Мутеин человеческого il-4, полинуклеотидная молекула, вектор, линия sf9, трансформированная вектором, способ выбора мутеина, фармацевтическая композиция для активирования т-клеток, способ лечения пациента, страдающего заболеванием, поддающимся лечению il-4

Патент 2235728

Авторы

Классы МПК

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения мутеинов человеческого IL-4, обладающих активирующей Т-клетки активностью и пониженной активирующей эндотелиальные клетки активностью. Мутеин IL-4 человека, вызывающий пролиферацию Т-клеток и пониженную секрецию IL-6 ЭКПВЧ по сравнению с IL-4 дикого типа, получают путем мутации поверхностных остатков D-спирали IL-4 человека, пронумерованного в соответствии с IL-4 дикого типа. Мутеины IL-4 содержат одиночные, двойные и тройные мутации, представленные обозначениями R121A, R121D, R121E, R121F, R121H, R121I, R121K, R121N, R121P, R121T, R121W; Y124А, Y124Q, Y124S, Y124Т; Y124A/S125A, T13D/R121E и R121Т/Е122F/Y124Q, при нумерации в соответствии с IL-4 дикого типа (His=1). Полинуклеотиды, кодирующие мутеины по изобретению, клонируют в вектор, и трансформируют им клетки-хозяева с последующим культивированием. Фармацевтические композиции, содержащие мутеины, используют для лечения пациентов, страдающих состоянием, поддающимся лечению IL-4. Изобретение позволяет получать менее токсичный мутеин IL-4, который делает возможным более широкое терапевтическое применение интерлейкина. 7 н. и 36 з.п.ф-лы, 23 ил., 1 табл.

Изобретение относится, главным образом, к областям фармакологии и иммунологии. Более конкретно, изобретение направлено на новые композиции вещества, избирательно активирующего Т-клетки и обладающего пониженным активирующим эффектом на эндотелиальные клетки или фибробласты. Новые композиции включают в себя варианты из семейства цитокинов и, в частности, человеческий интерлейкин-4 (IL-4).

Интерлейкин-4 (IL-4) представляет собой плейотропный цитокин, активирующий клетки иммунной системы, эндотелия и клетки фибробластного типа. Описанные эффекты, обнаруженные после введения IL-4 in vitro, включают в себя пролиферацию В-клеток, переключение иммуноглобулиновых классов в В-клетках. Что касается Т-клеток, IL-4 стимулирует пролиферацию Т-клеток после предварительной активации митогенами и оказывает понижающее регулирующее воздействие на продукцию IFN-. В моноцитах IL-4 индуцирует экспрессию молекул МНС II класса, секрецию липополисахаридиндуцированного tPA и экспрессию CD23. В эндотелиальных клетках (ЭК) IL-4 индуцирует экспрессию VCAM-1 и секрецию IL-6 и снижает экспрессию ICAM-1 (Maher, DW, et al., Human Interleukin-4: An Immunomodulator with Potential Therapeutic Applications, Progress in Growth Factor Research, 3:43-56 (1991)).

По причине его способности к стимулированию пролиферации Т-клеток, активированных воздействием IL-2, преследовались терапевтические приложения IL-4. Например, IL-4 проявлял противоопухолевую активность в животных моделях со злокачественными опухолями почки и вызывал регресс опухоли у мышей (Bosco, M., et al., Low Doses of IL-4 Injected Perilymphatically in Tumor-bearing Mice Inhibit the Growth of Poorly and Apparently Nonimmunogenic Tumors and Induce a Tumor Specific Immune Memory, J.Immunol., 145:3136-43 (1990)). Однако его токсичность ограничивает размер дозировки у людей (Margolin, К., et al., Phase II Studies of Human Recombinant Interleukin-4 in Advanced Renal Cancer and Malignant Melanoma, J.Immunotherapy, 15:147-153(1994)).

Вследствие иммунорегуляторной активности IL-4 для него предложен ряд клинических применений. Среди этих клинических применений находятся заболевания, вызванные дисбалансом в иммунной системе, в особенности заболевания, вызванные дисбалансом в реакциях Т-хелперной (Th) клетки на антиген. Данные заболевания включают в себя определенные аутоиммунные заболевания, ревматические заболевания, кожные заболевания и инфекционные заболевания. Большой объем экспериментальной работы позволил установить, что Th клетки подразделяются на два обширных класса, обозначаемых как Th1 и Th2 (Mosmann, T.R., Cherwinski, H., Bond, M.W., Giedlin, M.A. and Coffman, R.L., Two types of murine helper Т cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins, J. Immunol, 136:2348-2357 (1986); Mosmann, T.R., Cytokines, differentiation and functions of subsets of CD4 and CD8 Т cells, Behring Inst. Mitt., 1-6 (1995)). Данные классы Т-клеток определяются по цитокинам, которые они экспрессируют: Тh1-клетки продуцируют IL-2, IFN- и TNF-, тогда как Тh2-клетки продуцируют IL-4 и IL-5. Th1-и Тh2-клетки образуются из не подвергнутых воздействию CD4+ Т-клеток. Дифференцировка на Th1-или Тh2-подгруппы зависит от цитокина, присутствующего во время антигенной стимуляции: IFN- и IL-12 направляют процесс дифференцировки не подвергнутых воздействию клеток в сторону фенотипа Th1, тогда как IL-4 направляет процесс дифференцировки в сторону фенотипа Th2. Несмотря на то, что в Th1-и Тh2-подгруппах среди множества фенотипов Th-клеток могут быть представлены крайние случаи (например, были описаны Th0-клетки, которые проявляют низкий уровень экспрессии как IFN-, так и IL-4), тем не менее, данная классификация является главенствующей в области иммунологии для описания характера иммунного ответа.

