Антагонистические аналоги рилизинг-гормона гормона роста (gh-rh), ингибирующие инсулиноподобные факторы роста (igf-i и-ii)

Антагонистические аналоги рилизинг-гормона гормона роста (gh-rh), ингибирующие инсулиноподобные факторы роста (igf-i и-ii)

Реферат

 

Изобретение относится к пептиду, выбранному из группы, имеющей формулу: X-R¹-R²-Asp-Ala-R⁵-R⁶-Thr-R⁸-R⁹-R¹⁰-Arg-R¹²-R¹³-R¹⁴-R¹⁵-R¹⁶-Leu-R¹⁸-R¹⁹-Arg-R²¹-R²²-Leu-Gln-Asp-Ile-R²⁷-R²⁸-R²⁹-NH₂, где X означает PhAc, IndAc или Nac, R¹ означает Tyr или His, R² означает D-Arg, R⁵ означает Ile или Val, R⁶ означает Phe или Phe(Cl), R⁸ означает Asn, Gln, Ala или D-Asn, R⁹ означает Arg, Har, Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn, Cit, Nle, Tyr(Me), Ser, Ala или Aib, R¹⁰ означает Tyr или Tyr(Me), R¹² означает Lys, R¹³ означает Val или Nle, R¹⁴ означает Leu или Nle, R¹⁵ означает Gly, Ala, Abu, Nle или Gln, R¹⁶ означает Gln или Arg, R¹⁸ означает Ser или Nle, R¹⁹ означает Ala, R²¹ означает Lys, R²² означает Leu, Ala или Aib, R²⁷ означает Met, Leu, Nle, Abu или D-Arg, R²⁸ означает Arg, D-Arg или Ser, R²⁹ означает Arg, D-Arg, Har или D-Har, при условии, что когда ⁹ и R²⁸ означают Ser, R²⁹ не является Arg или Har, и его фармацевтически приемлемым солям. Соединения по изобретению являются антагонистами рилизинг-гормона гормона роста и обладают повышенным сродством к рецептору. Описан также способ подавления избыточных уровней гормона роста у больного, способ лечения злокачественной опухоли и способ ингибирования уровней IGF-II в опухолях. 4 с. и 7 з.п. ф-лы, 9 табл., 5 ил.

Данное изобретение было осуществлено при частичной правительственной поддержке Медицинской Исследовательской Службы Департамента по делам ветеранов. Правительство имеет определенные права на данную заявку.

Настоящее изобретение относится к новым синтетическим пептидам, которые ингибируют высвобождение гормона роста из гипофиза у млекопитающих, и к терапевтическим композициям, содержащим такие новые пептиды.

Предпосылки создания изобретения

Гормон роста (GH) является пептидом, имеющим 191 аминокислоту, который стимулирует продуцирование многочисленных различных факторов роста, например инсулиноподобного фактора роста I (IGF-I), и, таким образом, стимулирует рост многочисленных тканей (скелет, соединительная ткань, мышцы и внутренние органы) и физиологическую активность (повышение синтеза нуклеиновых кислот и белков и липолиза и понижение секреции мочевины).

Высвобождение GH находится под контролем высвобождающих и ингибирующих факторов, выделяемых гипоталамусом. Основным рилизинг-фактором является рилизинг-гормон гормона роста (GH-RH); рилизинг-гормон человеческого гормона роста (hGH-RH) является пептидом, состоящим из 44 аминокислот. Новые пептиды по настоящему изобретению относятся к аналогам hGH-RH, имеющим только остатки от 1 до 29 (hGH-RH(1-29)NH₂), то есть к аналогам пептида, имеющего аминокислотную последовательность:

Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile⁵-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Arg-Lys-Val-Leu-Gly¹⁵-

Gln-Leu-Ser-Ala-Arg²⁰-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp²⁵-Ile-Met-Ser-Arg²⁹-NH₂

GH причастен к некоторым заболеваниям. Одним из заболеваний, в которое вовлечен GH, является акромегалия, при которой присутствуют избыточные уровни GH. Патологически гипертрофированные лицевые кости и кости конечностей при данном заболевании могут подвергаться лечению путем введения антагониста GH-RH.

Другими заболеваниями, в которые вовлечен GH, являются диабетическая ретинопатия и диабетическая нефропатия. Полагают, что соответственно повреждение сетчатки и почек при таких заболеваниях, приводящее к слепоте или снижению функции почек, связано с GH. Такое поражение может быть предотвращено или замедлено при введении эффективного антагониста GH-RH.

