Селективные агонисты и антагонисты il-2

Селективные агонисты и антагонисты il-2

Реферат

 

Изобретение относится к полипептиду (I), представляющему собой мутантный белок IL-2 человека с нумерацией согласно IL-2 дикого типа, где человеческий IL-2 замещен по крайней мере по одному положению, 20, 88 или 126, благодаря чему указанный мутантный белок активирует Т-клетки предпочтительно перед естественными киллерными (NK) клетками; фармацевтической композиции, обладающей иммуностимулирующей активностью, включающей полипептид I; полинуклеотиду, представляющему собой последовательность ДНК, кодирующую мутантный белок IL-2 человека; вектору pBC1IL 2SA для экспрессии мутантного белка IL-2 человека; линии клеток яичников китайских хомячков; линии клеток африканской зеленой мартышки, штамму E.coli, линии клеток Spodoptera fugiperda, трансформинированных вектором pBC1IL 2SA, которые продуцируют мутантный белок IL-2 человека; способу лечения млекопитающих, страдающих онкологическими заболеваниями, а также к способу отбора мутантных белков IL-2 по оценке их в исследованиях с применением IL-2R в сравнении с IL-2R, где активность мутантного белка IL-2 повышается по отношению к IL-2 дикого типа в одном из исследований предпочтительно перед другим. 10 н. и 16 з.п.ф-лы, 8 табл., 20 ил.

Предшествующий уровень техники

1. Область изобретения

Изобретение в общем относится к областям фармакологии и иммунологии. Более точно, изобретение направлено на новые соединения для селективного активирования Т-клеток (ФГА-бластов (Т-клеток, активированных фитогемагглютинином)) и снижения активирования естественных киллерных (“NK”) клеток. Новые соединения включают варианты соединений семейства цитокинов, в частности человеческого интерлейкина-2 (“IL-2”).

2. Описание области техники

Интерлейкин 2 (IL-2) является эффективным стимулятором иммунитета, активирующим различные клетки иммунной системы, включая Т-клетки, В-клетки и моноциты. IL-2 является также потенциальным и критическим фактором роста Т-клеток. Благодаря этим активностям IL-2 исследовали на возможность применения в лечении рака. Человеческий IL-2 является одобренным FDA (Управление по контролю за продуктами и лекарствами (США)) лекарством для лечения метастазирующей почечной карциномы и метастазирующей меланомы. Использование IL-2 у нуждающихся в нем пациентов ограничено из-за высокой токсичности, связанной с лечением Интерлейкином-2; по оценкам, в лучшем случае 20% пациентов хорошо переносят лечение. Токсичность, связанная с лечением IL-2, включает сильную лихорадку, тошноту, рвоту, сосудистую проницаемость и серьезную гипотензию. Несмотря на токсичность, IL-2 эффективен по своим показателям (объективный уровень ответа ~17%).

Несмотря на то, что проводился широкий структурный и функциональный анализ мышиного IL-2 (Zurawski, S. M. and Zurawski, G. (1989) Embo J 8: 2583-90; Zurawski, S. M, et al., (1990) Embo J 9: 3899-905; Zurawski, G. (1991) Trends Biotechnol 9: 250-7; Zurawski, S. M. and Zurawski, G. (1992) Embo J 11: 3905-10; Zurawski, et al., EMBO J, 12: 5113-5119 (1993)), анализ человеческого IL-2 проводился ограниченно. Большинство исследований с мутантными белками IL-2 человека проводилось на мышиных клетках; однако ограниченное число исследований было проведено с использованием человеческих ФГА-бластов (Т-клетки, обработанные фитогемагглютинином), экспрессирующих высоко аффинный IL-2 рецептор IL-2R. Исследования с использованием ФГА-бластов подтвердили значимость остатков Asp-20 и D-спирали человеческого IL-2. Было показано, что положения Asp-20 и Gln-126 являются основными остатками, отвечающими за взаимодействие с - и -субъединицами рецептора IL-2 соответственно (описано в Theze, et al., Immunol. Today, 17,481-486 (1996)). Хотя было показано, что остатки в С-спирали мышиного IL-2 участвуют во взаимодействии с мышиным IL-2R ((Zurawski, et al., EMBO J, 12 5113-5119 (1993)), не было показано, что эквивалентные остатки в человеческом IL-2 обладают такими же свойствами (эти остатки в человеческом IL-2 соответствуют Asp-84 и Asn-88). Так как показана значительная видоспецифичность для человеческого и мышиного IL-2 (активность человеческого IL-2 в мышиных клетках снижена ~ в 100 раз), сложно предсказать, происходят ли сходные взаимодействия в пределах вида. Ничего не известно об исследованиях с использованием клеток, экспрессирующих только человеческий рецептор IL-2R со средней аффинностью.

