Способы трансформации растений для экспрессии дельта- эндотоксинов bacillus thuringiensis

Способы трансформации растений для экспрессии дельта- эндотоксинов bacillus thuringiensis

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к созданию трансгенных растений, обладающих инсектицидными свойствами. Выделяют последовательность нуклеиновой кислоты (варианты), содержащую промотор, функционально связанный с первой полинуклеотидной последовательностью, кодирующей пластидный транзитный пептид, которая в свою очередь связана в рамке считывания со второй полинуклеотидной последовательностью, кодирующей белок Cry2Ab -эндотоксина Bacillus thuringiensis, причем экспрессия указанной последовательности нуклеиновой кислоты растительной клеткой позволяет получить слитый белок, содержащий аминоконцевой пластидный транзитный пептид, ковалентно связанный с указанным белком -эндотоксина, и причем слитый белок действует таким образом, что локализует экспрессию белка -эндотоксина в субклеточной органелле или субклеточном компартменте. Вводят в геном растения вышеуказанную последовательность нуклеиновой кислоты. Регенерируют растение из ткани растения, трансформированной вышеуказанной последовательностью нуклеиновой кислоты. Скрещивают два полученных трансгенных растения между собой с получением растения-потомка. Описанное изобретение позволяет снизить производственные затраты и повысить сбор сельскохозяйственной продукции. 5 с. и 43 з.п. ф-лы, 7 ил., 13 табл.

1.0 Предпосылки изобретения

1.1 Область изобретения

Данное изобретение относится в общем к трансгенным растениям, обладающим инсектицидными способностями, и к конструкциям ДНК, используемым для переноса генов, придающих устойчивость к насекомым, в геномы растений. Более конкретно, данное изобретение относится к способу экспрессии инсектицидных белков в растениях, трансформированных геном, кодирующим -эндотоксин В.thuringiensis, что приводит к эффективной защите от чувствительных вредителей-мишеней.

1.2 Описание уровня техники

1.2.1 Способы борьбы с инвазией насекомых в растениях

Грамположительная почвенная бактерия В.thuringiensis хорошо известна вследствие продуцирования ею белковых параспоральных кристаллов, или -эндотоксинов, которые являются токсичными для личинок многочисленных чешуекрылых, жесткокрылых и двукрылых насекомых. В.thuringiensis продуцирует во время споруляции кристаллические белки, которые являются специфически токсичными в отношении определенных видов насекомых. Было показано, что различные штаммы В.thuringiensis продуцируют инсектицидные кристаллические белки. Композиции, содержащие штаммы В.thuringiensis, которые продуцируют белки, имеющие инсектицидную активность, использовали коммерчески в качестве приемлемых для окружающей среды топических инсектицидов вследствие их токсичности для конкретного насекомого-мишени и отсутствия токсичности для растений и других не являющихся мишенью организмов.

Кристаллы -эндотоксина являются токсичными в отношении личинок насекомого при проглатывании. Растворение кристалла в средней кишке насекомого высвобождает протоксиновую форму -эндотоксина, которая в большинстве случаев процессируется затем в активный токсин протеазой средней кишки. Активированные токсины узнают щеточную каемку эпителия средней кишки насекомого через рецепторные белки. Несколько предположительных рецепторов кристаллических белков были выделены из личинок определенных насекомых (Knight et al., 1995; Gill et al., 1995; Masson et al., 1995). Связывание активных токсинов сопровождается интеркаляцией и агрегацией молекул токсина с образованием пор в эпителии средней кишки. Этот процесс приводит к осмотическому дисбалансу, набуханию, лизису клеток, выстилающих эпителий средней кишки, и в конце концов к гибели личинок.