Однако главное применение антагонистов GH-RH предполагается в области злокачественных новообразований (A.V. Schally et al. in Growth Hormone Secretagogues in Clinical Practice, eds. Bercu, B.B. & Walker, R.F., Dekker, New York, pp. 145-162, 1998). IGF-I и -II являются сильнодействующими митогенами для различных злокачественных опухолей. Подавляя секрецию GH, антагонисты GH-RH уменьшают синтез IGF-I в печени и других тканях. Антагонисты GH-RH также понижают аутокринное и паракринное продуцирование IGF-I и/или IGF-II различными опухолями. При некоторых экспериментальных злокачественных опухолях лечение антагонистами GH-RH приводит к уменьшению IGF-I и -II, сопутствующему ингибированию роста опухоли.

При попытке воздействовать на развитие этих заболеваний и других состояний некоторые исследователи попытались контролировать уровни GH, используя соматостатин, один из ингибиторов высвобождения GH. Однако соматостатин, введенный в отдельности, не подавляет уровни GH или IGF-I до желаемой степени. При введении в комбинации с антагонистом GH-RH соматостатин намного бы улучшил подавление уровней IGF-I.

Исследовались различные модификации GH-RH для выяснения связи структуры GH-RH с его активностью в попытке обеспечить синтетические родственные соединения с улучшенными агонистическими или антагонистическими свойствами. Так, ранее было установлено, что фрагмент GH-RH, включающий остатки 1-29, или GH-RH (1-29), является минимальной последовательностью, необходимой для биологической активности. Этот фрагмент сохраняет 50% или более активности природного GH-RH.

Было найдено, что первый описанный антагонист GH-RH, [Ас-Туr¹, D-Arg²]hGH-RH (1-29) NH₂, который обычно называют в литературе "стандартным антагонистом", предотвращает активацию аденилатциклазы передней доли гипофиза крысы с помощью hGH-RH(l-29)NH₂. Тот же пептид блокировал действие GH-RH на его рецепторах в гипофизе и гипоталамусе и ингибировал пульсирующую секрецию гормона роста.

В значительном числе патентов и статей в открытой литературе описываются аналоги GH-RH, которые действуют либо как агонисты GH-RH (то есть, действуют как стимуляторы высвобождения GH), либо как антагонисты GH-RH (то есть, действуют как ингибиторы высвобождения GH). Большинство этих пептидов происходит от пептидной последовательности GH-RH(1-29) со специфическими структурными модификациями, которые отвечают за их повышенные агонистические или антагонистические свойства.

Так, патент США №4659693 раскрывает антагонистические аналоги GH-RH, которые содержат определенные N,N'-диалкил--гуанидино--аминоацильные остатки в положении 2 последовательности GH-RH(1-29).

Опубликованная международная заявка на патент WO 91/16923 рассматривает ранние попытки изменить вторичную структуру hGH-RH путем модификации его аминокислотной последовательности. Такие предпринятые ранее попытки включают замену Туr¹, Ala², Asp³ или Asn⁸ их D-изомерами; замену Asn⁸ на L- или D-Ser, D-Arg, Asn, Thr, Gln или D-Lys; замену Ser⁹ на Ala для повышения амфифильности участка и замену Gly¹⁵ на Ala или Aib. Когда R² в аналогах является D-Arg и R⁸, R⁹ и R¹⁵ замещены как указано выше, в результате наблюдают антагонистическую активность. Такие антагонистические пептиды считаются подходящими для введения в качестве фармацевтических композиций для лечения состояний, связанных с избыточными уровнями GH, например акромегалии.

Антагонистическая активность аналога hGH-RH [Ser⁹-[СН₂-NH]-Туг¹⁰]hGH-RH(1-29) по патенту США №5084555 была определена как результат псевдопептидной связи (то есть, пептидной связи, восстановленной до [CH₂-NH]-связи) между остатками R⁹ и R¹⁰. Однако было указано, что антагонистические свойства [Sеr⁹-[СH₂-NН]-Туr¹⁰] hGH-RH(1-29) были ниже, чем у стандартного антагониста, [N-Ac-Tyr¹, D-Arg²]GH-RH(1-29)-NH₂.

Патент США №5550212 и заявка на патент США 08/642472, представляющие такие же объекты, что и настоящая заявка, описывают аналоги hGH-RH(1-29)NH₂, характеризующиеся повышенными антагонистическими свойствами и продолжительным временем действия. Считается, что такие свойства являются результатом замены различных аминокислот и ацилирования ароматическими или неполярными кислотами по N-концу GH-RH(1-29)NH₂. Необходимо заметить, что в вышеупомянутых патенте США и заявке на патент США R⁹ всегда является Ser, R¹⁶ является Gln или аминокислотой, образующей лактамный мостик (то есть, Glu), R²⁸ является Ser, Asn, Asp, Ala или Abu и R²⁹ означает Agm, Arg-NH₂, Arg-OH, Cit-NH₂, Cit-OH, Har-NH₂, Har-OH или аминокислоту, образующую лактамный мостик (то есть, Lys или Orn).

