Моноклональное антитело, нуклеиновая кислота и вектор, кодирующие антитело, и использование антитела для диагностики и лечения злокачественных заболеваний

Моноклональное антитело, нуклеиновая кислота и вектор, кодирующие антитело, и использование антитела для диагностики и лечения злокачественных заболеваний

Реферат

 

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно, к новым последовательностям нуклеотидов ДНК и последовательностям аминокислот моноклональных антител (MAT), вырабатываемых против лимфобластоидных клеток, и к пептидам, с которыми связываются МАТ. Изобретение также относится к диагностическим анализам, в которых вышеуказанные антитела или пептиды используются для выявления индивидуумов с высокой вероятностью наличия злокачественных заболеваний и, иногда, для выявления индивидуума, имеющего специфическое злокачественное заболевание. Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим MAT или пептиды согласно настоящему изобретению и предназначенным для применения при лечении различных злокачественных заболеваний, а также к способам лечения злокачественных заболеваний с использованием MAT или пептидов согласно настоящему изобретению. Использование изобретения позволит проводить дифференциальную диагностику рака. 7 н. и 23 з.п. ф-лы, 18 ил., 5 табл.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к новым последовательностям моноклональных антител, пептидным последовательностям антигенов, с которыми связываются моноклональные антитела, а также к способам диагностики и терапии с использованием моноклональных антител и пептидов.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Совместная Международная Заявка, поданная в соответствии с РСТ (Договором о патентной кооперации), № публикации WO 95/20605, раскрывает сущность иммуностимулирующих моноклональных антител. Антитела, являющиеся предметом этой Международной Заявки, вырабатывались против лимфобластоидных В-клеток, и было показано, что они оказывают иммуностимулирующий эффект. При введении их животным-носителям опухолей было также обнаружено, что эти антитела оказывают противоопухолевый эффект.

Диагностика рака в соответствии с современными медицинскими процедурами типично является многостадийным процессом, включающим врачебный осмотр, применение различных техник визуализации, использование различных маркеров рака и т.д. В данной области техники давно существует потребность в методиках диагностики рака, которые обеспечивали бы выявление рака, а также определение типа рака, которым страдает обследуемый индивидуум.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на открытии последовательностей моноклональных антител к лимфобластоидным клеткам. Настоящее изобретение, кроме того, основано на открытии того, что уровень связывания этих антител с Т-клетками больных раком является иным (более высоким или более низким), нежели уровень связывания этих антител с Т-клетками здоровых людей.

В соответствии с одним из аспектов изобретения предусмотрено моноклональное антитело, имеющее вариабельную область, выбранное из группы, состоящей из:

(а) моноклонального антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изображенную на фиг.1;

(б) моноклонального антитела, имеющего вариабельную область легкой каппа-цепи, включающую аминокислотную последовательность, изображенную на фиг.2;

(в) моноклонального антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изображенную на фиг.1, и вариабельную область легкой каппа-цепи, включающую аминокислотную последовательность, изображенную на фиг.2;

(г) моноклонального антитела, имеющего вариабельную область тяжелой цепи, обладающую, по меньшей мере, 70%-ной идентичностью аминокислотной последовательности, изображенной на фиг.1;

(д) моноклонального антитела, имеющего вариабельную область легкой цепи, обладающую, по меньшей мере, 70%-ной идентичностью последовательности, изображенной на фиг.2.

Согласно настоящему изобретению, термин "антитело" относится к моноклональным антителам любого из классов IgG, IgM, IgD, IgA и IgE. Термин относится к целым антителам или фрагментам антител, включающим антигенсвязывающий домен антитела, например, к антителам, у которых отсутствует Fc-фрагмент, одноцепочечным антителам, фрагментам антител, состоящим, по существу, только из вариабельного антигенсвязывающего домена антитела и т.п.

Кроме того, изобретение также относится к антителам, которые связываются с антигеном, с которым специфически связывается любое из вышеперечисленных MAT, то есть к антителам, которые обладают перекрестной реактивностью с вышеуказанными антителами.