1.2.2 Трансгенные -эндотоксины В.thuringiensis в качестве биопестицидов

Устойчивость растений и биологическая защита являются центральными тактическими линиями защиты в большинстве программ усовершенствования инсектицидов, применяемых к большинству разнообразных культур. С пришествием молекулярно-генетических способов были выделены гены различных -эндотоксинов и были определены их последовательности ДНК. Эти гены использовали для конструирования некоторых генетически сконструированных продуктов В.thuringiensis, которые были одобрены для коммерческого применения. Недавние развития разработали новые системы доставки -эндотоксинов, в том числе растения, которые содержат и экспрессируют генетически сконструированные гены -эндотоксинов. Экспрессия -эндотоксинов В.thuringiensis в растениях содержит в себе потенциал для эффективной борьбы с вредителями растений, пока могут быть преодолены определенные проблемы. Эти проблемы включают в себя развитие устойчивости насекомых к конкретному белку Cry, экспрессируемому в данном растении, и развитие морфологически отклоняющихся от нормы растений вследствие присутствия трансгена.

Было показано, что экспрессия -эндотоксинов В.thuringiensis в трансгенных хлопчатнике, кукурузе и картофеле является эффективным средством борьбы с сельскохозяйственно важными насекомыми-вредителями (Perlak et al., 1990; Koziel et al., 1993; Perlak et al., 1993). Трансгенные культуры, экспрессирующие -эндотоксины В.thuringiensis, позволяют растениеводам значительно уменьшить применение дорогих, токсичных и иногда неэффективных топических химических инсектицидов. Применение трансгенов, кодирующих -эндотоксины В.thuringiensis, является особенно предпочтительным, когда встраивание трансгена не оказывает отрицательного действия на урожай желаемого продукта из трансформированных растений. Наблюдения показали, что урожаи из сельскохозяйственных растений, экспрессирующих определенные -эндотоксины В.thuringiensis, такие как Cry1A или Сry3А, являются эквивалентными или более высокими, чем для остальных одинаковых нетрансгенных коммерческих сортов растений. Это указывает на то, что некоторые -эндотоксины В.thuringiensis не имеют значимого отрицательного влияния на рост и развитие растений. Однако это относится не ко всем -эндотоксинам В.thuringiensis, которые могут быть использованы для трансформации растений.

Применение топических произведенных из В.thuringiensis инсектицидов может также привести к развитию штаммов насекомых, устойчивых к этим инсектицидам. Устойчивость к -эндотоксинам Cry1A В.thuringiensis, наносимым в виде лиственных спреев, развивалась в по меньшей мере одном хорошо документированном случае (Shelton et al., 1993). Ожидается, что насекомые могут подобным образом развивать устойчивость к -эндотоксинам В.thuringiensis, экспрессируемым в трансгенных растениях. Такая устойчивость, если она станет распространенной, могла бы явно лимитировать коммерческую ценность зародышевой плазмы кукурузы, хлопчатника, картофеля и другой зародышевой плазмы, содержащей гены, кодирующие -эндотоксины В.thuringiensis. Один из возможных способов как увеличения эффективности инсектицида против вредителей-мишеней, так и уменьшения развития устойчивых к инсектицидам вредителей мог бы заключаться в гарантии того, что трансгенные культуры экспрессируют высокие уровни -эндотоксинов В.thuringiensis (McGaughey and Whalon, 1993; Roush, 1994).

Кроме получения трансгенного растения, которое экспрессирует -эндотоксины В.thuringiensis при высоких уровнях, коммерчески жизнеспособные гены В.thuringiensis должны удовлетворять нескольким дополнительным критериям. Например, экспрессия этих генов в трансгенных сельскохозяйственных культурах не должна уменьшать силы, жизнеспособности или фертильности этих растений, и не должна влиять на нормальную морфологию этих растений. Подобные вредные эффекты имеют два нежелательных результата: они могут препятствовать получению и размножению трансгенных растений; они могут также препятствовать развитию зрелых растений или придавать неприемлемые агрономические свойства.

Остается потребность в композициях и способах, применимых в получении трансгенных растений, которые экспрессируют -эндотоксины В.thuringiensis при уровнях, достаточно высоких для эффективной защиты от насекомых-вредителей растения-мишени, а также предупреждения развития инсектицид-резистентных штаммов вредителей. Способ, приводящий к высоким уровням экспрессии -эндотоксинов В.thuringiensis, обеспечит также преимущества более частого получения коммерчески жизнеспособных трансформированных линий растений и более эффективной защиты от заражения в течение всего вегетационного периода.

