Способы разделения смеси энантиомеров

Способы разделения смеси энантиомеров

Реферат

 

Изобретение относится к способам разделения смеси энантиомеров цис-2-гидроксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолана: посредством пропускания через связанную с циклодекстрином хиральную колонку; селективным гидролизом 5’-O-ацильного производного нуклеозида с помощью ферментов; селективным дезаминированием смеси энантиомеров с помощью цитидиндезаминазы. 4 с. и 8 з.п.ф-лы, 11 табл., 12 ил.

Настоящее изобретение относится к биологически активным иуклеозидам, и, в частности, включает антивирусные составы, в которые входит 2-гидроксиметил-5-/5-фторцитозин-1-ил/1,3-оксатиолан /"ФТЦ"/, его физиологически приемлемое производное или физиологически приемлемая соль, а также способ расщепления и использования /-/--L и /+/--D энантиомеров ФТЦ.

В 1981 г. синдром приобретенного иммунодефицита /СПИД/ был определен как болезнь, которая тяжело поражает иммунную систему человека и которая почти всегда ведет к смерти. В 1983 г. было определено, что этиологической причиной возникновения СПИДа является вирус иммунодефицита человека /ВИЧ/. По оценкам Всемирной организации здравоохранения к декабрю 1990 г. во всем мире ВИЧ-инфицированных людей насчитывалось от 8 до 10 млн., из этого количества от 1 до 1,4 млн. людей проживали в США.

В 1985 г. стало известно, что синтетический нуклеозид 3’-азидо-3’-дезокситимидин /АЗТ/ ингибирует репликацию вируса иммунодефицита человека. С тех пор было доказано, что целый ряд других синтетических нуклеозидов, в том числе 2’,3’-дидезоксиинозин /ДДИ/, 2’,3’-дидезоксицитидин /ДДЦ/, 3’-фтор-3’-дезокситимидин /ФЛТ/ и 2’,3’-дидезокси-2’,3’-дидегидротимидин /Д4Т/, оказался эффективным в борьбе против ВИЧ. Ряд других. 2’,3’-дидезоксинуклеозидов продемонстрировали способность ингибировать рост различных вирусов in vitro. Оказывается, что после клеточного фосфорилирования с помощью клеточной киназы до 5’-трифосфата эти синтетические нуклеозды включаются в растущую нить вирусной ДНК, вызывая обрыв цепи вследствие отсутствия 3’-гидроксильной группы.

Положительные результаты различных 2’,3’-дидеоксинуклеозидов в ингибировании репликации ВИЧ in vivo или in vitro привели ряд ученых к тому, что они занялись созданием и испатанием нуклеозидов, которые замещают гетероатом на атом углерода в положении 3’-нуклеозида. Norbeck et al. обнаружили, что //-1-[/2, 4/-2-/оксиметил/-4-диоксоланил]тимин (в тексте упоминаемый как ()-диоксолан-Т) демонстрирует умеренную анти-ВИЧ активность (EC₅₀ 20 мкмоль в АТН8 клетках) и не является токсичным по отношению к неинфицированным контрольным клеткам при концентрации 200 мкмоль. Tetrahedren Lettere 30, (46), 6246, (1989). Европейская патентная заявка №0337713 и патент США №5041449, права на которые переданы IАF Biochem International, Inc., описывают 2-замещенный-4-замещенный-1,3-диоксоланы, которые демонстрируют антивирусную активность.

Патент США №5047407 и Европейская патентная заявка №0382526, права на которые также переданы Biochem International, Inc., описывают целый ряд 2-замещенный-5-замещенный-1,3-оксатиолан нуклеозидов, имеющих антивирусную активность, конкретно сообщают, что рацемическая смесь (около С4’-положения/ изомера С1’- 2-оксиметил-5-/цитозин-1-ил/-1,3-оксотиолана (упоминаемый ниже как ()-ВСН-189) обладает приблизительно такой же активностью против ВИЧ, как и АЗТ, и не обнаруживают на испытуемых уровнях клеточную токсичность. Было также обнаружено, что ()-BCH-I89 ингибирует репликацию АЗТ-резистентного изолята ВИЧ in vitro, взятого у пациента, которого лечили АЗТ более 36 недель.