В соответствии с одним из примеров осуществления изобретения моноклональное антитело (MAT) является химерным антителом человека и мыши, а именно - MAT с константной областью, полученной от человека, и вариабельной областью, полученной от мыши. С этой целью вариабельные области легких каппа-цепей и тяжелых цепей MAT согласно настоящему изобретению клонировали с помощью ПЦР, а их ДНК секвенировали. В соответствии с еще одним примером осуществления изобретения антитело является полностью гуманизированным антителом, то есть и вариабельная, и константная области его получены от человека.

Термин "имеющий, по меньшей мере, Х-процентную идентичность" относится к проценту остатков аминокислот, которые идентичны в двух сравниваемых последовательностях, если последовательности оптимально сопоставлены. Поэтому 70%-ная идентичность аминокислотной последовательности означает, что 70% аминокислот в двух или нескольких оптимально сопоставленных полипептидных последовательностях идентичны.

Предпочтительно, идентичность равна, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%.

В соответствии с дополнительным аспектом изобретения обеспечены линии гибридомных клеток мыши, которые продуцируют какие-либо MAT согласно настоящему изобретению. Гибридомы могут быть получены любым из способов, известных в данной области техники (например, Kohler, G. and Milstein, С., Nature, 256:495-497 (1975)). Супернатант гибридомных клеточных линий подвергали типичному скринингу на антигенсвязывающую активность каким-либо из способов, известных в данной области техники, например, с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или радиоиммунного анализа (RIA, РИА). Супернатанты подвергали скринингу на предмет продукции MAT, которые связываются с любым из пептидов согласно настоящему изобретению (что пояснено ниже) или которые связываются с клетками, с которыми связываются эти пептиды, например, клетками Дауди или Т-лимфоцитами.

Последовательности ДНК, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи или легкой цепи вышеуказанных MAT, также включены в объем изобретения. Как, несомненно, будет ясно любому специалисту в данной области техники, из-за вырожденности генетического кода MAT согласно настоящему изобретению может кодировать множество нуклеотидных последовательностей, кроме последовательностей, изображенных на фиг.1 или 2.

Изобретение также обеспечивает экспрессирующие векторы, такие как плазмиды, включающие вышеуказанные ДНК-последовательности, а также клетки-хозяева, содержащие один или несколько этих экспрессирующих векторов.

В соответствии с другим аспектом изобретения обеспечены пептидные последовательности антигенов В-клеток, к которым могут присоединяться MAT согласно настоящему изобретению. Был проведен поиск в базе данных банка неизбыточных генов, и отдел EST определил, что эти пептидные последовательности являются новыми.

В соответствии с этим дополнительным аспектом изобретения предусмотрен пептид, выбранный из группы, состоящей из:

(а) пептида, имеющего аминокислотную последовательность, изображенную на фиг.10;

(б) пептида, имеющего аминокислотную последовательность, изображенную на фиг.11;

(в) пептида, имеющего аминокислотную последовательность, изображенную на фиг.12;

(г) пептида, обладающего, по меньшей мере, 85%-ной идентичностью любой из аминокислотных последовательностей пептидов по пунктам (а), (б) и (в), приведенным выше, и

(д) белка или пептида, включающего один или несколько пептидов по пунктам (а)-(г), приведенным выше.

Пептиды согласно настоящему изобретению могут быть использованы для различных диагностических анализов, например, таких как конкурентные иммунологические анализы, при которых определяют уровень связывания MAT согласно настоящему изобретению с их естественным антигеном, который присутствует на Т-клетках. Кроме того, пептиды можно использовать для выработки антител у иммунизированных животных, причем эти антитела затем можно использовать для любой из целей, описанных выше и ниже.

Аналоги всех вышеуказанных пептидов также образуют дополнительный аспект настоящего изобретения. Как будет ясно специалисту в данной области техники, аминокислотные последовательности пептидов согласно настоящему изобретению могут быть изменены, например, посредством добавления, делеции или консервативного или неконсервативного замещения одной или нескольких аминокислот без существенного нарушения способности пептидов связывать антитела.

