Анализ антител

Анализ антител

Реферат

 

Изобретение относится к медицине. Предложен способ определения присутствия или количества свежесинтезированных антител в образце в ответной реакции на иммуноген путем детектирования выделившихся антител или их частей в образце, содержащем лимфоциты, которые были разрушены, чтобы высвободились синтезированные антитела или их части, связанные с указанными лимфоцитами, в результате чего определяют присутствие или количество свежесинтезированных антител в указанном образце, способы диагностики, использующие этот способ, и наборы для осуществления этого способа. Способ обеспечивает детектирование неспецифических инфекционных индикаторов в ответ на инфицирование или вакцинацию. 3 с. и 21 з.п. ф-лы, 5 табл., 9 ил.

Настоящее изобретение относится к детектированию антител и, в частности, к определению недавно синтезированных антител, вырабатываемых в образцах в ответ на инфицирование или вакцинацию и т.д., с помощью простого способа, включающего в себя разрушение лимфоцитов до детектирования присутствия антител.

ELISA в течение длительного времени использовали для детектирования и количественного определения уровней антител (или антигенов). В более общем плане ELISA используют в качестве серологического анализа, но его используют также для изучения иммунохимических характеристик антигенов или антител и он часто находит применение, например, для оценки и характеризации иммунных реакций, для исследования выработки антител клеточными культурами, в гибридомных технологиях и т.д.

Анализ ELISA прост для использования, чувствителен и относительно быстр, но он дает возможность лишь просто определять присутствие в образце антитела-мишени; с его помощью нельзя определить разницу между происходящим в настоящее время синтезом антител в ответ на антиген и антителами, которые уже присутствуют как следствие прошлой инфекции, или в результате пассивного переноса и т.д. Хотя в ряде случаев может оказаться достаточным просто получить информацию относительно присутствия антитела, в других случаях бывает желательно иметь возможность определить, действительно ли антитела-мишени быстро синтезированы лимфоцитами во время тестирования, например, в процессе вакцинации или при диагностике инфекции у новорожденных, чтобы отличить их от пассивно перенесенных материнских антител. Такой результат нельзя получить с помощью классического метода ELISA.

Поэтому были разработаны другие методы, которые обеспечили возможность детектирования синтезируемых в настоящее время антител. В этой связи следует конкретно упомянуть иммуноферментный спот-анализ (ELISPOT) (известный также как спот ELISA или ELISA-анализ бляшек), обзор которого приведен, например, у Czerkinsky et al. в ELISA and other Solid Phase Immunoassay, Ed. D.M.Kemeny and S.J.Challacombe, 1988, Chapter 10, 217-239. Эта методика, основанная на использовании метода ELISA, позволяет количественно определять секретируемые лимфоцитами антитела против одного или более из антигенов-мишеней. В основном ELISPOT является вариантом метода ELISA, с помощью которого клетки, секретирующие антитела (ASC), можно выявить, культивируя лимфоциты в специально модифицированных ELISA-лунках, покрытых антигеном-мишенью, и заменяя стандартные ELISA-реагенты комплексами фермент-субстрат, что приводит к получению окрашенного осадка (бляшек), которые расположены рядом с секретирующими клетками. Затем бляшки можно подсчитать, получая меру числа клеток, продуцирующих антитела. В культуральную среду можно включить ингибиторы синтеза белка для подтверждения того, что детектируемые бляшки связаны с de novo синтезом антител во время периода инкубирования in vitro.

Хотя, как было показано, метод ELISPOT является весьма полезным при изучении динамики гуморальных иммунных реакций и был использован для определения спонтанных АSС, которые кратковременно появляются в периферической циркуляции иммунизированных субъектов, некоторые особенности этого способа налагают ограничения на его использование в клинической диагностике. Во-первых, так как необходимо подсчитывать отдельные бляшки для каждого из отдельных образцов, что является трудоемким и может потребовать много времени, этот способ практически не пригоден для анализа большого числа образцов, что необходимо в клинической диагностической лаборатории. Во-вторых, подсчитывается только число клеток, секретирующих антитела в каждом образце, и вообще говоря, это требует достаточно больших объемов образцов, например несколько мл. Кроме того, планшеты для ELISPOT достаточно дороги, а анализ не так просто автоматизировать.

