Способ получения макроциклического лактона

Способ получения макроциклического лактона

Реферат

 

Изобретение относится к органической химии, в частности к способам получения соединения формулы (I):

в которой m означает 0, 1 или 2; n означает 0, 1, 2 или 3 и А обозначает двойную связь, В обозначает двойную или простую связь, С обозначает двойную связь, D обозначает простую связь, Е и F обозначают двойную связь; r₁ обозначает Н или С₁-С₈алкил; r₂ обозначает Н, С₁-С₈алкил или ОН; R₃ и R₄ каждый независимо друг от друга обозначают H или С₁-С₈алкил; R₅ обозначает Н или С₁-С₈алкил; R₆ обозначает Н; R₇ обозначает ОН; R₈ и R₉ независимо друг от друга обозначают Н или С₁-С₁₀алкил; в свободной форме или в виде соли, заключающийся в том, что соединение формулы (II):

вводят в контакт с биокатализатором, который способен избирательно окислять спирт в положении 4", с получением соединения формулы (III):

в которых R₁-R₇, m, n, А, В, С, D, Е и F имеют те же значения, что и указанные выше для формулы (I), и соединение формулы (III) подвергают взаимодействию в присутствии восстановителя с известным амином формулы HN(R₈)R₉, в которой R₈ и R₉ имеют те же значения, что и указанные для формулы (I), с последующим выделением целевого продукта в свободном виде или в виде соли. Предлагаемый способ является двухстадийным, при его осуществлении не требуется использовать защитные группы, а сам способ является более безвредным с экологической точки зрения. 4 с. и 10 з.п. ф-лы, 1 табл.

Настоящее изобретение относится к способу получения макроциклического лактона, к способу получения промежуточных соединений и к промежуточным соединениям, используемым при осуществлении этого способа. Изобретение относится, в частности, к способу получения соединения формулы

в которой

R₁-R₉ независимо друг от друга представляют собой водород или заместитель,

m означает 0, 1 или 2,

n означает 0, 1, 2 или 3 и

А обозначает двойную связь,

В обозначает двойную связь или простую связь,

С обозначает двойную связь,

D обозначает простую связь,

Е и F обозначают двойную связь;

R₁ обозначает Н или С₁-С₈алкил;

R₂ обозначает Н, С₁-С₈алкил или ОН;

R₃ и R₄ каждый независимо друг от друга обозначают Н или С₁-С₈алкил;

R₅ обозначает Н или C₁-С₁₀алкил;

R₆ обозначает Н;

R₇ обозначает ОН или ОМе;

R₈ и R₉ независимо друг от друга обозначают Н или C₁-С₁₀алкил,

в свободной форме или в форме соли, заключающемуся в том, что

1) соединение формулы

в которой R₁-R₇, m, n, А, В, С, D, Е и F имеют те же значения, что и указанные выше для формулы (I), вводят в контакт с биокатализатором, способным избирательно (специфично) окислять спирт в положении 4", с получением соединения формулы

в которой R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, m, n, А, В, С, D, Е и F имеют указанные для формулы (I) значения, и

2) соединение формулы (III) подвергают взаимодействию в присутствии восстановителя с известным амином формулы HN(R₈)R₉, в которой R₈ и R₉ имеют те же значения, что и указанные для формулы (I).

Методы синтеза соединений формулы (I) описаны в литературе. Однако было установлено, что при осуществлении известных из литературы методов в ходе проведения технологических процессов возникают существенные проблемы, связанные в основном с низким выходом продукта и с необходимостью проведения достаточно трудоемких технологических операций. Так, например, в заявке ЕР-А 0465121 описаны 4’’-кето- и 4’’-амино-4’’-дезоксиавермектиновые соединения и их замещенные аминопроизводные. 4’’-гидроксигруппу таких авермектиновых соединений окисляют до кетоновой группы или заменяют на (замещенную) аминогруппу. Гидроксигруппы в положениях 5 и 23 необходимо защищать во избежание их нежелательного окисления. Для получения соединения, соответствующего приведенной выше формуле (I), 4’’-кето-соединение подвергают аминированию. Таким образом, известные методы в этом отношении не являются удовлетворительными, и поэтому в данной области существует необходимость в разработке доступного усовершенствованного способа получения подобных соединений.

Соединения формул (I), (II) и (III) могут быть представлены в форме их таутомеров. В соответствии с этим выше и в последующем под соединениями формул (I), (II) и (III) понимаются также, когда это целесообразно, и их соответствующие таутомеры, даже если последние и не упоминаются в каждом конкретном случае.