Остается также потребность в способе увеличения уровня экспрессии -эндотоксинов В.thuringiensis, который не приводит одновременно к морфологическим изменениям растения, мешающим оптимальному росту и развитию желательных тканей растения. Например, способ усиления экспрессии -эндотоксинов В.thuringiensis в кукурузе не должен приводить к растению кукурузы, которое не может оптимально развиваться для культивирования. Достижение этих задач, таких как высокие уровни экспрессии, а также получение морфологически нормальных растений, не удавалось, и поиск их решения был упорно продолжающимся и важным аспектом долгосрочной ценности инсектицидных продуктов растений.

2.0 Сущность изобретения

Описаны новые способы для экспрессии Сry2А -эндотоксинов В.thuringiensis, которые лишены значимой игибирующей двукрылых насекомых активности в трансформированных растениях. Этот способ выгодно приводит к повышенным уровням экспрессии -эндотоксинов В.thuringiensis, а также более высокой скорости восстановления морфологически нормальных растений.

Посредством достижения высоких уровней экспрессии данное изобретение влияет на другой недостаток предыдущего уровня: развитие устойчивости насекомых. Конкретно, данное изобретение обеспечивает превосходящую прежние способы стратегию задержки или элиминации развития устойчивости к Cry1A -эндотоксинам, белкам В.thuringiensis, наиболее обычно экспрессируемым трансгенными линиями. Описанные способы включают в себя экспрессию класса Сry2А -эндотоксинов В.thuringiensis и, в частности, тех, которые лишены ингибирующей двукрылых насекомых активности. -эндотоксины В.thuringiensis группы Сry2А не имеют значимой гомологии с -эндотоксинами Cry1A типа и проявляют отличающиеся характеристики связывания и порообразования (English et al., 1994), и ожидается, что, как таковые, они действуют на насекомых, которые становятся устойчивыми к -эндотоксинам Cry1A или на которые не действуют -эндотоксины Cry1A (Hofte and Whiteley, 1989).

В предпочтительных вариантах данное изобретение обеспечивает выделенную и очищенную конструкцию ДНК, содержащую кодирующий -эндотоксин Сry2А район, локализованный в пластиде или хлоропласте или локализованный в ядерном геноме клетки растения и функционально (оперативно) связанный с районом, кодирующим пластидный транзитный пептид (РТР). Предпочтительные конструкции ДНК данного изобретения включают в себя конструкции, которые кодируют -эндотоксины Cry2A, лишенные ингибирующей двукрылых насекомых активности, хотя полная инактивация в отношении двукрылых не является необходимой. В иллюстративном варианте конструкции ДНК данного изобретения кодируют -эндотоксин Cry2Ab, функционально связанный с сегментом (или последовательностью) ДНК, кодирующим пластидный транзитный пептид, который является одним из средств, делающим возможной локализацию -эндотоксина Cry2Ab в пластиде или хлоропласте. В некоторых вариантах -эндотоксин Cry2Ab содержит последовательность SEQ ID NO:2. Однако авторы изобретения предполагают, что любой -эндотоксин Cry2A, лишенный ингибирующей двукрылых насекомых активности, может быть использован в соответствии с данным изобретением, причем особенно предпочтительными являются -эндотоксины Cry2A, имеющие значимые гомологии относительно Cry2Ab.

В другом варианте конструкции ДНК данного изобретения используют сегменты нуклеиновой кислоты, кодирующие РТР, для потенциирования экспрессии -эндотоксина. Применение одного типа РТР, нацеливающего на хлоропласты пептида (СТР), в соединении с трансгеном Cry1A В.thuringiensis для активации экспрессии этого трансгена в трансформированном растении, описано в патенте США 5500365 (специально включенного здесь в качестве полной ссылки). Однако, когда наблюдается повышенная экспрессия, ее приписывают отчасти использованию новой 5'-нетранслируемой лидерной последовательности в экспрессирующем векторе.

