Способ идентификации бактериофага, способ выделения клеток млекопитающего, способ селекции бактериофага (варианты), способ идентификации подгруппы бактериофагов и интернализующий лиганд (варианты)

Способ идентификации бактериофага, способ выделения клеток млекопитающего, способ селекции бактериофага (варианты), способ идентификации подгруппы бактериофагов и интернализующий лиганд (варианты)

Реферат

 

Изобретение относится к генной инженерии, конкретно к технологии фагового дисплея, и может быть использовано для отбора бактериофагов, экспрессирующих пептиды и белки, которые связываются с рецепторами клеточной поверхности и интернализуются. Бактериофаг или подгруппу бактериофагов идентифицируют путем контактирования библиотеки бактериофагов, экспрессирующих множество пептидов, с клеткой или рядом клеток млекопитающего, где геном бактериофага несет, по меньшей мере, один ген, кодирующий определяемый продукт. Способ выделения клеток млекопитающего, которые интернализовали бактериофаг, присутствующий в библиотеке бактериофагов, включает контактирование библиотеки бактериофагов, экспрессирующих множество пептидов, с клеткой млекопитающего, где бактериофаг несет ген, кодирующий определяемый продукт, определение продукта и выделение клеток млекопитающего, которые экспрессируют продукт. Способ селекции бактериофага, экспрессирующего гетерологичный пептид, который связывается с рецептором клеточной поверхности млекопитающего и интернализуется, проводят путем контактирования библиотеки бактериофагов, экспрессирующих множество пептидов, с клеткой млекопитающего, где бактериофаг несет ген, кодирующий определяемый продукт. Определяют продукт и выделяют ген бактериофага, кодирующий пептид, из клеток млекопитающего, экспрессирующих продукт. Изобретение позволяет идентифицировать in vitro или in vivo пептидные или белковые лиганды, способные к интернализации, 12 н. и 52 з.п. ф-лы, 8 ил.

Уровень техники, к которой относится изобретение

Это изобретение относится в целом к фаговому дисплею и, в частности, к отбору бактериофагов, экспрессирующих пептиды и белки, которые связываются с рецепторами клеточной поверхности и интернализуются.

Известный уровень техники

Бактериофаг, экспрессирующий на своей поверхности пептид, применяли для идентификации связывающих доменов белка, включая антигенные детерминанты, антител со специфической реактивностью, мутантов с высокоаффинным связыванием, для идентификации новых лигандов и сайтов субстратов для ферментов. В самом общем виде пептид экспрессируется в виде белка, слитого с капсидным белком нитчатого фага. Это приводит к экспозиции чужеродного белка на поверхности фаговой частицы. Созданы библиотеки фагов, которые экспрессируют множество чужеродных белков. Эти библиотеки связываются с субстратом или клеткой, которые представляют собой интересующий компонент связывания. Этот процесс скринига, по существу, представляет собой аффинную очистку. Связанные фаги выделяют, разводят, благодаря чему можно выделить и охарактеризовать ген, кодирующий чужеродный белок. Эту технологию обычно обозначают как "фаговый дисплей".

С помощью процесса, именуемого "биопанорамированием", можно идентифицировать и выделить специфический фаг, несущий пептид или белок, реагирующий с белком или другой составляющей на твердой фазе. Однако, в некоторых вариантах применения связывание или сродство связывания является не единственным существенным параметром. Например, в генной терапии последовательность гена необходимо ввести в клетку. В предпочтительных способах последовательность гена направленно доставляется к конкретным клеткам за счет взаимодействия лиганда с рецептором клеточной поверхности. Таким образом, лиганд должен не только взаимодействовать с клетками, но должен также интернализироваться. Природный интернализующийся лиганд при применении в системе для генной терапии может интернализироваться неэффективно. Например, FGF2 (фактор роста фибробластов 2) и EGF (эпидермальный ростовой фактор) являются интернализующими лигандами; однако, среди этих двух лигандов FGF (или полипептиды, взаимодействующие с рецептором FGF) в настоящее время предпочтительны в качестве лиганда для направленной доставки генов.

Можно провести скрининг библиотек фагов в отношении интернализующих лигандов с помощью биопанорамирования на живых клетках и высвобождения интернализованного фага из клеток после удаления фагов, связанных с внешней поверхностью клеток (например, с помощью элюции кислотой). Этот способ может приводить к выявлению нежелательных фагов, очень прочно связываемых (с поверхностью) или только частично интернализируемых. Более того, те фаги, которые интернализуются и подвергаются действию протеаз, теряют инфекционность и не могут быть выделены. Следовательно, имеющиеся в настоящее время методологии неадекватны для определения применимости лигандов для генной терапии.