Соединения формул (I), (II) и (III) могут образовывать кислотно-аддитивные соли. Подобные соли образуются, например, с сильными неорганическими кислотами, такими как минеральные кислоты, например с перхлорной, серной, азотной, азотистой, фосфорной или галогенводородной кислотой, с сильными органическими карбоновыми кислотами, такими как незамещенные или замещенные, например галозамещенные, С₁-С₄алканкарбоновые кислоты, например с уксусной кислотой, с насыщенными или ненасыщенными дикарбоновыми кислотами, например с щавелевой, малоновой, янтарной, малеиновой, фумаровой или фталевой кислотой, с гидроксикарбоновыми кислотами, например с аскорбиновой, молочной, яблочной, винной или лимонной кислотой, либо с бензойной кислотой или с органическими сульфокислотами, такими как незамещенные или замещенные, например галозамещенные, С₁-С₄алкан- или арилсульфоновые кислоты, например с метан- или n-толуолсульфоновой кислотой. Кроме того, соединения формул (I), (II) и (III), содержащие по меньшей мере одну кислотную группу, могут образовывать соли с основаниями. В качестве примера приемлемых солей с основаниями можно назвать соли металлов, такие как соли щелочных или щелочноземельных металлов, например соли натрия, калия или магния, или соли, образуемые с аммиаком или органическим амином, таким как морфолин, пиперидин, пирролидин, моно-, ди- или три-(низш.)алкиламин, например этил-, диэтил-, триэтил- или диметилпропиламин, или моно-, ди- или тригидрокси-(низш.)алкиламин, например моно-, ди- или триэтаноламин. Помимо этого возможно также образование соответствующих внутренних солей. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительны агрохимически приемлемые соли. С учетом тесной взаимосвязи между соединениями формул (I), (II) и (III) в свободной форме и в форме их солей при любом упоминании выше или в последующем описании свободных соединений формул (I), (II) и (III) или их соответствующих солей понимаются также, когда это уместно и целесообразно, соответствующие соли соединений формул (I), (II) и (III) или свободные соединения формул (I), (II) и (III) соответственно. Сказанное относится и к таутомерам соединений формул (I), (II) и (III) и их солям. Следует отметить, что соединения в свободной форме в целом являются предпочтительными в каждом случае.

Предлагаемым в изобретении способом предпочтительно получать соединения формулы (I), в которой

n означает 1,

m означает 1,

А представляет собой двойную связь,

В представляет собой простую связь или двойную связь,

С представляет собой двойную связь,

D представляет собой простую связь,

Е представляет собой двойную связь,

F представляет собой двойную связь либо простую связь и эпоксимостик, либо простую связь и метиленовый мостик,

R₁, R₂ и R₃ означают Н,

R₄ означает метил,

R₅ означает C₁-С₁₀алкил, С₃-С₈циклоалкил или С₂-С₁₀алкенил,

R₆ означает Н,

R₇ означает ОН,

R₈ и R₉ независимо друг от друга означают Н, С₁-С₁₀алкил или С₁-С₁₀ацил либо совместно образуют группу -(CH₂)_q- и

q означает 4, 5 или 6.

Предлагаемым в изобретении способом более предпочтительно получать соединение формулы (I), в которой

n означает 1,

m означает 1,

А, В, С, Е и F представляют собой двойные связи,

D представляет собой простую связь,

R₁, R₂, и R₃ означают Н,

R₄ означает метил,

R₅ означает втор-бутил или изопропил,

R₆ означает Н,

R₇ означает ОН,

R₈ означает метил и

R₉ означает H.

Предлагаемым в изобретении способом наиболее предпочтительно получать эмамектин, в частности бензоат эмамектина. Эмамектин представляет собой смесь 4’’-дезокси-4’’-N-метиламиноавермектина B_1a/B_1b и описан в US 4874749, а также в Journal of Organic Chemistry, т.59 (1994), 7704-7708 под обозначанием МК-244. Соли эмамектина, которые обладают наиболее ценными агрохимическими свойствами, описаны в US 5288710. Соединения формулы (I) являются эффективными пестицидами, прежде всего для борьбы с насекомыми и представителями отряда Acarina (клещей). К указанным вредителям относятся, например, вредители, описанные в заявке ЕР-А 736252. Все такие вредители, упомянутые в указанной заявке, включены в объем настоящего изобретения.

Используемые выше и в последующем описании общие понятия имеют следующие значения, если не указано иное.