В противоположность предыдущему уровню данной области данное изобретение описывает структурную последовательность ДНК, которая вызывает образование последовательности РНК, кодирующей целевой слитый белок, содержащий аминоконцевой пластидный транзитный пептид с -эндотоксином Cry2Ab; и 3’-нетранслируемую последовательность ДНК, которая функционирует в клетках растений, вызывая терминацию транскрипции и присоединение полиаденилированных нуклеотидов к 3’-концу указанной последовательности РНК. Неожиданно, эта конструкция ДНК приводит к увеличенным уровням экспрессии -эндотоксина Cry2A. Этот нацеленный слитый белок является неактивным для всех видов, но продуцируется как средство для локализации зрелого, инсектицидно активного белка -эндотоксина в хлоропласте, что дает удивительные и неожиданные выгодные агрономические эффекты.

Один вариант, представленный в данном изобретении, представляет собой введение гена, кодирующего -эндотоксин Cry2A, лишенный активности против двукрылых насекомых, в хлоропластный или пластидный геном. Альтернативно, ген, кодирующий -эндотоксин Cry2A, лишенный активности против двукрылых насекомых, мог бы экспрессироваться из автономно реплицирующегося эписомного элемента, локализованного в хлоропласте или пластиде.

В другом предпочтительном варианте данное изобретение обеспечивает трансгенные растения, которые были трансформированы выделенной и очищенной конструкцией ДНК, которая транслируется и экспрессируется при высоких уровнях данным растением. Как однодольные, так и двудольные растения могут быть трансформированы в соответствии с описанными здесь способами и с использованием описанных здесь конструкций ДНК. Растения, трансформированные согласно данному изобретению, могут быть получены в дополнительном предпочтительном варианте способом, включающим в себя получение выделенной и очищенной конструкции ДНК и затем трансформацию растения этой конструкцией таким образом, что данное растение экспрессирует белки, которые кодирует данная конструкция. Авторы изобретения наблюдали, что трансформация растений описанными способами приводит к увеличенной частоте трансформантов, которые экспрессируют данный трансген, а также к генерированию более морфологически нормальных растений из исходных трансформантов.

Предполагается, что увеличенные уровни экспрессии, наблюдаемые в описанном изобретении, позволят получить уменьшенное развитие устойчивости насекомых к -эндотоксинам В.thuringiensis. Это может быть достигнуто трансформацией растения предпочтительной конструкцией ДНК для получения только высоких уровней экспрессии Cry2A или посредством одновременного экспонирования насекомых-мишеней Cry1A и неактивным против двукрылых насекомых -эндотоксинам Cry2A, экспрессируемым в чувствительных растениях. Такие насекомые включают в себя Ostrina spp., Diatraea spp., Helicoverpa spp. и Spodoptera spp., в Zea mays; Heliothis virescens, Helicoverpa spp., Pectinophora spp., в Gossypium hirsutum; Anticarsia spp., Pseudoplusia spp., Epinotia spp., в Glycine max; и Scirpophaga incertulas в Oryza sativa.

Таким образом, предполагается, что способ, описанный данным изобретением, обеспечит многочисленные преимущества в сравнении с прежним уровнем, в том числе конкретно описанные выше. Эти преимущества включают в себя: достижение улучшенной борьбы в отношении чувствительных насекомых; минимизацию развития инсектицид-резистентности штаммов насекомых; получение большего числа коммерчески жизнеспособных устойчивых к насекомым линий растений; достижение сохраняющейся в течение всего вегетационного периода защиты от насекомых-патогенов и увеличение частоты встречаемости морфологически нормальных трансформированных растений. Дополнительным преимуществом данного изобретения является то, что будет требоваться получение уменьшенных количеств трансгенных линий для идентификации трансгенного события с нормальными характеристиками роста.

Таким образом, предполагается, что способ, описанный данным изобретением, обеспечит много преимуществ в сравнении с прежним уровнем, в том числе преимущества, конкретно очерченные выше. Эти преимущества включают в себя: достижение улучшенной борьбы в отношении чувствительных насекомых; минимизацию развития инсектицид-резистентности штаммов насекомых; получение большего числа коммерчески жизнеспособных устойчивых к насекомым линий растений; достижение сохраняющейся в течение всего вегетационного периода защиты от насекомых-патогенов и увеличение частоты встречаемости морфологически нормальных трансформированных растений. Дополнительным преимуществом данного изобретения является то, что будет требоваться получение уменьшенных количеств трансгенных линий для идентификации трансгенного события с нормальными характеристиками роста.