Таким образом, имеющиеся в настоящее время методы скрининга неадекватны для отбора пептидных или белковых лигандов, которые взаимодействуют с рецептором клеточной поверхности и интернализуются. Настоящее изобретение раскрывает способ фагового дисплея, с помощью которого отбирают пептидные или белковые лиганды, способные к интернализации, и предлагает другие дополнительные, относящиеся к этому преимущества.

Краткое изложение существа изобретения

В одном варианте настоящего изобретения представлен способ идентификации в библиотеке бактериофагов, экспрессирующих гетерологичные пептиды или белки, бактериофага, который связывается с рецептором клеточной поверхности и интернализуется, включающий: (а) контактирование библиотеки бактериофагов, экспрессирующих множество пептидов, с клеткой, где геном бактериофага несет ген, кодирующий определяемый продукт; и (b) определение продукта, в результате чего идентифицируется бактериофаг, экспрессирующий гетерологичный пептид, который связывается с рецептором клеточной поверхности и интернализуется.

В другом варианте в изобретении предлагается способ выделения клеток, которые интернализуют бактериофаг, представленный в библиотеке бактериофагов, экспрессирующих гетерологичные пептиды или белки, включающий: (а) контактирование библиотеки бактериофагов, экспрессирующих множество пептидов, с клеткой, где геном бактериофага несет ген, кодирующий определяемый продукт; (b) определение продукта; и (с) выделение клеток, которые экспрессируют продукт.

В еще одном варианте в изобретении предлагается способ отбора бактериофага, экспрессирующего гетерологичный пептид, который связывается с рецептором клеточной поверхности и интернализуется, включающий: (а) контактирование библиотеки бактериофагов, экспрессирующих множество пептидов, с клеткой, где геном бактериофага несет ген, кодирующий определяемый продукт; (b) определение продукта; и (с) выделение гена бактериофага, кодирующего пептид из клеток, экспрессирующих продукт; в результате чего отбирают бактериофаг, экспрессирующий гетерологичный пептид, который связывается с рецептором клеточной поверхности и интернализуется.

В еще одном варианте предлагается способ отбора бактериофага, экспрессирующего гетерологичный пептид, который связывается с рецептором клеточной поверхности и интернализуется, включающий: (а) контактирование библиотеки бактериофагов, экспрессирующих множество пептидов, с клетками, где геном бактериофага несет ген, кодирующий селектируемый продукт; (b) инкубацию клеток в селективных условиях; и (с) выделение гена бактериофага, кодирующего пептид, из отобранных клеток; в результате чего отбирают бактериофаг, экспрессирующий гетерологичный пептид, который связывается с рецептором клеточной поверхности и интернализуется.

В другом варианте в изобретении предлагается способ идентификации бактериофага, экспрессирующего гетерологичный пептид, который связывается с рецептором клеточной поверхности и интернализуется, включающий: (а) контактирование библиотеки бактериофагов, экспрессирующих множество пептидов, с рядом клеток, где геном бактериофага несет ген, кодирующий определяемый продукт; и (b) определение продукта в этом ряду, в результате чего идентифицируют подгруппу бактериофагов, экспрессирующих гетерологичный пептид, который связывается с рецептором клеточной поверхности и интернализуется. В одном осуществлении ряд содержит множество клеточных типов. В другом варианте осуществления способ дополнительно включает стадию (с), в которой библиотеку бактериофагов повторно делят на подгруппы пулов и проводят скрининг, применяя стадии (а) и (b) до тех пор, пока не идентифицируют конкретный бактериофаг, экспрессирующий гетерологичный пептид, который связывается с рецептором клеточной поверхности и интернализуется.

В предпочтительных вариантах осуществления библиотека представляет собой библиотеку кДНК, библиотеку генов антител или библиотеку генов случайных пептидов. В других предпочтительных вариантах осуществления определяемый продукт выбирают из группы, состоящей из белка зеленой флуоресценции, -галактозидазы, связанного с мембраной белка, секретируемой щелочной фосфатазы, хлорамфениколацетилтрансферазы, люциферазы, гормона роста человека и неомицинфосфотрансферазы.

В других вариантах осуществления рецептор клеточной поверхности представляет собой FGF-R или еrbВ2. В еще одних вариантах клетки представляют собой опухолевые клетки или эндотелиальные клетки. Клетки могут быть выделены, например, проточной цитометрией.