Были сделаны наблюдения, что определенные органоспецифичные аутоиммунные заболевания связаны с Т-клеточным ответом на аутоантиген, осуществляемый преимущественно Th1 (Liblau RS; Singer SM; McDevitt HO, Th1 and Th2 CD4⁺ Т cells in the pathogenesis of organ-specific autoimmune diseases, Immunol. Today, 16:34-38 (1995)). Одним таким аутоиммунным заболеванием является инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД), заболевание, характеpизующееся опосредованным Т-клетками разрушением -клеток поджелудочной железы. Некоторые данные позволяют предположить, что за разрушение -клеток поджелудочной железы преимущественно ответственны клетки Th1-типа (обзор в Tisch, R. et al., Review: Insulin-dependent Diabetes Mellitus, Cell, 85:291-297 (1996)). Введение IL-4 мышам NOD, которые служат животной моделью ИЗСД, оказывает понижающее регулирующее воздействие на популяцию Th1 и значительно замедляет развитие диабета (Rapoport, et al., IL-4 Reverses T cell Proliferation Unresponsiveness and Prevents the Onset of Diabetes in NOD Mice, J.Exp.Med., 178:87-99 (1993)). Другим таким аутоиммунным заболеванием является рассеянный склероз (PC), заболевание, которое характеризуется аутоиммунной атакой на миелиновую оболочку, окружающую нервные клетки. Исследования, проведенные на людях с PC, продемонстрировали, что обострение PC связано с присутствием аутоантигенспецифичных Th1- и Th0-клеток и что ремиссия связана с присутствием аутоантигенспецифичных Th2- и Th0-клеток (Correale, J. et al., Patterns of cytokine secretion by autoreactive proteolipid protein-specific T cell clones during the course of multiple sclerosis, J. Immunol., 154:2959-2968 (1995)). У мышей с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом (ЭАЭ), животной моделью PC также проявляется поляризация Th1-клеток (Cua, DJ, Hinton, DR, and Stohlman, SA, J.Immunol., 155:4052-4059 (1995)). Косвенные данные, полученные при исследовании модели ЭАЭ, приводят к предположению, что IL-4 играет принципиальную роль в уменьшении тяжести заболевания, являющимся результатом лечения толерогенным пептидом (Brocke, S. et al., Treatment of experimental encephalomyelitis with a peptide analogue of myelin basic protein, Nature, 379:343-346 (1996)).

Другие аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит (РА), также являются мишенями для терапии на основе IL-4. В животных моделях РА был показан дисбаланс показателей клеточных профилей, склоняющийся в сторону Th1-клеток, и было продемонстрировано, что у мышей с повышенным уровнем экспрессии TNF-, анти-TNF- антитела уменьшали тяжесть заболевания, что позволяет предположить, что курсы лечения на основе IL-4, результатом которых является понижающая регуляция популяций Th1-клеток, также могут обладать анти-TNF- действием (смотри Feldmann, М., et al., Review: Rheumatoid Arthritis, Cell, 85:307-310 (1996)).

Псориаз представляет собой хроническое кожное заболевание, характеризующееся инфильтрацией пораженной кожи моноцитами и Т-клетками. В нескольких сообщениях указывается, что Т-клетки и ЛПК из псориатического кожного очага обладают преимущественно фенотипом Th1 (Uyemura К; Yamamura М; Fivenson DF; Modlin RL; NickolofT BJ, The cytokine network in lesional and lesion-free psoriatic skin in characterized by a T-helper type 1 cell-mediated response, J.Invest. Dermatol, 101:701-705 (1993); Schlaak JF; Buslau M; Jochum W; Hermann E; Girndt M; Gallati H; Meyer zum Buschenfelde KH; Fleischer В, Т cells involved in psoriasis vulgaris belong to the Th1 subset, J. Invest. Dermatol, 102:145-149 (1994)). К тому же, было показано, что монометилфумарат, лекарственное средство, о котором сообщалось, что оно приносит клиническое улучшение состояния пациентов, страдающих псориазом, избирательно стимулирует секрецию цитокинов МКПК Th2 (de Jong R; Bezemer AC; Zomerdijk TP; van de Pouw-Kraan T; Ottenhoff TH; Nibbering PH, Selective stimulation of T helper 2 cytokine responces by anti-psoriasis agent monomethylfumarate, Eur. J.Immunol., 26:2067-2074 (1996)). Таким образом, ожидается, что IL-4 будет обращать поляризацию Th и будет вызывать клиническое улучшение при псориазе.