Была исследована активность некоторых мутантных белков IL-2 человека на человеческих ФГА-бластах (Xu, et al., Eur. Cytokine Netw, 6, 237-244 (1995)). Было показано, что мутантные белки, содержащие замены Asp-20 на лейцин (D20L), а также аргинин, аспарагин и лизин, сильно дефектны по способности индуцировать пролиферацию ФГА-бластов. Таким образом следует, что замена Asp-20 приведет к образованию мутантных белков с ограниченной активностью. Кроме того, в работе Xu et al. утверждается, что к 1995 г. не было идентифицировано мутантных белков IL-2, полезных для клинического или исследовательского применения.

Мутантный белок человеческого IL-2 Q126D, полученный Buchli и Ciardelli, Arch. Biochem. Biophys, 307(2): 411-415, (1993), обладает значительно сниженной активностью как по основному свойству, так и в агонизме; в эксперименте с Т-клетками человека он проявил активность, в 1000 раз меньшую, чем IL-2, и вел себя как частичный агонист. В эксперименте с мышиными Т-клетками мутантный белок был почти неактивен. Обе исследованные клеточные линии экспрессируют высокоаффинную форму рецептора IL-2. В клетках обоих типов была показана способность Q126D быть антагонистом IL-2-опосредованной активности, хотя в эксперименте с человеческими Т-клетками - только частично.

Zhi-yong, W., et al., Acta Biochimica et Biophysica Sinica 25(5): 558-560 (сентябрь 1993 г.) провели эксперименты по замене в IL-2 в положениях 62, 69, 99 и 126, демонстрирующие 20- и 30-кратное снижение активности 62-Leu-IL-2 и 126-Asp-IL-2 соответственно по сравнению с IL-2 дикого типа в эксперименте с мышиными Т-клетками (CTLL-2). Однако не сделано вывода или предположения о том, что замены по положению 126 могут обусловить активность, селективную к Т-клеткам по сравнению с NK клетками, или показать, будут ли такие замены иметь сходный эффект в человеческих Т-клетках.

В работе Collins, L., et al., PNAS USA 85:7709-7713 (1988) сообщается, что замена Asp в положении 20 на Asn (D20N) или Lys (D20K) приводит к потере связывания как с рецептором высокой (IL-2R, обозначенным в работе Collins et. аl. р55/р70), так и (промежуточной) средней аффинности (IL-2R, обозначенным р70) в 100-1000 раз по сравнению с человеческим IL-2. Связывание с IL-2R оказалось неизмененным для обоих мутантных белков. Из этой работы следует, что нарушение связывания с IL-2-рецептором промежуточной (средней) аффинности (IL-2R) приведет к нарушению связывания и с высокоаффинным IL-2- рецептором (IL-2R), при этом предполагается, что раздельное связывание или активация между IL-2R или IL-2R недостижимы путем замены Asp в положении 20.

