терапии и диагностике, оптимальных для конкретных мишеней и конкретной среды. Таким образом, данное изобретение предоставляет дополнительные группы фотосенсибилизирующих соединений, которые являются частью набора вариантов, предназначенных для применения в конкретных терапевтических и диагностических ситуациях.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящее время обнаружено в соответствии с данным изобретением, что соединения формул I, I' или I", приведенных ниже, где А, как определено ниже, представляет заместитель, способный обеспечить эффективный перенос в плазме и проникновение через клеточную мембрану, применяются в качестве агентов PDT и обладают преимуществами, состоящими в увеличении растворимости, стабильности и/или эффективности по сравнению с известными соединениями. Данное изобретение таким образом касается соединений формулы I, I' или I"

где А представляет собой ОН, OR₁,

-O-(CH₂)_n-Y,

-S-(CH₂)_n-Y,

-NH-(CH₂)_n-Y,

-O-(CH₂)₂-NH₂,

-O-(CH₂)₂-OH,

-NH-(CH₂)_n-⁺N о, X^-,

-NH-(CH₂)₂-NH=BOC или

-N-(CH₂-CH=CH₂)₂

где

r₁ представляет собой Na⁺, К⁺, (Ca²⁺)_0,5, (Мg²⁺)_0,5, Li⁺, NH₄⁺₊

⁺NН₃-С(CН₂ОH)₃, ⁺NН₃-СН₂-(СНОН)₄-CH₂OH,

⁺NH₂(CH₃)-CH₂-(CHOH)₄-CH₂OH или

⁺N(C_n,H_2n'+1)₄;

R₂ представляет собой Н, ОН или COOR₄, где R₄ представляет собой C₁-C₁₂ алкил или С₃-С₁₂ циклоалкил;

R₃ представляет собой Н, ОН или C₁-C₁₂ алкил или алкокси;

n равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6,

Y представляет собой -NR'₁R'₂ или -NR'₁R'₂R'₃,X^-, где R'₁, R'₂ и

R'₃ независимо друг от друга представляют собой -СН₃ или -С₂Н₅;

Х представляет собой F, Cl, Вr или I, n' равно 1, 2, 3 или 4,

и где * обозначает ассимметричный атом углерода, и -представляет одинарную насыщенную связь или двойную ненасыщенную связь.

Кроме того, настоящее изобретение касается способов получения вышеуказанных новых соединений.

Таким образом, в одном из аспектов в данном документе описывается способ инициирования повреждения или разрушения целевого биологического субстрата, данный способ включает обработку целевого субстрата количеством соединения формулы I, I' или I", эффективным для фотосенсибилизации упомянутого субстрата, с последующим облучением упомянутого целевого субстрата в интервале длин волн, поглощаемых соединением формулы I, I' или I", в течение времени, эффективного для повреждения или разрушения субстрата.

В другом аспекте данное изобретение таким образом направлено на фармацевтические композиции, включающие по меньшей мере соединение формулы I, I' или I" в качестве активного агента вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Данные композиции применяются для in vivo фотодинамической терапии и диагностики опухолей и для умерщвления клеток, вирусов и бактерий, паразитов и грибков, в образцах и в живых тканях, с помощью хорошо известных фотодинамических методик.

Кроме того, данное изобретение касается применения соединений формулы I, I' или I" для получения фармацевтической композиции, применимой в фотодинамической терапии.

Данное изобретение также касается применения соединений данного изобретения для получения композиций, применимых в диагностике и для ех vivo умерщвления бактерий, паразитов, вирусов и грибков.

Данное изобретение также касается хлорангидрида и ангидрида кислот формул II и III, соответственно приведенных ниже, как промежуточных соединений.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На фигуре 1 показан спектр оптического поглощения Pd-BPheid в смеси ацетон и метанол/К-фосфатный буфер.

На фигурах 2 и 3 показаны соответственно масс-спектры Pd-BPheid низкого и высокого разрешения, полученные методом бомбардировки быстрыми атомами (FAB-MS).

На фигуре 4 показаны зависимые от времени морфологические изменения клеток А431 с Pd-BPheid или BChl-SerOMe после PDT (на фигурах Bchl-Ser обозначает BChl-SerOMe, серилметиловый эфир BChl).