Термин "консервативное замещение" относится к замещению аминокислоты одного класса аминокислотой того же класса, где класс определяется одинаковыми физико-химическими свойствами боковых цепей аминокислот и высокой частотой замещений в гомологичных белках, встречающихся в природе, что можно определить, например, с помощью стандартной матрицы частоты обмена Дейхоффа или матрицы BLOSUM. [Было охарактеризовано шесть основных классов аминокислот, которые включают: Класс I (Cys); Класс II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); Класс III (Asn, Asp, Gin, Glu); Класс IV (His, Arg, Lys); Класс V (Ile, Ley, Val, Met) и Класс VI (Phe, Туr, Тrр)]. Например, замещение Asp на другой остаток Класса III, такой как Asn, Gln или Glu, является консервативным замещением. Термин "неконсервативное замещение "относится к замещению аминокислоты одного класса аминокислотой из другого класса; например, замещение Ala, остатка Класса II, остатком Класса III, таким как Asp, Asn, Glu или Gln.

Отдельные буквы, использованные выше (и ниже) для обозначения специфических аминокислот (ак), соответствуют 1-буквенным символам аминокислот, рекомендованным Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB.

Аналогами вышеуказанных пептидов, которые попадают в объем настоящего изобретения, являются такие пептиды, которые имеют примерно такой же уровень связывания с MAT согласно настоящему изобретению, как пептиды, изображенные на фиг.10-12. Уровень связывания можно определить любым способом, известным в данной области техники.

Пептиды и аналоги согласно настоящему изобретению можно также модифицировать химически, и такие химически модифицированные пептиды и их аналоги также образуют часть изобретения. Термин "химически модифицированный" относится к белку, в котором по меньшей мере один из его аминокислотных остатков модифицирован либо посредством естественных процессов, таких как процессинг или другие посттрансляционные модификации, либо с помощью методик химической модификации, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Среди многочисленных известных модификаций типичные, но не исключительные, примеры включают: ацетилирование, ацилирование, аминирование, АДФ-рибозилирование, гликозилирование, образование GPI-якорей, ковалентное присоединение жидкостей или производных липидов, метилирование, миристилирование, пегилирование, пренилирование, фосфорилирование, убихинонирование и любые сходные процессы.

Вторым открытием, на котором основано изобретение, является то, что MAT согласно настоящему изобретению могут в различной степени связываться с Т-клетками, полученными от людей, имеющих злокачественное заболевание, по сравнению со степенью связывания тех же MAT с Т-клетками здоровых людей.

Поэтому, в соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения, предусмотрен анализ для идентификации обследованных людей с высокой вероятностью наличия злокачественного заболевания, включающий:

(а) получение пробы жидкости организма от вышеуказанного человека;

(б) контакт вышеуказанной пробы по меньшей мере с одним MAT согласно настоящему изобретению;

(в) определение степени связывания вышеуказанных MAT с Т-клетками, содержащимися в вышеуказанной пробе, и

(г) сравнение степени связывания, определенной на этапе (в), со степенью связывания MAT согласно настоящему изобретению с Т-клетками, содержащимися в пробе, полученной от здорового человека;

достоверное различие между двумя степенями связывания указывает на то, что существует высокая вероятность наличия у обследованного человека злокачественного заболевания.

В соответствии с изобретением пробой, полученной от человека, которому необходимо провести анализ, может быть любая жидкость организма, которая содержит обнаружимое количество Т-клеток. В типичном случае проба жидкости организма является пробой крови или лимфатической жидкости. Предпочтительно, перед контактом MAT согласно настоящему изобретению с полученной пробой мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), содержащиеся в пробе, отделяют с помощью любого из способов, известного в данной области техники, например, с помощью центрифугирования в градиенте плотности Ficoll Hypaque, а затем отделенные клетки приводят в контакт с исследуемыми антителами.

Термин "злокачественное заболевание" в соответствии с изобретением следует понимать как любое злокачественное заболевание, известное в данной области техники, на любой его стадии.

Этот термин также охватывает злокачественные заболевания, которые находятся на ранней стадии и еще не вызывают клинических симптомов. Предпочтительно, этот термин относится к плотным опухолям.