Другим вирусом, вызывающим серьезные проблемы в здоровье человека, является вирус гепатита В (упоминаемый ниже как "ВГВ"). ВГВ является второй после табака причиной рака у человека. Механизм, с помощью которого ВГВ индуцирует рак, неизвестен, хотя не вызывает сомнения, что он может непосредственно вызывать развитие опухоли, или косвенно способствовать ее развитию через хроническое воспаление, цирроз или перерождение клеток вследствие инфекции.

По прошествии инкубационного периода, длящегося от 2 до 6 месяцев, в течение которого носитель заболевания не знает о своей болезни, инфекция ВГВ может привести к острому гепатиту и поражению печени, что вызовет боли в области живота, желтуху и повышение уровней некоторых ферментов в крови. ВГВ может вызвать молниеносный гепатит, быстро прогрессирующую, часто смертельную форму заболевания, при которой разрушаются обширные участки печени.

Заболевшие острым гепатитом пациенты обычно выздоравливают. У некоторых пациентов, однако, высокие уровни вирусного антигена сохраняются в крови в течение продолжительного или неопределенного времени, являясь причиной хронической инфекции. Хроническая инфекция может привести к (хроническому) персистирующему гепатиту. Больные, инфицированные хроническим персистирующим ВГВ, чаще всего встречаются в развивающихся странах. В середине 1991 г. в одной только Азии было приблизительно 225 млн хронических носителей ВГВ, а во всем мире их было почти 300 млн. Хронический персистирующий гепатит может быть причиной усталости, цирроза печени, злокачественной гепатомы, а также первичного рака печени.

В промышленных западных странах группы высокого риска инфицирования ВГВ включают людей, которые находятся в контакте с носителями ВГВ или с образцами их крови. Эпидемиология ВГВ очень схожа с эпидемиологией синдрома приобретенного иммунодефицита, что объясняет, почему инфицирование ВГВ является обычным среди пациентов, больных СПИД или обусловленным СПИД комплексом. Однако ВГВ является более заразным, чем ВИЧ.

Для иммунизации пациентов против ВГВ была разработана человеческая полученная из сыгоротки крови вакцина. Хотя вакцина оказалась эффективной, производство вакцины является затруднительным, поскольку снабжение сывороткой крови, полученной от хронических носителей, ограничено, а процедура очистки является длительной и дорогой, далее каждая партия вакцины, приготовленная из различной сыворотки, для обеспечения безопасности должна быть проверена на шимпанзе. Вакцина была получена также с помощью генетической инженерии. Обещающим оказалось также ежедневное лечение -интерфероном, полученным с помощью генетической инженерии белком. Однако до настоящего времени не известно фармацевтическое средство, которое эффективно ингибирует репликацию вируса.

Чтобы предложить нуклеозид для использования в фармацевтических целях, он должен быть не только эффективным средством, обладающим низкой токсичностью, но он также должен быть рентабельным в производстве. Значительные работы были проведены по изучению и разработке новых более рентабельных процессов производства нуклеозида в большом масштабе. 2’,3’-дидеоксинуклеозиды в настоящее время получают двумя способами: деривацией ннтактного нуклеозида или конденсацией дериватного фрагмента сахара с гетероциклическим основанием. Хотя существует множество неудобств, связанных с получением новых аналогов нуклеозидов путем модификации интактных нуклеозидов, главное достоинство этого подхода состоит в том, что соответствующая абсолютная стереохимия уже создана природой. Однако этот подход не может быть использован в производстве нуклеозидов, которые содержат не встречающиеся в природе основания или не встречающиеся в природе углеводные фрагменты (которые, следовательно, не были получены из интактных нуклеозидов), например, 1,3-оксатиолановые нуклеозиды и 1,3-диоксолановые нуклеозиды.

В результате конденсации углевод или углеводоподобный фрагмент с гетероциклическим основанием образуют синтетический нуклеозид, полученный нуклеозид имеет два хиральных центра (в положениях С1’ и С4’) и, таким образом, существует как диамтереомерическая пара. Каждый диастереомер является группой энантиомеров. Следовательно, продукт является смесью четырех энантиомеров.

Часто обнаруживается, что нуклеозиды, имеющие не встречающуюся в природе пространственную структуру в положениях С1 или C4, менее активны, чем те же самые нуклеозиды с природной пространственной структурой. Например, Carter et al. сообщили, что концентрация /-/-энантиомера карбовира /2’,3’-дидегидро-2’,3’-дидезоксигуанозин/ в культуре клеток, необходимая для уменьшения активности обратной транскриптазы на 50% (EC₅₀), составляет 0,8 мкмоль, в то время как EC₅₀ для (+)-энантиомера карбовира превышает 60 мкмоль. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 34:6, 1297-1300 (июнь 1990).

