Гены рецептора трансферрина moraxela

Гены рецептора трансферрина moraxela

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой очищенную и выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок бактерии Moraxella catarrhalis или иммуногенный фрагмент рецептора трансферрина, а также способ получения рекомбинантного белка рецептора трансферрина. Нуклеиновая кислота может быть использована в составе иммуногенной композиции, применяемой при вакцинации против заболеваний, вызываемых бактерией Moraxella catarrhalis, для диагностики инфекций Moraxella, а также в качестве инструмента для получения иммунологических реагентов. 8 н. и 6 з.п. ф-лы, 90 ил., 3 табл.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к молекулярному клонированию генов, кодирующих белки рецептора трансферрина (TfR), а в частности к клонированию генов рецептора трансферрина Moraxella (Branhamella) catarrhalis.

Эта заявка является частичным продолжением одновременно рассматриваемой заявки на патент США №08/778570, поданной 3 января 1997 г, которая, в свою очередь, является частичным продолжением заявки на патент США №08/613009, поданной 8 марта 1996 г.

Уровень техники

Бактерии Moraxella (Branhamella) catarrhalis являются грамотрицательными диплококковыми патогенами, которые бессимптомно присутствуют в дыхательных путях здорового человека. В последние годы было установлено, что М.catarrhalis является важным патогеном, вызывающим воспаление среднего уха. Кроме того, M.catarrhalis ассоциируется с синуситом, конъюктивитом, и мочеполовыми инфекциями, а также с рядом воспалительных заболеваний нижних дыхательных путей у детей и взрослых, включая пневмонию, хронический бронхит, трахеит, и энфизему (см. 1-8). (В данной заявке для более полного описания состояния той области науки, к которой имеет отношение настоящее изобретение, приводятся различные ссылки на цитируемые работы, которые даны в скобках. Полные библиографические данные для каждой цитируемой работы приводятся в конце описания, непосредственно перед формулой изобретения. Содержание этих работ вводится в настоящее описание посредством ссылки). В некоторых случаях, заражение бактерией М.catarrhalis вызывает септицемию, артрит, эндокардит, и менингит (см. 9-13).

Воспаление среднего уха является одним из наиболее распространенных заболеваний детей в раннем возрасте, и около 80% всех детей в возрасте до трех лет страдает, по крайней мере, одной инфекцией среднего уха (см. 14). Хроническое воспаление среднего уха ассоциируется с нарушением слуха и речи у детей, а в некоторых случаях, с нарушением способности к обучению. Стандартное лечение воспаления среднего уха предусматривает введение антибиотиков и хирургические операции, включая тонзиллэктомию, аденоидэктомию и тимпаноцентез. По оценкам специалистов, стоимость лечения воспаления среднего уха в США составляет от одного до двух миллиардов долларов в год.

В случае воспаления среднего уха, М.catarrhalis обычно выделяют из жидкости среднего уха вместе с бактерией Streptococcus pneumoniae и нетипируемой бактерией Haemophilus influenzae, которые, очевидно, ответственны за 50% и 30% инфекций среднего уха, соответственно. Полагают, что бактерия М.catarrhalis ответственна примерно за 20% инфекций среднего уха (см. 15). Эпидемиологические отчеты сообщают, что число случаев воспаления среднего уха, связанных с М.catarrhalis, возрастает одновременно с увеличением числа резистентных к антибиотикам изолятов М.catarrhalis. Так, например, до 1970 г. не было никаких сообщений о изолятах М.catarrhalis, продуцирующих -лактамазу, но с середины семидесятых годов было обнаружено возрастающее число изолятов, экспрессирующих -лактамазу. Последние обзоры дают основание предполагать, что 75% клинических изолятов продуцируют -лактамазу (см. 16, 26).

Железо является основным питательным элементом, необходимым для роста многих бактерий. Несколько бактериальных видов, включая M.catarrhalis, получают железо от хозяина, используя для захвата трансферрина белки рецепторов трансферрина. Ряд бактерий, включая, Neisseria meningitidis (см. 17), N.gonorrhoeae (см. 18), Haemophilus Influenzae (см. 19), а также M.catarrhalis (см. 20), продуцируют наружные мембранные белки, которые специфически связываются с трансферрином человека. Экспрессия этих белков регулируется количеством железа в окружающей среде.

Два белка рецепторов трансферрина М.catarrhalis, называемых трансферрин-связывающим белком 1 (Tbp1) и трансферрин-связывающим белком 2 (Tbp2), имеют молекулярную массу 115 кДа (Tbp1) и приблизительно 80-90 кДа (Tbp2). В отличие от белков рецепторов трансферрина других бактерий, рецепторы Tbp2 M.catarrhalis обладают предпочтительным сродством к железонасыщенному (то есть, ферри-) трансферрину (см. 21).