Каждая из углеродсодержащих групп и каждое из углеродсодержащих соединений содержат от 1 до 8 включительно, предпочтительно от 1 до 6 включительно, более предпочтительно от 1 до 4 включительно, прежде всего 1 или 2 атома углерода.

Алкил является либо прямоцепочечным, т.е. представляет собой, например, метил, этил, пропил, бутил, пентил или гексил, либо разветвленным, например представляет собой изопропил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, изопентил, неопентил или изогексил.

Алкенил индивидуально либо в качестве структурного элемента других групп и соединений, таких, например, как галоалкенил и арилалкенил, в каждом случае с учетом количества атомов углерода, содержащихся в конкретной группе или конкретном соединении, является либо прямоцепочечным, например представляет собой винил, 1-метилвинил, аллил, 1-бутенил или 2-гексенил, либо разветвленным, например представляет собой изопропенил.

С₃-С₆Циклоалкил представляет собой циклопропил, циклобутил, циклопентил или циклогексил, прежде всего циклогексил.

Другими объектами изобретения являются следующие:

- указанные выше соединения формулы (III),

- способ получения соединений формулы (III) исходя из соединения формулы (II) в соответствии с описанной выше стадией 1) и

- способ получения соединения формулы (I) исходя из соединения формулы (III) в соответствии с описанной выше стадией 2).

В контексте настоящего изобретения под "биокатализатором" понимаются:

а) живой микроорганизм, например, в виде вегетативных клеток, покоящихся клеток или высушенных вымораживанием клеток,

б) споры указанного микроорганизма,

в) неживой микроорганизм предпочтительно в частично разрушенном виде, т.е. со вскрытой в результате механического или химического воздействия либо в результате распылительной сушки клеточной стенкой/клеточной мембраной,

г) сырые экстракты содержимого клеток указанного микроорганизма и

д) фермент, который обеспечивает (катализирует) превращение соединений формулы (II) в соединения формулы (III).

Наиболее пригодными микроорганизмами для использования в предлагаемом в изобретении способе являются бактерии и грибы. В качестве пригодных для этой цели бактерий особо следует назвать представителей актиномицетов (Actinomycetes), прежде всего из рода Streptomyces. Предпочтительными штаммами рода Streptomyces являются штаммы, выбранные из группы, включающей Streptomyces tubercidicus, Streptomyces chattanoogensis, Streptomyces lydicus, Streptomyces saraceticus и Streptomyces kasugaensis. Наиболее пригодными штаммами для региоселективного окисления гидроксигруппы в положении 4’’ соединений формулы (II) являются, как было установлено, штаммы Streptomyces R-922 (Streptomyces tubercidicus) и прежде всего Streptomyces I-1529 (Streptomyces tubercidicus).

Относящиеся к роду Streptomyces штаммы Streptomyces I-1529 и Streptomyces R-922 в соответствии с Будапештским договором 5 ноября 1999 г. были депонированы в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Germany) под регистрационными номерами DSM-13135 и DSM-13136 соответственно.

К другим штаммам, для которых была выявлена способность осуществлять региоселективное окисление в соответствии с настоящим изобретением, относятся, например, штамм Streptomyces MAAG-7027 (Streptomyces tubercidicus), штамм Streptomyces DSM-40241 (Streptomyces saraceticus, идентифицированный также как Streptomyces chattanoogensis), штамм Streptomyces NRRL-2433 (Streptomyces lydicus ssp. lydicus) и штамм Streptomyces A/96-1208710 (Streptomyces kasugaensis). Все вышеуказанные штаммы обладают высокой степенью родства с относящимися к роду Streptomyces штаммами Streptomyces I-1529 и Streptomyces R-922 соответственно, что подверждается анализом 16s рДНК, выявленная с помощью которого идентичность между такими штаммами составила от 99,4 до 100%.

Соединения формулы (I) являются известными высокоэффективными, соответственно высокоактивными средствами борьбы с вредителями растений. Соединения формулы (II) являются исходными соединениями для получения соединений формулы (I) известными методами, как это описано, например, в ЕР 301806, а также предлагаемым в изобретении способом с использованием микроорганизмов.

В известных методах на первой стадии в соединении формулы (II) защищают атом кислорода в положении 5, а затем это соединение окисляют до 4’’-кетона с последующим превращением в амин и удалением "замаскированной" гидроксигруппы в положении 5, что соответствует обычной технологии использования защитных групп, как это описано у Greene и Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 1999.