РСТ международная публикация № WO 91/11186 сообщает, что 1,3-оксатиолановые нуклеозиды могут быть получены с высокой диастетеоселективностью (высокое процентное содержание нуклеозида с конфигурацией цепи от С1’-углерода до гетероциклического основания) путем тщательного отбора льюисовской кислоты, использовавшейся при конденсации. Было обнаружено, что конденсация 1,3-оксатиоланового нуклеозида с основанием происходит с почти полной -стереоспецифичностью, когда в качестве катализатора конденсации используется тетрахлорид олова. Другие льюисовские кислоты обеспечивают низкую (или вообще не обеспечивают) C1’- селективность или просто не способны выступить в качестве катализатора реакций.

В свете того факта, что синдром приобретенного иммунодефицита, обусловленный СПИДом комплекс и вирус гепатита В достигли во всем мире эпидемического уровня и оказывают трагическое воздействие на инфицированных людей, существует настоятельная необходимость в создании новых эффективных фармацевтических средств для лечения этих заболеваний, обладающих низкой токсичностью для носителя.

Существует также потребность в создании рентабельного, коммерчески жизнеспособного способа производства имеющих фармацевтическое значение нуклеозидов и особенно необходимо добиться образования -стереоспецифичности в С4’-положении синтетических нуклеозидов, полученных путем конденсирования углеводоподобного фрагмента с основанием.

Следовательно, целью настоящего изобретения является создание способа и состава для лечения людей, инфицированных ВИЧ.

Следующей целью настоящего изобретения является создание способа и состава для лечения людей и животных, инфицированных ВГВ.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание обогащенных энантиомерами 1,3-оксатиолановых нуклеозидов.

И еще одной целью настоящего изобретения является создание способа расщепления С4’-энантиомеров 1,3-оксатиолановых нуклеозидов.

Краткое изложение существа изобретения

Описывается способ и состав для лечения вызванных ВИЧ и ВГВ инфекций у людей и других животных-носителей, который включает введение эффективного количества 2-оксиметил-5-/5-фторцитозин/-1,3-оксатиолана, его фармацевтически приемлемого производного, 5’ или N⁴ алкилированное или ацилированное производное или его фармацевтически приемлемой соли в фармацевтически приемлемом носителе.

Было обнаружено, что 2-оксиметил-5-/5-фторцитозин-1-ил/-1,3-оксатиолан ("ФТЦ") демонстрирует неожиданно высокую активность против вируса иммунодефицита человека, причем обнаруживает очень низкую токсичность по отношению к клеткам хозяина. Было также обнаружено, что ФТЦ демонстрирует очень значительную активность против ВГВ и поэтому может быть использован для лечения пациентов, страдающих от различных заболеваний, связанных с инфицированием ВГВ.

Изучение токсичности и фармакокинетических свойств ФТЦ подтверждает ценность его как антивирусного средства для фармацевтического использования. ФТЦ и его энантиомеры не являются токсичным для периферических клеток костного мозга человека при концентрациях до 50 мкмолей и для других клеточных линий при концентрациях до 200 мкмолей. ФТЦ-ТП является главным внутриклеточным метаболитом в МКПК (мононуклеарные клетки периферической крови) и клетках HepG2. ФТЦ-ТП конкретно ингибирует ВИЧ-1 обратной транскриптазы (ОТ) с помощью К_I 0,2 мкмоля, используя поли(1)олиго(дц)матрицу-праймер. Используя анализ последовательностей, можно показать, что, когда применяется ВИЧ-ОТ (С-stops), ФТЦ-ТП может быть сильнодействующим терминатором цепи ДНК.

Постоянное лечение ФТЦ не является токсичным для грызунов, даже когда оральные дозы составляют 85 мг/кг в день в течение по крайней мере двух месяцев. Фармакокинетика ФТЦ показывает высокую биологическую доступность на макаках резус при оральном приеме (приблизительно 736%) и терминальный период полужизни плазмы приблизительно 1,340,18 (среднее орального и внутривенного введения).