На фигуре 5 показана фототоксичность Pd-BPheid и BChl-SerOMe, анализированная на клетках ECV-304.

На фигуре 6 показана фототоксичность Pd-BPheid и этилового эфира Pd-BPheid на культивированных клетках мышиной меланомы M2R. (А) пигменты растворяют в 95% этаноле и дополнительно разбавляют до указанных концентраций в культуральной среде+10% сыворотки до 1% этанола. (В) пигменты растворяют непосредственно в культуральной среде+10% сыворотки.

На фигуре 7 показана фототоксичность Pd-BPheid на культивированных клетках мышиной меланомы M2R и клетках карциномы ободочной кишки человека Н29.

На фигуре 8 показана PDT мышиной меланомы M2R с использованием Pd-BPheid (2/5 мг/кг), растворенного в Cremophor и разбавленного солевым раствором.

На фигуре 9 показана PDT мышиной меланомы M2R с использованием Pd-BPheid (2,5 мг/кг), растворенного в солевом растворе и разбавленного Cremophor.

Фигура 10 иллюстрирует излечение первичных глиомных опухолей С6 после PDT с использованием Pd-BPheid или Pd-BPheid-SerOMe (на фигуре Pd-Bchl-Ser).

На фигуре 11 показано появление метастаз глиомы С6 у голых мышей CD1 после операции (ампутации) или после PDT с использованием Pd-BPheid или Pd-BPheid-SerOMe (на фигуре Pd-Bchl-Ser).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В предпочтительном воплощении соединения данного изобретения имеют следующую формулу с оптической конфигурацией, указанную ниже:

где А является таким, как определено выше. Если пунктирные линии, представляющие в вышеприведенной структуре связь между С7 и С8 и С17 и С18, являются насыщенными одинарными связями, то атомы углерода с номерами 7, 8, 17 и 18 являются асимметричными. Если R₂ или R₃ представляет собой Н, то С13² является асимметричным атомом углерода.

В присутствии кислорода или на воздухе при воздействии света может происходить окисление вышеупомянутых связей С₇-С₈ и С₁₇-С₁₈, что приводит к образованию соединений с двойными связями в указанных положениях С₇-С₈ и С₁₇-С₁₈.

Соединения формулы I' и I" настоящего изобретения являются окисленными формами соединений формулы I и могут быть получены по способу, описанному в Chlorophyll, by Scheer H. (ed.), CRC Press, 1991, pp. 147-209.

В предпочтительном воплощении данного изобретения соединения представляют собой такие соединения, в которых А представляет OR₁.

В наиболее предпочтительном воплощении соединение данного изобретения представляет собой Pd-BPheid (также обозначаемый иногда в данном документе Pd-BChl-COOH), соединение формулы I, где А представляет ОН, имеющее следующую структуру:

Один из способов получения соединений формулы I, где А представляет ОН, включает по меньшей мере стадии:

a) объединенные деметаллирование и гидролиз соединения M-BPheid-17³-Z, где Z представляет собой фитил, геранилгеранил (gg) или SerOMe (серил-O-метиловый сложный эфир), а М представляет собой металл, выбранный из Мg, Cd или Zn;

b) включение Pd с помощью Pd реагента в соединение, полученное на стадии (а), с получением Pd-BPheid, и, при желании,

c) последующая реакция полученного Pd-BPheid с соответствующим соединением формулы R₁-H или А-Н с образованием соответствующей соли R₁ или соединения, где А не является ОН.

В одном предпочтительном воплощении способ направлен на получение Pd-BPheid, бактериохлорофилл a (Bchia) подвергают деметаллированию и гидролизу на стадии (а) и полученный бактериофеофорбид (BPheid) взаимодействует с Pd реагентом на стадии (b) с получением целевого Pd-BPheid.

Другой способ получения соединения формулы I включает по меньшей мере стадии:

a) трансметаллирование BChlide-17³-Z с получением соответствующего Pd-BPheid-17³-Z, где Z представляет собой фитил, gg или SerOMe

b) гидролиз полученного соединения и

c) необязательно последующая реакция полученного Pd-BPheid с соответствующим соединением формулы R₁-H или А-Н с образованием соответствующей соли R₁ или соединения, где А не является ОН.