Инфекция, вызываемая М.catarrhalis, может приводить к серьезным заболеваниям. Поэтому было бы желательно получить рекомбинантный источник трансферрин-связывающих белков, которые могут быть использованы в иммуногенных препаратах, включая вакцины, в качестве антигенов в качестве носителей для других антигенов, и в качестве иммуногенов, а также для продуцирования диагностических реагентов. Особенно желательны и полезны гены, кодирующие трансферрин-связывающие белки и их фрагменты для специфической идентификации и диагностики инфекций Moraxella, для иммунизации против заболеваний, вызываемых М.catarrhalis, а также для продуцирования диагностических реагентов.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к получению очищенных, изолированных молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих рецептор трансферрина штамма Moraxella, или фрагмент или аналог белка рецептора трансферрина. Полученные в соответствии с настоящим изобретением молекулы нуклеиновой кислоты могут быть использованы для специфического обнаружения штаммов Moraxella и для диагностики инфекции, вызываемой Moraxella. Очищенные и выделенные молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, такие как ДНК, могут быть также использованы для экспрессии генов Tbp с использованием техники рекомбинантных ДНК в целях продуцирования экономическим способом очищенных и выделенных белков рецептора трансферрина, а также их субъединиц, фрагментов, или аналогов. Рецептор трансферрина, его субъединицы, фрагменты, или аналоги, а также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие указанный рецептор, его субъединицы, фрагменты или аналоги, и векторы, содержащие такие молекулы нуклеиновой кислоты, могут быть использованы в иммуногенных композициях для вакцинации против заболеваний, вызываемых Moraxella, и для диагностики инфекций Moraxella, a также в качестве инструмента для получения иммунологических реагентов. Моноклональные антитела или моноспецифическая антисыворотка (антитела) против белка рецептора трансферрина, продуцированные в соответствии с аспектами настоящего изобретения, могут быть использованы для диагностики инфекции Moraxella; для специфического обнаружения Moraxella (например, в in vitro и in vivo анализах); и для лечения заболеваний, вызываемых Moraxella.

В соответствии с одним из своих аспектов настоящее изобретение относится к очищенным и выделенным молекулам нуклеиновой кислоты (НК-молекулам), кодирующим белок рецептора трансферрина штамма Moraxella, а более конкретно, штамма M.catarrhalis, в частности, штаммов M.catarrhalis 4223, Q8 или R1, либо фрагмент или аналог белка рецептора трансферрина.

В одном из предпочтительных вариантов настоящего изобретения НК-молекула может кодировать только белок Tbp1 штамма Moraxella, или только белок Тbр2 штамма Moraxella. В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения НК-молекула может кодировать фрагмент белка рецептора трансферрина штамма Moraxella, имеющий консервативную аминокислотную последовательность.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной и выделенной НК-молекуле, имеющей ДНК-последовательность, выбранную из группы, включающей: (а) ДНК-последовательность, представленную на фиг.5, 6, 10, 11 или 27 (SEQ ID Nо: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 45 или 46), или комплементарную ей ДНК-последовательность; (b) ДНК-последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную на фиг.5, 6, 10, 11 или 27 (SEQ ID Nо: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 47) или комплементарную ей ДНК-последовательность; и (с) ДНК-последовательность, которая гибридизируется в жестких условиях с любой из ДНК-последовательностей, определенных в пунктах (а) и (b). ДНК-последовательность, определенная в п. (с) имеет предпочтительно последовательность, которая, по крайней мере, примерно на 90% идентична любой одной из ДНК-последовательностей, определенных в пунктах (а) и (b). ДНК-последовательность, определенная в (с), может быть такой, что она будет кодировать эквивалентный белок рецептора трансферрина, происходящий от другого штамма Moraxella.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к вектору, адаптированному для трансформации хозяина, и содержащему НК-молекулу настоящего изобретения, которая может обладать свойствами нуклеотидной последовательности, содержащейся в векторах LEM3-24, pLEM3, pLEM25, pLEM23, SLRD-А, DS-1698-1-1, DS-1754-1, pSLRD2, pSLRD3, pSLRD4 и pSLRD5.