В патенте WO 96/26443 раскрыто использование модифицированного ELISA-теста, который можно использовать для определения происходящего в настоящее время синтеза антител. В этом анализе лимфоциты культивируют после выделения и определяют уровни содержания антител, продуцируемых за время культивирования. В этом способе необходимо проводить инкубирование лимфоцитов в тестируемом образце при температуре около 37С, для того чтобы можно было определить антитела, секретированные во время периода инкубирования. В среднем период инкубирования составляет от 2 до 5 часов, что выдвигает значительные ограничения в отношении скорости анализа. Для инкубирования необходимо предусмотреть соответствующее оборудование там, где проводится тестирование, чтобы его можно было бы осуществить непосредственно перед процедурой анализа. Обычно это означает, что анализ лимфоцитов необходимо осуществлять как можно быстрее после получения образца от пациента, так как хранение образца, например, используя замораживание, неприемлемо, так как приводит к снижению жизнеспособности клеток. Жизнеспособность очищенных клеток можно поддерживать лишь в течение относительно короткого промежутка времени, сохраняя их на льду при 0С или менее, предпочтительно при 4С.

Поэтому очевидно, что несмотря на достижения в области методик определения антител все еще сохраняется необходимость в более усовершенствованном способе анализа, который был бы простым, быстрым и экономичным для осуществления, который давал бы возможность надежно количественно определять спонтанно секретируемые антитела, который позволял бы различать синтез антител de novo и который можно было бы осуществлять на образцах, например образцах крови, для диагностических целей. Настоящее изобретение именно к этому и относится.

В описанной выше методике используют период культивирования, определяя который необходимо учитывать, что он должен быть достаточным для достижения достаточного титра антител для получения результатов анализа для иммунодиагностических целей.

В литературе было установлено, что биосинтез антител (иммуноглобулинов) происходит в В лимфоцитах (см. Roitt I., Brostoff J., Male D. "Immunology", 4 th Edition published by Mosby, London 1996, 6.12-6.13), после чего они секретируются в кровоток для борьбы с инфекцией. Если они секретируются секретирующими антитела клетками (ASC), молекулы оказываются полностью собранными (например, в молекуле IgG две тяжелые цепи и две легкие цепи соединены дисульфидными связями) и гликозилированы. Считают, что стадией, ограничивающей скорость биосинтеза антител, является внутриклеточный транспорт и гликозилирование за счет эндоплазматического ретикулума и комплекса Гольджи (что занимает 1 час или более), тогда как биосинтез различных тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов требует всего лишь нескольких минут для завершения. Обычно время, необходимое для процесса синтеза и секретирования, оценивается примерно равным 2 часам (Melchers, 1971, Histochemical, J., 3, р.389-397). Как следствие быстрой секреции иммуноглобулинов из клеток, ранее никогда не предполагалось, что функциональные антитела или даже частично синтезированные антитела (например, до гликозилирования) могут присутствовать внутри клеток лимфоцитов в сколько-нибудь заметном количестве. Кроме того, не предполагалось, что разрушение лимфоцитов в образце может привести к появлению значительных количеств "свежесинтезированных антител", позволяя осуществить детектирование с целью иммунодиагностики.

Однако было неожиданно обнаружено, что содержащиеся в лимфоцитах клетки содержат достаточное количество антител, чтобы обеспечить детектирование и даже количественное определение острого синтеза антител у субъекта, если образцы для анализа отбирают в острой фазе иммунной реакции. Обычно это соответствует такому же временному интервалу, который предполагается и для появления секретирующих антитела клеток в периферической крови. Таким образом обеспечивается необходимая для диагностики информация.