Краткое описание изобретения

Представлен новый ряд синтетических аналогов hGH-RH(1-29)NH₂. Данные аналоги ингибируют активность эндогенного hGH-RH и тем самым предотвращают высвобождение гормона роста. Более сильные ингибирующие эффекты новых аналогов по сравнению с описанными ранее являются результатом замены различных аминокислот.

Конкретно, изобретение относится к пептидам, которые охватываются формулами:

Х-R¹-R²-Аsр-Аla-R⁵-R⁶-Тhr-R⁸-R⁹-R¹⁰-Аrg-R¹²-R¹³-R¹⁴-R¹⁵-R¹⁶-Leu-R¹⁸-R¹⁹-Arg-R^2l-R²²-Leu-Gln-Asp-Ile-R²⁷-R²⁸-R²⁹-NH₂,

где Х означает PhAc, IndAc, Ibu, Nac, 1- или 2-Npr или

Fpr,

R¹ означает Туr или His,

R² означает D-Arg или D-Cit,

R⁵ означает Ilе или Val,

R⁶ означает Phe, Nal или Phe(Y), в котором Y=F, Cl, Br,

R⁸ означает Asn, Gln, Ser, Thr, Ala, D-Asn, D-Gln, D-Ser, D-Thr, Abu, D-Abu или Aib,

R⁹ означает Arg, Har, Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn, Cit, Nle, Tyr(Me), Ser, Ala или Aib,

R¹⁰ означает Туr или Phe(Y), в котором Y=H, F, Cl, Br или

ОСН₃,

R¹² означает Lys, D-Lys или Orn,

R¹³ означает Val или Nle,

R¹⁴ означает Leu или Nle,

R¹⁵ означает Gly, Ala, Abu, Nle или Gln,

R¹⁶ означает Gln или Arg,

R¹⁸ означает Ser или Nle,

R¹⁹ означает Ala или Abu,

R²¹ означает Lys или Orn,

R²² означает Leu, Ala или Aib,

R²⁷ означает Met, Leu, Nle, Abu или D-Arg,

R²⁸ означает Arg, D-Arg, Ser, Asn, Asp, Ala или Abu,

R²⁹ означает Arg, D-Arg, Наг или D-Har, и к их фармацевтически приемлемым солям.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения рассматриваются пептиды, в которых Х означает PhAc, IndAc или Nac, R¹ означает Туr или His, R² означает D-Arg, R⁵ означает Ile, R⁶ означает Phe(pCl), R⁸ означает Asn или Abu, R⁹ означает Аrg или Наr, Lys, Orn, D-Arg, D-Har, D-Lys, D-Orn, Cit, Nle или Тyr(Me), R¹⁰ означает Тyr или Тyr(Me), R¹² означает Lys, R¹³ означает Val или Nle, R¹⁴ означает Leu или Nle, R¹⁵ означает Abu, Ala или Nle, R¹⁶ означает Gln или Arg, R¹⁸ означает Ser или Nle, R¹⁹ означает Ala или Abu, R²¹ означает Lys, R²⁷ означает Nle или D-Arg, R²⁸ означает D-Arg, Arg или Ser, R²⁹ означает D-Arg, Наr или D-Har.

Отмечено, что аминокислотные остатки от 30 до 44 природной молекулы GH-RH, по-видимому, не являются существенными для активности; также не является критичной их идентичность. Поэтому похоже, что присоединение некоторых или всех из этих дополнительных аминокислотных остатков к С-концу аналогов hGH-RH(1-29)-NH₂ по настоящему изобретению не повлияет на эффективность этих аналогов в качестве антагонистов GH-RH. Если некоторые или все из этих аминокислот присоединяли к С-концу аналогов hGH-RH(1-29)-NH₂, то присоединенные аминокислотные остатки могли бы быть такими же, как и остатки от 30 до 44 в последовательности природного hGH-RH, или приемлемыми эквивалентами.

Синтетические методы.

Синтетические пептиды получают подходящим способом, как, например, исключительно твердофазным способом, частично твердофазным способом, путем конденсации фрагментов или путем классического синтеза в растворе.

Когда аналоги по изобретению синтезируют твердофазным способом, С-концевой остаток (здесь R²⁹) подходящим образом связывается (закрепляется) с инертным твердым носителем (смола), сохраняя в то же время защитные группы для своей -аминогруппы (и, соответственно, при необходимости, для функциональной группы боковой цепи). После завершения этой стадии защитную группу -аминогруппы удаляют с закрепленного аминокислотного остатка и прибавляют следующий аминокислотный остаток, R²⁸, имеющий подходящим образом замещенную -аминогруппу (как и любую соответствующую функциональную группу боковой цепи), и так далее. Защитные группы N-конца удаляют после присоединения каждого остатка, но в то же время не удаляют защитные группы боковой цепи. После того как присоединили все желаемые аминокислоты в надлежащей последовательности, пептид отделяют от носителя и освобождают от всех защитных групп боковой цепи в условиях, которые являются минимально деструктивными по отношению к остаткам в последовательности. Затем следует тщательная очистка и точная идентификация синтетического продукта для гарантии того, что действительно получена желаемая структура.