Этот вектор может быть адаптирован для экспрессии кодированного рецептора трансферрина, его фрагментов или аналогов, в гетерологичном или гомологичном хозяине, либо в липидной, либо в нелипидной форме. В соответствии с другим своим аспектом настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, адаптированному для трансформации хозяина, и содержащему НК-молекулу настоящего изобретения, а также к экспрессионному элементу, оперативно связанному с НК-молекулой, и обеспечивающему экспрессию белка рецептора трансферрина, его фрагмента, или аналога. В конкретном варианте этого аспекта настоящего изобретения НК-молекула может кодировать, в основном, полный белок рецептора трансферрина, или только белок Тbр1, только белок Тbр2 штамма Moraxella, или фрагменты белка Tbp1 или белка Tbp2. Этот экспрессионный элемент может включать промотор и часть нуклеиновой кислоты, кодирующую лидерную последовательность для секреции белка рецептора трансферрина, или его фрагмента, или его аналога из клетки-хозяина. Этот экспрессионный элемент может также включать фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий сигнал липидизации для экспрессии в клетке-хозяине липидизированной формы белка рецептора трансферрина, или его фрагмента, или его аналога. Хозяин может быть выбран, например, из Escherichia. coli, Bordetella, Bacillus, Haemophilus, Moraxella, а в качестве экспрессирующих систем могут быть использованы грибки, дрожжи или бакуловирус и вирус Semliki Forest (лесов Семлики). В конкретном варианте настоящего изобретения плазмидой, адаптированной для экспрессии Tbp1 является pLEM29, а для экспрессии Tbp2 - рLЕМ33. Другими векторами являются pLEM-37, SLRD35-A и SLRD35-B.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к трансформированному хозяину, содержащему экспрессирующий вектор настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение включает белок рецептора трансферрина, его фрагмент, или аналог штамма Moraxella, продуцируемый трансформированным хозяином.

Такой рекомбинантный белок рецептора трансферрина может быть получен, в основном, в чистой форме в соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, в котором предлагается способ получения, в основном, чистого рекомбинантного белка рецептора трансферрина, предусматривающий культивирование трансформированного хозяина настоящего изобретения для экспрессии белка рецептора трансферрина в виде телец включения; очистку этих телец включения от клеточного материала и растворимых белков; солюбилизацию белка рецептора трансферрина, полученного из очищенных телец включения; и очистку белка рецептора трансферрина от других солюбилизированных материалов. В основном, чистый рекомбинантный белок рецептора трансферрина может содержать только один Tbp1, только один Тbр2, или их смесь. В основном, чистота этого рекомбинантного белка составляет, по крайней мере, около 70%, а предпочтительно, по крайней мере, около 90%.

Поэтому в других своих аспектах настоящее изобретение относится к рекомбинантно продуцированному белку Tbp1 штамма Moraxella, не содержащему белок Тbр2 штамма Moraxella и любой другой белок штамма Moraxella, и к рекомбинантно продуцированному белку Тbр2 штамма Moraxella, не содержащему белок Tbp1 штамма Moraxella и любой другой белок штамма Moraxella. Штаммом Moraxella может быть штамм 4223 M.catarrhalis, штамм Q8 M.catarrhalis, или штамм R1 M.catarrhalis.

В соответствии с другим своим аспектом настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, которая содержит, по крайней мере, один активный компонент, выбранный, по крайней мере, из одной НК-молекулы настоящего изобретения, и, по крайней мере, одного рекомбинантного белка настоящего изобретения; и его фармацевтически приемлемый носитель или вектор. Этот, по крайней мере, один активный компонент вызывает иммунный ответ при его введении хозяину.

Иммуногенные композиции настоящего изобретения могут быть изготовлены в виде вакцин для in vivo введения хозяину. Для этого, указанные композиции могут быть изготовлены в виде микрочастицы, капсулы, ISCOM, или липосомного препарата. Эта иммуногенная композиция может быть введена в комбинации с молекулой, обеспечивающей доставку этой композиции к специфическим клеткам иммунной системы или к поверхностям слизистых оболочек. Иммуногенные композиции настоящего изобретения (включая вакцины) могут, кроме того, содержать, по крайней мере, один другой иммуногенный или иммуностимулирующий материал, и этот иммуностимулирующий материал может быть, по крайней мере, одним из адъювантов, либо, по крайней мере, одним из цитокинов. Адъювантами, подходящими для использования в настоящем изобретении, являются (но не ограничиваются ими) фосфат алюминия, гидроксид алюминия, QS21, Quil А, их производные и компоненты, матрикс ISCOM, фосфат кальция, гидроксид кальция, гидроксид цинка, гликолипидный аналог, октадециловый сложный эфир аминокислоты, мурамилдипептид, полифосфазен, ISCOPREP, DC-chol, DDBA, и липопротеин. Преимущественные комбинации адъювантов описаны в одновременно рассматриваемых заявках на патент США №08/261194 (поданной 16 июня 1994 г.), и №08/483856 (поданной 7 июня 1995 г.), которые были переуступлены их правопреемнику, и которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки (WO 95/34308).

В соответствии со своим другим аспектом настоящее изобретение относится к способу получения иммунного ответа у хозяина, включающему стадию введения восприимчивому хозяину, такому как, человек, эффективного количества иммуногенной композиции настоящего изобретения. Иммунный ответ может быть гуморальным или клеточно-опосредованным иммунным ответом, и может обеспечивать иммунную защиту от заболевания, вызываемого Moraxella. Хозяевами, у которых может быть обеспечена иммунная защита от заболеваний, являются приматы, включая человека.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к "живому" вектору, обеспечивающему доставку рецептора трансферрина в клетку-хозяина, и содержащему НК-молекулу, описанную выше. Этот вектор может быть выбран из Salmonella, BCG, аденовируса, поксвируса, вируса коровьей оспы и полиовируса.

Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут быть использованы в диагностических целях. В соответствии с еще одним своим аспектом настоящее изобретение относится к способу обнаружения присутствия в образце нуклеиновой кислоты, кодирующей белок рецептора трансферрина штамма Moraxella, где указанный способ включает следующие стадии:

(а) контактирование образца с НК-молекулой настоящего изобретения для продуцирования дуплекса, содержащего эту НК-молекулу и любую НК-молекулу, кодирующую белок рецептора трансферрина штамма Moraxella, присутствующего в образце, и специфически гибридизирующуюся с ней; и

(b) определение продуцирования дуплексов.

Кроме того, настоящее изобретение относится к диагностическому набору для обнаружения присутствия в образце нуклеиновой кислоты, кодирующей белок рецептора трансферрина штамма Moraxella, где указанный набор включает:

(a) НК-молекулу настоящего изобретения;

(b) средство для контактирования НК-молекулы с образцом для продуцирования дуплексов, содержащих эту НК-молекулу и любую НК-молекулу, кодирующую белок рецептора трансферрина штамма Moraxella, присутствующего в образце, и специфически гибридизирующуюся с ней; и

(c) средство для определения продуцирования дуплексов.

Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию НК-молекул и белков настоящего изобретения в качестве лекарственных средств. Настоящее изобретение также относится к использованию НК-молекул и белков настоящего изобретения в целях изготовления лекарственных препаратов против инфекций, вызываемых штаммами Moraxella.

Преимуществами настоящего изобретения являются:

- выделенная и очищенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок рецептора трансферрина штамма Moraxella, или его фрагмент, или аналог;

- рекомбинантные продуцированные белки рецептора трансферрина, включая Tbp1 и Тbр2, свободные друг от друга и от других белков штамма Moraxella; и

- диагностические наборы и иммунологические реагенты для специфической идентификации Moraxella.

Краткое описание чертежей

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приводится его подробное описание со ссылками на следующие чертежи, где:

фиг.1 иллюстрирует аминокислотные последовательности (SEQ ID No: 17 и 18) консервативной области белков Tbp1, используемой для синтеза вырожденных праймеров, используемых для PCR-амплификации фрагмента гена tbpA штамма 4223 M.catarrhalis;

фиг.2 иллюстрирует рестрикционную карту клона LEM3-24, содержащего гены tbpA и tbpB изолята 4223 М.catarrhalis:

фиг.3 иллюстрирует рестрикционную карту гена tbpA для штамма 4223 M.catarrhalis;

фиг.4 иллюстрирует рестрикционную карту гена tbpB для штамма 4223 M.catarrhalis;

фиг.5 иллюстрирует нуклеотидную последовательность гена tbpA (SEQ ID No: 1 - полная последовательность, и SEQ ID No: 2 - кодирующая последовательность), и выведенную аминокислотную последовательность белка Tbp1 штамма 4223 (SEQ ID No: 9 - полноразмерная последовательность, и SEQ ID No: 10 - последовательность зрелого белка). Лидерная последовательность (SEQ ID No: 19) подчеркнута;

фиг.6 иллюстрирует нуклеотидную последовательность гена tbpB (SEQ ID No: 3 - полная последовательность, и SEQ ID No: 4 - кодирующая последовательность), и выведенную аминокислотную последовательность белка Tbp2 штамма 4223 (SEQ ID No: 11 -полноразмерная последовательность, и SEQ ID No: 12 - последовательность зрелого белка). Лидерная последовательность (SEQ ID No: 20) подчеркнута;

фиг.7 иллюстрирует рестрикционную карту клона SLRD-A, содержащего гены tbpA и tbpB штамма Q8 М.catarrhalis;

фиг.8 иллюстрирует рестрикционную карту гена tbpA для штамма Q8 М.catarrhalis;

фиг.9 иллюстрирует рестрикционную карту гена tbpB для штамма Q8 М.catarrhalis;

фиг.10 иллюстрирует нуклеотидную последовательность гена tbpA (SEQ ID No: 5 - полная последовательность, и SEQ ID No: 6 - кодирующая последовательность), и выведенную аминокислотную последовательность белка Tbp1 штамма Q8 (SEQ ID No: 13 - полноразмерная последовательность, и SEQ ID No: 14 - последовательность зрелого белка);

фиг.11 иллюстрирует нуклеотидную последовательность гена tbpB (SEQ ID No: 7 - полная последовательность, и SEQ ID No: 8 - кодирующая последовательность), и выведенную аминокислотную последовательность белка Tbp2 штамма Q8 (SEQ ID No: 15 - полноразмерная последовательность, и SEQ ID No: 16 - последовательность зрелого белка);