Удобно то, что это позволяет избежать необходимости длительного инкубирования образца, например препарата очищенных лимфоцитов, до анализа, так как этот анализ не требует какого-либо инкубирования лимфоцитов.

Способ анализа согласно изобретению обеспечивает также надежный анализ, при котором образцы можно хранить до осуществления анализа, например, в охлажденном виде (предпочтительно около 4С) или в замороженном виде, например, при температуре ниже 0С. Специалистам должно быть очевидно, что цельную кровь предпочтительнее охлаждать (например, как будет описано далее), нежели замораживать, так как замораживание цельной крови приведет к лизису клеток. Однако такие образцы, как очищенные лимфоциты, можно замораживать или охлаждать до осуществления анализа, что не приведет к искажению результатов тестов. Такие образцы можно хранить в течение длительного промежутка времени до анализа даже такими способами, которые могут повлиять на жизнеспособность клеток (например, так же, как при хранении образцов сыворотки или плазмы). Как следствие, способ анализа согласно изобретению обеспечивает значительные преимущества для отбора образцов, их хранения и обработки, и особенно в том, что позволяет значительно отложить осуществление анализа, что может быть крайне необходимым при лабораторном тестировании образцов, полученных в полевых условиях.

Поэтому в одном из аспектов в настоящем изобретении предложен способ определения в образце количества свежесинтезированных антител в реакции на иммуноген, который включает в себя

получение образца, содержащего лимфоциты;

разрушение указанных лимфоцитов, в результате чего выделяются антитела или их части, связанные с указанными лимфоцитами;

детектирование выделенных антител или их частей, тем самым детектирование присутствия или количества свежесинтезированных антител в указанном образце.

В том смысле, как здесь использован термин "свежесинтезированное антитело", он относится к антигенно активному антителу (т.е. способному распознавать и связываться с антигеном, соответствующим иммуногену), которое было продуцировано или синтезировано клетками лимфоцитов и внутри них в ответ на присутствие иммуногена in vivo, как часть происходящей в рассматриваемое время иммунной реакции. Таким образом, антитела синтезируются лимфоцитами во время иммунной реакции, стимулируемой появлением иммуногена in vivo, то есть синтезируются до и во время отбора у подопытного животного образца, содержащего лимфоциты.

Ссылки на антитела или их части, связанные с указанными лимфоцитами, относятся к свежесинтезированным антителам или их частям, которые антигенно активны (т.е. способны распознавать иммуноген и связываться с ним), которые еще не были секретированы из клеток. Как было указано выше, это обычно соответствует антителам, продуцированным в предшествующие 2 часа (что может происходить исключительно in vivo или по крайней мере частично in vivo, до разрушения клеток, если эти клетки хранят в соответствующих условиях), хотя время, необходимое для секретирования, может меняться. Хотя антитела могут быстро продуцироваться внутри клеток (например, за 1-2 минуты, хотя секретирование происходит значительно медленнее), свободные цепи, которые составляют антитела, или негликозилированные или частично гликозилированные антитела, или цепи антител могут присутствовать в лимфоцитах и, следовательно, выделяться при их разрушении. В соответствующих случаях эти "части" могут определяться и могут быть включены в измерения присутствия или определения количества свежесинтезированных антител при условии, что они антигенно активны в указанном выше смысле. Антитела или их части, выделенные из лимфоцитов, включают в себя свежесинтезированные антитела. Оценка уровней содержания таких свежесинтезированных антител предоставляет соответствующую информацию о количестве активных антител, продуцированных в ответ на конкретный иммуноген, то есть антител, которые продуцированы, например, в процессе хронического или острого иммунного ответа. Таким образом, в настоящем изобретении предложен также способ определения присутствия или количественного определения продуцируемых активных антител путем коррелирования с уровнями свежесинтезированных антител при сравнении с соответствующими контрольными образцами.