Особо предпочтительно защитить -аминофункциональную группу аминокислот во время стадии сочетания с помощью чувствительной к кислоте или основанию защитной группы. Такие защитные группы должны обладать свойствами сохранения стабильности в условиях образования пептидных связей, в то же время должны легко удаляться без разрушения растущей пептидной цепи и без рацемизации любого из содержащихся там хиральных центров. Подходящими защитными группами -аминогруппы являются Воc(трет-бутоксикарбонил) и Fmoc(9-флуоренилметилоксикарбонил).

Применения в медицине.

Являющиеся антагонистами hGH-RH пептиды или соли этих пептидов могут быть приготовлены в виде фармацевтических лекарственных форм, содержащих эффективные количества указанных соединений, и введены людям или животному с лечебными или диагностическими целями. Пептиды могут быть использованы для подавления уровней GH и для лечения состояний, связанных с избыточными уровнями GH, например диабетическая ретинопатия и нефропатия, и акромегалия. Также обеспечены методы лечения этих заболеваний путем введения композиции по изобретению индивидууму, нуждающемуся в таком лечении. Основное применение антагонистов GH-RH относится, однако, к области злокачественных новообразований, например при раке молочной железы, легкого, ободочной кишки, мозга, поджелудочной железы и предстательной железы человека, где присутствуют рецепторы IGF-I или IGF-II.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет графическую зависимость изменений объема мышиных, относящихся к молочной железе злокачественных опухолей МХТ от дней обработки при обработке определенными антагонистами GH-RH.

Фиг.2 представляет графическую зависимость изменений объема человеческих злокачественных опухолей молочной железы MDA-MB-468 у бестимусных мышей от дней обработки при обработке определенными антагонистами GH-RH.

Фиг.3 представляет графическую зависимость изменений объема человеческих злокачественных опухолей ободочной кишки НТ-29 у бестимусных мышей от дней обработки при обработке определенными антагонистами GH-RH.

Фиг.4 представляет графическую зависимость изменений объема человеческих глиобластом U87MG у бестимусных мышей от дней обработки при обработке антагонистом GH-RH.

Фиг.5 представляет графическую зависимость изменений объема человеческих злокачественных опухолей предстательной железы РС-3 у бестимусных мышей от дней обработки при обработке определенными антагонистами GH-RH.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

А. Сокращения

Номенклатура, используемая для определения пептидов, является такой, которая установлена специальным уполномоченным ИЮПАК-МБС (МБС - Международный биохимический союз) по биохимической номенклатуре, где в соответствии с общепринятым представлением аминогруппа при N-конце находится слева и карбоксильная группа при С-конце находится справа. Термин "природная аминокислота", используемый здесь, означает одну из обычных, встречающихся в природе L-аминокислот, находящихся в природных белках: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp и His, Когда остаток природной аминокислоты существует в изомерных формах, именно L-форма аминокислоты представлена здесь, если специально не указано иначе.

Некодированные аминокислоты или аминокислотные аналоги также включены в антагонисты GH-RH. ("Некодированные" аминокислоты представляют те аминокислоты, которые не находятся среди примерно 20 природных аминокислот, встречающихся в природных пептидах). К некодированным аминокислотам или аминокислотным аналогам, которые могут быть использованы в пептидах, являющихся антагонистами hGH-RH, относятся следующие: под Abu имеют ввиду -аминомасляную кислоту, под Aib имеют ввиду -аминоизомасляную кислоту, под Наr имеют ввиду гомоаргинин, под Nal имеют ввиду 2-нафтилаланин, под Nle имеют ввиду норлейцин и под Оrn имеют ввиду орнитин. Когда эти некодированные аминокислоты или аналоги аминокислот существуют в изомерных формах, именно L-форма аминокислоты представлена здесь, если специально не указано иначе. Используемые здесь сокращения:

Abu - -аминомасляная кислота;

Ас - ацетил;

АсОН - уксусная кислота;

Ас₂O - уксусный ангидрид;

Aib - -аминоизомасляная кислота;

Воc - трет-бутоксикарбонил;

Воm - бензилоксиметил;

2BrZ - 2-бромбензилоксикарбонил;

сНх - циклогексил;

Cit - цитруллин (2-амино-5-уреидовалериановая кислота);

2CIZ - 2-хлорбензилоксикарбонил;