2.1 Композиции нуклеиновых кислот

В одном важном варианте данное изобретение обеспечивает выделенную и очищенную конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую кодирующий Cry2A район и кодирующий РТР район. Эти конструкции ДНК при перенесении в растение подвергаются клеточным процессам, приводящим к увеличенной экспрессии -эндотоксинов в трансгенном растении. -эндотоксины Cry2A данного изобретения являются предпочтительно неэффективными против двукрылых насекомых, хотя некоторые вредные действия в отношении двукрылых могут быть приемлемыми. В некоторых вариантах конструкция ДНК кодирует неактивный в отношении двукрылых насекомых -эндотоксин Cry2Ab, а в более предпочтительных вариантах -эндотоксин Cry2Ab имеет полипептидную последовательность SEQ ID NO:2 или последовательность, по существу гомологичную полипептидной последовательности SEQ ID NO:2. Такие нуклеотидные гомологи могут быть более чем на приблизительно 88% гомологичными, более чем на приблизительно 90% гомологичными, более чем на приблизительно 95% гомологичными и даже более, чем на 99% гомологичными с -эндотоксином Cry2Ab, представленным в SEQ ID NO:2. Примеры пептидов включают в себя пептиды, которые на приблизительно 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 и даже 99 или более процентов гомологичны -эндотоксину Cry2Ab, представленному в SEQ ID NO:2.

В даже более предпочтительных вариантах конструкция ДНК данного изобретения содержит кодирующий -эндотоксин Cry2Ab район с последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:1 или последовательностью со значительной гомологией относительно последовательности SEQ ID NO:1. Также рассматриваются как находящиеся в объеме данного изобретения конструкции ДНК, имеющие сегменты со значительными гомологиями относительно последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO:1, такие как сегменты, которые могут быть приблизительно на 90% гомологичными или приблизительно на 95% гомологичными или даже на приблизительно 99% гомологичными. Более конкретно, гомологичные последовательности нуклеиновых кислот, включенные в данное изобретение, включают в себя последовательности, которые являются на приблизительно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 и 99 процентов гомологичны последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:1.

Конструкции ДНК, обеспеченные здесь, включают в себя также РТР-кодирующий район, расположенный выше по ходу транскрипции (слева) от района, кодирующего -эндотоксин Cry2A, и ниже по ходу транскрипции (справа) от промотора. Эти кодирующие пластидный транзитный пептид районы могут кодировать любой функциональный в растении РТР и могут функционировать для нацеливания кодируемых белков в определенные пластиды в клетке растений или для увеличения экспрессии -эндотоксина, кодируемого данной конструкцией ДНК. В предпочтительных вариантах данное изобретение может включать в себя РТР, выбранный из группы, состоящей из zmSSU, РТР1, РТР1 и РТР2, или любые другие функциональные в растении РТР. Более конкретно район, кодирующий пластидный транзитный пептид, кодирует пластидный транзитный пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10 или любую полипептидную последовательность, по существу гомологичную этим последовательностям. Даже более предпочтительно данное изобретение включает в себя район, кодирующий пластидный транзитный пептид, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:9 или последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу гомологична этим последовательностям.

Авторы изобретения предполагают, что данное изобретение могло бы решить задачи увеличения патогенности для вредителей и получить уменьшенное развитие устойчивых к пестицидам насекомых, если конструкции ДНК, обеспеченные здесь, ко-экспрессировать вместе с другими пестицидными конструкциями, такими как другие белки. Таким образом, данное изобретение обеспечивает применение описанных конструкций ДНК, которые дополнительно содержат экспрессируемые в растении кодирующие районы других Cry-белков. В них могли бы быть включены кодирующие районы для Cry1-белков, таких как Cry1A, Cry1Ab, Cry1Bb или Cry1-химеры (см. находящиеся в процессе одновременного рассмотрения заявки на патент США с регистрационными номерами 08/754490 и 08/922505 и находящуюся в процессе одновременного рассмотрения РСТ заявку PCT/US97/17507 на основе заявки США с регистрационным номером 08/721259, каждая из которых включена здесь в полном виде в качестве ссылки).