В одном предпочтительном воплощении способ направлен на получение Pd-BPheid, бактериохлорофилл a (BchLa) подвергают трансметаллированию на стадии (а) для замены природного центрального атома Мg на Pd, и полученный Pd-BPheid-l7³-Z, где Z представляет собой фитил, подвергают гидролизу на стадии (b) с получением целевого Pd-BPheid.

Другой способ получения соединения формулы I включает по меньшей мере стадии:

а) ферментативный гидролиз BChlide-17³-Z, где Z представляет собой фитил или геранилгеранил, с получением BChlide;

b) кислое деметаллирование упомянутого BChlide, полученного на стадии (а);

c) введение Pd с помощью Pd реагента в деметаллированный BPheid, полученный на стадии (b); и

d) необязательно последующая реакция полученного Pd-BPheid с соответствующим соединением формулы R₁-H или А-Н с образованием соответствующей соли R₁ или соединения, где А не является ОН.

В вышеуказанных способах получения соединений формулы I Pd реагент может представлять собой любое подходящее реакционноспособное соединение, доставляющее Pd в таких структурах, как, например, ацетат Pd и хлорид Pd.

Введение Pd в вышеуказанных процедурах может быть достигнуто с помощью двухстадийной методики с использованием аскорбата Na или аскорбиновой кислоты, или с помощью одностадийной методики с использованием 6-О-пальмитоил-L-аскорбиновой кислоты.

Соединения данного изобретения, в которых А отличается от ОН и OR₁, могут быть получены путем взаимодействия Pd-BPheid (Pd-BChl-COOH) с соответствующим соединением А-Н.

Соединения формул II и III, приведенных выше, являются промежуточными соединениями для соединений формулы I данного изобретения. Хлорангидриды формулы II, Pd-BPheid-COCl могут быть получены с помощью любого агента, подходящего для получения хлорангидридов, такого как, например, SOCl₂.

Ангидриды кислоты формулы III могут быть получены путем дегидратации соединений формул I, I', I" с помощью уксусного ангидрида.

Соединения формул I, I' или I" могут быть получены путем взаимодействия данных промежуточных соединений II и III с соответствующим соединением АН.

Далее данное изобретение включает фармацевтически приемлемые соли свободных кислот формул I, I' и I". Данные соли могут быть получены с помощью методов, хорошо известных в данной области, таких как взаимодействие свободной кислоты или ее соли с неорганическими или органическими реагентами, такими как, не ограничиваясь ими, NaOH, КОН, подходящие соли кальция или магния, LiOH, NH₄OH, гидроксид тетраалкиламмония, например гидроксид тетраэтиламмония, или N-метилглюкамин, глюкамин и триэтаноламин.

Соединения данного изобретения предназначены для применения в фотодинамической терапии и диагностике, что касается целевых биологических субстратов. Под целевым биологическим субстратом подразумеваются любые клетки, вирусы или ткани, которые являются нежелательными для их окружения, к которому применяют терапию или другое корректирующее воздействие, такое как стерилизация, или местоположение которых желательно узнать в их окружении, диагностику которого осуществляют.

В соответствии с настоящим изобретением, лекарственный препарат вводят субъекту и позволяют достичь оптимальной концентрации в целевом субстрате. Затем целевой субстрат облучают при длине волны, соответствующей спектру поглощения введенного соединения. Действие данного соединения может быть усилено путем сопутствующего повышения температуры целевого субстрата.