Термин "здоровый человек" относится к человеку, у которого нет злокачественного заболевания, и может также относиться к среднему значению для нескольких человек или к значению, полученному при образовании пула из жидкостей организма, полученных от нескольких человек. Следует отметить, что, если стандартная степень связывания для здоровых людей определена, нет необходимости повторно определять этот стандарт при каждом анализе, и полученное число можно использовать постоянно. Согласно изобретению, было обнаружено, что у здоровых людей примерно 25% CD3⁺ Т-клеток связывают антитела согласно настоящему изобретению.

Термин "высокая вероятность" означает, что анализ согласно настоящему изобретению является анализом, выполняемым при первичном скрининге и способным выявить людей, у которых предположительно имеется злокачественное заболевание. Факт действительного наличия злокачественного заболевания у человека, выявленного с помощью способа согласно настоящему изобретению, должен быть позже подтвержден с использованием дополнительных методик, известных в данной области техники.

Термин "степень связывания" относится к уровню связывания антитела с антигеном, предъявляемым Т-клетками обследованного человека, причем этот уровень можно определить любым из известных в данной области техники способов определения уровней связывания антител, например ELISA или вестерн-блоттингом. Степень связывания можно определить с помощью любой системы обнаружения, например с помощью иммуноглобулина к антигенам мыши или его фрагментов, соединенных с обнаружимым маркером. Примерами таких обнаружимых маркеров являются радиоактивная группа, флуоресцирующая группа, фермент, способный катализировать реакцию, продуктом которой является обнаружимый продукт (например, цветную реакцию), биотиновая группа, которую можно выявить с помощью авидина, и т.д. В предпочтительном примере осуществления изобретения степень связывания MAT согласно настоящему изобретению с Т-клетками определяют с помощью двойной маркировки, при которой антитело к Т-клетке (например, антитело к СО3⁺ клетке) присоединяют к одному флуоресцентному маркеру, a MAT согласно настоящему изобретению - к другому типу флуоресцентного маркера. Степень связывания затем определяют с помощью устройства для сортировки клеток, активированных флуоресцеином (FACS). Количественную оценку степени связывания производят посредством определения процента CD3⁺ Т-клеток (определяемых по их связыванию с антителами к CD3⁺ клеткам), которые также связывают MAT согласно настоящему изобретению.

В соответствии с изобретением, было обнаружено, что общее количество CD3⁺ клеток в пробах крови людей, имеющих злокачественные заболевания, сходно с количеством CD3⁺ клеток в пробах крови, полученных от здоровых людей, так что нормализация степени связывания MAT и CD3⁺ Т-клеток с помощью общего числа CD3⁺ связывающих Т-клеток у больных раком и здоровых людей правомерна. Тем не менее, процент CD3⁺ связывающих Т-клеток, которые связывают также и MAT согласно изобретению (далее: "CD3⁺ MAT клетки") у людей, имеющих злокачественные заболевания, достоверно отличается от процента CD3⁺ MAT клеток в крови здоровых людей. Процент CD3⁺ MAT клеток у человека, имеющего злокачественное заболевание, может быть достоверно более высоким или достоверно более низким, чем процент СD3⁺ MAT клеток в крови здоровых людей, в зависимости от типа злокачественного заболевания.

Степень связывания MAT согласно настоящему изобретению с Т-клетками, полученными от обследованного человека, будет признана "достоверно отличающейся" от степени связывания с Т-клетками, полученными от здорового человека, если различие в связывании MAT статистически достоверно при оценке с помощью любого из статистических методов, известных в данной области техники (например, с помощью t-критерия Стьюдента), которые используются для оценки результатов, полученных с помощью экспериментальных методов, указанных здесь.

Изобретение не только позволяет выявить людей с высокой вероятностью наличия у них какого-либо типа злокачественного заболевания (поскольку больные люди имеют другую степень связывания Т-клеток с MAT согласно настоящему изобретению, по сравнению со здоровыми людьми), но может также помочь идентифицировать людей с определенным типом рака посредством определения того, является ли вышеуказанная степень связывания более высокой или более низкой, чем соответствующая степень связывания у здоровых людей.

В типичном случае, процент связывания MAT согласно настоящему изобретению с Т-клетками, полученными от здоровых людей, составляет примерно 25%, то есть 25% клеток, экспрессирующих маркер CD3⁺ Т-клеток (определяемый по связыванию с антителом к CD3⁺ клеткам), также связывают и MAT согласно настоящему изобретению.