DCM - дихлорметан (ДХМ);

DIC - N,N'-диизопропилкарбодиимид (ДИКД);

DIEA - диизопропилэтиламин (ДИЭА);

DMF - диметилформамид (ДМФА);

Fmoc - флуоренилметилоксикарбонил;

Fpr - 3-фенилпропионил;

GH - гормон роста;

GH-RH - рилизинг-гормон гормона роста;

Наr - гомоаргинин;

HBTU - 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметил-урония гексафторфосфат;

hGH-RH - человеческий GH-RH;

HOBt - 1-гидроксибензотриазол;

HPLC - высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ);

Ibu - изобутирил;

IndAc - индол-3-ацетил;

МВНА - п-метилбензгидриламин (МБГА);

МеОН - метанол;

MeCN - ацетонитрил;

Nac - 1-нафтилацетил;

Nal - 2-нафтилаланин;

NMM - N-метилморфолин;

Npr - нафтилпропионил;

РАМ - фенилацетамидометил;

Phe(pCl) - п-хлорфенилаланин;

PhAc - фенилацетил;

rGH-RH - крысиный GH-RH;

RP-HPLC - ВЭЖХ с обращенной фазой;

TFA - трифторуксусная кислота (ТФК);

Tos - п-толуолсульфонил;

Тyr(Me) - простой тирозинметиловый эфир;

Z - бензилоксикарбонил.

В. Аналоги GH-RH

Аналоги hGH-RH по настоящему изобретению были получены с целью повышения сродства пептидов к рецептору, повышения метаболической устойчивости и максимизирования амфифильности вторичной структуры молекул. Многие из этих аналогов вызывают очень эффективное и продолжительное ингибирование высвобождения GH, стимулированного hGH-RH(1-29)NH₂ in vitro и in vivo.

Следующие варианты осуществления изобретения особенно предпочтительны как обладающие прекрасной биологической активностью:

[PhAc⁰,D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 1;

[IndAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NН₂ пептид 2;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Наr⁹, Tyr(Me)¹⁰, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 3;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Har⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 4;

[Nac⁰, D-Arg³, Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 5;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Tyr(Me)¹⁰, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 6;

[PhAc⁰, His¹, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 7;

[Nac⁰, His¹, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 8;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 9;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Abu¹⁵, Аrg¹⁶, Nle²⁷, D-Arg²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 10;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 11;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Nle⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 12;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Nle¹³, Nle¹⁴, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 13;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Nle¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 14;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Abu¹⁵, Nle¹⁸, Nle²⁷, D-Arg²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 15;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Тyr(Ме)¹⁰, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 16;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Abu⁸, Tyr(Me)¹⁰, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 17;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, D-Abu⁸, Tyr(Me)¹⁰, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 18;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Tyr(Me)¹⁰, Abu¹⁵, D-Arg²⁷, Arg²⁸, D-Arg²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 19;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Tyr(Me)³, Abu¹⁵, D-Arg²⁷, Arg²⁸, D-Arg²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 20;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Abu¹⁵, D-Arg²⁷, Arg²⁸, D-Arg²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 21;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Abu⁸, Tyr(Me)¹⁰, Abu¹⁵, D-Arg²⁷, Arg²⁸, D-Arg²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 22;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, D-Abu⁸, Туr(Ме)¹⁰, Abu¹⁵, D-Arg²⁷, Arg²⁸, D-Arg²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 23;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Lys⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 24;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Orn⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 25;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, D-Аrg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 26;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, D-Har⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 27;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, D-Lys⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 28;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, D-Orn⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 29;

(PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Cit⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 30.

Шесть очень предпочтительных вариантов осуществления изобретения имеют формулы:

PhAc⁰-Tyr¹-D-Arg²-Asp³-Ala⁴-Ile⁵-Phe(pCl)⁶-Thr⁷-Asn⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Arg¹¹-Lys¹²-Val¹³-Leu¹⁴-Abu¹⁵-Gln¹⁶-Leu¹⁷-Ser¹⁸-Ala¹⁹-Arg²⁰-Lys²¹-Leu²²-Leu²³-Gln²⁴-Asp²⁵-Ile²⁶-Nle-²⁷-D-Arg²⁸-Har²⁹-NH₂ пептид 1;

lndAc⁰-Tyr¹-D-Arg²-Asp³-Ala⁴-Ile⁵-Phe(pCl)⁶-Thr⁷-Asn⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Arg¹¹-Lys¹²Val¹³-Leu¹⁴-Abu¹⁵-Gln¹⁶-Leu¹⁷-Ser¹⁸-Ala¹⁹-Arg²⁰-Lys²¹-Leu²²-Leu²³-Gln²⁴-Asp²⁵-Ile²⁶-Nle²⁷-D-Arg²⁸-Har²⁹-NH₂ пептид 2;