Преимущество предлагаемого в изобретении способа заключается в том, что он является только двухстадийным в отличие от известных методов, которые являются четырехстадийными. Кроме того, при осуществлении этого способа не требуется использовать защитные группы, а сам способ является более безвредным с экологической точки зрения благодаря использованию меньшего количества химикатов. Соединение формулы (III), образующееся на предусмотренной изобретением стадии биокаталитического превращения, известно, например, из ЕР 401029.

В одном из конкретных вариантов предлагаемый в изобретении способ можно осуществлять, в частности, следующим образом.

На первой стадии получают соединения формулы (III). С этой целью соединение формулы (II) можно вводить непосредственно в контакт с биокатализатором, способным селективно окислять спирт в положении 4’’ до кетона формулы (III), и сохранять такой контакт в течение периода времени, достаточного для протекания окислительной реакции.

Наиболее целесообразно при осуществлении способа использовать в качестве биокатализатора микроорганизм, способный обеспечить протекание окислительной реакции согласно изобретению. Подобный микроорганизм предпочтительно культивировать в пригодной для этой цели культуральной среде, стимулирующей быстрое размножение микроогранизма, а также в контролируемых условиях в присутствии соединения формулы (II), продолжая совместную инкубацию этого микроорганизма и его субстрата в течение периода времени, достаточного для протекания окислительной реакции, предпочтительно до достижения степени превращения добавленного в культуральную среду соединения формулы (II) в соединение формулы (III), составляющей от 25 до 99,9%, более предпочтительно от 50 до 99,9%, наиболее предпочтительно от 80 до 99,9%.

Другой, более предпочтительный вариант осуществления предлагаемого в изобретении способа заключается в том, что сначала микроорганизм, способный обеспечить протекание окислительной реакции согласно изобретению, культивируют в контролируемых условиях в пригодной для этой цели культуральной среде, стимулирующей быстрое размножение этого микроогранизма, и затем соответствующими методами, например фильтрацией или центрифугированием, собирают биомассу, образовавшуюся в результате размножения микроорганизма. После этого такую биомассу либо можно сразу же использовать в качестве биокатализатора для превращения соединений формулы (II) в соединения формулы (III), либо ее до использования в реакции можно хранить в охлажденном состоянии как таковую либо после предварительной сушки вымораживанием или распылительной сушки. Затем такой микроорганизм либо в свежесобранном после культивирования виде, либо после его хранения по описанной выше методике и соединение формулы (II) совместно инкубируют в реакционной среде, которая не стимулирует быстрое размножение микроогранизма в течение периода времени, достаточного для протекания окислительной реакции, предпочтительно до достижения степени превращения добавленного в реакционную среду соединения формулы (II) в соединение формулы (III), составляющей от 25 до 99,9%, более предпочтительно от 50 до 99,9%, наиболее предпочтительно от 80 до 99,9%.

Полученный таким путем реакционный продукт формулы (III) можно отделять от исходного материала формулы (II) простыми с технической точки зрения, широко распространенными методами разделения, например фракционированной кристаллизацией или хроматографией. К хроматографическим методам относятся, например, колоночная хроматография, толстослойная хроматография или тонкослойная хроматография на минеральных носителях, таких как силикагель или органические ионообменные смолы (иониты).

В предлагаемом способе вместо клеточных структур в виде вегетативных клеток можно использовать также споры микроорганизмов, для чего сначала собирают споры микрорганизмов, способных избирательно окислять спирт в положении 4’’ до кетона формулы (III), и затем такие споры инкубируют с соединением формулы (II) в течение периода времени, достаточного для протекания соответствующей окислительной реакции. Инкубацию спор и субстрата предпочтительно проводить в отсутствие культуральной среды с целью предотвратить развитие спор.

Соединения формулы (II) используются в качестве субстрата для проведения окислительной реакции в соответствии с настоящим изобретением. Такие соединения известны (см. DE 2717040) или их можно получать из известных соединений известными методами. Эти соединения пригодны для борьбы с паразитами животных и вредителями растений и помимо этого являются ценными исходными соединениями или промежуточными соединениями при получении соединений формулы (I). Соединения формулы (III) можно также получать, используя для окисления соединений формулы (II) не сам микроорганизм, а активные компоненты, источником которых является подобный микроорганизм (согласно определениям, приведенным выше в п.п. б)-д)) и которые способны избирательно окислять спирт в положении 4’’ до кетона формулы (III).

В соответствии с этим еще одним объектом настоящего изобретения является применение способных избирательно окислять спирт в положении 4’’ до кетона формулы (III) иммобилизованных вегетативных клеток микроорганизмов, бесклетоных экстрактов, спор, ферментов и смесей ферментов указанных микроорганизмов.