Определенные инфекционные заболевания связаны с поляризованными Th-клеточными реакциями на инфекционный агент. Тh2-опосредованные реакции в некоторых случаях были связаны с невосприимчивостью к инфекционному агенту. Примером служит Borrelia burgdorferi, возбудитель болезни Lyme. У людей, инфицированных В. burgdorferi, наблюдается преимущественно Тh1-подобный профиль цитокинов (Oksi J; Savolainen J; Репе J; Bousquet J; Laipalla P; Viljanen MK, Decreased interleukin-4 and increased gamma interferon production by peripheral blood mononuclear cells of patients with Lyme borreliosis, Infect. Immun., 64:3620-3623 (1996)). В модели В. burgdorferi-индуцированного артрита у мышей сопротивляемость заболеванию связана с продукцией IL-4, тогда как подверженность связана с продукцией IFN- (Matyniak JE; Reiner SL, Т helper phenotype and genetic susceptibility in experimental Lyme disease, J.Exp.Med., 181(3):1251-1254 (1995); Keane-Myers A; Nickell SP, Role of IL-4 and IFN-gamma in modulation of immunity Borrelia burgdorferi in mice, J.Immunol., 155:2020-2028 (1995)). Лечение инфицированных В. burgdorferi мышей IL-4 увеличивает сопротивляемость инфекции (Keane-Myers A; Maliszewski CR; Finkelman FD; Nickell SP, Recombinant IL-4 treatment augments resistance to Borrelia burgdorferi infections in both normal susceptible and antibody-deficient susceptible mice, J. Immunol., 156:2488-2494 (1996)).

Сообщалось, что IL-4 обладает прямым ингибирующим действием на развитие лимфом и лейкозов (Akashi, К, The role of interleukin-4 in the negative regulation of leukemia cell growth, Leuk. Lymphoma, 9:205-9 (1993)). Например, сообщалось, что IL-4 индуцирует апоптоз клеток пациентов, страдающих острым лимфобластным лейкозом (Manabe, A., et al., Interleukin-4 induces programmed cell death (apoptosis) in cases of high-risk acute lymphoblastic leukemia, Blood, 83:1731-7 (1994)), и подавляет рост клеток пациентов, страдающих неходжкинской В-клеточной лимфомой (Defrance, Т., et al., Antiproliferative effects of interleukin-4 on freshly isolated non-Hodgkin malignant B-lymphoma cells, Blood, 79:990-6 (1992)).

Также сообщалось, что IL-4 проявляет активность, наличие которой предполагает, что он сможет вызывать клиническое улучшение при остеоартрите. Остеоартрит представляет собой заболевание, при котором основным патологическим процессом является разрушение хряща (Sack, KE, Osteoarthritis, A continuing challenge, West J. Med., 163:579-86 (1995); Oddis, CV, New perspectives on osteoarthritis, Am. J. Med., 100:10S-15S (1996)). IL-4 ингибирует продукцию TNF- и IL-1 моноцитами и синовиоцитами пациентов, страдающих остеоартритом (Bendrups, A, Hilton, A, Meager, A and Hamilton, JA, Reduction of tumor necrosis factor alpha and interleukin-1 beta levels in human synovial tissue by interleukin-4 and glucocorticoid, Rheumatol. Int., 12:217-20 (1993); Seitz, M., et al., Production of interleukin-1 receptor antagonist, inflammatory chemotactic proteins, and prostaglandin E by rheumatoid and osteoarthritic synoviocytes-regulation by IFN-gamma and IL-4, J. Immunol., 152:2060-5 (1994)). Также сообщалось, что IL-4 непосредственно блокирует разрушение хряща в эксплантатах хряща ex vivo (Yeh, LA, Augustine, AJ, Lee, P, Riviere, LR and Sheldon, A, Interleukin-4, an inhibitor of cartilage breakdown in bovine articular cartilage explants, J. Rheumatol., 22:1740-6 (1995)). Данные активности предполагают, что IL-4 будет вызывать клиническое улучшение при остеоартрите.

Однако клиническое применение IL-4 было ограничено по причине его острой токсичности, которая проявляется в виде синдрома повышенной проницаемости сосудов (Margolin, К., et al., Phase II Studies of Human Recombinant Interleukin-4 in Advanced Renal Cancer and Malignant Melanoma, J. Immunotherapy, 15, 147-153 (1994)). В литературе не существует ни данных, которые описывали бы механизм острого токсического эффекта IL-4, ни данных, которые описывали бы аналоги или мутанты IL-4, у которых сохранена иммунорегуляторная активность, но которые обладают пониженной острой токсичностью.

Известны мутантные белки ("мутеины") IL-4. Мутеин IL-4 IL-4/Y124D представляет собой Т-клеточный антагонист (Kruse N, Tony HP, Sebald W, Conversion of human interleukin-4 into a high affinity antagonist by a single amino acid replacement, Embo J., 11:3237-44 (1992)).