PhAc⁰-Tyr¹-D-Arg²-Asp³-Ala⁴-Ile⁵-Phe(pCl)⁶-Thr⁷-Asn⁸-Har⁹-Tyr(Me)¹⁰-Arg¹¹-Lys¹²-Var¹³-Leu¹⁴-Abu¹⁵-Gln¹⁶-Leu¹⁷-Ser¹⁸-Ala¹⁹-Arg²⁰-Lys²¹-Leu²²-Leu²³-Gln²⁴-Asp²⁵-Ile²⁶-Nle²⁷-D-Arg²⁸-Har²⁹-NH₂ пептид 3;

PhAc⁰-Tyr¹-D-Arg²-Asp³-Ala⁴-Ile⁵-Phe(pCl)⁶-Thr⁷-Asn⁸-Arg⁹-Tyr(Me)¹⁰-Arg¹¹-Lys¹²-Val¹³-Leu¹⁴-Abu¹⁵-Gln¹⁶-Leu¹⁷-Ser¹⁸-Ala¹⁹-Arg²⁰-Lys²¹-Leu²²-Leu²³-Gln²⁴-Asp²⁵-Ile²⁶-Nle²⁷-D-Arg²⁸-Har²⁹-NH₂ пептид 6;

PhAc⁰-His¹-D-Arg²-Asp³-Ala⁴-Ile⁵-Phe(pCl)⁶-Thr⁷-Asn⁸-Arg⁹-Tyr¹⁰-Arg¹¹-Lys¹²-Val¹³-Leu¹⁴-Abu¹⁵-Gln¹⁶-Leu¹⁷-Ser¹⁸-Ala¹⁹-Arg²⁰-Lys²¹-Leu²²-Leu²³-Gln²⁴-Asp²⁵-Ile²⁶-Nle²⁷-D-Arg²⁸-Har²⁹-NH₂ пептид 7;

Nac⁰-His¹-D-Arg²-Asp³-Ala⁴-Ile⁵-Phe(pCl)⁶-Thr⁷-Asn^в-Arg⁹-Tyr¹⁰-Arg¹¹-Lys¹²-Val¹³-Leu¹⁴-Abu¹⁵-Gln¹⁶-Leu¹⁷-Ser¹⁸-Ala¹⁹-Arg²⁰-Lys²¹-Leu²²-Leu²³-Gln²⁴-Asp²⁵-Ile²⁶-Nle²⁷-D-Arg²⁸-Har²⁹-NH₂ пептид 8.

Согласно общепринятому правилу такие соединения могут быть представлены с сокращенным наименованием, как следует ниже:

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 1;

[IndAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 2;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Har⁹, Tyr(Me)¹⁰, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 3;

[PhAc⁰, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Tyr(Me)¹⁰, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 6;

[PhAc⁰, His¹, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29)NH₂ пептид 7;

[Nac⁰, His¹, D-Arg², Phe(pCl)⁶, Arg⁹, Abu¹⁵, Nle²⁷, D-Arg²⁸, Har²⁹]hGH-RH(1-29) NH₂ пептид 8.

С. Способ получения

1. Обзор синтеза.

Пептиды синтезируют подходящими способами, как, например, исключительно путем твердофазного пептидного синтеза, частично путем твердофазного синтеза, путем конденсации фрагментов или путем классического синтеза в растворе. Например, методики исключительно твердофазного синтеза представлены в учебнике "Solid Phase Peptide Synyhesis", J.M. Stewart and J.D. Young, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 1984 (2nd. ed.), and M. Bodanszky, "Principles of Peptide Synthesis", Springer Verlag, 1984. Являющиеся антагонистами hGH-RH пептиды предпочтительно получают при применении твердофазного синтеза, как, например, описанного Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, р. 2149 (1963), хотя другие эквивалентные химические синтезы, известные в данной области, могут быть также применены, как указывалось выше.

Синтез осуществляют с аминокислотами, которые защищены по -аминогруппе. Предпочтительно для защиты -аминогруппы используют защитные группировки типа уретана (Воc или Fmoc). Предпочтительной защитной группой является Воc.

При твердофазном синтезе защищенный по атому азота -аминогруппы участок аминокислоты, который образует аминоацильную группу конечного пептида при С-конце, присоединяют химической связью к носителю из полимерной смолы. После завершения реакции связывания защитную группу -аминогруппы для проведения последующих реакций связывания по аминоконцу селективно удаляют, предпочтительно с помощью 50% трифторуксусной кислоты (ТФК) в дихлорметане (ДХМ), когда N--защитной группой является Воc. Остальные аминокислоты с подобным же образом Вос-защищенными -аминогруппами постадийно присоединяют к свободной аминогруппе предыдущей аминокислоты на смоле для получения желаемой пептидной последовательности. Так как аминокислотные остатки связываются с -аминогруппой С-терминального остатка, рост синтетических пептидных аналогов hGH-RH начинается при С-конце и продвигается в направлении к N-концу. Когда получена желаемая последовательность, пептид ацилируют по N-концу и его удаляют с полимерного носителя.