Для иммобилизации подобных биокатализаторов можно использовать методы, которые известны как таковые. В контексте настоящего изобретения в этом отношении следует назвать прежде всего методы, основанные на адсорбционном связывании подобных биокатализаторов твердыми, обычно водонерастворимыми, носителями либо на ионном или ковалентном их связывании с указанными твердыми носителями, а также на перекрестном сшивании биокатализаторов би- или полифункциональными реагентами, на инкапсулировании (внедрении) в матрицу, на мембранном разделении или на сочетании двух или более вышеуказанных методов.

Адсорбционное связывание водонерастворимыми носителями (адсорбентами) обусловлено главным образом силами межмолекулярного взаимодействия (ван-дер-ваальсовыми силами). В качестве адсорбентов в указанных целях можно использовать большое число неорганических и органических соединений, а также синтетические полимеры.

Методы подобной иммобилизации микроорганизмов описаны у Bickerstaff (под. ред.), 1997 (иммобилизация ферментов и клеток), у van Haecht и др., 1985 (иммобилизация дрожжевых клеток на стекле), у Black и др., 1984 (иммобилизация дрожжевых клеток на высококачественной стали, сложном полиэфире), у Wiegel и Dykstra, 1984 (иммобилизация клостридий на целлюлозе, гемицеллюлозе), у Forberg и Haggstrom, 1984 (иммобилизация клостридий на древесной стружке), а также у Ehrhardt и Rehm, 1985 (иммобилизация псевдомонад на активированном угле). Соответствующую более подробную информацию о применении ферментов, иммобилизованных путем адсорбционного связывания, можно найти, в частности, у Krakowiak и др., 1984 (глюкоамилаза, иммобилизованная на оксиде алюминия), у Cabral и др., 1984 (глюкоамилаза, иммобилизованная на активированном титаном стекле), у Miyawaki и Wingard, 1984 (глюкозооксидаза, иммобилизованная на активированном угле), у Kato и Horikoshi, 1984 (глюкозотрансфераза, иммобилизованная на синтетическом полимере). Ионные связи обусловлены электростатическим притяжением между противоположно заряженными группами носителя (в качестве примера которого можно назвать коммерчески доступные типы ионообменников, например, на основе полисахаридов или синтетических полимеров) и связываемого биокатализатора.

Методы иммобилизации микроорганизмов, основанные на образовании ионных связей, описаны у DiLuccio и Kirwan, 1984 (иммобилизация бактерий из рода азотобактер на Cellex E (целлюлоза)) и у Giard и др., 1977 (иммобилизация животных клеток на ДЭАЭ- ((диэтиламино)этил-) сефадексе). Соответствующие методы иммобилизации ферментов подробно описаны у Angelino и др., 1985 (иммобилизация альдегидоксидазы на октиламино-сефарозе 4В), у Hofstee, 1973 (иммобилизация лактатдегидрогеназы на октиламино-сефадексе), у Kuhn и др., 1980 (иммобилизация глюкозооксидазы на ДЭАЭ-сефадексе, ДЭАЭ-целлюлозе) и в других литературных источниках.

Другой метод иммобилизации основан на силах ковалентной связи, которые обычно возникают в результате образования фиксированной химической связи между биокатализаторами или между биокатализатором и носителем. Пригодными для этой цели носителями являются пористые материалы, такие как различные типы стекол, диоксид кремния или иные нерастворимые неорганические материалы.

Для использования в предлагаемом в изобретении способе микроорганизмы можно иммобилизовать, например, по методам, описанным у Messing и Oppermann, 1979 (иммобилизация Enterobacteria на боросиликатном стекле, иммобилизация дрожжевых клеток на оксиде циркония), у Romanovskaya и др., 1981 (иммобилизация метанообразующих бактерий на силохроме), у Navarro и Durand, 1977 (иммобилизация дрожжевых клеток на пористом кремнеземе).

Для иммобилизации ферментов можно использовать методы, описанные у Weetall и Mason, 1973 (иммобилизация папаина на пористом стекле) и у Monsan и др., 1984 (иммобилизация инвертазы на пористом кремнеземе).

Пригодными для иммобилизации носителями, которые можно использовать при осуществлении предлагаемого в изобретении способа, являются не только уже указанные выше материалы, но и целый ряд природных или синтетических полимеров, таких, например, как целлюлоза, декстран, крахмал, агароза и т.д., или полимеров на основе, например, производных акриловой и метакриловой кислоты, которые обычно используют в производстве реакционноспособных сополимеров. Пригодными реакционноспособными группами, посредством которых образуется связь с биокатализатором, являются реакционноспособные динитрофторфенильные или изотиоцианатные группы или прежде всего оксирановые и кислотноангидридные группы. Другой возможный подход заключается в хлоридной активации несущих карбоксигруппы смол, которые коммерчески доступны, например, под товарными знаками Amberlite XE-64 и Amberlite IRC-50.