Для применения в способе данного изобретения получают композицию, в которую входят соединения данного изобретения, с использованием традиционных эксципиентов, подходящих для подразумевающегося применения. Для системного введения в основном применяют забуференные водные композиции с достаточным количеством нетоксичного детергента для солюбилизации активного соединения. Так как соединения данного изобретения в основном не очень хорошо растворяются в воде, может применяться солюбилизирующее количество такого детергента. Подходящие нетоксичные детергенты включают, не ограничиваясь ими, Tween-80, различные желчные соли, такие как глихолат натрия, различные аналоги желчных солей, такие как фузидаты. В альтернативных композициях используют липосомальные носители. Раствор забуферивают при желательном рН, используя традиционные буферы, такие как раствор Хэнка, раствор Рингера или фосфатный буфер. Могут быть также включены другие компоненты, которые не препятствуют функционированию лекарственного препарата, такие как стабилизирующие количества белков, например сывороточного альбумина, или липопротеины низкой или высокой плотности (LDL и HDL соответственно). Композиции, предназначенные для системного введения, могут быть введены путем инъекции, такой как внутривенная (в.в.), интраперитонеальная (и.п.), внутримышечная или подкожная (п.к.) инъекция, или могут быть введены с помощью трансмембранного или трансдермального метода. Композиции, подходящие для трансдермального или трансмембранного введения, включают спреи и свечи, содержащие вещества, способствующие проникновению, которыми зачастую могут являться детергенты, описанные выше.

Композиция, предназначенная для местного локального введения, также может содержать вещество, способствующее проникновению, она может существовать в виде мази, бальзама, линимента, крема или масла. Подходящие композиции как для системного, так и для локализованного местного введения можно обнаружить в Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition,. Mack Publishing Co., Easton, PA.

При применении ex vivo для обработки, например, крови или плазмы для переливания, или препаратов кровяных продуктов, нет необходимости в использовании специальных композиций, причем соединения данного изобретения растворяют в подходящем совместимом растворителе и смешивают с биологической жидкостью в подходящих концентрациях, порядок которых обычно составляет 1-100 мкг/мл, до облучения.

При фотодинамических терапевтических и диагностических применениях подходящие интервалы дозировок варьируют в зависимости от способа применения и выбора соединения, а также от природы состояния, подлежащего лечению или диагностике. Однако в основном порядок подходящих доз составляет от 0/01 до 50 мг/кг массы тела, предпочтительно 0,1 до 10 мг/кг. При местном применении обычно применяют общее количество, порядок которого составляет 5-100 мг.

Общие процедуры фотодинамической обработки ex vivo аналогичны приведенным Matthews, J. L., et al., Transfusion (supra).

Короче говоря, при системном введении дают пройти подходящему периоду времени после введения, обычно составляющему от нескольких минут до двух дней, для того, чтобы достичь оптимальной концентрации соединений данного изобретения в целевом биологическом субстрате. В основном данный субстрат является опухолевой сосудистой сетью, клетками опухоли или любым другим опухолевым компонентом, и локализацию соединения можно отслеживать путем измерения оптического поглощения целевой ткани по сравнению с базовым уровнем. После проведения оптимизации целевой биологический субстрат облучают подходящим участком спектра, в интервале 740-800 нм или 500-600 нм, или 700-900 нм, с мощностью 5-750 мВт/см², и с общей энергией 100-1000 Дж/см².

При местном применении локализация является немедленной, и соответствующее облучение может быть предоставлено позднее. При обработке биологических жидкостей ех vivo облучение применяют после достижения оптимального связывания/поглощения целевой тканью. Порядок плотности потока облучения составляет 1-10 Дж/см². Так как не требуется проникновение через ткань, можно применять более низкую общую энергию.

Композиции данного изобретения включают по меньшей мере одно соединение формулы I, I' или I", как определено выше, с физиологически приемлемым носителем. Данные композиции могут находиться в виде раствора, липидной эмульсии или геля, или в виде липосом или наночастиц. Подходящий носитель выбирают так, чтобы получить оптимальную концентрацию соединения данного изобретения в целевом субстрате. Примеры таких носителей представляют собой, не ограничиваясь ими, "Tween 80", полиэтиленгликоль, например PEG 400, "Cremophor EL", пропиленгликоль, этанол, базиликовое масло, желчные соли и аналоги желчных солей, и их смеси. Липосомальные композиции могут быть получены, например, на основе димиристоилфосфатидилхолина или фосфатидилглицерина. Носитель может также включать дипальмитоилфосфатидилхолин.

При применении наночастиц они могут находиться в виде PEG-покрытых наночастиц поли(молочной кислоты). Для липидных эмульсий обычно используют липопротеины низкой плотности и триглицериды.