Согласно настоящему изобретению, было показано, что в пробах, полученных от больных раком предстательной железы, процент CD3⁺ Т-клеток, с которыми связываются MAT согласно настоящему изобретению, составляет примерно 50%.

Кроме того, было показано, что, если CD3⁺ Т-клетки происходят из проб, взятых у больных раком толстого кишечника или молочной железы, то процент клеток, которые также присоединяют MAT согласно настоящему изобретению, составляет примерно 7 и 10% соответственно.

Поэтому, согласно настоящему изобретению, появилась возможность определить высокую вероятность наличия специфического типа рака по образцу жидкости организма, полученному от обследованного человека, с помощью простого и одиночного анализа, основанного на степени связывания MAT согласно настоящему изобретению с CD3⁺ клетками, присутствующими в образце жидкости организма. Простота диагностического анализа согласно настоящему изобретению, для которого достаточно использования только одного вида MAT для идентификации человека, имеющего определенный тип рака, очень хорошо подходит для широкого скрининга населения.

Поэтому настоящее изобретение еще в одном из его аспектов предусматривает анализ для выявления обследованного человека с высокой вероятностью наличия у него специфического злокачественного заболевания, включающий:

(а) получение пробы жидкости организма от вышеуказанного человека;

(б) контакт вышеуказанной пробы с MAT согласно настоящему изобретению;

(в) определение степени связывания вышеуказанных MAT с Т-клетками, содержащимся в вышеуказанной пробе, и

(г) сравнение степени связывания, определенной на этапе (в), полученных клеток со степенью связывания MAT с Т-клетками, полученными от здорового человека; достоверное различие между степенями связывания с высокой вероятностью указывает на то, что у обследованного человека имеется злокачественное заболевание, причем то, является ли степень связывания MAT с Т-клетками, полученными от вышеуказанного человека, более высокой или более низкой, чем степень связывания MAT с Т-клетками здоровых людей, указывает на специфический тип злокачественного заболевания, которое с высокой вероятностью имеется у обследованного человека.

В частности, если степень связывания с MAT согласно настоящему изобретению достоверно выше, чем у здоровых людей, существует высокая вероятность, что у обследованного человека имеется рак предстательной железы.

Если степень связывания достоверно ниже, чем у здорового человека, существует высокая вероятность, что у обследованного человека имеется рак толстого кишечника или молочной железы.

Согласно диагностическому аспекту изобретения, составы (композиции), включающие MAT согласно настоящему изобретению, могут быть использованы для диагностики с целью выявления людей, у которых с высокой вероятностью имеется злокачественное заболевание (вообще), или для идентификации специфического злокачественного заболевания, которое, вероятно, имеется у человека. Поэтому изобретение в еще одном из его аспектов предусматривает диагностический состав, включающий MAT, относящиеся, по меньшей мере, к одному из вышеуказанных антител, совместно с подходящим носителем. Носитель может быть или растворимым носителем, например, каким-либо из физиологически приемлемых буферных растворов, известных в данной области техники (например, фосфатный буферный раствор (ФБР)), или твердым носителем, таким как, например, латексные шарики.

Настоящее изобретение также обеспечивает наборы, например, наборы для диагностических анализов, предназначенные для использования MAT согласно настоящему изобретению и выполнения диагностических анализов, сущность которых раскрыта выше. В одном из примеров осуществления изобретения диагностический набор может обычно включать по меньшей мере одно из вышеуказанных MAT в одной или нескольких емкостях, конъюгат вещества-партнера, специфически связывающегося с MAT (например, антигена или его аналога согласно настоящему изобретению), метку, способную давать обнаружимый сигнал, и инструкции по их использованию. Метка может, априорно, связываться с моноклональным антителом, или, альтернативно, метка может связываться с молекулой-носителем, которая затем специфически связывается с МАТ. Инкубации анализируемой пробы с составом, являющимся диагностическим реактивом, в течение определенного времени достаточно для связывания моноклональных антител с клетками.