Иммобилизацию микроорганизмов на природных или синтетических носителях можно осуществлять по методам, описанным у Chipley, 1974 (иммобилизация Bacillus subtilis на агарозе), у Gainer и др., 1980 (иммобилизация бактерий из рода азотобактер на целлюлозе), у Jack и Zajic, 1977 (иммобилизация Micrococcus на карбоксиметилцеллюлозе), у Jirku и др., 1980 (иммобилизация дрожжевых клеток на гидроксиалкилметакрилате), а также у Shimizu и др., 1975 (иммобилизация бактериальных клеток на сополимере этилена и малеинового ангидрида). Для иммобилизации ферментов можно использовать, в частности, методы, описанные у Cannon и др., 1984 (иммобилизация лактатоксидазы на целлюлозе), у Dennis и др., 1984 (иммобилизация химотрипсина на сефарозе), у Ibrahim и др., 1985 (иммобилизация эпоксигидролазы на декстране), у Beddows и др., 1981 (иммобилизация -галактозидазы на сополимере найлона и акрилата), у Raghunath и др., 1984 (иммобилизация уреазы на метакрилате-акрилате).

В процессе перекрестного сшивания биокатализаторы связываются между собой би- или полифункциональными реагентами, такими, в частности, как глутаровый диальдегид, диизоцианаты, с образованием характерных нерастворимых, обычно гелеобразных, агрегатов с высокой молекулярной массой.

Иммобилизацию микроорганизмов подобными методами можно проводить по технологии, описанной у De Rosa и др., 1981 (иммобилизация бактериальных клеток путем перекрестного сшивания с яичным альбумином с помощью глутарового диальдегида). Методы иммобилизации ферментов, пригодные для использования в соответствии с настоящим изобртением, описаны у Barbaric и др., 1984 (иммобилизация инвертазы путем перекрестного сшивания с дигидразидом адипиновой кислоты), у Talsky и Gianitsopoulos, 1984 (иммобилизация химотрипсина за счет пептидной связи между молекулами фермента без участия агента сшивания), у Workman и Day, 1984 (иммобилизация инулиназы путем перекрестного сшивания содержащих фермент клеток с глутаровым диальдегидом), у Khan и Siddiqi, 1985 (иммобилизация пепсина путем перекрестного сшивания с глутаровым диальдегидом), у Bachmann и др., 1981 (иммобилизация глюкозоизомеразы путем перекрестного сшивания с желатином с помощью глутарового диальдегида), у Kaul и др., 1984 (иммобилизация -галактозидазы путем перекрестного сшивания с яичным альбумином с помощью глутарового диальдегида).

Инкапсуляция в матрицу заключается во внедрении биокатализаторов в природные или синтетические полимеры, обычно гелеобразной консистенции. Наиболее пригодными материалами матрицы для внедрения клеток, органелл и спор являются природные полимеры, такие как альгинат, карраген, пектин, агар, агароза или желатин, поскольку эти соединения являются не токсичными и защищают клетки при оперировании с ними. Вместе с тем в вышеуказанных целях можно использовать и синтетические полимеры, такие, например, как полиакриламиды, и, в частности, фотосшитые полимеры. Продукты, получаемые инкапсулированием в матрицу, могут иметь самую разнообразную форму, например сферическую, цилиндрическую, волокнистую и пластинчатую (листовую). Иммобилизацию микроорганизмов с помощью природных или синтетических материалов матрицы можно осуществлять по методам, описанным у Mazumder и др., 1985 (иммобилизация бактериальных клеток на фотосшитых полимерах), у Bettmann и Rehm, 1984 (иммобилизация бактериальных клеток на полиакриламидном гидразиде), у Umemura и др., 1984 (иммобилизация бактериальных клеток на каррагене), у Karube и др., 1985 (иммобилизация бактериальных протопластов на агаре-ацетилцеллюлозе), у Cantarella и др., 1984 (иммобилизация дрожжевых клеток на гидроксиэтилметакрилате), у Qureshi и Tamhane, 1985 (иммобилизация дрожжевых клеток на альгинате), у Deo и Gaucher, 1984 (иммобилизация гифомицетов па каррагене), у Eikmeier и Rehm, 1984 (иммобилизация гифомицетов на альгинате), у Bihari и др., 1984 (иммобилизация конидий гифомицетов па полиакриламиде), у Vogel и Brodelius, 1984 (иммобилизация растительных клеток на альгинате, агарозе), у Nakajima и др., 1985 (иммобилизация растительных клеток на агаре, альгинате, каррагене). Для иммобилизации ферментов можно использовать метод, описанный у Mori и др., 1972 (иммобилизация аминоацилазы на полиакриламиде).