Также описывается способ расщепления рацемической смеси энантиомеров нуклеоэида, включая рацемическую смесь ФТЦ, который содержит этап, когда рацемическая смесь подвергается воздействию фермента, который предпочтительно катализирует реакцию в одном из энантиомеров. Способ может быть использован для разделения разнообразных нуклеозидов, включая пиримидиновый и пуриновый нуклеозиды, которые необязательно могут быть замещены в углеводном фрагменте или в основании. Способ может быть также использован для разделения производных нуклеозидов, которые содержат дополнительные гетероатомы в углеводном фрагменте, например, ()-ФТЦ и ()-ВСН-189. Разделение нуклеозидов может быть осуществлено в большом масштабе при умеренной стоимости.

Используя описанные здесь способы, ФТЦ был разделен на свои (+)--D и (-)--L энантиомеры. (-)--L-энантиомер представляется более сильнодействующим, чем (+)--D-энантиомер, против ВИЧ, ВГВ и ВИО (вирус иммунодефицита обезьян). (+)-энантиомер ФТЦ также активен против ВИЧ, ВГВ и ВИО.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 изображена химическая структура 2-оксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолана ("ФТЦ").

На фиг.2 схематически изображен способ получения 2-оксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолана.

На фиг.3 изображена диаграмма специфичности щелочной фосфатазы и фосфдиестеразы яда змей для (+) и (-) энантиомеров ФТЦ.

На фиг.4 представлен график развития катализируемого липазой процесса гидролиза 5’-бутирилового эфира ФТЦ во времени с использованием ферментов Amano РS-800 (-незакрашенный квадрат-) и PLE (-незакрашенный кружок с точкой-).

На фиг.5 представлен график воздействия концентрации (мкмоль) рацемически или энантиомерно обогащенного ФТЦ (полученного способом из примера 4) в сравнении с процентом ингибирования человеческих мононуклеарных клеток периферической крови, инфицированных ВИЧ-1 (-темный кружок-, ()-ФТЦ), (-незакрашенный кружок-, (-)-ФТЦ), (-закрашенный квадрат-, (+)-ФТЦ).

На фиг.6 представлен график влияния концентрации (мкмоль) рацемически или энантиомерно обогащенного ФТЦ (полученного способом из примера 3) на процент ингибирования человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (МКПK), инфицированных ВИЧ-1 (-темный кружок-, (±)-ФТЦ), (-незакрашенный кружок-, (-)-ФТЦ), (-темный квадрат-, (+)-ФТЦ).

На фиг.7 изображен график поглощения меченного тритием ()-ФТЦ в человеческих мононуклеарных клетках периферической крови (среднее от двух измерений) во времени (часы) и в пикомоль/10⁶ клетки.

Фиг.8 является графиком выхода меченных радиоактивным изотопом ()-ФТЦ из человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), измеряемого по часам в пикомоль/10⁶ клетки.

Фиг.9 отражает присутствие [³H]-(±)-ФТЦ и его фосфорилированных производных в человеческих НерG2 клетках (среднее двух измерений), инкубируемых в среде, содержащей 10 мкмолей раствора [³H]-()-ФТЦ, измеренного в пикомоль/10⁶ клетки во времени.

На фиг.10 представлен график выхода [³H]-(±)-ФТЦ и его фосфорилированных производных в человеческие клетки НерG2, во времени в пикомоль/10⁶ клетки после того, как клетки были в течение 24 часов сенсибилизированы 10 мкмоль раствора [³H]-()-ФТЦ (700 DPM/пикомоль), а также оценка концентрации соединения через 24 часа после удаления.

Фиг.11 иллюстрирует снижение комбинированной концентрации [³H]-()ФТЦ и его фосфорилированных производных в человеческих клетках НерG2 после инкубации с 10 мкмолями раствора [³H]-()-ФТЦ (700 DРМ/пикомоль) в течение 24 часов, выраженное в пикомоль/10⁶ клетки в зависимости от времени.

Фиг.12 представляет собой график воздействия энантиомеров ФТЦ на образование колонии клеток, предшественников гранулоцитмакрофагов, выраженного в проценте выживания в зависимости от концентрации в мкмолях. (-)-ФТЦ, -незакрашенный кружок; (+)-ФТЦ, -темный кружок; AST - темный квадрат.

Подробное описание изобретения

Используемый здесь термин "энантиомерно обогащенный нуклеозид" относится к составу нуклеозида, который включает по крайней мере 95% одного энантиомера этого нуклеозида.

Используемый здесь термин "ФТЦ" относится к 2-оксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолану (рацемической форме или энантиомерам), а также к 2’-дезокси-5-фтор-3’-тиацидину.

Используемый здесь термин "()-ФТЦ" относится к (±)--D, L-2-оксиметил-5-(5’-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолану.