Терапевтические применения IL-4, описанные в патентах или в заявках на патент, включают в себя следующие: применение IL-4 для потенцирования противораковых эффектов химиотерапевтических средств в особенности при лимфогранулематозе и неходжкинской лимфоме (смотри международную заявку на патент WO 9607422); применение антигенных фрагментов IL-4 для наработки антител для лечения заболеваний, связанных с IL-4, путем подавления или имитации связывающей активности IL-4 (смотри международную заявку на патент WO 9524481) и для определения, измерения и иммунологической очистки IL-4 (смотри международную заявку на патент WO 9317106); для индукции дифференцировки предшественников В-клеток в иммуноглобулинсекретирующие клетки, зрелые В-клетки, применимые для компенсации иммунной функции у пациентов с нарушенной деятельностью иммунной системы (смотри международную заявку на патент WO 9404658); будучи примененным в сочетании с IL-10, в качестве средства для лечения лейкоза, лимфомы, воспаления кишки и гиперчувствительности замедленного типа (например, язвенного колита и болезни Крона) (смотри международную заявку на патент WO 9404180); лечения ВИЧ-инфекции путем введения IL-4 для ингибирования репликации вируса в моноцитах и макрофагах и для повышения их цитотоксичности по отношению к некоторым опухолевым клеткам (смотри WO 9404179); для стимулирования пролиферации кожных фибробластов для лечения ран у пациентов, страдающих сахарным диабетом и иммунными нарушениями (смотри международную заявку на патент WO 9211861); для усиления первичного иммунного ответа при введении бактериальных, токсоидных и вирусных вакцин, особенно вакцины столбнячного анатоксина (смотри международную заявку на патент WO 9211030); для подавления IL-2-индуцированной пролиферации в В-клеточных злокачественных опухолях особенно при хроническом лимфолейкозе, неходжкинской злокачественной лимфоме (смотри международную заявку на патент WO 9210201); применение IL-4 для лечения меланом, злокачественных опухолей почки и базалиом (смотри международную заявку на патент WO 9204044).

В патентной литературе описаны белки и некоторые мутеины IL-4, но не направленные на лечение на основе IL-4 со сниженными побочными эффектами. Патент США №5017691 ("патент "691"), выданный Lee et al., направлен на продуцируемые млекопитающими белки и мутеины человеческого IL-4, которые обнаруживают как активность факторов роста В-клеток, так и активность факторов роста Т-клеток. В нем описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, проявляющие активность IL-4, также сами полипептиды и способы их получения. Описаны мутеины IL-4 дикого типа по аминокислотным положениям, которые сохраняют in vitro свою способность стимулировать пролиферацию как В -, так и Т-клеток. Однако в патенте США 5017691 ничего не предложено по поводу каких-либо мутеинов IL-4, избирательно действующих на Т-клетки, ожидаемой активации ЭК или увеличения проницаемости эндотелиальных клеток, которая сопутствует введению IL-4. Таким образом, сам IL-4 не может использоваться в качестве лечебного воздействия по причине ограничивающей дозировку токсичности.

В патенте США №5013824 описаны пептидные производные hIL-4, содержащие от 6 до 40 аминокислот нативного hIL-4. Также описаны иммуногены, содержащие конъюгаты пептидов и носителей. Носители включают эритроциты, бактериофаги, белки, синтетические частицы или любое вещество, способное вызывать продукцию антител против конъюгированного пептида. Мутеинов IL-4 не описано.

В международной заявке на патент WO 96/04306-A2 описаны одиночные мутеины, которые являются антагонистами и частичными агонистами hIL-2 и hIL-13. Данных, касающихся IL-4, не приведено. В международной заявке на патент WO 95/27052 описаны сплайсинговые мутанты IL-2 и 1L-4, содержащие экзоны 1, 2 и 4.

Существует потребность в усовершенствованной молекуле IL-4, которая обладает пониженной токсичностью и в основном более толерантна.

Изобретение направлено на мутеины человеческого IL-4, пронумерованные в соответствии с IL-4 дикого типа, обладающие активирующей Т-клетки активностью, но обладающие пониженной активностью активирования эндотелиальных клеток. В частности, мутеины человеческого IL-4, где экспонированные поверхности на остатки D-спирали IL-4 дикого типа мутированы, в результате чего полученный мутеин вызывает пролиферацию Т-клеток и вызывает пониженную секрецию IL-6 ЭКПВЧ по сравнению с IL-4 дикого типа. Данное изобретение представляет менее токсичный мутеин IL-4, который делает возможным более широкое терапевтическое применение данного интерлейкина.

Кроме того, изобретение направлено на мутеины IL-4, содержащие одиночные, двойные и тройные мутации, представленные обозначениями R121A, R121D, R121E, R121F, R121H, R121I, R121K, R121N, R121P, R121T, R121W; Y124A, Y124Q, Y124S, Y124T, Y124A/S125A, T13D/R121E и R121T/E122F/Y124Q, при нумерации в соответствии с IL-4 дикого типа (His=1). Изобретение также включает в себя полинуклеотиды, кодирующие мутеины

этого изобретения, векторы, содержащие полинуклеотиды, трансформированные клетки-хозяева, фармацевтические композиции, содержащие мутеины, и терапевтические способы лечения.