Мембранная сепарация заключается в создании специальных определенных зон, в которых протекает реакция. Мембранную сепарацию можно классифицировать на следующие основные типы:

а) микрокапсулирование,

б) технология липосом,

в) использование биокатализатора в мембранных реакторах.

Описанные выше методы иммобилизации можно комбинировать между собой, например комбинировать адсорбцию с перекрестным сшиванием. В этом случае ферменты сначала адсорбируют на носителе, а затем сшивают между собой бифункциональным реагентом.

Инкубацию биокатализаторов, используемых согласно настоящему изобретению, с соединениями формулы (II) для избирательного окисления спирта в положении 4’’ до кетона формулы (III) можно осуществлять по методам, общепринятым в прикладной микробиологии. При этом помимо использования встряхиваемых культур прежде всего следует назвать различные системы ферментации, которые уже достаточно давно используются для микробиологических исследований и в промышленном производстве.

Основное назначение биореакторов состоит в создании оптимальных гидродинамических условий с целью снижения кажущейся константы Михаэлиса и ускорения реакции. Достигается это в основном за счет поддержания необходимой относительной подвижности между биокатализатором и окружающей его средой, что позволяет повысить внешний массообмен до такой степени, при которой он на практике не создает более никаких помех протеканию процесса.

В качестве примера реакторов, пригодных для проведения рассматриваемого процесса, можно назвать реакторы с мешалкой, циркуляционные реакторы, реакторы с неподвижным слоем, реакторы с псевдоожиженным слоем, мембранные реакторы, а также большое число реакторов особых типов, например реакторы с мешалкой с сетчатыми лопастями, ромбоидные реакторы, трубчатые реакторы (W. Hartmeier, Immobilisierte Biokatalysatoren, 1986; W. Crueger и A. Crueger, Biotechnologie-Lehrbuch der angewandten Mikrobiologie, 1984; P. Prave и др., Handbuch der Biotechnologie, 1984). Согласно изобретению предпочтительно использовать реакторы с мешалкой.

Реакторы с мешалкой среди реакторов всех остальных типов нашли наибольшее распространение в биотехнологических процессах ферментации. Реакторы подобного типа обеспечивают быстрое и тщательное смешение субстрата и биокатализатора благодаря высокой эффективности смешения и высокой интенсивности насыщения реакционной смеси килородом.

Преимущества реакторов с мешалкой заключаются в простоте и тем самым экономичности их конструкции, а также в наличии у них хорошо изученных свойств.

При использовании реакторов с мешалкой в принципе возможны два режима проведения технологического процесса, одним из которых является периодический режим, а другим - непрерывный режим.

При работе в периодическом режиме биокатализаторы по завершении процесса удаляют путем сепарации или фильтрации и либо направляют в отходы (вегетативные клетки), либо используют повторно при получении следующей партии продукта (иммобилизованные биокатализаторы).

При работе в непрерывном режиме израсходованный субстрат в реакционном объеме непрерывно, без остановки процесса заменяют на новый субстрат для конечного продукта реакции. При этом биокатализаторы должны постоянно оставаться в реакторе, для чего используют пригодные для этой цели средства (сита, фильтры, устройства рециркуляции).

Культивирование вегетативных клеток микроорганизмов проводят согласно изобретению в соответствии с известными, широко распространенными методами, при этом для упрощения технологического процесса предпочтительно использовать жидкие питательные среды.

Состав питательных сред варьируется в зависимости от используемого микроорганизма. Как правило, предпочтительно использовать комплексные среды с нечетко определенными, легко усвоямыми источниками углерода (С) и азота (N) типа сред, обычно применяемых, например, в том числе и при получении антибиотиков.