фиг.12 иллюстрирует сравнение аминокислотных последовательностей Tbp1 штамма 4223 М. catarrhalis (SEQ ID No: 9) и Q8 М.catarrhalis (SEQ ID No: 13), штамма Eagan H.influenzae (SEQ ID No: 21), штаммов В16В6 (SEQ ID No: 22) и М982 (SEQ ID No: 23) N.meningitidis, и штамма FA19 N.gonorrhoeae (SEQ ID No: 24). Точки указывают на идентичные остатки, а черточки были введены для максимального соответствия сравниваемых первичных последовательностей;

фиг.13 иллюстрирует сравнение аминокислотных последовательностей Тbр2 штамма 4223 М.catarrhalis (SEQ ID No: 11) и Q8 M.catarrhalis (SEQ ID No: 15), штамма Eagan H.influenzae (SEQ ID No: 25), штаммов В16В6 (SEQ ID No: 26) и М982 N.meningitidis (SEQ ID No: 27), и штамма FA19 N.gonorrhoeae (SEQ ID No: 28). Точки указывают на идентичные остатки, а черточки были введены для максимального соответствия сравниваемых первичных последовательностей;

фиг.14 иллюстрирует конструирование плазмиды pLEM29 для экспрессии рекомбинантного белка Tbp1 в E.coli;

фиг.15 иллюстрирует ДСН-ПААГ-анализ экспрессии белка Tbp1 клетками E.coli, трансформированными плазмидой pLEM29;

фиг.16 иллюстрирует блок-схему процесса очистки рекомбинантного белка Tbp1;

фиг.17 иллюстриует ДСН-ПААГ-анализ очищенного рекомбинантного белка Tbp1;

фиг.18 иллюстрирует конструирование плазмиды рLЕМ33 и плазмиды pLEM37, которые предназначены для экспрессии гена tbpA штамма 4223 М.catarrhalis в E.coli, и одна из которых не содержит, а другая содержит лидерную последовательность, соответственно;

фиг.19 иллюстрирует ДСН-ПААГ-анализ экспрессии белка rТbр2 клетками E.coli, трансформированными плазмидой pLEM37;

фиг.20 иллюстрирует конструирование плазмиды SLRD35B, предназначенной для экспрессии гена tbpB штамма Q8 M.catarrhalis в E.coli, и не содержащей лидерной последовательности; и конструирование плазмиды SLRD35A, предназначенной для экспрессии гена tbpB штамма Q8 M.catarrhalis в E.coli, и содержащей лидерную последовательность. Рестирикционные сайты: В=BamHI; Вg=BglII; Н=HindIII; R=EcoRI;

фиг.21 иллюстрирует ДСН-ПААГ-анализ экспрессии белка rТbр2 клетками E.coli, трансформированными плазмидами SLRD35A и SLRD35B;

фиг.22 иллюстрирует блок-схему процесса очистки рекомбинантного белка Тbр2 из E.coli;

фиг.23 (панели А и В) иллюстрирует ДСН-ПААГ-анализ очистки рекомбинантного белка Тbр2 штаммов 4223 (панель А) и Q8 (панель В) М.catarrhalis, экспрессированного в E.coli;

фиг.24 иллюстрирует связывание Тbр2 с трансферрином человека;

фиг.25 (включает панели А, В и С) иллюстрирует антигенную консервативность белка Тbр2 для штаммов М.catarrhalis;

фиг.26 иллюстрирует рестрикционную карту гена tbpB для штамма R1 М.catarrhalis;

фиг.27 иллюстрирует нуклеотидную последовательность гена tbpB (SEQ ID No: 45 - полная последовательность и SEQ ID No: 46 - кодирующая последовательность) и выведенную аминокислотную последовательность белка Тbр2 штамма R1 М.catarrhalis (SEQ ID No: 47); и

фиг.28 иллюстрирует сравнение аминокислотных последовательностей Tbp2 штамма 4223 М.catarrhalis (SEQ ID No: 21), штамма Q8 M.catarrhalis (SEQ ID No: 15), и штамма R1 (SEQ ID No: 47). Точки указывают на идентичные остатки, а черточки были введены для максимального соответствия сравниваемых первичных последовательностей. Звездочками указаны стоп-кодоны.

Подробное описание изобретения

Для получения очищенной и выделенной нуклеиновой кислоты, которая может иметь форму ДНК-молекул, содержащих, по крайней мере, часть нуклеиновой кислоты, кодирующей рецептор трансферрина, тип которого определен в вариантах настоящего изобретения, может быть использован любой штамм Moraxella. Эти штаммы обычно получают из клинических источников и из коллекций бактериальных культур, таких как Американская коллекция типовых культур.