В композиции данного изобретения соединение(я) данного изобретения присутствует(ют) в количестве, составляющем от 0,01 до 20%, предпочтительно от 0,05 до 5% по массе от общей массы композиции.

Далее данное изобретение будет иллюстрироваться с помощью следующих неограничивающих примеров.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение Pd-BPheid

Pd-BPheid получают из ВСhlа с помощью следующего 3-стадийного способа.

(а) Выделение бактериохлорофилла а (ВСhlа)

ВСhlа экстрагируют из лиофилизированной бактерии Rhodovolum. sulfidophilum следующим образом:

Лиофилизированные клетки (100 г) измельчают в порошок, промывают 5 раз общим количеством ацетона 1250 мл для частичной промывки от каротиноидов, смесь фильтруют и BChla, экстрагируют из твердого вещества абсолютным метанолом (~1200 мл, 4-5 фильтраций). После фильтрации темный сине-зеленый раствор частично упаривают в вакууме, концентрированный раствор (~500 мл) экстрагируют 2-3 раза петролейным эфиром (т.пл. 80-100С, ~1300 мл) для дальнейшего устранения каротиноидов, и фазу петролейного эфира экстрагируют дважды метанолом (~550 мл). Данную фазу затем отбрасывают, объединенную метанольную фазу упаривают в вакууме, сине-зеленый осадок перерастворяют в смеси метанол-ацетон (1:3, об/об) и загружают на колонку с DEAE-сефарозой (3 10 см), уравновешенную смесью метанол-ацетон (1:3, об/об). BChla элюируют смесью метанол-ацетон (1:3, об/об), затем метанол-ацетоновую смесь упаривают и сухой ВСhlа, перерастворяют в точном объеме (для получения спектра поглощения) простого эфира и фильтруют через вату для того, чтобы избавиться от растворенного вещества колонки. После последнего упаривания твердый пигмент хранят в атмосфере аргона в темноте при -20С. Выход на стадии экстракции: приблизительно 700 мг ВСhlа на 100 г лиофилизированных клеток.

Колонку с DEAE-сефарозой готовят по описанной ранее методике (Omata and Murata, 1983, "Preparation of Chlorophyll a. Chlorophyll b and Bacteriochlorophyll a by column chromatography with DEAE-Sepharose C1-6B and Sepharose C1-6B", Plant Cell Physiol., vol. 24, pp. 1093-1100). Короче говоря, DEAE-сефарозу промывают дистиллированной водой и затем превращают в ацетатную форму путем суспендирования в 1 М натрий-ацетатном буфере (рН 7). Взвесь промывают 3 раза ацетоном, затем суспендируют в смеси метанол-ацетон (1:3, об/об) и хранят при 5С.

(b) Получение бактериофеофорбида (BPheid)

Неочищенный экстракт ВСhlа, полученный на стадии (а) (приблизительно 100 мг Bchia, содержащего некоторое количество остаточных каротиноидов), растворяют в 80% водном растворе трифторуксусной кислоты (приблизительно 15 мл), через который барботируют азот в течение 10 мин. Раствор перемешивают 2 ч при температуре окружающей среды. Затем реакционную смесь выливают в воду (250 мл) и экстрагируют хлороформом. Экстракт дважды промывают водой и сушат над безводным Na₂SO₄. После упаривания растворителя остаток хроматографируют на оксиде кремния (колонка 3 см 15 см, Kieselgel 60, Merck и элюируют раствором метанола в хлороформе при ступенчатом градиенте: 2, 5, 10, 15%. Сначала вымывают каротиноиды и небольшое количество бактериофеофитина, затем элюируют алло-бактериофеофитин и каротиноиды. При 10% метанола в хлороформе начинают собирать продукт, контролируя с помощью ТСХ (Kieselgel, хлороформ-метанол, 9:1). Продукт (60 мг) упаривают и остаток, взятый в хлороформе, фильтруют через мембрану UltraPore для удаления остатков оксида кремния, который в противном случае может вызвать окисление.