В предпочтительных вариантах осуществления бактериофаг представляет собой нитчатый фаг или лямбдовидный фаг.

В еще одном варианте в настоящем изобретении представлены лиганды, идентифицированные с помощью указанных выше методов скрининга. В одном варианте осуществления эти лиганды имеют аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из FVPDPYRKSR (SEQ ID NO: 1), CGGGPVAQRC (SEQ ID NO: 2) и CLAHPHGQRC (SEQ ID NO: 3). В другом варианте осуществления лиганд имеет аминокислотную последовательность FVPDPYRKSR (SEQ ID NO: 1).

Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут очевидными при ссылке на последующее подробное описание и прилагаемые фигуры. Кроме того, ниже представлены различные ссылки, в которых более подробно описаны определенные процедуры или композиции (например, плазмиды и т.д.), и, следовательно, они включены здесь в виде ссылок в полном объеме.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1А и 1В представлены схематические изображения фаговых векторов для трансдукции в клетки млекопитающих. На фиг. 1А изображен родительский фаговый вектор с диким типом белка pIII оболочки. Основной вектор является геномом М13 с геном устойчивости к ампициллину (Аmр^R) и экспрессионной кассетой GFP, введенной в межгенный район между pIV и pII (MEGFP3). Вектор MEGFP3 содержит следующие элементы: ori-CMV, точку начала репликации SV40 и промотор CMV; EGFP, усиленный ген белка зеленой флуоресценции; BGH и последовательность полиаденилирования гормона роста быка. На фиг. 1В представлен слитый фаговый дисплей FGF-pIII (MF2/1G3).

На фиг. 2 представлено сканированное изображение иммуноблоттинга, показывающего выявление слитого белка FGF2-pIII в белковых экстрактах из очищенного FGF2-фага (FGF2-MEGFP).

Фиг. 3А и 3В представляют собой гистограммы определения FGF2 на FGF2-фаге с помощью ELISA (ТИФА). На фиг. 3А изображено количество белка фага, определяемое с применением как пустого вектора MEGFP3, так и FGF2 слитой конструкции (FGF2-MEGFP). На фиг. 3В изображено количество FGF2, определенное на фаге, имеющем слитую конструкцию.

Фиг. 4А и 4В представляют собой гистограммы, показывающие трансдукцию FGF2-фагом в клетках COS.

Фиг. 5 представляет собой гистограмму, показывающую трансдукцию фаговым дисплеем пептида в клетки COS.

Подробное описание изобретения

Как отмечалось выше, в настоящем изобретении предлагается способ фагового дисплея на основе экспрессии трансгена, переносимого фаговым геномом, с помощью которого идентифицируют и/или отбирают пептидные и белковые лиганды, которые связываются и интернализуются.

В кратком виде в настоящем изобретении библиотеку антител, кДНК или генов, кодирующих случайные пептиды, клонируют в белке оболочки бактериофага (например, гене белка III нитчатого фага). Геном фага также содержит "экспрессионную кассету", кодирующую трансген, расположенный ниже клеточного промотора, который активен в инфицируемых клетках (фиг. 1А). Трансгеном обычно является отбираемый генный продукт и/или определяемый маркер. Фаг контактирует с тестируемыми клетками и экспрессию трансгена отслеживают или отбирают. Интернализуемый фаг будет обеспечивать фенотип трансгена, такой как устойчивость к лекарству или экспрессия флуоресцирующего белка. На основе экспрессии трансгена могут быть выделены клетки. Например, когда трансген является геном устойчивости к лекарству, клетки выращивают в присутствии лекарства, в результате чего размножаются только клетки, получившие и экспрессирующие трансген. Слитые с белком оболочки ген(ы), которые стимулируют связывание с клеткой и интернализацию, выявляют в отобранных клетках с помощью подходящего способа.

I. Векторы фагового дисплея и способы

В контексте настоящего изобретения могут быть применены различные бактериофаги. Такие фаги включают нитчатые фаги, лямбда, Т4, MS2 и тому подобное. Предпочтительным фагом является нитчатый фаг, такой как М13 или f1.