В настоящей заявке, термины "рецептор трансферрина" (TfR) и "трансферрин-связывающие белки" (Тbр) используются для определения семейства белков Tbp1 и/или Tbp2, которое включает белки, имеющие изменения в своих аминокислотных последовательностях, включая белки различных природных штаммов, например, штаммов Moraxella. Выделенными и очищенными ДНК-молекулами, содержащими, по крайней мере, часть, кодирующую рецептор трансферрина настоящего изобретения, являются также молекулы, кодирующие функциональные аналоги белков рецептора трансферрина Tbp1 и Tbp2 Moraxella. В настоящей заявке первый белок является "функциональным аналогом" второго белка, в том случае, если первый белок является иммунологически родственным второму белку и/или имеет те же самые функции, аналогичные функциям второго белка. Таким функциональным аналогом может быть, например, фрагмент белка, или его мутант, имеющий замену, инсерцию или делецию.

Хромосомную ДНК из штамма 4223 М.catarrhalis гидролизовали ферментом Sаu3А с получением фрагментов размером в пределах от 15-23 т.п.о., и клонировали в BamHI-сайт лямбда-вектора EMBL3. Библиотеку скринировали с использованием антисыворотки морских свинок против Tbp1, и позитивный клон LEM3-24, содержащий вставку размером приблизительно 13,2 т.п.о., отбирали для последующего анализа. Было обнаружено, что лизат от LE392 E.coli, инфицированный LEM3-24, содержит белок размером приблизительно 115 кДа, который реагирует на Вестерн-блотах с антисывороткой против Tbp1. Второй белок размером приблизительно 80 кДа связывается на Вестерн-блотах с антисывороткой морских свинок против Tbp2.

Для того, чтобы определить локализацию гена tbpA на 13,2 т.п.о. - вставке LEM3-24, были использованы вырожденные PCR-праймеры для амплификации небольшой области предполагаемого гена tbpA штамма 4223 М.catarrhalis. Последовательности вырожденных олигонуклеотидных праймеров были выбраны на основе консервативных аминокислотных последовательностей в белках Tbp1 некоторых видов Neisseria и Haemophilus, и показаны на фиг.1 (SEQ ID No: 17 и 18). Был продуцирован амплифицированный 300 п.о. - продукт, и его локализация показана на фиг.5 жирным шрифтом (SEQ ID No: 29). Этот амплифицированный продукт был субклонирован в вектор pCRII, меченный и использованный для зондирования Саузерн-блота, содержащего клон ДНК LEM3-24, гидролизованный рестриктирующей эндонуклеазой. Этот зонд гибридизировали с 3,8 т.п.о -HindIII-HindIII-, 2,0 т.п.о. AvrII-AvrII-, и 4,2 т.п.о. -SаlI-SарhI-фрагментами (фиг.2).

3,8 т.п.о -HindIII-HindIII-фрагмент субклонировали в рАСY-177, и секвенировали. Большую открытую рамку считывания идентифицировали, после чего было обнаружено, что она содержит приблизительно 2 т.п.о - фрагмент предполагаемого гена tbpA. Остальные 1 т.п.о. гена tbpA были получены путем субклонирования находящегося непосредственно ниже смежного HindIII-HindIII-фрагмента в вектор pACY177. Нуклеотидная последовательность гена tbpA штамма 4223 М.catarrhalis (SEQ ID No: 1 и 2), и выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID No: 9 - полноразмерная последовательность; SEQ ID No: 10 - зрелый белок) показаны на фиг.5.

Хромосомную ДНК от штамма Q8 М.catarrhalis гидролизовали ферментом Sau3A I, и 15-23 т.п.о. - фрагменты лигировали с ВamHI-плечами EMBL3. Библиотеку с высоким титром генерировали в клетках LE 392 E.coli и скринировали с использованием олигонуклеотидных зондов, полученных на основе последовательности tbpA штамма 4223. Получали фаговую ДНК, и с помощью рестрикционного анализа было выявлено, что были клонированы вставки размером около 13-15 т.п.о. Для субклонирования фрагментов для анализа последовательностей был использован фаговый клон SLRD-A. Для облегчения клонирования фрагментов был генерирован вектор клонирования (pSKMA), и были получены плазмиды pSLRD1, pSLRD2, pSLRD3, pSLRD4 и pSLRD5, которые содержат все tbpA и большинство tbpB. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID No: 5 и 6) и выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID No: 13 - полноразмерная последовательность, SEQ ID No: 14 - последовательность зрелого белка) гена tbpA штамма Q8 показаны на фиг.10.