Образец, содержащий лимфоциты, можно отобрать у любого животного, предпочтительно млекопитающего, например человека, на которого можно воздействовать иммуногеном перед отбором образца. Обычно, если необходимо определить иммунный ответ по способу настоящего изобретения, его вызывают свежей инфекцией или вакцинацией, и желательно произвести отбор образцов в течение нескольких недель или нескольких дней экспонирования этого иммуногена. Оптимальное время отбора образца у субъекта зависит от природы инфекции или типа использованной вакцины и, кроме того, определяется эффективностью механизма иммунного ответа субъекта, а это может варьировать у различных индивидуумов. Однако необходимо, чтобы образец был отобран в то время, когда лимфоциты иммунной системы субъекта находятся в фазе острого синтеза антител в ответ на представляющий интерес иммуноген. Так вообще было обнаружено, что образцы отбирают в течение 3 недель представления субъекта действию иммуногена, более предпочтительно в течение 8-12 дней после инфицирования или вакцинации, но в некоторых случаях происходит продуцирование достаточного количества антител в течение 1-5 дней или более конкретно 2-3 дней после инфицирования или вакцинации для получения значимых результатов с помощью анализа в соответствии с настоящим изобретением.

Образец может быть образцом крови или образцом, полученным из лимфатической системы субъекта. Обычно пригодны любая жидкость организма или образец ткани, которые содержат лимфоциты из иммунной системы субъекта. В частности, в клинике или в экспериментальных условиях удобно отобрать лимфу или периферическую кровь субъекта, но равным образом подходит любая лимфатическая или лимфоидная ткань или любой источник крови, включающий в себя лимфоциты, включая образцы, полученные из лимфатических узелков или желез или лимфатических узлов, например миндалин. Были разработаны методики хирургического вмешательства, которые позволяют получать материал биопсии от субъекта, и такую процедуру можно использовать при необходимости для получения образцов для использования в способе настоящего изобретения. В зависимости от источника лимфоцитов может оказаться необходимым (а может, и нет) выделить и очистить лимфоциты перед проведением анализа по способу настоящего изобретения. Однако при необходимости или при желании лимфоциты можно очистить. Так предпочтительным образцом для использования в таком анализе является препарат лимфоцитов, подготовленный из одного из вышеперечисленных источников известными специалистам способами.

Под термином "разрушение" лимфоцитов подразумевают, что содержимое клеток, включая все синтезированные антитела, выделяется за пределы клеточной мембраны и внутренних мембранных структур, так что их можно определять любым удобным биохимическим или химическим способом анализа. Известно, что иммуноглобулины синтезируются и секретируются по схеме с участием эндоплазматического ретикулума и комплекса Гольджи. Так, необходимое разрушение требует высвобождения из этих внутренних структур. Таким образом, разрушение лимфоцитов можно осуществить известными способами разрушения клеток, позволяющими выделить содержание мембранных компартментов, например, клеточным лизисом, например, используя средства физического разрушения, например циклы замораживания-оттаивания, или химическими способами, используя разрушающие клетки буферы или растворы.

В том смысле, как здесь использованы термины "детектирование" и "определение присутствия или количества", оба охватывают количественную и качественную оценку уровня продуцирования антител в смысле получения абсолютной величины количества антител, продуцируемых в образце, а также коэффициент, отношение, процент или аналогичные показатели уровня продуцирования антител, так же, как и полуколичественные или качественные оценки. Термин "определение присутствия" охватывает также ситуации, где негативный результат, указывающий на отсутствие синтезированных антител, представляет ценность для оценки иммунного ответа у субъекта. Например, негативный результат может указывать на отсутствие иммунного ответа на представляющий интерес иммуноген или может быть показателем хронической инфекции, если антитела к этому представляющему интерес иммуногену присутствуют в сыворотке.

Определение свежесинтезированных антител позволяет скорее оценивать уровни таких антител, специфических к одному или более из иммуногенов, нежели оценивать все антитела, присутствующие в клетках.

Определять синтезированные антитела можно любым способом, который позволяет идентифицировать те антитела, которые связываются с представляющим интерес иммуногеном, вызывая иммунный ответ. Так, можно использовать любой способ детектирования, который приводит к получению сигнала, который отражает присутствие антитела-мишени. Например, можно использовать связанные с ферментами анализы, в которых растворимый или нерастворимый продукт можно получить из субстрата, количество которого может быть оценено.