В следующем аспекте изобретения предусмотрены фармацевтические композиции, включающие, в качестве активного ингредиента, одно или несколько MAT согласно настоящему изобретению. Использование вышеуказанных MAT для приготовления фармацевтических препаратов для лечения различных злокачественных заболеваний у человека также входит в объем изобретения.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение предусматривает метод лечения злокачественных заболеваний посредством введения нуждающемуся в этом человеку терапевтически эффективного количества вышеуказанных МАТ. Терапевтически эффективное количество - это количество, способное облегчать симптомы злокачественного заболевания, снижая симптомы или полностью их устраняя.

Фармацевтические композиции, включающие пептиды согласно настоящему изобретению, также образуют аспект изобретения. Такие композиции могут использоваться, например, для активной иммунизации человека с целью получения антител, которые могут затем связываться с Т-клетками человека и вызывать иммунный ответ у человека.

Далее основные аспекты изобретения будут описаны с периодическими ссылками на прилагаемые графические материалы. В следующем ниже описании и графических материалах термин "ВАТ антитело" будет использован как равнозначный термину "MAT согласно изобретению".

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1 демонстрирует ДНК и пептидные последовательности вариабельной области тяжелой цепи MAT согласно настоящему изобретению.

Фиг.2 демонстрирует ДНК и пептидные последовательности вариабельной области легкой каппа-цепи MAT согласно настоящему изобретению.

Фиг.3 демонстрирует анализ аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела согласно настоящему изобретению (обозначенной как "ВАТ"). "ВАТ" обозначает аминокислотную последовательность _н-области ВАТ антитела, в то время как "VMS2" обозначает аминокислотную последовательность гена VMS2/VGK4 зародышевой линии клеток. Если ВАТ-последовательность и последовательность зародышевой линии идентичны, последовательность зародышевой линии обозначают точкой (.); если существуют несоответствия, указан отличающийся остаток зародышевой линии. Таблицы, приведенные ниже, и последовательности, приведенные на следующих страницах, описывают частоту, с которой определенные аминокислоты можно обнаружить в определенном положении остатка, как в смешанной подгруппе тяжелых цепей мыши (Мышь v_н Смешан.) (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, (1991)), так и в большей по объему базе данных всех известных последовательностей V_H мыши (все последовательности V_H мыши).

Фиг.4 демонстрирует результаты анализа аминокислотной последовательности вариабельной области легкой каппа-цепи антитела согласно настоящему изобретению (обозначенного на фиг.4 как "ВАТ"). "Мышь" обозначает аминокислотную последовательность К_К области ВАТ антитела, тогда как "Зародыш" обозначает аминокислотную последовательность гена Н4 зародышевой линии клеток. Если ВАТ последовательность и последовательность зародышевой линии идентичны, последовательность зародышевой линии обозначена точкой (.); если существуют несоответствия, указан отличающийся остаток для зародышевой линии. Таблицы, приведенные ниже и на следующих страницах, описывают частоту, с которой можно обнаружить определенные аминокислоты в определенном положении остатка, как в подгруппе VI тяжелых цепей мыши согласно Kabat, так и в большей по объему базе данных всех известных последовательностей V_К мыши (все последовательности V_К мыши).

Фиг.5 демонстрирует ДНК и пептидные последовательности вариабельных областей легкой каппа-цепи химерного антитела согласно настоящему изобретению.

Фиг.6 демонстрирует ДНК и пептидные последовательности вариабельной области тяжелой цепи химерного антитела согласно настоящему изобретению.

Фиг.7 демонстрирует схематическое изображение экспрессирующего вектора pKN 110 млекопитающих, используемого для экспрессии легкой каппа-цепи химерного антитела согласно настоящему изобретению.

Фиг.8 демонстрирует схематическое изображение экспрессирующего вектора pG1D 110 млекопитающих, используемого для экспрессии тяжелой цепи химерного антитела согласно настоящему изобретению.

Фиг.9 демонстрирует возможности графического представления результатов анализа ELISA, измеряющего характеристики связывания химерного антитела мыши и 1/Каппа согласно настоящему изобретению с клетками Дауди.

Фиг.10 демонстрирует аминокислотную последовательность пептида 1 согласно настоящему изобретению.