Изобретение также направлено на вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий мутеин этого изобретения, вектор, направляющий экспрессию мутеина человеческого IL-4, обладающего активностью активирования Т-клетки, но обладающего пониженной активностью активирования эндотелиальных клеток, причем вектор обеспечивает возможность трансфекции организма-мишени и последующей экспрессии in vivo указанного мутеина человеческого IL-4, кодируемого указанным полинуклеотидом. Изобретение также направлено на способ выбора мутеина человеческого IL-4, пронумерованного в соответствии с IL-4 дикого типа, обладающего активностью активирования Т-клетки, но обладающего пониженной активностью активирования эндотелиальных клеток, включая мутацию поверхностных остатков D-спирали IL-4 дикого типа, посредством чего полученный мутеин вызывает пролиферацию Т-клеток и вызывает пониженную секрецию IL-6 ЭКПВЧ по сравнению с диким типом.

Изобретение также направлено на способ лечения пациента, страдающего состоянием, поддающимся лечению IL-4, путем введения терапевтически эффективного количества мутеина человеческого IL-4, пронумерованного в соответствии с IL-4 дикого типа, обладающего активирующей Т-клетки активностью, но обладающего пониженной активностью активирования эндотелиальных клеток. Данный способ применим, когда состояние, поддающееся лечению IL-4, представляет собой аутоиммунное заболевание, в частности рассеянный склероз, ревматоидный артрит, инсулинзависимый сахарный диабет, системную красную волчанку, инфекционное заболевание, в частности болезнь Lyme, Th1-поляризованное заболевание, в частности псориаз, злокачественную опухоль, в частности острый лимфобластный лейкоз и неходжкинскую лимфому, заболевание хрящевой ткани, в частности остеоартрит.

Краткое описание чертежей. На фиг.1 представлена аминокислотная последовательность (ПОСЛ. ИД. №:1) зрелого человеческого IL-4 дикого типа, применяемого в данном исследовании. Спирали подчеркнуты и последовательно помечены А, В, С и D. Положения, которые, будучи мутированы, позволяли получить агонисты IL-4, избирательно действующие на клетки, указаны жирньм шрифтом.

Фиг.2 является графическим представлением концепции агониста, избирательно действующего на Т-клетки.

На фиг.3 представлена суммарная кривая "доза-ответ" мутеинов-избирательных агонистов в исследовании секреции IL-6 ЭКПВЧ. Панель А: О, IL-4 дикого типа; , R121E; , R121P; , R121T/E122F/Y124Q. Панель В: О, IL-4 дикого типа; , Y124Q; , Y124R; , R124A/S125A.

На фиг.4 представлены индивидуальные кривые "доза-ответ" мутеинов-избирательных агонистов в исследовании секреции IL-6 ЭКПВЧ. Панель А: О, IL-4 дикого типа; , R121E. Панель В: О, IL-4 дикого типа; , R121P. Панель С: О, IL-4 дикого типа; Y124Q. Панель D: О, IL-4 дикого типа; , Y124R. Панель Е: О, IL-4 дикого типа; , Y124A/S125A. Панель F: О, IL-4 дикого типа; , R121T/E122F/Y124Q.

На фиг.5 представлена суммарная кривая "доза-ответ" мутеинов-избирательных агонистов для биологического ответа мутеинов IL-4 при анализе пролиферации 1 Т-клеток. Панель А: O, IL-4 дикого типа; , R121E; , R121P; , R121T/E122F/Y124Q. Панель В: O, IL-4 дикого типа; , Y124Q; , Y124R; , R124A/S125A.

На фиг.6 представлены индивидуальные кривые "доза-ответ" в исследованиях пролиферации 1 Т-клеток. Панель А: О, IL-4 дикого типа; , R121E. Панель В: О, IL-4 дикого типа; , R121P. Панель С: O, IL-4 дикого типа; , Y124Q. Панель D: О, IL-4 дикого типа; , Y124R. Панель Е: O, IL-4 дикого типа; , Y124A/S125A. Панель F: O, IL-4 дикого типа; , R121T/E122F/Y124Q.

На фиг.7 представлены индивидуальные кривые "доза-ответ", показывающие антагонизм IL-4-индуцированной секреции IL-6 ЭКПВЧ и мутеинов-агонистов IL-4, избирательно действующих на Т-клетки, R121E () и Y124Q (2). Кривая "доза-ответ" антагониста IL-4 R121D/Y124D (O) включена в качестве контроля.

На фиг.8А, 8В представлены индивидуальные кривые "доза-ответ": на Панели В показан биологический ответ на мутеин R121D при анализе пролиферации 1 Т-клеток (O=IL-4, =R121D); на Панели А показана неспособность R121D индуцировать секрецию IL-6 ЭКПВЧ (O=IL-4, =R121D).

На фиг.9А представлены индивидуальные кривые "доза-ответ" для IL-4 (O) и для мутеинов-агонистов, избирательно действующих на Т-клетки, R121E (A) и T13D/R121E при анализе пролиферации 1 Т-клеток.

На фиг.9В представлены индивидуальные кривые "доза-ответ", показывающие антагонизм IL-4-индуцированной секреции IL-6 ЭКПВЧ и мутеинов-агонистов IL-4, избирательно действующих на Т-клетки, R121E (А) и T13D/R121E .

Описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

А. Предпосылки

Было показано, что IL-4 опосредует множество клеточных реакций in vitro, включая различные воздействия на В-клетки, Т-клетки и моноциты, равно как и на эндотелиальные клетки (Maher DW, Davis I, Boyd AW, Morstyn G: Human interleukin-4: an immunomodulator with potential therapeutic applications. Prog. Growth Factor Res. 3:43-56, 1991; Powrie F, Coffman RL: Cutokine regulation of Т cell function: potential for therapeutic intervention. Immunol. To day 14:270-4, 1993). В частности, повышающая регуляция молекулой адгезии сосудистых клеток-1 (VCAM-1; (Swerlick RA, Lee KH, Li LJ, Sepp NT, Caughman SW, Lawley TJ: Regulation of vascular cell adhesion molecule 1 on human dermal microvascular endothelial cells. J.Immunol. 149:698-705, 1992)) и индукция IL-6 (Colotta F, Sironi M, Borre A, Luini W, Maddalena F, Mantovani A: Interleukin 4 amplifies monocyte chemotactic protein and interleukin 6 production by endothelial cells. Cytokine 4:24-8, 1992) и моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (МСР-1; Colotta F, Sironi M, Borre A, Luini W, Maddalena F, Mantovani A: Interleukin 4 amplifies monocyte chemotactic protein and interleukin 6 production by endothelial cells. Cytokine 4:24-8, 1992; Rollins BJ, Pober JS: Interleukin-4 induces the synthesis and secretion of MCP-1/JE by human endothelial cells. Am.J.Pathol. 138:1315-9, 1991)) являются прямыми воздействиями IL-4 на культивируемые эндотелиальные клетки; повышающая регуляция VCAM-1 коррелирует с повышенной адгезией лимфоцитов как in vitro (Carlos TM, Schwartz BR, Kovach NL, Yee E, Rosa M, Osborn L, Chi-Rosso G, Newman B, Lobb R, Rosso M, et al.: Vascular cell adhesion molecule-1 mediates lymphocyte adherence to cytokine- activated cultured human endothelial cells. Blood 76:965-70, 1990; Thornhill MH, Wellicome SM, Mahiouz DL, Lanchbury JS, Kyan-Aung U, Haskard DO: Tumor necrosis factor combines with IL-4 or IFN-gamma to selectively enhance endothelial cell adhesiveness for Т cells. The contribution of vascular cell adhesion molecule-1-dependent and -independent binding mechanisms. J. Immunol. 146:592-8, 1991), так и in vivo (Briscoe DM, Cotran RS, Pober JS: Effects of tumor necrosis factor, lipopolysaccharide, and IL-4 on the expression of vascular cell adhesion molecule-1 in vivo. Correlation with CD3+ Т cell infiltration. J. Immunol. 149:2954-60, 1992).

Мутеин IL-4 IL-4/Y124D (замена тирозина на аспарагиновую кислоту в положении 124) представляет собой Т-клеточный антагонист (Kruse N, Tony HP, Sebald W: Conversion of human interleukin-4 into a high affinity antagonist by a single amino acid replacement. Embo J. 11:3237-44, 1992). Эксперименты in vivo, проведенные авторами настоящего изобретения, продемонстрировали, что IL-4/Y124D проявляет острую токсичность, сходную с таковой IL-4 дикого типа у обезьян, ранее не описанное наблюдение. Клеточные процессы, связанные как с токсичностью IL-4 дикого типа, так и с IL-4/Y124D-опосредованной токсичностью, включают в себя повышающую регуляцию VCAM-1, повышающую регуляцию МСР-1 в сыворотке, увеличения содержания циркулирующих моноцитов совместно с сопутствующим снижением содержания циркулирующих лимфоцитов и повышения гематокрита. Сходные клеточные процессы наблюдали в клинических испытаниях с применением IL-4 на людях (Wong HL, Lotze MT, Wahl LM, Wahl SM: Administration of recombinant IL-4 to humans regulates gene expression, phenotype, and function in circulating monocytes. J. Immunol. 148:2118-25, 1992). Поскольку он является антагонистом Т-клеток, данные результаты предполагают, что токсические эффекты, демонстрируемые IL-4/Y124D, обусловлены агонистической активностью и опосредуются через клетки, отличные от Т-клеток. Наблюдаемые in vivo токсические эффекты при применении IL-4/Y124D и известное воздействие IL-4 на эндотелиальные клетки согласуются с механизмом, состоящим в том, что токсичность IL-4 in vivo опосредуется через прямые воздействия IL-4 на эндотелий сосудов.

Благодаря этим (и родственным) исследованиям авторы настоящего изобретения установили, что на эндотелиальных клетках ("ЭК") может существовать новый рецептор IL-4. Данная возможность привела к попыткам синтеза мутеинов IL-4, которые избирательно активировали бы Т-клетки, но не ЭК. Тогда как Т-клетки экспрессируют рецептор IL-4, состоящий из субъединиц IL-4R и IL-2R, авторы настоящего изобретения установили, что эндотелиальные клетки пупочной вены человека (ЭКПВЧ) экспрессируют IL-4R, но не экспрессируют IL-2R. Исследования с применением поперечных сшивок показали, что на клеточной поверхности ЭКПВЧ экспрессируются две рецепторные цепи: молекулярная масса одной совпадает с IL-4R, и вторая цепь с меньшей молекулярной массой. Данные результаты позволяют предположить, что на ЭКПВЧ экспрессируется компонент нового рецептора IL-4, сходный по функции с IL-2R, но отличающийся от него по последовательности. Различия в особых молекулярных структурах между этими двумя рецепторами были использованы для создания варианта IL-4, который является избирательным по отношению к одному рецептору перед другим (например, избирательно действующим на Т-клетки агонистом).