Обычно синтезированные антитела можно детектировать, например, с помощью анализа связывания на твердой фазе, например ELISA, где они связываются с антигеном, используемым при анализе, хотя используемый антиген может отличаться от иммуногена, стимулирующего иммунный ответ в начале. Так, хотя оба используемые в анализе антиген и иммуноген, которые стимулировали или стимулируют продуцирование антител in vivo, должны связываться с антителами, подлежащими определению за счет идентичных или очень похожих эпитопов, в других отношениях антиген и иммуноген могут не быть идентичными. Так, хотя антигеном, используемым в способе настоящего изобретения, может быть материал, содержащий все или некоторые части соответствующего иммуногена, например, полученный от инфицированных индивидуумов, или очищенных частей из того же самого материала, антиген может быть также получен синтетическим путем, например, с помощью химического синтеза или рекомбинантной экспрессии, с добавлением или удалением частей, относящихся к природному антигену. Так, можно использовать гибридные белки или молекулы, экспрессирующие только соответствующий эпитоп (эпитопы).

Настоящее изобретение предоставляет ряд преимуществ по сравнению с известными методиками анализа антител. Во-первых, в противоположность методикам, в которых определяют уровни антител в сыворотке (например ELISA сывороток), в способе анализа настоящего изобретения определяют антитела, которые являются показательными для текущей инфекции/иммунной стимуляции, или в случае новорожденных позволяют различить антитела матери и новорожденного. Это оказывается возможным, так как лимфоциты из образца используют непосредственно в способе анализа согласно настоящему изобретению без каких-либо других форм предварительной обработки или стимуляции, например in vitro стимуляции антигеном. Таким образом можно детектировать антитела, которые синтезируются лимфоцитами во время отбора образца. (Таким способом, даже используя очень маленькие объемы образцов, спонтанный протекающий в рассматриваемый промежуток времени синтез антител в ответ на представляющий интерес иммуноген можно отличить от случайной активации лимфоцитов). Кроме того, анализ проводят на лимфоцитах, которые были разрушены на стадии, когда они спонтанно продуцировали и секретировали или начинали секретировать антитела, без стимуляции клеток для проявления какой-либо памяти. Это противоположно другим опубликованным методикам, которые извлекали преимущества из in vitro стимуляции антигеном, что может повысить чувствительность теста, но что выявляет клеточную память, и поэтому не является точной или подходящей методикой для определения полученных в остром периоде или свежесинтезированных антител в ответ на текущую инфекцию или недавнюю вакцинацию.

С другой стороны, настоящее изобретение извлекает преимущество из спонтанной секреции антител, что позволяет определять антитела в крови, свидетельствующие о протекающей инфекции, с помощью тестового антигена; лимфоциты плазмы будут секретировать антитела против тестового антигена в течение нескольких первых недель после инфицирования или вакцинации и т.п. Детектирование таких антител способом настоящего изобретения позволяет диагностировать или определять инфекцию или антительный ответ на вакцинацию в процессе мониторинга и т.д.

Таким образом, в дальнейшем аспекте настоящего изобретения обеспечивается способ диагностики или мониторинга инфекции человека или животного или части указанного животного с помощью иммуногена путем осуществления способа настоящего изобретения и определения наличия или степени инфицирования указанным иммуногеном путем сравнения с соответствующими контрольными и/или сравнительными образцами.

Способ настоящего изобретения особенно полезен для младенцев и новорожденных, когда важно отличить свежесинтезированные антитела от пассивно перенесенных материнских антител. Те же самые содержащие лимфоциты образцы можно проанализировать на антитела против некоторых определенных инфекционных агентов либо в отдельном анализе, либо в том же самом анализе, используя множество соответствующих антигенов, что позволяет использовать родственные контактирующие антигены, соответствующие клиническим синдромам, присутствующим у пациента.