Было установлено, выведенные аминокислотные последовательности для белка Tbp1, кодированного генами tbpA, имеют некоторую гомологию с аминокислотными последовательностями, кодированными генами ряда видов Neisseria и Haemophtlus (фиг.12; SEQ ID No: 21, 22, 23 и 24)

До разработки настоящего изобретения было установлено, что гены tbpA, идентифицированные в видах Neisseria, Haemophilus и Actinobacillus, предшествуют гену tbpB с несколькими консервативными областями. Эти два гена обычно разделены короткой межгенной последовательностью. Однако ген tbpB не был обнаружен выше гена tbpA в штамме 4223 М.catarrhalis. Для того, чтобы определить локализацию гена tbpB в 13,2 т.п.о. - вставке клона LEM3-24, был синтезирован вырожденный олигонуклеотидный зонд на основе аминокислотной последовательности EGGFYGP (SEQ ID No: 30), которая является консервативной для белков Тbр2 в нескольких видах бактерий. Этот олигонуклеотид был помечен и использован для зондирования Саузерн-блота, содержащего различные эндонуклеазо-рестрикционные фрагменты клона LEM3-24. Этот зонд гибридизировали с 5,5 т.п.о. - NheI-SаlI-фрагментом, который затем субклонировали в pBR328, и секвенировали. Этот фрагмент содержал большую часть предполагаемого гена tbpB за исключением промоторной области. Клон LEM3-24 секвенировали для определения остальной расположенной выше последовательности. Ген tbpB был расположен приблизительно на 3 т. п.о. ниже от конца гена tbpA, в отличие от генетической организации генов tbpA и tbpB в Haemophilus и Neisseria. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID No: 3 и 4) гена tbpB от штамма 4223 M.catarrhalis и выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID No: 11, 12) показаны на фиг.6. Был также клонирован и секвенирован ген tbpB штамма Q8 М.catarrhalis. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID No: 7 и 8) и выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID No: 15 и 16) показаны на фиг.11. Был также клонирован и секвенирован ген tbpB штамма R1 М.catarrhalis. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID No: 45 и 46) и выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID No: 47) показаны на фиг.27. Наблюдались области гомологии между аминокислотными последовательностями Тbр2 штаммов М.catarrhalis, как показано на фиг.28, где иллюстрируется сравнение их первичных последовательностей (SEQ ID No: 11, 15 и 47), и между аминокислотными последовательностями Tbp2 M.catarrhalis и последовательностями Тbр2 ряда видов Neisseria и Haemophilus, как показано на фиг.13, где иллюстрируется сравнение их первичных последовательностей (SEQ ID No: 25, 26, 27, 28).

Клонированные гены tbpA и tbpB были экспрессированы в E.coli для продуцирования рекомбинантных белков Tbp1 и Tbp2, отделенных от других белков Moraxella. Эти рекомбинантные белки очищали и использовали для иммунизации.

Антигенная консервативность белка Tbp2 для других штаммов M.catarrhalis была продемонстрирована путем разделения белков в целых клеточных лизатах штаммов M.catarrhalis или штаммов E.coli, экспрессирующих рекомбинантные белки Tbp2 (rTbp2), с помощью электрофореза на ПААГ с ДСН и иммуноблоттинга с использованием антисыворотки против rТbр2 4223 или антисыворотки против rTbp2 Q8, продуцированной у морских свинок. Таким способом тестировали все штаммы 3, 56, 135, 585, 4223, 5191, 8185 и АТСС 25240 M.catarrhalis, и все они обнаруживали специфическое взаимодействие с антителом против rTbp2 4223 или с антителом против rTbp2 Q8 (фиг.25).

Кроме того, способность антител против rTbp2 от одного штамма распознавать нативный или рекомбинантный белок от гомологичного или гетерологичного штамма в ELISA-анализе, продемонстрирована в таблице 1.

Было проведено аминокислотное секвенирование N-конца и бромциановых фрагментов рецепторов трансферрина от штамма 4223 M.catarrhalis. Оба N-конца Tbp1 и Tbp2 были блокированы. Предполагаемые сигнальные последовательности Tbp1 и Tbp2 подчеркнуты на фиг.5 и 6 (SEQ ID Nos: 19 и 20), соответственно. Выведенные аминокислотные последовательности для N-концевой области Tbp2 дают основание предположить, что они имеют липопротеиновую структуру.

Результаты, представленные в таблице 1 и 2, иллюстрируют способность антисывороток против rTbp1 и против rTbp2, продуцированных у морских свинок путем их иммунизации белками Tbp1 или Tbp2, лизировать M.catarrhalis. Эти результаты показывают, что антисыворотки, продуцированные путем иммунизации белками Tbp1 и Тbр2, выделенными из М.catarrhalis, обладают бактерицидным действием против гомологичного неагглютинирующего штамма RH408 М.catarrhalis [штамм, который, согласно Будапештскому договору, был депонирован 13 декабря 1994 г. под per. №55637 Американской коллекцией типовых культур (находящейся в США по адресу 1301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA) в связи с заявкой на патент США №08/328589, переуступленной ее правопреемнику (WO 96/12733)], происходящего от изолята 4223. Кроме того, антисыворотка, продуцированная путем иммунизации белком Tbp1, выделенным из штамма 4223 M.catarrhalis, обладала бактерицидной активностью против неагглютинирующего штамма Q8 (любезно предоставленного Dr. M.Bergeron, Centre Hospitalier de I'Universite Laval, St. Foy, Quebec). Кроме того, антисыворотка, продуцированная против рекомбинантного белка Тbр2 (rТbр2), обладала бактерицидным действием против гомологичного штамма M.catarrhalis.