Используемый здесь термин "(-)-ФТЦ" относится к (-)--L-2-оксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолану.

Используемый здесь термин "(+)-ФТЦ" относится к (+)--D-2-оксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолану.

Используемые здесь термины "ФТЦ-МФ, ФТЦ-ДФ и ФТЦ-ТФ" относятся к монофосфату, дифосфату и трифосфату ФТЦ соответственно.

Используемый здесь термин "ВСН-189" относится к 2-оксиметил-5-цитозин-1-ил-1,3-оксатиолану.

Используемый здесь термин "предпочтительный ферментативный катализ" относится к катализу ферментом, который предпочтительно способствует одному из субстратов по сравнению с другим.

Используемый здесь термин "отщепляемая группа" обозначает функциональную группу, которая образует начальную карбонизацию, когда отделяется от молекулы, к которой была присоединена.

Описываемое изобретение предлагает способ получения и состав для лечения инфекций, вызванных ВИД и ВГВ, а также другими вирусами, репликация которых происходит аналогичным путем, у людей или других животных-носителей, который включает введение эффективного количества ()--D,L, (-)--L или (+)--D энантиомера 2-оксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолана, фармацевтически ("физиологически") приемлемого производного, включая 5’ или N⁴ алкилированное или ацилированное производное или его фармацевтически ("физиологически") приемлемой соли в фармацевтически приемлемом носителе. Как будет показано ниже, предлагаемые настоящим изобретением соединения сами обладают антиретровирусной активностью, например, анти-ВИЧ-1, анти-ВМ-2 и антивирус иммунодефицита обезьян (анти-ВИО) активностью или в ходе обмена веществ преобразуются в соединение, которое демонстрирует антиретровирусную активность.

ФТЦ и его фармацевтически приемлемые производные или фармацевтически приемлемые составы, содержащие эти соединения, применяются для профилактики и лечения вызванных ВИЧ инфекций и других связанных состояний, например, связанный со СПИДом комплекс (ССК), персистирующая генерализованная лимфеденопатия (ПГЛ), связанные со СПИДом неврологические состояния, состояния, вызванные наличием антител к ВИЧ, и ВИЧ-положительные состояния, саркома Капоши, тромбоцитопения пурпура и условно-патогенные инфекции. Помимо этого эти соединения или составы могут быть использованы профилактически для предотвращения или торможения развития клинической формы заболевания у лиц, имеющих антитела к ВИЧ или антиген ВИЧ или которые были подвергнуты воздействию ВИЧ.

ФТЦ и его фармацевтически приемлемые производные, или соли, или фармацевтически приемлемые составы, содержащие эти соединения, используются также для профилактики и лечения инфекций ВГВ и других связанных состояний, например, состояний, вызванных наличием антител к ВГВ, и ВГВ-положительных состояний, хронического воспаления печени, вызванного ВГВ, цирроза, острого гепатита, молниеносного гепатита, хронического персистируещего гепатита и слабости. Эти соединения или составы могут быть также использованы профилактически с целью предотвращения или торможения развития клинической формы заболевания у лиц, имеющих антитела к ВГВ и антиген ВГВ или которые подверглись воздействию ВГВ.

Резюмируя сказанное, настоящее изобретение включает следующие признаки:

(a) ()--D, L-2-оксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан и его фармацевтически приемлемые производные и соли;

(b) (-)--L-2-оксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан и его фармацевтически приемлемые производные и соли;

(c) (+)--D-2-оксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан и его фармацевтически приемлемые производные и соли;

(d) ()--D, L-2-оксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан, его (-) и (+) энантиомеры и фармацевтически приемлемые производные и соли для использования в медицинских целях, например, для лечения или профилактики ВИЧ или ВГВ инфекций;

(е) использование ()--D, L-2-оксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолана, его (-) и (+) энантиомеров и фармацевтически приемлемых производных и солей в производстве лекарственного препарата для лечения инфекций ВИЧ или ВГВ;

(f) фармацевтические составы, включающие (±)--D, L-2-оксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан, его (-) или (+) энантиомер, или фармацевтически приемлемое производное, или соль с фармацевтически приемлемым носителем;

(g) способ получения 2-оксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолана:

(I) необязательно защищенный 5-фторцитозин вступает в реакцию с 1,3-оксатиоланом формулы А