При диагностике инфекции важно также иметь возможность отличать протекающий в рассматриваемое время синтез антител от антител, которые уже присутствуют, как результат предшествующих инфекций. Вызов иммунологической памяти путем антигенной стимуляции in vitro несовместим с анализом, предназначенным для идентификации протекающей в рассматриваемое время инфекции, и поэтому известные ранее способы, основанные на антигенной стимуляции, не имеют такого преимущества. Кроме того, включение стадии антигенной стимуляции снижает благоприятный временной фактор анализа по способу настоящего изобретения, который осуществляется очень быстро по сравнению с известными ранее способами.

Во-вторых, в противоположность методикам, в которых определяют клетки, секретирующие антитела, или активно секретируемые антитела, в способе настоящего изобретения, хотя формы острого синтеза антител и являются основным параметром для определения, нет необходимости поддерживать образец в состоянии, которое промотирует синтез и/или секрецию антител. Это существенно упрощает тест и особенно выгодно по сравнению с известными ранее способами анализа, раскрытыми в WO/26443, где требуется инкубирование лимфоцитов после отбора образца, а также требуется поддержание во время анализа условий, которые позволили бы лимфоцитам продолжать секретирование антител.

Особенно неожиданным преимуществом настоящего изобретения является отсутствие какой-либо стадии инкубирования или специальных условий для анализа, а это означает, что после отбора образцов их удобно обрабатывать для эффективного разрушения или лизиса клеток, и полученный лизат можно затем хранить, например, при охлаждении или замораживании в течение некоторого промежутка времени перед осуществлением стадии анализа.

В другом варианте, как было указано ранее, образец, например, цельной крови или очищенный препарат можно хранить, например, охлажденным или замороженным (в зависимости от обстоятельств) в течение некоторого промежутка времени, например вплоть до нескольких часов или дней, например в течение более 4 часов, перед разрушением клеток. Например, при необходимости или при желании препарат очищенных лимфоцитов можно в течение некоторого времени хранить замороженным, например в течение нескольких часов или дней, или охлажденным, например в течение нескольких часов, перед тем, как образец обрабатывают с целью разрушения или лизиса клеток.

Однако было неожиданно обнаружено, что некоторые образцы, например препараты цельной крови, можно хранить охлажденными в течение более длительного времени без каких-либо вредных воздействий на клетки и искажений результатов тестов. Например, было обнаружено, что образцы цельной крови можно хранить охлажденными (например, при 4С) в течение по меньшей мере 6 дней, и при желании образцы могут храниться периодически при комнатной температуре (18-25С) в течение по меньшей мере 6 часов перед началом процедуры очистки лимфоцитов без какого-либо вредного влияния на результаты тестов. Это особенно полезно, если образцы крови находятся на хранении в лаборатории и хранятся охлажденными в ожидании рутинных или дополнительных процедур тестирования плазмы/сыворотки. Это удивительно и неожиданно, так как предполагает, что физическая целостность лимфоцитов сохраняется при хранении, что позволяет осуществлять последующее выделение лимфоцитов из хранящейся крови (при необходимости), и разрушение лимфоцитов происходит без значительного уменьшения определяемых антител.

Таким образом, в предпочтительном варианте перед разрушением лимфоцитов, например, в случаях, когда образцом является кровь, образец может храниться в течение нескольких дней, например вплоть до около 6 дней или более, особенно если он хранится при охлаждении примерно до 4С, даже может оставаться вынутым из холодильника на прерываемые промежутки времени, например от 4 до 6 часов, например, при комнатной температуре два или несколько раз на протяжении периода хранения без вредного воздействия на результаты анализа. Это особенно полезно, когда образцы крови хранят охлажденными, но при этом нельзя избежать ситуации, когда образец должен оставаться на столе при комнатной температуре в течение короткого промежутка времени. Неожиданно оказалось, что жизнеспособность клеток при этом не изменяется настолько сильно, чтобы исказить результаты или предотвратить получение приемлемых результатов при использовании способа анализа согласно изобретению.