Каждую защищенную аминокислоту применяют в избытке (2,5 или 3 эквивалента), и реакции сочетания обычно проводят в ДХМ, ДМФА или в их смесях. Степень завершения реакции связывания контролируется на каждой стадии с помощью реакции с нингидрином. В случаях, когда определяют неполное связывание, процедуру связывания повторяют или реакцию завершают путем ацилирования непрореагировавших аминогрупп до удаления защитной группы с -аминогруппы перед связыванием следующей аминокислоты.

Типичный цикл синтеза представлен в таблице 1.

После завершения синтеза отщепление пептида от смолы может быть осуществлено с использованием методик, хорошо известных в химии пептидов.

Некоторые из аминокислотных остатков пептидов имеют такие функциональные группы в боковой цепи, которые реакционноспособны по отношению к реагентам, использующимся при связывании или снятии защиты. Когда в боковой цепи присутствуют такие группы, подходящие защитные группы присоединяют к этим функциональным группам для предотвращения нежелательных химических реакций, происходящих при реакциях, используемых для образования пептидов. При выборе соответствующей защитной группы для боковой цепи придерживаются следующих общих правил: (а) защитная группа предпочтительно сохраняет свои защитные свойства и не отщепляется в условиях связывания, (b) защитная группа должна быть устойчивой в условиях удаления защитной группы с -аминогруппы на каждой стадии синтеза, (с) защитная группа боковой цепи должна быть способной после завершения синтеза желаемой аминокислотной последовательности удаляться в реакционных условиях, которые не изменят нежелательным образом пептидную цепь.

Реакционноспособные функциональные группы боковой цепи предпочтительно защищают следующим образом: бензил для Thr и Ser; 2-бромбензилоксикарбонил для Тyr; п-толуолсульфонил или нитрогруппа для Аrg и Наr; 2-хлорбензилоксикарбонил или флуоренилметилоксикарбонил для Lys, Orn; бензилоксиметил для His и циклогексил или флуоренилметил для Asp и Glu. Боковые цепочки Asn и Gln не защищаются.

3. Постадийное связывание аминокислотных остатков с полимерным носителем.

Пептиды, являющиеся антагонистами hGH-RH, могут быть синтезированы на ряде полимерных носителей, то есть, на смоле на основе п-метилбензгидриламина (МБГА), на смоле Меррифилда, на смоле на основе фенилацетамидометила или на смоле Wang. Когда для синтеза используются N--Boc-защищенные аминокислоты, предпочтительной смолой является смола на основе МБГА. В этом случае получают пептиды с амидированным С-концом при отщеплении от фазы-носителя.

Сначала С-концевая аминокислота присоединяется к нейтрализованной МБГА-смоле и затем проводятся последующие связывания аминокислот. Каждая защищенная аминокислота связывается примерно при трехкратном молярном избытке по отношению к связанным смолой остаткам со свободными аминогруппами, и связывание может быть проведено в среде, как, например, ДМФА: CH₂Cl₂ (1:1) или только в ДМФА, или только в CH₂Cl₂. Выбор подходящего связывающего реагента является компетенцией специалиста в данной области. Особенно подходящими в качестве реагентов связывания являются N,N-диизопропилкарбодиимид (ДИКД) или гексафторфосфат 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония, смешанный с 1-гидроксибензотриазолом. Успех прохождения реакции связывания на каждой стадии синтеза предпочтительно контролируется с помощью нингидриновой реакции. В случаях, когда происходит неполное связывание, либо процесс связывания повторяют, либо связанные смолой непрореагировавшие остатки с аминогруппами ацетилируют с использованием уксусного ангидрида в ДХМ до удаления защитной группы -аминогруппы.

Конечное ацилирование N-конца пептида проводят таким же образом, как и предыдущие связывания, с той разницей, что вместо аминокислоты используют соответствующую карбоновую кислоту.

4. Удаление пептида с полимерного носителя.

Когда синтез завершен, пептид отщепляют от фазы-носителя. Удаление пептида со смолы осуществляют при обработке реагентом, как, например, жидкий фтористый водород, который также отщепляет все оставшиеся защитные группы боковой цепи.

Соответственно, высушенный и защищенный пептид-смола обрабатывают смесью, состоящей из 1,0 мл м-крезола и 10 мл безводного фтористого водорода на грамм пептида-смолы, в течение 60 мин при 0°С для отщепления пептида со смолы, а также для удаления всех защитных групп боковой цепи. После удаления фтористого водорода в токе азота и в вакууме свободные пептиды осаждают диэтиловым эфиром, фильтруют, промывают диэтиловым эфиром и этилацетатом, экстрагируют 50% уксусной кислотой и подвергают лиофилизации.