В некоторых предпочтительных вариантах конструкция ДНК является экспрессионной кассетой, которая может быть вырезана и выделена из указанной плазмиды.

2.2 Дополнительные элементы композиции нуклеиновой кислоты

Полинуклеотидные композиции данного изобретения применимы в трансформации как однодольных, так и двудольных растений. Таким образом, конструкция ДНК данного изобретения может дополнительно содержать другие различные регуляторные элементы для содействия в экспрессии белков и для дополнительного облегчения введения данной конструкции ДНК в растение. Одним примером этого является включение в данную конструкцию ДНК интрона, расположенного в нетранслируемом лидере, выше по ходу транскрипции (слева) от района, кодирующего пластидный транзитный пептид. Одной из применимых лидерных последовательностей является хитшоковый белок (белок теплового шока) петунии. В различных альтернативных вариантах данный интрон может быть любым из следующих интронов: интроном 1 Adh, интроном сахарозосинтазы, омега-элементом TMV, хитшоковым белком 70 кукурузы (hsp 70) или интроном Act1 риса. В предпочтительных вариантах данный интрон является либо хитшоковым белком 70 кукурузы, либо хитшоковым белком 70 петунии.

В другом предпочтительном варианте данного изобретения обеспечена нуклеотидная последовательность, содержащая дополнительно кодирующий район по существу неактивного относительно двукрылых насекомых -эндотоксина Cry2A и кодирующий РТР район, расположенные под контролем функционального в растении промотора. Применение промотора необходимо для запуска клеточных процессов таким образом, чтобы максимизировалась экспрессия данного гена. Предпочтительные промоторы включают в себя следующие промоторы: CaMV 35S, гистона, CaMV 19S, nos, OCS, Adh, сахарозосинтазы, -тубулина, актина, cab, ФЕП-карбоксилазы, ssRUBISCO (малой субъединицы РБФК), Act1, Famv, усиленного FMV, или промоторы, связанные с комплексом R-генов. В более предпочтительных вариантах промотор представляет собой усиленный или удвоенный промотор CaMV 35S (Кау et al., 1987). В дополнительных предпочтительных вариантах промотор является промотором FMV35S. Функциональные в хлоропластах или пластидах растений промоторы также входят в сферу действия данного изобретения.

Далее, данное изобретение рассматривает включение терминаторного района в конструкцию ДНК для содействия клеточным процессам, участвующим в экспрессии белка. В различных вариантах этот терминатор может быть любым из следующих терминаторов: терминатором гена нопалинсинтазы Agrobacterium tumefaciens, терминатором гена октопинсинтазы Agrobacterium tumefaciens и 3’-концом гена ингибитора протеазы I или II из картофеля или томата. В особенно предпочтительном варианте терминатором является терминатор гена нопалинсинтазы Agrobacterium tumefaciens.

2.3 Трансформирующие векторы

Поскольку конструкция ДНК данного изобретения предназначена прежде всего, хотя и не исключительно, для применения в трансформации растений, она в некоторых предпочтительных вариантах содержится в экспрессирующем векторе. Такие экспрессирующие векторы могут содержать множество регуляторных и других элементов, предназначенных для возможности оптимальной экспрессии желательных белков, которые кодирует данный экспрессирующий вектор. Эти дополнительные элементы могут включать в себя промоторы, терминаторы и интроны, описанные выше в разделе 2.2. Вектор, содержащий конструкцию ДНК и любые регуляторные или другие элементы, может быть выбран из группы, состоящей из искусственной хромосомы дрожжей, искусственной хромосомы бактерий, плазмиды или космиды.