где R_1a является водородом или гидроксильной защитной группой, включая ацильную группу, а L является отщепляемой группой; и необязательно удаляют гидроксилзащитную группу;

(II) соединение формулы В

(где R_1a имеет указанное ранее значение, а R_1b является аминоэащитной группой) вступает в реакцию с фторирующим реагентом, служащим для введения атома фтора в положение 5 кольца цитозина; или

(III) соединение формулы С

(где R_1a имеет указанное ранее значение) вступает в реакцию с реагентом, служащим для преобразования оксогруппы в положении 4 кольца урацила в аминогруппу; и любую остающуюся защитную группу отщепляют для получения целевого продукта;

(f) способ получения (-) или (+) энантиомера 2-оксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолана, который включает этап, на котором соединение или его производное (например, 5'-сложннй эфир) в виде смеси (-) и (+) энантиомеров помещается в такие условия или вступает в реакцию с таким реагентом, что происходит разделение энантиомеров и, при необходимости, конечное производное преобразуют в исходное соединение.

Что касается способа е) (I), то защитная гидроксильная группа включает защитные группы, подробно описанные ниже, в том числе, апил- (например, ацетил-), арилацил- (например бензоил- или замещенный бензоил-), тритил- или монометокситритил-, бензил- или замещенный бензил-, трехзамещенный силил-, включая триалкилсилил- (например, диметил-Т-бутилсидил-) или дифенилметилсилил-. Соединение 5-фторцитозин необязательно может быть защищено трехзамещенным силилом. Защитные группы могут быть отщеплены обычным образом. Отщепляемая группа L является одной из типичных групп, известных в химии нуклеозидов, например, галоген- (хлор- или бром-), алкокси- (метокси- или этокси-) или ацил- (ацетил- или бензоил-).

Реакция по способу е) (I) может протекать в органическом растворителе (например, 1,2-дихлоратан или ацетонитрил) в присутствии кислоты Льюиса, предпочтительно тетрахлорида олова, или триметилсилилтрифлата.

Соединение формулы А (где L является ацильной группой, например, ацетильной группой) может быть получено путем введения в реакцию соединения формулы Д

(где R_1a имеет указанное ранее значение) с восстанавливающим реагентом, например, с алюмогидридом лития, после чего его подвергают воздействию обычного реагента для получения целевого промежуточного соединения, например, ангидрида карбоновой кислоты (ангидрида уксусной кислоты) с целью ацилирования, воздействию хлорирующих или бромирующих реагентов с целью галоидирования, или воздействию алкилирующих реагентов.

Соединение формулы Д можно получить введением в реакцию соединения формулы Е

с HSCH₂CO₂H при повышенной температуре.

Соединение формулы Е можно получить озонолизом простого или сложного эфира алила формулы CH₂=CH-CH₂-OR или ди- простого или сложного эфира 2-бутен-1,3-диола формулы ROCH₂-CH=CH-CH₂OR, в котором R является защитной группой, например, алкил-, силил- или ацил-.

Что касается способа (II), то 5-фтор можно ввести с помощью известных методов (М.Дж. Робина и др. Химия нуклеиновой кислоты, ч.2, Л.В.Тоунсенд и Р.С.Типсон, издатели, Дж.Вилей и Сыновья, Нью-Йорк, 895-900 (19/8) и список литературы там же; Р. Душинский. Химия нуклеиновой кислоты, ч.1, Л.В. Тоунсенд и Р.С. Типсон, издатели, Дж. Вилей и Сыновья, Нью-Йорк, 43-46 (1978) и список литературы там же). Фторирующим реагентом может быть, например, триметилгипофлуорит во фтортрихлорметана.

Что касается способа е) (III), то соединение формулы С можно подвергнуть воздействию 1,2,4-триазола вместе с 4-хлор-фенилдифлофосфатом для получения соответствующего соединения 4-(1,2,4-триазоилил), которое затем преобразуют в целевое соединение 4-амино (цитидин) реакцией, например, с метанолом.

Исходные вещества формул В и С можно получить реакцией, например, соответствующего (необязательно защищенного) основания с соединением формулы А аналогично описанному выше способу е) (I). 5-фторурация и 5-фторцитозин можно закупить у Олдрич Кемикел Ко., Мнлуоки, Висконсин 53233, США.

Раствор ()-энантиомеров можно выполнить согласно подробному описанию, приведенному ниже в разделе III.