Способность выделенных и очищенных трансферрин-связывающих белков генерировать бактерицидные антитела in vivo является свидетельством того, что эти белки могут быть использованы в качестве вакцин для вырабатывания иммунитета против заболевания, вызываемого Moraxella.

Таким образом, в соответствии с другим своим аспектом, настоящее изобретение относится к вакцине против инфекции, вызываемой штаммами Moraxella, где указанная вакцина содержит иммуногенно эффективное количество трансферрин-связывающего белка, происходящего от штамма Moraxella, и его физиологически приемлемый носитель. Вакцинные препараты могут содержать трансферрин-связывающие белки, которые отличаются по своей антигенности или по своим последовательностям.

Трансферрин-связывающий белок настоящего изобретения может быть использован в качестве диагностического реагента, в качестве антигена для генерирования антител против белков, связывающихся с трансферрином, в качестве антигена для вакцинации против заболевания, вызываемого видами Moraxella, и для обнаружения инфекции, вызываемой Moraxella и другими такими бактериями.

Трансферрин-связывающий белок настоящего изобретения может быть также использован в качестве белка-носителя для гаптенов, полисахаридов или пептидов при получении вакцины конъюгата против антигенных детерминант, не родственных трансферрин-связывающим белкам. Поэтому в других вариантах осуществления настоящего изобретения, указанный трансферрин-связывающий белок может быть использован в качестве молекулы-носителя для получения химерных молекул и вакцин конъюгатов (включая гликоконъюгаты) против патогенных бактерий, включая инкапсулированные бактерии. Так, например, гликоконъюгаты настоящего изобретения могут быть использованы для вырабатывания иммунитета против заболеваний и инфекций, вызываемых любыми бактериями, имеющими полисахаридные антигены, включая липоолигосахариды (ЛОС) и PRP. Такими бактериальными патогенами могут быть, например, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi, Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, Klebsiella, Staphytococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa. Конкретные антигены, которые могут быть конъюгированы с трансферрин-связывающим белком, и методы осуществления такого конъюгирования описаны в заявке на патент США №08/433522 (поданной 23 ноября 1993 г (WO 94/12641), и переуступленной ее правопреемнику), которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.

В другом варианте настоящего изобретения функция трансферрин-связывающего белка как носителя может быть использована для индуцирования иммунного ответа против аномальных полисахаридов опухолевых клеток, или для продуцирования противоопухолевых антител, которые могут быть конъюгированы с химиотерапевтическими или биологически активными агентами.

Настоящее изобретение относится к трансферрин-связывающим белкам от Moraxella catarrhalis, которые могут быть использованы в качестве активного ингредиента в вакцине против заболеваний, вызываемых инфекцией Moraxella. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической вакцинной композиции, содержащей трансферрин-связывающие белки Moraxella catarrhalis, и необязательно, фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к использованию трансферрин-связывающих белков для получения фармацевтической вакцинной композиции, предназначенной для иммунизации против заболевания, вызываемого инфекцией Moraxella.

Для каждого специалиста очевидно, что различные варианты настоящего изобретения могут иметь множество применений в области вакцинации, диагностики, лечения, например, инфекций Moraxella, и получения иммунологических или других диагностических реагентов. Ниже приводится обсуждение неограничивающее таких применений.

1. Получение и использование вакцины

Иммуногенные композиции, подходящие для использования в качестве вакцин, могут быть получены из иммуногенных белков рецепторов трансферрина, их аналогов и фрагментов, кодированных молекулами нуклеиновой кислоты, а также молекулами нуклеиновых кислот, описанными в настоящей заявке. Эта вакцина вырабатывает иммунный ответ, который продуцирует антитела, включая антитела против рецептора трансферрина, и антитела, которые являются опсонизирующими или бактерицидными. Если вакцинированный индивидуум будет заражен Moraxella, то антитела будут связываться с рецептором, и, тем самым, преграждать доступ бактерий к источнику железа, который необходим для их жизнеобеспечения. Кроме того, опсонизирующие или бактерицидные антитела против рецептора трансферрина могут также обеспечивать защиту посредством альтернативных механизмов.

Иммуногенные композиции, включая вакцины, могут быть получен