Далее, сами экспрессирующие векторы могут быть в различных формах. Эти формы могут отличаться в силу разных причин и будут, вероятно, состоять из различных компонентов в зависимости от того, предназначены ли они для трансформации однодольного или двудольного растения. Например, фиг.1 иллюстрирует один возможный вариант, где экспрессирующий вектор однодольных растений содержит ген Cry2Ab в плазмиде, названной (SEQ ID NO:16). Кроме того, предполагается, что в качестве применимых трансформирующих конструкций будут применимы также другие экспрессирующие векторы, содержащие экспрессионные кассеты, представленные в этих плазмидных векторах, а также экспрессионные кассеты, содержащие по существу гомологичные последовательности. Таким образом, любой трансформирующий вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты от нуклеотида 1781 до нуклеотида 5869 SEQ ID NO:16, может быть использован.

Фиг.2 иллюстрирует один возможный экспрессирующий вектор двудольных растений. Он содержит ген Cry2Ab, представленный в плазмидах, названных pMON33827 (SEQ ID NO:13), pMON33828 (SEQ ID NO:14) и pMON33829 (SEQ ID NO:15). Как и в случае трансформирующих векторов однодольных растений авторы изобретения считают, что другие экспрессирующие векторы, содержащие экспрессионные кассеты, представленные в этих плазмидных векторах, или по существу гомологичные этим экспрессионным кассетам векторы, будут применимы в качестве трансформирующих конструкций двудольных растений. Предпочтительные экспрессионные кассеты двудольных растений включают в себя кассеты, представленные нуклеиновыми кислотами 17-3182 SEQ ID NO:13; нуклеиновыми кислотами 17-3092 SEQ ID NO:14 и нуклеиновыми кислотами 17-3155 SEQ ID NO:15. Иллюстративные варианты векторов, содержащих такие экспрессионные кассеты, описаны в последовательностях, обозначенных здесь как SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:15.

Векторы, дополнительно рассматриваемые как находящиеся в сфере действия данного изобретения, включают в себя векторы, способные содержать как композиции нуклеиновых кислот неактивного к двукрылым насекомым Cry2A, описанные в разделе 2.1 выше, так и любые другие конструкции ДНК, которые дополнительно содержат экспрессируемые в растениях кодирующие районы для других белков Cry, таких как белок Cry1. Векторы, способные содержать обе из этих конструкций, могут также содержать множество различных цистронов, делающих их полицистронными или мультицистронными.

2.4 Трансформированные клетки-хозяева

Другой предпочтительный вариант данного изобретения включает в себя клетки, трансформированные конструкциями ДНК, описанными здесь в разделах 2.1 и 2.2, и с использованием трансформирующих векторов, описанных в разделе 2.3. Трансформированные клетки, рассматриваемые в данном изобретении, включают в себя как прокариотические, так и эукариотические клетки, экспрессирующие белки, кодируемые новыми конструкциями ДНК данного изобретения. Способ получения трансгенных клеток хорошо известен в данной области. В общих чертах данный способ предусматривает трансформацию подходящей клетки-хозяина сегментом ДНК, который содержит промотор, функционально (оперативно) связанный с кодирующим районом, который кодирует -эндотоксин В.thuringiensis. Такой кодирующий район обычно функционально связан с районом терминации транскрипции, вследствие чего данный промотор способен запускать транскрипцию данного кодирующего района в данной клетке и, следовательно, обеспечивать клетку способностью продуцировать -эндотоксин in vivo. Альтернативно, в случаях, когда желательно контролировать, регулировать или снижать количество конкретного -эндотоксина или эндотоксинов, экспрессируемых в конкретной трансгенной клетке, данное изобретение обеспечивает также экспрессию антисмысловой мРНК -эндотоксина; антисмысловой мРНК интрона; антисмысловой мРНК РТР или антисмысловой мРНК UTR. Применение антисмысловой мРНК как средства регуляции или уменьшения количества конкретного представляющего интерес белка в клетке хорошо известно в данной области.