(с) Введение палладия в бактериофеофорбид (BPheid)

BPheid (100 мг), полученный на стадии (b), и ацетат Pd (80 мг) растворяют в дихлорметане (~10 мл) и добавляют к суспензии 200 мг аскорбата натрия в 50 мл метанола. Реакционную смесь перемешивают в закрытой колбе при комнатной температуре, каждые 15-20 мин берут образцы из реакционной смеси и регистрируют их оптическое поглощение. Приблизительно через 4 ч максимум поглощения BPheid при 357 нм заменяется на поглощение Pd-BPheid при 330 и 390 нм.

Реакционную смесь переносят в раствор хлороформ/вода (200 мл; 50:50 об/об) и встряхивают в разделительной воронке. Органическую фазу собирают, промывают водой, сушат над безводным хлоридом натрия и упаривают. Сухое вещество добавляют к 80 мг ацетата Pd и указанные выше стадии повторяют до тех пор, пока остаточное поглощение при 357 нм полностью не исчезнет, и соотношение между поглощением при 765 нм (пик перехода в инфракрасную область) и максимальным поглощением при 330 нм не достигнет значения ~2,4 (в хлороформе).

Сухую реакционную смесь солюбилизируют в минимальном объеме смеси хлороформ:ацетон 2:1 и загружают на колонку с СМ-сефарозой (150 мм 25 мм), которую предварительно уравновешивают ацетоном. Колонку вначале промывают ацетоном и первую элюированную фракцию отбрасывают. Затем колонку промывают смесью ацетон:метанол 9:1. Две полосы становятся заметными и вымываются - первая является основным продуктом, а вторая является алломеризованным побочным продуктом (отбрасывают). Продукт концентрируют почти досуха и переносят в систему хлороформ : вода 50:50 в разделительной воронке. Смесь тщательно встряхивают и органическую фазу отделяют, сушат над безводным сульфатом натрия (или хлоридом натрия) и упаривают досуха.

Пример 2. Получение Pd-BPheid

(а) Выделение ВСhlа

Данную стадию способа проводят,как описано в приведенном выше примере 1(а).

(b) Получение Pd-BPheid

6-О-пальмитоил-L-аскорбиновую кислоту (246 мг, 593 мкмоль) растворяют в МеОН (84 мл) и через раствор пропускают N₂. BPheid (92 мг, 151 мкмоль) и Pd(CH₃COO)₂ (83 мг, 370 мкмоль) растворяют в СНСl₃ (34 мл, дегазированный с помощью N₂) и добавляют к метанольному раствору. Смесь держат в инертной атмосфере при перемешивании и развитие реакции отслеживают, записывая спектры поглощения небольших порций реакционной смеси каждые несколько минут. Через ~30 мин реакция завершается и растворители упаривают.

(с) Очистка Pd-BPheid

Неочищенный Pd-BPheid растворяют в СНСl₃ и загружают на колонку, содержащую 15 г 0,4%-Silica-Asc. Небольшой объем СНСl₃ (~30 мл) пропускают через колонку и затем пигмент элюируют, используя МеОН:СНСl₃ (1:99, ~250 мл). Чистоту фракций определяют с помощью ТСХ и оптической абсорбционной спектроскопии. Масс-спектроскопию и ЯМР детекцию проводят на контрольных образцах. Выход: 82,5 мг чистого Pd-BPheid (76%).

Для получения 0,4%-Silica-Asc. аскорбиновую кислоту (240 мг) растворяют в 240 мл смеси EtOH: СНСl₃:МеОН (60:60:120). Добавляют силикагель 60 (60 г, Merck, кат. номер 107734, меш 70-230, взвесевую смесь перемешивают в течение 10 мин и затем фильтруют под вакуумом. Silica-Asc желтоватого цвета в конце высушивают в течение ~1 ч при ~50С. Данный 0,4%-Silica-Asc является готовым к применению как силикагель регулярной структуры; его природа является менее полярной и он обладает некоторыми антиоксидантными свойствами.

Пример 3. Получение Pd-BPheid

(a) Выделение Bchla

Данную стадию проводят, как описано в приведенном выше примере 1(а).