Фиг.11 демонстрирует аминокислотную последовательность пептида 2 согласно настоящему изобретению.

Фиг.12 демонстрирует аминокислотную последовательность пептида 3 согласно настоящему изобретению.

Фиг.13 является схематическим изображением, демонстрирующим процент CD3⁺ клеток, которые также связывают MAT согласно настоящему изобретению (обозначенные как "ВАТ"), по сравнению с общим числом CD3⁺ клеток в пробах крови здоровых людей, определенный с помощью анализа ФАКС.

Фиг.14 демонстрирует процент CD3⁺ клеток, которые также связывают MAT согласно настоящему изобретению (обозначенные как "ВАТ"), по сравнению с общим числом CD3⁺ клеток в пробах крови, полученных от больных, имеющих карциному толстого кишечника, определенный с помощью анализа ФАКС.

Фиг.15 демонстрирует процент CD3⁺ клеток, которые также связывают MAT согласно настоящему изобретению (обозначенные как "ВАТ"), по сравнению с общим числом CD3⁺ клеток в пробах крови, полученных от больных, имеющих карциному молочной железы.

Фиг.16 демонстрирует процент CD3⁺ клеток, которые также связывают MAT согласно настоящему изобретению (обозначенные как "ВАТ"), по сравнению с общим числом CD3⁺ клеток в пробах крови, полученных от больных, имеющих карциному предстательной железы.

Фиг.17 является схематическим изображением, демонстрирующим средний процент CD3⁺ клеток, которые связывают MAT согласно настоящему изобретению (обозначенные как ВАТ), у здоровых людей, по сравнению с больными, имеющими карциному молочной железы, карциному толстого кишечника или карциному предстательной железы.

Фиг.18 является фотографией результатов вестерн-блоттинга пептидов, полученных из Т-клеток людей, имеющих рак предстательной железы, оториноларингологические карциномы (ЛОР), карциному молочной железы, или пептидов, полученных из мембран клеток Дауди. Блот инкубировали с MAT согласно настоящему изобретению и выявили повышенную концентрацию антигена в Т-клетках, полученных от больных, имеющих карциному предстательной железы, по сравнению с необнаружимым уровнем антигена в Т-клетках, полученных от больных, имеющих карциному молочной железы.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. СЕКВЕНИРОВАНИЕ MAT

(А) Аббревиатуры

Фетальная сыворотка телят (ФСТ); рибонуклеиновая кислота (РНК); информационная РНК (иРНК); дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК); копированная ДНК (кДНК); полимеразная цепная реакция (ПЦР); минута (мин); секунда (с); Трис-боратный буфер (ТББ).

(Б) Материалы

Компоненты сред и все остальные материалы для культур тканей были получены из компании Life Technologies (Великобритания). Набор для выделения РНК был получен из компании Stratagene (США), тогда как набор для синтеза 1-й нити кДНК был закуплен в компании Pharmacia (Великобритания). Все компоненты и оборудование для ПЦР-реакций, включая AmpliTaq ДНК-полимеразу, были закуплены в компании Perkin Elmer (США). Набор ТА Cloning был получен из компании Invitrogen (США). Агароза (UltraPure) была получена из компании Life Technologies (Великобритания). Предварительно составленный набор для циклического секвенирования Thermo Sequences и аппарат для секвенирования ДНК Vistra 725 были закуплены в компании Amersham (Великобритания). Все остальные продукты для молекулярной биологии были получены из компании New England Biolabs (США).

(В) Методики эксперимента: ПЦР-клонирование и секвенирование генов вариабельной области ВАТ антитела мыши

Клеточная линия гибридомных клеток ВАТ мыши и линия клеток Дауди были успешно перенесены на MRC-CC, и обе линии клеток культивировали в суспензии с использованием RPMI (без глутамина) с добавлением 10% (объемных) ФСТ, 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 12,5 единиц/мл нистатина.