В предпочтительном варианте данное изобретение включает в себя клетку растения, которая была трансформирована сегментом нуклеиновой кислоты или конструкцией ДНК данного изобретения и которая экспрессирует ген или сегмент гена, кодирующий один или несколько неактивных относительно двукрылых насекомых -эндотоксинов Cry2A В.thuringiensis, как описано здесь. В применении здесь термин “трансгенная клетка растения” относится к клетке растения, которая имеет включенные последовательности ДНК, в том числе, но не только, гены, которые, возможно, в норме не присутствуют, последовательности ДНК, которые в норме не транскрибируются в РНК или не транслируются (“не экспрессируются”) в белок, или любые другие гены или последовательности ДНК, которые желательно ввести в нетрансформированное растение, такие как гены, которые в норме присутствуют в нетрансформированном растении, но которые желательно сконструировать генетически или которые должны иметь измененную экспрессию.

Предполагается, что в некоторых случаях геном трансгенного растения данного изобретения будет увеличен посредством стабильного введения конструкций ДНК, кодирующих неактивный относительно двукрылых насекомых -эндотоксин Cry2A В.thuringiensis, как описано в разделах 2.1 и 2.2 выше. В некоторых случаях более одного трансгена будут включены в ядерный геном или в хлоропластный или пластидный геном трансформированной клетки-хозяина растения. Это имеет место, когда более чем один сегмент ДНК, кодирующий кристаллический белок, включен в геном такого растения. В некоторых ситуациях может быть желательно иметь один, два, три, четыре или даже больше кодирующих кристаллический белок В.thuringiensis полинуклеотидов (либо нативных, либо рекомбинантно-сконструированных), включенных и стабильно экспрессируемых в трансформированном трансгенном растении.

В предпочтительных вариантах введение трансгена в геном клетки растения приводит к стабильной интеграции, при которой потомство таких растений также содержит копию трансгена в их геноме. Наследуемость этого генетического элемента потомством растения, в которое исходно был введен данный ген, является предпочтительным аспектом данного изобретения. Предпочтительный ген, который может вводиться, включает в себя, например, ген -эндотоксина В.thuringiensis и, в частности, один или несколько из генов, описанных здесь.

Средства для трансформации клетки растения и получения трансгенной клеточной линии хорошо известны в данной области (примеры приведены в патентах США 5550318; 5508468; 5482852; 5384253; 5276269 и 5225341, все специально включены здесь в полном виде в качестве ссылок) и вкратце обсуждаются здесь. Векторы, плазмиды, космиды, YAC (искусственные хромосомы дрожжей) и сегменты ДНК для применения в трансформации таких клеток будут, конечно, обычно содержать либо опероны, гены, либо произведенные из генов последовательности данного изобретения, либо нативные, либо синтетически полученные, и, в частности, кодирующие описанные кристаллические белки. Эти конструкции ДНК могут дополнительно включать в себя структуры, такие как промоторы, энхансеры, полилинкеры или даже генные последовательности, которые имеют положительно или отрицательно регулирующую активность в отношении конкретных представляющих интерес генов, если это желательно. Сегмент ДНК или ген может кодировать либо нативный, либо модифицированный кристаллический белок, который будет экспрессироваться в полученных рекомбинантных клетках и/или который будет придавать улучшенный фенотип регенерированному растению.

Трансгенные клетки, конкретно рассматриваемые в данном изобретении, включают в себя трансгенные клетки растений. Особенно предпочтительные клетки растений включают в себя клетки, полученные из кукурузы, пшеницы, сои, дернообразующих трав, декоративных растений, плодового дерева, кустарников, овощей, зерновых, бобовых и т.п. или любого растения, в которое желательно введение трансгена -эндотоксина В.thuringiensis, неактивного в отношении двукрылых насекомых.

2.5 Трансформированные растения

В другом аспекте растения, трансформированные любой конструкцией ДНК данного изобретения, которая экспрессирует белки, кодируемые данной конструкцией, рассматриваются как часть данного изобретения. Таким образом, данное изобретение обеспечивает далее трансгенные растения, которые были трансформированы конструкцией ДНК, описанной здесь в разделах 2.1 и 2.2, и были трансформированы с использованием трансформирующих векторов, описанных в разделе 2.3. Агрономические, плодоовощные, декоративные и другие экономически или коммерчески ценные растения могут быть созданы в соответствии со способами, описанными здесь, для экспрессии -эндотоксинов В.thuringiensis при уровнях, достаточно высок