Фаги, которые представляют чужеродный белок или пептид в виде гибрида с белком оболочки фага, конструируют так, чтобы он содержал соответствующие кодирующие участки. Могут быть применены различные бактериофаги и белки оболочки. Примеры включают, не ограничиваясь этим, ген III, ген VIII М13; минорный белок оболочки pIII fd (Saggio et al., Gene 152:35, 1995); белок D лямбда (Sternberg and Hoess, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1609, 1995; Mikawa et al., J. Mol. Biol. 262:21, 1996); белок pV хвоста лямбда фага (Maruyama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8273, 1994; патент США №5627024); белок оболочки fr (WO 96/11947; DD 292928; DD 286817; DD 300652); белок gp9 хвоста 29 (Lee, Virol. 69:5018, 1995); белок оболочки MS2; малый внешний капсидный белок Т4 (Ren et al., Protein Sci. 5:1833, 1996), неосновной капсидный каркасный белок IPIII T4 (Hong and Black, Virology 194:481, 1993), или ген удлиненного фибритинового белка T4 (Efimov, Virus Genes 10:173, 1995); ген III PRD-1; капсидный белок Q3 (до тех пор, пока на него не повлияет димеризация); и белок острия хвоста Р22 (Carbonell and Villaverde, Сеnе 176:225, 1996). Техника вставки чужеродной кодирующей последовательности в ген фага хорошо известна (смотри, например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, NY, 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Co., NY, 1995).

В предпочтительной системе нитчатого фага доступен широкий спектр векторов (смотри Кау et al., Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, 1996). Наиболее обычные векторы допускают вставки в ген III или ген VIII. Более того, чужеродный ген можно вставлять прямо в геном фага или в фагемидный вектор. Методы размножения нитчатых фагов и фагемид хорошо известны.

Векторы нитчатых фагов обычно разделяют на две категории: геномы фагов и фагемиды. В контексте настоящего изобретения может быть применен любой тип вектора. Много таких векторов имеется в продаже. Например, могут быть использованы векторы серии pEGFP (Clontech; Palo Alto, CA), векторы M13mp (Pharmacia Biotech, Sweden), pCANTAB 5E (Pharmacia Biotech), серии pBluescript (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) и другие. Одним из особенно пригодных коммерческих фагемидных векторов является pEGFP-Nl, который содержит ген белка зеленой флуоресценции (GFP) под контролем сверхраннего промотора CMV. Эта плазмида включает также точку начала репликации SV40 для усиления экспрессии гена за счет обеспечения репликации фагемид в большом количестве копий в клетках, синтезирующих Т антиген SV40.

В научном сообществе доступны другие векторы (смотри, например, Smith, in Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses, Rodriquez and Denhardt, eds., Butterworth, Boston, pp. 61-84, 1988), или они могут быть сконструированы с применением стандартных методов (Sambrook et al., Molecular Biology: A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, NY, 1995), руководствуясь принципами, обсуждаемыми ниже.

Источник лиганда (например, ген, фрагмент гена или последовательность, кодирующая пептид) может происходить, например, из библиотеки кДНК, библиотеки антител или библиотеки случайных пептидов. В противоположном варианте лиганд может быть из библиотеки случайных мутаций известного лиганда. Еще одной альтернативой является происхождение лиганда из библиотеки известных связывающихся с рецептором агентов. Например, библиотека может содержать подгруппу пептидов, для которых известно, что они связываются с рецептором FGF или EGF, но для которых неизвестна доставка генов и экспрессионные характеристики (т.е. способность к трансдукции).

Когда применяют библиотеку кДНК, исходную кДНК синтезируют из мРНК, выделенной из тканевого источника или клеточной линии, из которой происходит желаемый лиганд. кДНК затем амплифицируют, применяя праймеры, содержащие последовательности подходящих сайтов для ферментов рестрикции, для вставки в желаемый вектор. В противоположном варианте для вставки в вектор можно амплифицировать имеющиеся в продаже библиотеки кДНК (например, Clotech; Palo Alto, CA).

Сходным образом библиотеки фрагментов антител могут быть получены из мРНК, выделенной из клеток селезенки иммунизированных животных (иммунизированных, например, целыми клетками-мишенями или мембранами), или субклонированы из существующих библиотек антител от иммунизированных или интактных животных. Случайные пептиды субклонируют из библиотек, имеющихся в продаже (New England Biolabs; MA), или их можно синтезировать и клонировать, применяя методы, описанные ранее (смотри Кау et al., выше).