5. Очистка.

Очистку технических пептидов можно осуществлять, используя методики, хорошо известные в химии пептидов. Например, очистка может быть проведена с использованием системы MacRabbit для ВЭЖХ (Rainin Instrument Co. Inc., Woburn, MA) с УФ-фотометром Knauer и регистрирующим устройством Kipp и Zonen BD40, используя колонку Vydac 218TP5010 с обращенной фазой (10250 мм, заполненную силикагелем С 18, размер пор 300, размер частиц 5 мкм) (The Separations Group Inc., Hesperia, CA). Колонку элюируют системой растворителей, состоящей из (А) 0,1% водной ТФК и (В) 0,1% ТФК в 70% водном MeCN с линейным градиентом (например, 30-55% В в 120 мин). Элюент контролируется при 220 нм и фракции исследуются с помощью аналитической ВЭЖХ при использовании жидкостного хроматографа модели HP-1090 фирмы Hewlett-Packard и объединяются для обеспечения максимальной чистоты. Аналитическую ВЭЖХ осуществляют на колонке Vydac 218TP52 с обращенной фазой (2250 мм, С 18, 300, 5 мкм), применяя изократное элюирование системой растворителей, состоящей из (А) и (В), обозначенных выше. Пики регистрируются при 220 и 280 нм. Пептиды по данным аналитической ВЭЖХ получают в значительной степени чистыми (> 95%). Ожидаемый аминокислотный состав также подтверждается аминокислотным анализом.

D. Фармацевтическая композиция

Пептиды по изобретению могут вводиться в виде фармацевтически приемлемых нетоксичных солей, как, например, аддитивные соли кислоты. Примерами таких аддитивных солей кислот являются гидрохлорид, гидробромид, сульфат, фосфат, фумарат, глюконат, таннат, малеат, ацетат, цитрат, бензоат, сукцинат, альгинат, памоат, малат, аскорбат, тартрат и им подобные. Особенно предпочтительными антагонистами являются соли с малой растворимостью, например памоаты и им подобные. Они проявляют продолжительную активность.

Соединения по настоящему изобретению соответственно вводят людям или животным подкожно, внутримышечно или внутривенно, через нос или путем легочной ингаляции, или в виде формы с замедленным выделением (депо-форма) (например, микрокапсулы, микрогранулы или цилиндрическая палочка, подобная имплантатам), приготовленной из биораспадающегося подходящего полимера (как, например, D,L-лактид-согликолид), причем первые две депо-формы являются предпочтительными. Другие эквивалентные формы введения также представлены в рамках данного изобретения, то есть, продолжительное капельное внутривенное вливание, инъекции веществ замедленного всасывания, инфузионный насос и формы с высвобождением во времени, как, например, микрокапсулы, и им подобные. Введение допустимо в любом физиологически приемлемом инъецируемом носителе, физиологическом растворе, хотя другие носители, известные в данной области, могут также использоваться.

Пептиды предпочтительно вводят парентерально, внутримышечно, подкожно или внутривенно с фармацевтически приемлемым носителем, как, например, изотонический солевой раствор. Альтернативно пептиды могут вводиться в виде интраназального аэрозоля с помощью подходящего носителя или путем легочной ингаляции. Подходящим путем введения является депо-форма, приготовленная из биораспадающегося соответствующего полимера, например поли-D,L-лактид-согликолида, в виде микрокапсул, микрогранул или цилиндрических имплантатов, содержащих диспергированные антагонистические соединения.

Необходимое количество пептида зависит от способа введения и предполагаемого результата. Обычно диапазон доз составляет 1-100 мкг/кг массы тела организма-хозяина в день.

Е. Терапевтическое применение антагонистов GH-RH.

Антагонисты hGH-RH могут быть применены при лечении состояний, вызванных избытком гормона роста, например акромегалии, которая проявляется в виде аномального разрастания костей лица и конечностей. Антагонисты GH-RH могут также применяться для лечения диабетической ретинопатии (главная причина слепоты у диабетиков) и диабетической нефропатии, при которых повреждения глаз и почек, соответственно, связывают с GH.

Антагонисты hGH-RH предназначаются для блокирования связывания и, следовательно, действия GH-RH, который стимулирует выделение GH, который, в свою очередь, стимулирует продуцирование IGF-I. Антагонисты GH-RH могут вводиться отдельно или вместе с аналогами соматостатина, как комбинация, которая более полно понижает уровни IGF-I. Полезнее вводить антагонисты-GH-RH, чем соматостатин, благодаря тому факт