Было накоплено примерно 10⁸ жизнеспособных клеток гибридомной клеточной линии ВАТ, и из 10⁸ клеток была выделена общая РНК с помощью набора для выделения РНК в соответствии с инструкциями изготовителя. В наборе была использована одностадийная процедура экстракции гуанидиния тиоцианатом-фенолом-хлороформом, описанная Chromczynski and Sacchi, Anal. Biochem., 162:156, 1987. Также в соответствии с инструкциями изготовителя набор для синтеза 1-й нити кДНК был использован для получения однонитевой ДНК-копии мРНК ВАТ-гибридомы с помощью Notl-(dT)₁₈ праймера, поставляемого в наборе. В каждом объеме конечной реакционной смеси, равном 33 мкл, использовалось примерно 5 мкг общей РНК. После завершения реакции реакционную смесь нагревали до 90С в течение 5 мин для денатурации дуплекса РНК-кДНК и инактивации обратной транскриптазы перед охлаждением на льду.

Для ПЦР-амплификации гена вариабельной области тяжелой цепи мыши (V_Н гена) и гена вариабельной области легкой каппа-цепи мыши (V_К гена) из линии гибридомных клеток использовали метод, описанный Jones and Bendig, Bio/Technology, 9:8, 1987. По существу, были использованы две серии вырожденных праймеров - один, предназначенный для гибридизациии лидерных последовательностей генов тяжелой цепи мыши (то есть MHV1-12; таблица 1), и второй, предназначенный для гибридизации лидерных последовательностей генов легкой каппа-цепи мыши (то есть MKV1-11; таблица 2), вместе с праймерами, предназначенными для гибридизации 5'-конца соответствующего гена константной области, для ПЦР-клонирования генов вариабельной области мышей.

Отдельные ПЦР-реакции готовили для каждого из вырожденных праймеров вместе с соответствующим ему праймером константной области в специальном помещении для ПЦР с использованием специфических протоколов, предназначенных для сведения к минимуму возможности перекрестного загрязнения. Во всех случаях для амплификации матричной кДНК использовали ДНК-полимеразу Amplitaq^®. Пробирки для реакции ПЦР затем загружали в аппарат для циклического нагревания и осуществляли циклы (после первоначального плавления при 94С в течение 1,5 мин) при 94С в течение 1 мин и при 72С в течение 10 мин в количестве 25 циклов. После завершения последнего цикла осуществляли последнюю стадию удлинения при 72С в течение 10 мин, после чего реакции охлаждали до 4С. За исключением перерыва между стадиями отжига (50С) и удлинения (72С), когда использовали увеличенное время линейного нарастания, равное 2,5 мин, между всеми стадиями цикла время линейного нарастания было равно 30 с.

Аликвоты объемом по 10 мкл из каждой ПЦР-реакции пропускали через гель, содержавший 1% агарозу/ФБР (рН 8,8), для того, чтобы определить, в какой реакции был образован ПЦР-продукт правильного размера. Те ПРЦ-реакции, в которых, по-видимому, были амплифицированы полномерные гены вариабельной области, повторяли для получения независимых ПЦР-клонов и таким образом минимизировали эффект ПЦР-ошибок. Аликвоты объемом 1-6 мкл этих ПЦР-продуктов правильного размера клонировали непосредственно в pCRII вектор, поставляемый в наборе ТА Cloning, и трансформировали в компетентные клетки INA F’, как описано в инструкциях изготовителей. Колонии, содержащие плазмиду с вставкой правильного размера, идентифицировали посредством ПЦР-скрининга колоний с использованием прямого (pCRII) и обратного (pCRII) олигонуклеотидных праймеров, описанных в таблице 3, согласно способу and Clackson, Nucleic Acids Res., 17:4000, 1989.

Идентифицированные предположительно позитивные клоны были двунитевыми плазмидными ДНК, секвенированными с помощью аппарата для секвенирования ДНК Vistra и предварительно смешанного набора для циклического секвенирования Thermo Sequenase в соответствии с инструкциями изготовителя.

Пример 1: Клонирование и секвенирование вариабельной области тяжелой цепи ВАТ антитела

Как при любых планах гуманизации, строго следовали протоколу ПЦР-клонирования и секвенирования. Это было сделано для минимизации возможности внедрения ошибок в последовательности дикого типа генов вариабельной области V_H мыши из гибридомной клеточной линии ВАТ. Только если все данные о последовательности ДНК из по меньшей мере двух различных клонов V_H генов из гибр