Brendt, W.G., et al., Biochemistry 33 (21):6571-6577 (1994) использовали комбинаторный кассетный мутагенез для одновременной замены положений 17-21 в природном IL-2, предполагается, что эти положения взаимодействуют с IL-2-рецептором промежуточной (средней) аффинности. Из 2610 проанализированных клонов только 42 были активны. Было обнаружено, что положения 20 и 21 имеют первостепенное значение для биологической активности. Не сделано предположений или выводов об индивидуальных заменах, за исключением L21V.

В патенте США №5229109 (Grimm et al.) утверждается низкая токсичность аналогов IL-2 при использовании в иммунотерапии и лечении рака. Свойства двух аналогов IL-2 с заменами в положениях Arg38 (на аланин) и Phe42 (на лизин) были изучены и сравнены со свойствами природного IL-2. Было обнаружено, что аналоги способны поддерживать способность связываться с промежуточным рецептором IL-2 при минимальном связывании с так называемым “высокоаффинным” рецептором. В то же время предполагалось, что рецептор с промежуточной (средней) аффинностью состоит только из р75 (IL-2R), а рецептор с высокой аффинностью состоит только из рецепторного комплекса р55+р75 (IL-2R). Также аналоги поддерживали способность стимулировать мононуклеарные клетки периферийной крови к производству лимфокин-активированных киллеров (LAK). Следует отметить, что секреция IL-1 и TNF в ответ на аналоги была значительно снижена по сравнению с природной молекулой IL-2, В этом патенте описаны аминокислотные остатки, которые будут специфически взаимодействовать с IL-2R (р55); исключение взаимодействия с IL-2R приведет к снижению активности на клетках, несущих высокоаффинный IL-2 рецептор, и не повлияет на активность клеток, несущих IL-2 рецептор с промежуточной активностью. Таким образом, продукция LAK клеток (предполагается, что они являются производньми NK-клеток) будет поддерживаться. Мутации в белках, описанные здесь, направлены на аминокислотные положения 20, 88 и 126; считается, что эти положения специфически взаимодействуют с IL-2R (р75; положения 20 и 88) и IL-2R (на момент подачи патента Grimm et аl. неизвестно; положение 126). Как следствие, взаимодействие с IL-2R остается неизменным. С механистической точки зрения мутантные белки, описанные Grimm et аl., будут характеризоваться сниженным взаимодействием с высокоаффинным рецептором IL-2, но не повлияют на активность IL-2-рецептора с промежуточной (средней) аффинностью; мутантные белки, описанные в данной работе, обладают противоположными характеристиками, они характеризуются значительным дефектом по способности к взаимодействию с IL-2-рецептором с промежуточной аффинностью IL-2R, и очень слабо или совсем не дефектны по функциональным взаимодействиям с высокоаффинным IL-2-рецептором, IL-2R.

В патенте США №5206344 (Gordon et al.) описаны мутантные белки IL-2, в которых одна из аминокислот зрелой нативной последовательности IL-2 заменена на цистеиновый остаток, затем эти белки обрабатывали и через замещенный цистеиновый остаток конъюгировали с полимером, выбираемым из ряда гомополимеров полиэтиленгликоля или полиоксиэтилированных полиолов, где гомополимеры не замещены или замещены с одного конца алкильной группой. Эти мутантные белки получают экспрессией в хозяине мутантных генов, эти гены были поставлены вместо генов, кодирующих белки хозяина, методом сайт-направленного мутагенеза. Кроме того, другие виды IL-2 могут быть конъюгированы через цистеиновый остаток в положении 125 зрелого IL-2, которое не является необходимьм для биологической активности IL-2. Мутации, обусловливающие пониженную токсичность, не описаны.

В патенте США №4959314 (Lin et al.) описаны мутанты биологически активных белков, таких как IFN- и IL-2, в которых цистеиновые остатки, не важные для биологической активности, были удалены или замещены на другие аминокислотные остатки для исключения сайтов межмолекулярного кросслинкинга или образования незаконных дисульфидных мостиков. Такие мутантные белки получают экспрессией в бактериях мутантных генов, эти гены были синтезированы из генов, кодирующих белки хозяина, методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза. Мутации, обусловливающие пониженную токсичность, не описаны.