Библиотеки фагового дисплея случайных мутаций известных лигандов для улучшения доставки генов получают тем же способом, что и описанный для скрининга библиотек случайных пептидов. Случайные мутации гена нативного лиганда могут быть вызваны с помощью перетасовки ДНК по Stemmer (Stemmer P., Nature 370:389-391, 1994). Вкратце, в этом методе лиганд амплифицируют и гидролизуют случайным образом ДНКазой I. Фрагменты из 50-300 пар оснований заново объединяют при амплификации, проводимой без праймеров, с применением Taq ДНК-полимеразы или сходного фермента. Высокая частота ошибок при работе этой полимеразы вводит случайные мутации в фрагменты, которые заново объединяются случайным образом, вводя таким образом комбинаторные вариации различных мутаций, распределенные по всей длине гена. В противоположном варианте для введения случайных мутаций может быть применена амплификация, подверженная ошибкам (Bartell and Szostak, Science, 261:1411, 1993). Мутацию лиганда можно создать с помощью кассетного мутагенеза (Hutchison et al., in Methods in Enzymology 202:356-390, 1991), при котором случайные мутации вводят, применяя синтетические олигонуклеотиды, и клонируют в лиганд для создания библиотеки лигандов с измененной специфичностью связывания. Могут быть применены дополнительные методы мутагенеза. Некоторые из дополнительных методов описаны в Кау et al., смотри выше.

Если библиотеки кДНК не могут быть созданы, потому что, например, источник желаемого лиганда недоступен или неизвестен, в качестве исходной точки для скрининга могут быть применены библиотеки случайных пептидов или библиотека кДНК из плаценты. Способы конструирования библиотек случайных пептидов могут быть найдены, например, в Кау et al., смотри выше. Вкратце, случайные пептиды кодируются ДНК, собранной из вырожденных олигонуклеотидов, и вставленной в один из описанных здесь бактериофаговых векторов. Для создания случайных пептидов может быть применено несколько различных стратегий. Например, триплеты NNN, где каждый N представляет собой эквимолярное представление всех четырех нуклеотидов, будут генерировать все 20 аминокислот (а также 3 стоп-кодона).

Альтернативные стратегии используют NN(G/T) и NN(G/C), что ведет к образованию 32 кодонов, которые кодируют все 20 аминокислот и только один стоп-кодон. В других стратегиях применяют синтез смесей трехнуклеотидных кодонов, представляющих все 20 аминокислот и никаких стоп-кодонов. Как только нуклеотиды синтезируются, их объединяют в виде двойных цепей различными способами, один из которых включает синтез комплементарной цепи (смотри выше Кау et al.).

В дополнение к гибриду лиганда и белка оболочки вектор содержит ген, чей продукт может быть определен или использован для селекции. Как обозначается здесь, "репортерным" геном является тот ген, чей продукт может быть определен за счет флуоресценции, ферментативной активности на хромогенном или флуоресцирующем субстрате и тому подобное, или может быть отобран по условиям роста. Такие репортерные гены включают, не ограничиваясь этим, белок зеленой флуоресценции (GFP), -галактозидазу, хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), люциферазу, неомицинфосфотрансферазу, секретируемую щелочную фосфатазу (SEAP) и гормон роста человека (HGH). Селектируемые маркеры включают устойчивость к лекарствам, таким как неомицин (G418), гидромицин и тому подобное.

Маркерный ген функционально связан с промотором. Может быть использован любой промотор, который активен в клетках, подвергаемых трансфекции. Вектор должен также иметь точку начала репликации вируса и сигнал упаковки для сборки векторной ДНК с капсидными белками.

Большая часть применения настоящего изобретения должна включать трансфекцию клеток млекопитающих, включая клетки человека, собаки, кошки, лошади и тому подобное. Выбор промотора частично должен зависеть от типа клетки-мишени. Промоторы, которые подходят в контексте настоящего изобретения, включают, не ограничиваясь этим, конститутивные, индуцибельные, тканеспецифические, специфичные для определенного типа клеток, временно специфичные или специфичные в определенных обстоятельствах, хотя предпочтительны конститутивные промоторы.

Примеры конститутивных или неспецифических промоторов включают ранний промотор SV40 (патент США №5118627), поздний промотор SV40 (патент США №5118627), промотор раннего гена CMV (патент США №5168062), промотор вируса папилломы быка и аденовирусный промотор. В дополнение к вирусным промоторам в контексте настоящего изобретения также подходят клеточные промоторы. В частности, применимы клеточные промоторы для так называемых генов домашнего хозяйства (например, -актина). Вирусные промоторы обычно являются более сильными промоторами, чем клеточные промоторы.