ФТЦ можно преобразовать в фармацевтически приемлемый сложный эфир путем реакции с соответствующим реагентом, например с галогенангидридом или ангидридом кислоты. ФТЦ или его фармацевтически приемлемое производное может быть преобразовано в фармацевтически приемлемую соль обычным способом, например, воздействием соответствующего основания. Сложный эфир или соль ФТЦ могут быть преобразованы в ФТЦ путем, например, гидролиза.

I. Активное соединение, его физиологически приемлемые производные и соли

Описываемым антивирусным активным соединением является 2-оксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан (см. фиг.1) в рацемической форме или в виде изолированного энантиомера.

Активное соединение может применяться в виде любого производного, которое после введения реципиенту может дать непосродственно или косвенно исходное ФТЦ соединение или которое само демонстрирует активность. Неограничивающими примерами являются фармацевтически приемлемые соли (или же упоминаемые в тексте как "физиологически приемлемые соли") и 5’ и N⁴ ацилированные или алкилированные производные активного соединения (или же упоминаемые как "физиологически или фармацевтически активные производные"). В одном варианте осуществления настоящего изобретения ацил является сложным эфиром карбоновой кислоты, в котором некарбонильный фрагмент сложного эфира выбран из прямого, разветвленного или циклического алкила, алкоксиалкила, включая метоксиметил, аралкила, в том числе фенила, необязательно замещенного галогеном, С₁-С₄ алкила или С₁-С₄ алкокси сложных эфиров сульфокислот, например, алкил- или аралкил-сульфонил, в том числе метансульфонил, моно, ди или трифосфат сложного эфира, тритил или монометокситритил, замещенный бензил, триал-килсилил (например, диметилбутилсилил) или дифенилметилсилил. Оптимально, чтобы арилом в сложных эфирах был фенил. Алкил может быть прямым, разветвленным или циклическим, оптимально от С₁ до С₁₈.

Конкретные примеры фармацевтически приемлемых производных ФТЦ включают, но не ограничиваются ими:

где R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из алкила и ацила, в том числе конкретно включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил, изопропил, изобутил, сек-бутил, t-бутил, изопентил, амил, t-пентил, 3-метилбутирил, гидроген сукцината, 3-хлорбензоат, циклопентил, циклогексил, бензоил, ацетил, пивалоил, мезилат, пропионил, бутирил, валерил, капроновую, каприловую, каприновую, лауриновую, миристиновую, пальмитиновую, стеариновую, олеиновую кислоты, аминокислоты, в том числе, но не ограничиваясь, аланинил, валинил, лейцинил, изолейцинил, пролинил, фенилаланинил, триптофанил, метионинил, глицинил, серинил, треонинил, цистеинил, тирозинил, аспарагинил, глутаминил, аспартоил, глутаоил, лизинил, аргининил и гистидинил и где один из R₁ и R₂ может быть водородом.

ФТЦ или его производные могут быть предложены в форме фармацевтически приемлемых солей. Используемый здесь термин "фармацевтически приемлемые соли или комплексы" относится к солям или комплексам ФТЦ, которые поддерживают целевую биологическую активность исходного соединения и демонстрируют минимальное, если есть таковое, нежелательное токсикологическое воздействие. Неограничивающими примерами таких солей являются а) соли присоединения кислот, образованные неорганическими кислотами (например, соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота, азотная кислота и т.п.), и соли, образованные органическими кислотами, как, например, уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, аскорбиновая кислота, бензойная кислота, дубильная кислота, памоевая кислота, альгиновая кислота, полиглютаминовая кислота, нафталинсульфоновые кислоты, нафталиндисульфоновые кислоты и полигалактуроновая кислота;

b) соли присоединения основания, образованные катионами многовалентных металлов, например, цинк, кальций, висмут, барий, магний, алюминий, медь, кобальт, никель, кадмий, натрий, калий и т.п., или органическим катионом, образованным из N,N-дибензилэтилендиамина, аммония или этилендиамина; или с) сочетание а) и b), например, соль дубильной кислоты и цинка и т.п.

Модификации активного соединения, конкретно в положениях N⁴ и 5’-O, могут влиять на биологическую доступность и скорость метаболизма активных разновидностей, обеспечивая таким образом контроль над их поступлением. Далее модификации могут влиять на антивирусную активность соединения, увеличивая в некоторых случаях его активность по сравнению с исходным соединением. Это можно легко оценить путем получения производного и исследования его антивирусной активности в соответствии с описанными здесь способами или другим способом, известным специалистам в данной области.