На фиг.2 графически представлена концепция избирательных агонистов. На ней показан Т-клеточный рецептор IL-4, содержащий субъединицу IL-4R/IL-2R и рецептор IL-4 эндотелиальных клеток, содержащий IL-4R/-подобную рецепторную субъединицу. Несмотря на то, что два рецептора IL-4 изображены здесь вместе исключительно в целях иллюстрации, они экспрессируются на различных клеточных типах. Т-клеточный рецептор состоит из IL-4R и IL-2R; связывание IL-4 индуцирует образование гетеродимерного рецептора, которое приводит к передаче клеточного сигнала. Индуцированное IL-4 образование гетеродимерного рецептора сходным образом происходит и на ЭК за исключением того, что рецептор IL-4 состоит из IL-4R и -подобного рецепторного компонента, -подобный рецепторный компонент отличен от IL-2R. Избирательно действующие на Т-клетки агонисты IL-4 представляют собой такие варианты IL-4, которые сохраняют свою способность взаимодействовать с Т-клеточным рецептором IL-4R/IL-2R, но не способны индуцировать гетеродимеризацию и, таким образом, передачу сигнала IL-4R/-подобной субъединицы не-Т-клеточного рецептора. Такие избирательно действующие на Т-клетки агонисты IL-4 сохраняют свою способность взаимодействовать с IL-4R; их способность различать IL-2R и -подобную субъединицу обеспечивает их свойства избирательно активировать клетки.

Два компонента Т-клеточного рецептора, IL-4R и IL-2R, взаимодействуют с различными участками молекулы IL-4 и, таким образом, авторы настоящего изобретения сосредоточились на модификации небольшого участка IL-4. Предположив, что новая рецепторная субъединица будет взаимодействовать с тем же участком IL-4, что и IL-2R, авторы настоящего изобретения произвели ряд замен в D-спирали, в частности остатков 121, 124 и 125.

D-спираль вовлечена во взаимодействия как с IL-2R, так и с предполагаемым новым рецептором на ЭКПВЧ (характерно, что мутеин IL-4 R121D/Y124D является антагонистом ЭКПВЧ). Мутеины, содержащие модификации D-спирали IL-4 (остатки со 110 по 126; His=1) подвергали скринингу на предмет их способности стимулировать либо пролиферацию Т-клеток, либо секрецию IL-6 эндотелиальными клетками пупочной вены человека (ЭКПВЧ). Мутеины, которые индуцировали ответ Т-клеток, отличный от ответа ЭКПВЧ, в дальнейшем характеризовали далее с применением мутагенеза.

Исходные данные сканирования D-спирали были взяты для определения потенциальных областей взаимодействия. В дополнение к этому, были проведены сканирующие замены аланина в АВ-петле, поскольку предполагается, что данный фрагмент вовлечен во взаимодействие цитокина-лиганда и рецепторной субъединицы, взаимодействующей с D-спиралью. В частности, экспонированные на поверхности остатки Glu-110, Asn-111, Glu-114, Arg-115, Lys-117, Thr-118, Arg-121, Glu-122, Туг-124, Ser-125 и Lys-126 были выбраны целью исследования и являются предпочтительными мишенями для мутационного анализа. Более предпочтительными являются сайты 118-126, а сайты 121-125 являются наиболее предпочтительными. Сравнения между IL-2, IL-4, IL-7 и IL-15 в данном фрагменте также выявляют различия между IL-4 и IL-2, IL-7 и IL-15, что, возможно, предполагает существование особых остатков, ответственных за взаимодействие с рецептором ЭКПВЧ. Специфичные замены, взятые из выравнивания, проведенного между IL-2 и IL-4, вносили в IL-4. Они включали в себя: Arg-115 на Phe; Lys-117 на Asn; Glu-122 на Phe; Lys-126 на Ilе; и три одновременные замены Arg-121 на Thr, Glu-122 на Phe и Туг-124 на Gln.

Мутации вносили, применяя сайтнаправленный мутагенез на кДНК человеческого IL-4 дикого типа. Подходящие клоны субклонировали в экспрессирующий вектор, подходящий для экспрессии в гетерологичной системе (например, Е. соli, бакуловирусе или клетках СНО). Очищенные белки тестировали в анализах пролиферации Т-клеток и секреции цитокинов ЭКПВЧ (IL-6). Различные ответы, вызванные отдельными мутеинами, полученные в данных анализах, либо в ЭК₅₀, либо в максимальном ответе (плато), указывают мутации, которые влияют на данные активности. Конкретно, мутеины, которые стимулируют относительно более сильный ответ в Т-клеточном анализе (против IL-4 дикого типа) по сравнению с ответом ЭКПВЧ (против IL-4 дикого типа), вероятно предполагают наличие положений, которые более важны для взаимодействия IL-4 с IL-2R, чем для взаимодействия IL-4 с новым рецептором IL-4 ЭКПВЧ. Дальнейший анализ и мутагенез (например, комбинаторные замены, замены всеми аминокислотами) определенных положений даст возможность получить мутеин IL-4, обладающий свойствами избирательного агониста по отношению к Т-клеточному рецептору IL-4. Данный белок также будет являться избирательным антагонистом IL-4-индуцированных реакций ЭКПВЧ.