(b) Получение хлорофиллазы (Chlase)

Хлорофиллазу (Chlase) получают из хлоропластов листьев Melia azedarach L.,. Chine tree leafs. Свежие листья (50 г) измельчают в течение 2 мин в смесителе, содержащем 350 мл ацетона, охлажденного до -20С. Гомогенат фильтруют через четыре слоя марли, фильтрат собирают и оставляют на ночь при 4С для дальнейшей преципитации. Ацетон удаляют путем фильтрации и оставшийся порошок промывают несколько раз холодным ацетоном для удаления следов Chlase и каротиноидов, пока фильтрат не обесцветится. Chlase ацетоновый порошок в конце сушат в лиофилизаторе и далее хранят при -20С. В данных условиях ферментативный препарат является стабильным в течение 1 года без значительной потери активности. Выход: получают 20 г Chlase на 1 кг листьев.

(с) Синтез и очистка бактериохлорофиллида (BChlide)

Аскорбиновую кислоту (70 мг, Merck) растворяют в воде (9 мл), рН раствора доводят до 7,7 с помощью 10 М водного раствора КОН и добавляют 1 мл 0,5 М натрий-фосфатного буфера (рН 7,7) для поддержания рН в течение реакции. Добавляют тритон Х-100 (приблизительно 80 мкл) до достижения конечной концентрации детергента 0,8% (об/об). Chlase ацетоновый порошок (200 мг) гомогенизируют в 6 мл данного раствора, используя гомогенизатор Polytron. Оставшийся раствор используют для промывания инструмента и затем объединяют с гомогенатом. Раствор фермента обрабатывают ультразвуком с 20 мг твердого ВСhlа, насыщенного аргоном, и инкубируют в темноте в течение 6 ч при 37С при перемешивании.

Для очистки реакционное вещество непосредственно замораживают (~20С) через 6 ч после начала реакции и затем лиофилизируют. Сухой остаток растворяют в ацетоне, обрабатывают ультразвуком, после чего раствор наносят на колонку с СМ-сефарозой, уравновешенную ацетоном. Колонку промывают ацетоном для элюирования непрореагировавшего вещества и затем 5% и 7% метанолом в ацетоне (об/об) для элюирования бактериохлорофиллида (BChlide) и бактериофеофорбида (BPheid). Продукт элюируют 25% метанолом в ацетоне. Растворитель упаривают и твердый пигмент хранят в атмосфере аргона при -20С в темноте. Выход реакции: 30-55%. СМ-сефарозу для хроматографии получают путем промывания СМ-сефарозы вначале водой, затем 3 раза ацетоном перед наполнением колонки и уравновешиванием в ацетоне. Хроматографическое вещество можно использовать повторно после тщательного промывания 2 М водным раствором NaCl до обесцвечивания, промывания водой и ресуспендирования в ацетоне.

(d) Введение палладия в бактериофеофорбид (BPheid)

Процедура является такой же, как в примере 1(с), описанном выше. ВЭЖХ сухого вещества показывает, что основной продукт присутствует в виде двух эпимеров, которые являются химически идентичными (88% от всей смеси), и остаточных алломеров. Имеется также незначительное загрязнение (0,5%) исходным веществом, BPheid.

Пример 4. Характеристика соединения Pd-BPheid

(а) Спектры поглощения

Спектры поглощения Pd-BPheid получали с помощью спектрофотометра UVICON (длина прохождения луча 1 см) с использованием детектора РМ, нормализованного по отношению к базовой линии. Чувствительность составляет 0,05.

Спектр поглощения Pd-BPheid в ацетоне и смеси метанол/К-фосфатный буфер приведены в таблице 1 и на фигуре 1.

Спектр поглощения Pd-BPheid в плазме сдвинут в красную область до 763 нм.

При детектировании в режиме pie обнаруживают следующие пики в соответствии с фигурой 1: при 758 нм - 1,2502; при 537 нм - 0,3239; при 384 нм - 0,5351; и при 329 нм - 0,7766.

(b) Детектирование Pd-BPheid методом ВЭЖХ

Для характеристики профиля примесей и количества палладий-BPheid был разработан метод обращен-нофазовой ВЭЖХ.

Твердая фаза - C₈ Intersil 5 мкм 250 4,6 нм

Жидкая фаза - метанол: 20 мМ калий-фосфатный буфер, рН 6,59 (70%/30%}

Скор