В предпочтительных осуществлениях фаг имеет точку начала репликации, подходящую для трансфецируемых клеток. Могут быть использованы вирусные системы репликации, такие как EBV ori и EBNA ген, SV 40 ori и Т антиген или BPV ori. Можно провести замену на другие системы репликации млекопитающих. Гены репликации могут создать большое число копий. Экспрессия терапевтических генов из генома фага может быть усилена путем увеличения числа копий фагового генома. В одном методе для создания нескольких сотен тысяч копий применяют точку начала репликации SV40 в присутствии Т антигена SV40. Ген Т антигена может уже присутствовать в клетках, вводиться отдельно или включаться в геном фага под транскрипционным контролем подходящего клеточного промотора. Для увеличения числа копий можно также использовать другие вирусные системы репликации, такие как точку начала EBV и EBNA.

В других вариантах осуществления включают и экспрессируют на поверхности бактериофага пептиды или другие составляющие, которые позволяют или стимулируют исключение векторов (и любой молекулы, прикрепленной к ним или включенной в них) из эндосомы. Такие "другие составляющие" включают молекулы, которые сами не являются пептидами, но которые обладают способностью разрушать мембрану эндосом, облегчая тем самым исключение вектора, и молекулы, которые иным способом имитируют способность описанных здесь пептидных последовательностей вызывать исключение из эндосом (смотри, например, заявку РСТ №WO 96/10038, включенную здесь в качестве ссылки).

Особенно предпочтительны пептидные последовательности, которые обладают способностью вызывать исключение из эндосом. Такие последовательности хорошо известны и могут быть легко слиты, ковалентно или генетически, с белком оболочки, таковы ген III или ген VIII нитчатого фага. Хотя слияние одной или более пептидных последовательностей с белком оболочки описано здесь в качестве предпочтительного варианта осуществления, должно быть понятно, что, как раскрыто здесь, применимы и другие способы присоединения и другие составляющие, кроме пептидов.

Так, примером двойного дисплея нитчатого фага является лиганд (например, FGF) в виде гибрида с геном III и пептид эндосомального исключения, слитого с геном VIII. Локализация лигандной и исключающей последовательностей взаимозаменяема. Подходящие исключающие последовательности включают, не ограничиваясь этим, следующие примеры последовательностей: пептид экзотоксина Pseudomonas (Donnelly, J.J., et al., PNAS 90:3530-3534, 1993); пептиды вируса гриппа, такие как НА пептид и происходящие из него пептиды, например, пептид FP13; пептид слияния вируса Сендай; последовательность генетического слияния из белка gpl HIV; пептид генетического слияния Paradaxin; и пептид генетического слияния Melittin (смотри WO 96/41606).

Другой последовательностью, которая может быть включена в вектор, является последовательность, которая облегчает перемещение белков в ядро. Эти так называемые последовательности ядерной транслокации или ядерной локализации (NLS) обычно богаты положительно заряженными аминокислотами. Поскольку карбоксильный конец белкового продукта гена VIII нитчатого фага уже несет положительный заряд, увеличение заряда и облегчение ядерного транспорта может быть стимулировано путем слияния известных последовательностей NLS клеток млекопитающих с геном белка VIII. Слияния NLS можно заменить на другие белки оболочки нитчатого фага.

Примеры последовательностей NLS включают те из них, которые сходны с короткой основной NLS Т антигена SV40; двухкомпонентную NLS нуклеоплазмина; последовательность А1 рибонуклеопротеина; последовательность U1A малого ядерного рибонуклеопротеина и вирус-1 Tax белок Т-лимфоцитов человека. Другие пригодные последовательности NLS включают NLS белка HIV матрикса; и компоненты ядерной транслокации importain/hSRP1 и Ran/TC4; консенсусную последовательность KXX (K/R), фланкирующую Pro или Аlа; последовательность ядерной транслокации нуклеоплазмина; или NLS из антеннапедии (смотри WO 96/41606).

Как здесь описано, библиотеку затем размножают в фаговом дисплее путем трансфекции подходящего бактериального хозяина (например, DH5F’ для нитчатых фагов) и выращивают в культуре с добавлением, если необходимо, компетентного для репликации вируса-хелпера в течение ночи при 37С. Фаговые частицы выделяют из культуральной среды с использованием стандартных протоколов.