В другом предпочтительном варианте, если используют препараты очищенных лимфоцитов, эти образцы можно хранить при температуре ниже 4С (например, в течение нескольких дней или дольше) или хранить примерно при 4С (вплоть до 6 часов). Возможность хранения различных образцов для использования в анализе делает способ настоящего изобретения особенно подходящим для крупных диагностических лабораторий, когда дорогое автоматизированное лабораторное оборудование, например оборудование для ELISA, можно использовать наиболее эффективно, обрабатывая значительное количество образцов одновременно. Это также означает, что образцы можно отобрать во многих различных местах и послать по почте или доставить в центральную диагностическую лабораторию для анализа, осуществляемого таким же образом, как и процедуры, установленные для анализа образцов сыворотки в тестах других типов.

Таким образом в альтернативном аспекте в настоящем изобретении предложен способ определения присутствия или количественного определения свежесинтезированных антител в образце в ответ на иммуноген, включающий в себя

детектирование выделенных антител или их частей в образце, содержащем лимфоциты, которые были разрушены, в результате чего высвободились синтезированные антитела или их части, связанные с указанными лимфоцитами, за счет чего происходит определение присутствия или количественное определение свежесинтезированных антител в указанном образце.

Основным преимуществом настоящего изобретения является то, что требуется лишь небольшой объем образца. Всего 100000 лимфоцитов или даже менее 50000 лимфоцитов могут привести к получению детектируемого сигнала при использовании способа настоящего изобретения. Так как, например, 1 мл крови содержит 110⁶ лимфоцитов, при использовании настоящего изобретения для анализа лимфоцитов, полученных из крови, необходимо лишь 50 или 100 мкл крови для получения достаточного количества лимфоцитов для осуществления способа настоящего изобретения. Даже учитывая соответствующие контрольные тесты (например, слепые тесты и позитивные тесты), для получения диагностических результатов достаточно всего 150-300 мкл. Очевидно, что по крайней мере несколько контрольных образцов придется отбросить, если тест стандартизован. Так, обычный тест по способу настоящего изобретения требует, например, 50-500 мкл, предпочтительно 100-300 мкл и обычно 100-200 мкл содержащего лимфоциты образца в объеме, сравнимом со всем образцом. Таким образом, в способе настоящего изобретения можно использовать, например, 510⁴-510⁵, предпочтительно 1-210⁵ лимфоцитов. Это противоположно классическим диагностическим тестам, которые обычно основаны на объемах в несколько мл сыворотки или другой жидкости. Это особенно применимо в случае образцов крови, когда доступны лишь маленькие объемы проб, например, от новорожденных, так как способ настоящего изобретения требует лишь микролитровые объемы, которые можно отобрать, например, капиллярной трубочкой из подходящего места, например мочки уха, кончика пальца или из пятки.

Таким образом, способ настоящего изобретения позволяет использовать маленькие объемы образцов крови (например, мкл объемы менее 1 мл, предпочтительно менее 500 мкл, например менее 100 мкл) непосредственно для детектирования спонтанного продуцирования антител или de novo продуцирования антител за счет нестимулированных лимфоцитов без предварительной стадии прекультивирования лимфоцитов перед анализом.

Антигены или иммуногены, на которые направлены антитела, для детектирования по способу настоящего изобретения включают в себя как бактериальные, так и вирусные антигены. Клинически важные антигены включают в себя (но ими не ограничиваются) те, которые получены, например, из вируса простого герпеса, цитомегаловируса, вируса иммунодефицита человека (HIV) и любого из вирусов гепатита, а также токсоплазм и вируса Эпштейна-Барр (EBV). Вообще, однако, способом настоящего изобретения можно определить любой иммуноген, полученный в результате инфицирования или вакцинации, вызывающий четкую реакцию антител (например, во время острой фазы). В случаях, когда хроническая инфекция приводит к детектируемым уровням антител-мишеней в лимфоцитах, анализ этих антител можно также осуществить в соответствии со способом настоящего изобретения. Так, например, антитела к любому иммуногену, которые можно детектировать, используя обычный метод ELISA, можно детектировать способом настоящего изобретения. Детектирование антител к такому антигену можно использовать для быстрого определения того факта, инфицирован ли пациент, например, с целью скринирования крови или для установления и/или контроля за инфекцией.

Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ диагностики или контроля за инфекцией у человека или животного или частей указанного животного, вызванной бактерией или вирусом, причем указанный способ включает в себя получение содержащего лимфоциты образца от указанного животного, определение присутствия или количества свежесинтезированных антител или их частей, связанных с указанными лимфоцитами, направленных против указанной бактерии или вируса, в соответствии с раскрытым здесь способом и определение наличия или степени инфицирования указанной бактерией или вирусом путем сравнения с соответствующими контрольными и/или сравнительными образцами.

Способ особенно полезен благодаря его простоте и может быть использован в случаях, когда недоступно сложное оборудование, например в полевых условиях. Так как не требуется инкубирования как части аналитического метода, он легко может быть автоматизирован, но также относительно быстро и просто осуществить клеточный лизис и детектировать антитела в ситуации, когда сложное оборудование недоступно.

Далее способ настоящего изобретения будет раскрыт более подробно. Предпочтительно, чтобы первая стадия способа включала в себя выделение лимфоцитов из образца. Однако, как было указано выше, препарат очищенных лимфоцитов вовсе не необходим и вместо него можно использовать препарат, из которого удалена основная часть плазменных антител. Предпочтительно, чтобы такой препарат содержал менее 15% антител, соответствующих антителам плазмы, присутствующим в образце, например, менее 5%, предпочтительно менее 1%. Обычно этого можно достичь, используя препарат, который практически не содержит плазмы (например, менее 5% (об./об.), например, препарат, который не содержит плазмы). Препарат лимфоцитов можно приготовить, используя стандартные методики, хорошо известные специалистам, например, используя способы фильтрования, или способы с использованием абсорбентного материала, или препаративный набор для лимфоцитов. Так, например, обычно удобно использовать различные препараты цельной крови для получения лимфоцитов, например, из гепаринизированной крови, EDTA-крови и т.д., такие как те, которые обычно приготавливают в клинических лабораториях. Следует учитывать, что все обогащенные или очищенные препараты должны содержать лимфоциты, присутствующие в том образце, из которого получен препарат, для того чтобы можно было определить спонтанную или de novo продукцию антител.

Лимфоциты предпочтительно выделить, например, используя стандартную среду для выделения лимфоцитов, например Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norway), или используя иммуномагнитное выделение (IMS), или аналогичную систему выделения с использованием твердой фазы, или другие обычные методики. В случае IMS или аналогичных методик выделения твердую фазу, например магнитные шарики, покрытые антителом, специфичным для определенных наборов лейкоцитов, можно использовать для селективного выделения нужных лимфоцитов. Если используют выделенные лимфоциты, клетки можно промыть перед использованием, используя стандартные способы промывки. Предпочтительно, чтобы лимфоциты были промыты для удаления всех плазменных антител, которые могут присутствовать после выделения клеток. Обычно для осуществления изобретения примесь плазменных антител в клетках лимфоцитов поддерживают на минимальном уровне, предпочтительно менее 20 нг плазменного IgG на 100 мкл образца, что соответствует коэффициенту конечного разбавления плазмы примерно 1:50000, например ниже, чем около 0,5 нг сывороточного IgG на 100 мкл образца. Однако было отмечено, что для достижения этого не требуется избыточной или интенсивной промывки клеток. Например, было обнаружено, что просто центрифугируя цельную кровь, трижды разбавленную буферами примерно в тех же условиях вращения, можно получить препарат лимфоцитов, достаточно свободный от загрязняющих антител сыворотки/плазмы. Для более подробного изложения см. пример 3.

Вообще говоря, способ настоящего изобретения позволяет избежать необходимости инкубирования лимфоцитов из образца перед осущес