II. Получение активных соединений

Рацемическая смесь ФТЦ может быть получена в соответствии с методом, подробно описанным в международной публикации № WО 91/11186 согласно Договору о патентной кооперации, опубликованной 8 августа 1931 г. и зарегистрированной Эмори Юниверсити. В целом, способ включает озонирование простого или сложного эфира алила формулы СН₂=СН-СН₂-OR или простого или сложного диэфира 2-бутен-1,3-диола формулы ROCH₂-CH=CH-CH₂OR, где R является защитной группой, как, например, алкил-, силил- или ацил-, для образования гликолевого альдегида формулы OHC-CH₂-OR; добавление тиогликолевой кислоты дает лактон формулы 2-(R-окси)-метил-5-оксо-1,3-оксатиолан; восстановление лактона до различных соединений, включающих отщепляемую группу в положении 5 кольца оксатиолана; присоединение этих соединений к силированному 5-фторцитозину в присутствии SnСl₄ дает -изомер ФТЦ; и необязательное отщепление защитных групп.

Пример 1. Получение ()--D, L-2-оксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолана.

Способ получения рацемической смеси ФТЦ приведен на фиг.2 и подробно описан ниже.

Защита 2-бутен-1,4-диола

В сухой трехгорлой колбе емкостью 2 л, в инертной атмосфере растворили 100 г (93,5 мл = 1,135 моль = 1,00 экв.) 2-бутен-1,4-диола и 15 г (приблизительно 0,1 экв.) ДМАП (4-диметиламинопиридин) в 800 мл обезвоженного пиридина и затем их перемешивали во время охлаждения до 0С. Затем для предотвращения перегревания медленно добавили хлорид бутирила (260 мл = 2,2 экв.) и перемешивали в течение одного часа. Реакцию охладили небольшим количеством ледяной воды. Жидкость декантировали из соли и выпарили in vitro. Оставшуюся соль растворили в воде и водный раствор дважды экстрагировали простым этиловым эфиром. Другие связанные слои один раз промыли насыщенным CuSO₄ и дважды - насыщенным NаНСО₃, содержащим Norit, и затем подвергли вакуум-фильтрации через Celite томпон .

Концентрированную реакционную смесь растворили в простом эфире и промыли, используя процедуру, описанную выше для соляного раствора. Связанные органические слои выпарили с помощью роторного испарителя и затем поместили в вакуум. Эта реакция обычно очень близка к количественной. В случае необходимости ее масштаб может быть легко увеличен. Продукт, 1,4-дибутирил-2-бутен-1,4-диол, является от бесцветной до желтоватой прозрачной жидкостью.

Озонолиз защищенного диола

1,4-дибутирил-2-бутен-1,4-диол (1,365 моль) растворили в 4 л обезвоженного СН₂Сl₂ в сухой трехгорлой колбе, емкостью 5 л, оснащенной насадкой с осушителем и открытой трубкой для введения газа. Оптимально трубка не является фриттированной трубкой для барботирования газа, которая будет засоряться при воздействии концентрированного раствора. Раствор перемешивали и охладили до 78C в то время, как через него барботировали инертный газ. Когда раствор достаточно охладился, газовый клапан закрыли, а колбу и перемешивающее устройство поместили в озоновый генератор. Кислород барботировали через перемешанный раствор, выдерживаемый из ледяной бани в течение по крайней мере 20 минут. Криогенное охлаждение является наилучшим для поддержания низкой температуры во время этой длительной реакции. Затем ввели озон при давлении 8-8,5 фунт/дюйм². По завершении поток озоне остановили, а кислород барботировали через раствор в течение получаса до того, как добавили 3 эквивалента Me₂S. Колбу удалили из охлаждающей бани и перенесли под колпак, где перемешивали в течение 2 дней, чтобы осуществить полное восстановление. Раствор выпарили и поместили в вакуум на несколько часов.

Обычно выход этой реакции составляет приблизительно 95% защищенного альдегида (2-бутирилоксиацетальдегид), от бесцветной до желтой прозрачной жидкости.

Циклизация альдегида меркаптоуксусной, кислотой

Альдегид (0,1 экв.) растворили в толуоле и получили 0,80-0,85 М раствор в колбе, оснащенной насадкой Дина-Старка. Добавили тиогликолевую кислоту и нагрели смесь до обратного холодильника. Воду удалили азеотропной отгонкой. Реакция закончилась через 3 часа и смесь остудили до комнатной температуры. Органи