Инфицирование клеток млекопитающих фагом выполняют в условиях, которые блокируют вход фагов дикого типа в клетки Barry et al., Nature Med. 2:299-305, 1996). Фаги добавляют прямо к клеткам, обычно с титром 10¹² CFU/мл в буфере, таком как ЗФР, с 0,1% БСА или другими подходящими блокирующими агентами и инкубируют с клетками при 37С или на льду. Количество фага, добавляемого к клеткам, должно частично зависеть от сложности библиотеки. Например, библиотека фагового дисплея, содержащая 10⁵ членов, содержит 10⁶ копий каждого члена в 1 мл при типичном титре фагов 10¹¹ колониеобразующих единиц/мл.

II. Определение/отбор трансгенной экспрессии

В конечном итоге проводят скрининг библиотеки фагового дисплея по отношению к ткани-мишени или клеточной линии. Скрининг может быть выполнен in vitro или in vivo. Критерием позитивного "попадания" является то, что фаг должен обладать способностью связываться, интернализовываться и экспрессировать геномную ДНК, содержащую репортерный ген, в клетке-мишени. В этом случае считается, что фаг должен связываться, интернализовываться, транслоцироваться в ядро, покидать оболочку и реплицироваться для того, чтобы экспрессировать ген. Таким образом, отбирают только те фаги, которые экспрессируют репортерный ген.

Тестируемыми клетками могут быть любые клетки, которые экспрессируют выбранный рецептор или являются тем клеточным типом или источником, для которого предназначена генная терапия. Таким образом, в некоторых случаях рецептор может быть неизвестен. В таких случаях может быть применен способ селекции для выделения лиганда для рецептора, лиганд которого неизвестен (сиротского рецептора), такого как еrbВ3.

Вкратце, сиротский рецептор клонируют в экспрессионный вектор млекопитающих, который содержит также селектируемый ген устойчивости к лекарству, и трансфецируют в клетки млекопитающих, такие как клетки COS. С помощью культивирования с соответствующим лекарством отбирают стабильные трансфектанты, которые характеризуются гиперпродукцией сиротского рецептора. Такую трансформированную рецептором клеточную линию COS затем используют как клеточную линию для отбора экспонирующего лиганд фага.

Тканеспецифические или специфичные для опухоли лиганды могут быть отобраны путем предварительной абсорбции библиотеки фага с использованием нормальных тканей или тканей-немишеней клеточных культур. Процесс селекции может быть также применен in vivo с помощью введения библиотеки мышам-носителям опухоли. Опухоль забирают из мыши через 48-72 ч после введения. Готовят клеточную суспензию и клетки, несущие геном фага, отбирают с помощью одного из методов, описанных выше. Затем из устойчивых к лекарству клеточных колоний выделяют ген, чей продукт позволяет геному фага входить и экспрессироваться.

Скрининг можно проводить прямо в отношении клеток-мишеней без предварительного скрининга или предварительного обогащения. Предварительный скрининг и предварительное обогащение могут быть использованы и могут быть особенно полезными в том случае, когда наблюдается либо слишком мало, либо слишком много попаданий. Обогащение клеточного связывания может улучшить определяемость, если при первоначальном скрининге не найдено никаких попаданий. Предварительный скрининг для удаления фагов, которые связываются с неспецифическими белками клеточной поверхности, может снижать неспецифические попадания, если проявляется слишком много первоначальных попаданий. Например, инфицирование 10⁷ клеток-мишеней проводят приблизительно 10¹¹ фагами, однако применимы различная плотность клеток и диапазон титров фагов. Клетки инкубируют в течение, по меньшей мере, 2 ч в ЗФР/БСА и интенсивно отмывают (Barry et al., Nature Med. 2:299-305, 1996). Клетки инкубируют в среде при 37С в течение 48-96 ч и затем определяют или отбирают на основе экспрессии репортерного гена.

Определение продуктов каждого из этих репортерных генов хорошо известно. Например, GFP определяют с помощью флуоресцентной микроскопии или поточной цитометрии, SEAP определяют в среде с применением флуоресцирующего субстрата (Clontech; Palo Alto, CA), гормон роста человека может быть определен в среде с помощью простого и чувствительного радиоиммунного метода (Nichols Institute; CA). Для иммунологического определения и измерения присутствия продукта репортерного гена можно также применять иммуноблоттинг и ТИФА (ELISA). В противоположном варианте сигнал для репортерного гена определяют, применяя метод защиты зонда от РНКазы или гибридизацию флуоресцентного зонда. Для выделения ДНК фагового вектора и вставки может быть применена любая техника, которая позволяет идентифицировать и выделять клетки, экспрессирующие определяемый маркерный продукт. В частности, для определения флуоресценции в или на клетке и выделения такой клетки хорошо подходит проточная цитометрия.