Б. Определения

Здесь описаны новые мутеины и механизм получения новых мутеинов IL-4, обладающих свойствами избирательно действующих на Т-клетки агонистов и пониженной токсичностью. Сходная стратегия может быть применена для идентификации избирательно действующих на Т-клетки антагонистов.

Термин "IL-4 дикого типа" означает здесь IL-4, нативный или рекомбинантный, содержащий последовательность из 129 обычно встречающихся аминокислот нативного человеческого IL-4, состоящей, как показано, например, на фиг.1.

Термин "мутеин IL-4" означает здесь полипептид, полученный в результате того, что в человеческом зрелом белке интерлейкине-4 произведены особые замены.

В частности, как здесь описано, остаток аргинина (R) в положении 121 ("Arg-121"), пронумерованный в соответствии с IL-4 дикого типа, заменен аланином (А), аспартатом (D), глютаматом (Е), фенилаланином (F), гистидином (Н), изолейцином (I), лизином (К), аспарагином (N), пролином (Р), треонином (Т) или триптофаном (W); или остаток глютамата (Е) в положении 122 замещен фенилаланином (F); или остаток тирозина в положении 124 замещен аланином (А), глютамином (Q), аргинином (R), серином (S) или треонином (Т); или остаток серина (S) в положении 125 замещен аланином (А). Наиболее предпочитаемые авторами настоящего изобретения мутеины IL-4 обладают аминокислотной последовательностью, идентичной IL-4 дикого типа по остальным, незамещенным остаткам. Однако мутеины IL-4 этого изобретения также могут быть охарактеризованы вставками, делениями, заменами и модификациями аминокислот в одном или нескольких сайтах в других остатках полипептидной цепи нативного IL-4. В соответствии с данным изобретением любые такие вставки, делеции, замены и модификации приводят к образованию мутеина IL-4, который сохраняет избирательную активность по отношению к Т-клеткам, в то же время обладая пониженной способностью активировать эндотелиальные клетки.

Авторы настоящего изобретения предпочитают консервативные модификации и замены в других положениях IL-4 (т.е. в тех, которые обладают минимальным воздействием на вторичную и третичную структуру мутеина). Такие консервативные замены включают в себя таковые, описанные Dayhoff в The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978) и Argos в ЕМВО J., 8:779-785 (1989). Например, аминокислоты, относящиеся к одной из следующих групп, представляют собой консервативные замены:

- ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr;

- cys, ser, tyr, thr;

- val, ile, leu, met, ala, phe;

- lys, arg, his;

- phe, tyr, trp, his; и

- asp, glu.

Авторы настоящего изобретения также предпочитают модификации или замены, которые не вносят сайтов дополнительных межмолекулярных сшивок или неправильного образования дисульфидных связей. Например, известно, что IL-4 содержит шесть остатков cys, в положениях 3, 24, 46, 65, 99 и 127 белка дикого типа.

Под термином "пронумерованный в соответствии с IL-4 дикого типа" авторы настоящего изобретения подразумевают идентификацию выбранной аминокислоты относительно положения, в котором данная аминокислота в норме находится в IL-4 дикого типа. Если в мутеине IL-4 произведены вставки или делеции, для специалиста в данной области представится ценным тот факт, что ser (S), в норме находящийся в положении 125 при нумерации в соответствии с IL-4 дикого типа, может быть смещен в положении в мутеине. Однако локализация смещенного ser (S) может быть с легкостью определена путем проверки и корреляции фланкирующих аминокислот с таковыми, фланкирующими ser в IL-4 дикого типа.

Мутеины IL-4 настоящего изобретения могут быть получены с помощью любого подходящего метода, известного в данной области. Такие методы включают в себя конструирование последовательности ДНК, кодирующей мутеины IL-4 данного изобретения, и экспрессирование данных последовательностей в подходящем трансформированном хозяине. Данный метод позволит получить рекомбинантные мутеины по данному изобретению. Однако мутеины по данному изобретению также могут быть получены, хотя и менее предпочтительно, с помощью химического синтеза или технологии рекомбинантных ДНК.

В одном из вариантов осуществления рекомбинантного метода получения мутеина данного изобретения последовательность ДНК конструируют путем выделения или синтеза последовательности ДНК, кодирующей IL-4 дикого типа, с последующей заменой кодона, кодирующего arg121, на кодон, кодирующий аланин (А), аспартат (D), глютамат (Е), фенилаланин (F), гистидин (Н), изолейцин (I), лизин (К), аспарагин (N), пролин (Р), треонин (Т) или триптофан (W) с помощью сайтспеци