Кроме того, культуральная среда должна содержать витамины и требующиеся для роста микроорганизмов ионы металлов, которые, однако, обычно в любом случае присутствуют в соответствующей концентрации в используемой комплексной питательной среде в виде ее компонентов или примесей. При необходимости в питательную среду можно добавлять подобные компоненты, такие, например, как необходимые для роста витамины, а также ионы Na⁺, К⁺, Са²⁺, Mg²⁺, NH⁺₄, (SO₄)^2-, Сl^-, (СО₃)^2- и микрооэлементы кобальт и марганец, а также, в частности, цинк в виде их солей. Наиболее пригодными источниками азота помимо дрожжевых экстрактов, дрожжевых гидролизатов, дрожжевых автолизатов и дрожжевых клеток являются прежде всего мука соевых бобов, кукурузная мука, овсяная мука, эдамин (продукт, образующийся в результате ферментативного разложения лактальбумина), пептон, гидролизат казеина, жидкость, образующаяся при замачивании зерен кукурузы до набухания, и мясной экстракт.

Предпочтительная концентрация указанных источников азота составляет от 0,1 до 6 г/л. Пригодными источниками углерода являются прежде всего глюкоза, лактоза, сахароза, декстроза, мальтоза, крахмал, церелоза, целлюлоза, маннит, солодовый экстракт и меласса. Предпочтительная коцентрация указанных источников углерода составляет от 1,0 до 25 г/л. В описанном ниже процессе окисления и прежде всего при применении в этом процессе микроорганизмов-представителей рода Streptomyces в качестве источника углерода предпочтительно использовать D-глюкозу, растворимый крахмал или солодовый экстракт, а также церелозу. В соответствии с этим наиболее пригодными культуральными средами для представителей рода Streptomyces являются, например, среды следующих составов:

Среда 1

растворимый крахмал 1,0 г

пептон 0,2 г

дрожжевой экстракт 0,2 г

Объем доводят до 1 л дистиллированной водой, значение рН устанавливают на 7 с помощью NaOH, автоклавируют.

Среда 2

D-глюкоза 4,0 г

солодовый экстракт 10,0 г

дрожжевой экстракт 4,0 г

Объем доводят до 1 л дистиллированной водой, значение рН устанавливают на 7 с помощью NaOH, автоклавируют.

Среда 3

глицерин 10,0 г

декстрин 20,0 г

soytone (Difco Manual, 9-е изд.,

Detroit, Difco Laboratories, 1969) 10,0 г

(NH₄)₂SO₄ 2,0 г

СаСО₃ 2,0 г

Объем доводят до 1 л дистиллированной водой, значение рН устанавливают на 7 с помощью NaOH, автоклавируют.

Среда 4

D-глюкоза 10,0 г

солодовый экстракт 10,0 г

дрожжевой экстракт 3,0 г

Pharmamedia (Traders Protein,

Southern Cotton Oil Co.,

Мемфис, шт. Теннесси, США) 10,0 г

мясной экстракт 1,0 г

Объем доводят до 1 л дистиллированной водой, значение рН устанавливают на 7 с помощью NaOH, автоклавируют.

Среда 5 (агар ISP-2)

дрожжевой экстракт (Oxoid Ltd.,

Бейсингсток, Гемпшир, Англия) 4 г

D(+)-глюкоза 4 г

бактосолодовый экстракт (Difco

№0186-17-7) 10 г

агар (Difco №0140-01) 20 г

Указанные ингредиенты растворяют в 1 л деминерализованной воды и значение рН устанавливают на 7,0.

Раствор стерилизуют при 121°С в течение 20 мин, охлаждают и выдерживают при 55°С в течение непродолжительного интервала времени, необходимого для непосредственного получения агаровых пластинок.

Среда 6 (среда PHG)

пептон (Sigma 0521) 10 г

дрожжевой экстракт (Difco) 10 г

D-(+)-глюкоза 10 г

NaCl 2 г

MgSO₄7H₂O 0,15 г

NaH₂PO₄H₂O 1,3 г

К₂НРО₄ 4,4 г

Указанные ингредиенты растворяют в 1 л деминерализованной воды и значение рН устанавливают на 7,0.

Вышеописанные среды особо пригодны также для культивирования микроорганизмов-представителей рода Streptomyces и для проведения окислительной реакции. Следует отметить, что приведенные выше данные о составе сред, а также остальных сред, подробно рассмотренных в настоящем описании, приведены только в качестве примеров, иллюстрирующих настоящее изобретение, и не ограничивают его объем.

Помимо собственно состава сред важную роль играет также технология приготовления подобных сред, например последовательность растворения или суспендирования, стерилизация питательного раствора в целом или стерилизация его отдельных компонентов, предотвращение загрязнения питательной среды посторонними примесями, и поэтому подобные параметры для эффективного осуществления предлагаемого в изобретении способа необходимо соответствующим образом оптимизировать.

Следует также отметить, что стерилизация может привести к изменению значения рН питательной среды, а также к выпадению осадка.