Когда репортерным геном является селективный маркер, клетки выращивают в селективных условиях. В зависимости от маркера условиями может быть конкретная температура роста, добавление лекарства или тому подобное. В представленных здесь примерах селективным маркером является неомицинтрансфераза, которая сообщает клеткам млекопитающих устойчивость к G418. Вкратце, клетки растут в присутствии G418 в течение 7-14 дней или до тех пор, пока устойчивые колонии не будут видимыми под микроскопом. Колонии собирают и ДНК фагового вектора, пригодную для амплификации вставки, выделяют.

В противоположном варианте применяют множественные циклы инфицирования и селекции для снижения сложности организации инфицирующих фагов. Например, объединяют устойчивые к лекарству колонии и отобранные вставки амплифицируют и вновь клонируют в векторе фагового дисплея для нового цикла инфицирования. Когда репортер является флуоресцентным, для отбора наиболее сильно флуоресцирующих клеток, чтобы выбрать наиболее высокоэффективные лиганды для доставки гена, может быть применена проточная цитометрия. Более строгие условия скрининга также включают более высокие концентрации селективного лекарства. При завершении процесса селекции образцы клонов фагов могут быть подвергнуты анализу с помощью секвенирования ДНК для дальнейшей характеристики лигандов для доставки генов.

В еще одном варианте для идентификации лигандов могут быть применены высокопроизводительные методологии скрининга, такие как библиотеки для скрининга путем субселекции пулов. Вкратце, может быть использован массив фагов, содержащий множество членов, в сочетании с набором для идентификации интернализующих лигандов. Например, массив бактериофагов, содержащий члены библиотеки, может быть подразделен на подгруппы массивов таким образом, чтобы каждый массив содержал от приблизительно 10² до приблизительно 10³ членов. Затем проводят скрининг каждого исходного раствора с применением набора (например, многолуночных планшетов, содержащих клетки-мишени). После определения репортерного гена массив фагов можно разбить на подгруппы еще раз и повторно провести скрининг до тех пор, пока не идентифицируют фаг, который содержит интернализующий лиганд. В противоположном варианте специалисты в данной области должны принимать во внимание, что набор может содержать множество клеточных типов, которые можно подвергнуть скринингу с одной или более фаговыми библиотеками, каждая из которых может также включать множество репортерных генов (если это желательно). В соответствии с этим может быть проведена быстрая идентификация тех клеток, которые интернализуют бактериофаг и/или библиотеки, которые содержат интернализующие лиганды для специфического типа клетки. Применение как множества библиотек фагов, так и множества клеточных типов должно позволить применить высокоэффективный метод для одновременного определения подгрупп библиотек, которые содержат лиганды для конкретных клеточных типов. Наборы для связывающих биомолекул известны науке и, следовательно, могут быть адаптированы для применения в методологии скрининга фагов настоящего изобретения, смотри, например, РСТ WO 95/11755, заявка РСТ №WO 95/35505, патент США №4591570. Кроме того, для иммобилизации фага или клеток для высокоэффективного скрининга могут быть применены биосенсоры, функционирующие на основе сродства, такие как Biacore instrument, продаваемый Biacore AB, Uppsula, Швеция.

Скрининг in vivo может быть выполнен сходно со способами для органов-мишеней или ксенотрансплантатов опухолей с применением пептидов, экспонируемых фагом (Pasqualini et al., Nature Biotech. 25:542-546, 1997; Pasqualini et al., Nature 380:364-366, 1996), за исключением того, что органы или опухоли проверяют на экспрессию репортерного гена, вместо того, чтобы проверять на присутствие фага. Вкратце, библиотеку фагового дисплея вводят животным, обычно мышам, внутривенно и образцы органов или опухолей тестируют через 48-96 ч после введения на наличие функции репортерного гена. Опухолевые клетки можно культивировать в селективных условиях или отсортировывать с помощью проточной цитометрии или другого метода для обогащения клетками, которые экспресcируют трансдуцированный ген фага. Последовательности, кодирующие лиганд, могут быть амплифицированы из отобранных клеток, как описывалось выше. Как и в скрининге in vitro, для получения наиболее эффективных лигандов для доставки генов могут быть использованы повторные циклы инфицирования и повторный скрининг как таковой или в сочетании с увеличенной жесткостью скрининга.

Специфичность может быть также проверена in vitro с применением панелей линий клеток-немишеней и клеток-мишеней и определения экспрессии трансдуцируемого гена фага. Исследование конкуренции