В патенте США №5116943 (Halenbeck et al.) описано, что биологически активный стандартный терапевтический белок защищают от окисления способом, включающим замещение каждого метионинового остатка, подверженного окислению хлорамином Т или пероксидом, на консервативную аминокислоту, причем дополнительные, невосприимчивые к окислению метиониновые остатки не замещают. Устойчивым к окислению мутантным белком, получаемым таким образом, является предпочтительно мутантный белок интерлейкина-2 или интерферона- человека, а консервативной аминокислотой - наиболее предпочтительно аланин. Мутации, обусловливающие пониженную токсичность, не описаны.

Патент США №4853332 (Mark et al.) описывает мутантные белки IFN- и IL-2, в которых цистеиновые остатки, не важные для биологической активности, были удалены или замещены другими аминокислотами для исключения сайтов межмолекулярного кросслинкинга или образования незаконных дисульфидных мостиков. В патенте заявлено, что замена в IL-2 цистеина в положении 125 на серин приводит к образованию мутантного белка с активностью, сравнимой с нативным IL-2.

Патент США №5696234 (Zurawski et al.) описывает мутантные белки цитокинов млекопитающих и способы поиска агонистов и антагонистов цитокинов млекопитающих. В частности показано, что двойной мутант человеческого IL-2, P82A/Q126D, обладает антагонистической активностью на мышиных клетках Baf3, котрансфицированных - и -субъединицами IL-2R человека. Показано наличие небольшой агонистической активности. Также показано, что мутанты мышиного IL-2 демонстрируют частичную агонистическую и антагонистическую активность на НТ2 клетках, в частности это мутанты Q141D, Q141K, Q141V и Q141L. Активности мутантных белков, подтверждающие или предполагающие избирательный агонистический эффект мутаций по положениям 20, 88 и 126, не описаны.

Zurawski et al, описывает мутантные белки мышиного IL-2, которые активны на клетках, экспрессируюших IL-2R, и неактивны на клетках, экспрессирующих IL-2R (Zurawski.G., Trends Biotechnol. 9: 250-257 (1991); Zurawski, S.M. and Zurawski. G.Embo. J. 11:3905-3910 (1992)). Мутантные мышиные белки IL-2, обладающие такими свойствами, имеют замены Asp-34 на Ser или Thr, и Gin-141 на Lys. Asp-34 и Gln-141 мышиного IL-2 эквивалентны Asp-20 и Gln-141 человеческого IL-2 соответственно. Хотя эти ссылки относятся к мутантным белкам IL-2 - “селективным агонистам”, преимущественно описывается потенциал этих белков как антагонистов эндогенного IL-2, но не потенциал их более низкой токсичности.

В ЕР 0267795 А2 (Zurawski et al.) описан ряд мутантных белков мышиного IL-2 по последовательности, включая мутанты, содержащие делеции и/или замены внутри первой трети биологически важных N-концевых аминокислотных остатков, но туда не включены, не обсуждаются и не предлагаются аминокислотные замены, предлагаемые в настоящей работе на эквивалентных остатках мышиного IL-2. Существует потребность в улучшенной молекуле IL-2 с пониженной токсичностью и большей общей переносимостью.

Патент США №4738927 (Taniguchi et al.) описывает рекомбинантную ДНК, включающую рекомбинантную ДНК, кодирующую полипептид с биологической активностью IL-2, причем указанная активность - это стимулирование роста клеточной линии цитотоксических Т-лимфоцитов, и векторную ДНК, способную реплицироваться в прокариотических и эукариотических клетках; кодирующая последовательность указанного гена расположена в направлении вниз от промоторной последовательности, причем указанный полипептид в общем представляет собой от 132 до 134 аминокислот в аминокислотной последовательности полипептида. В работе также описаны ген, рекомбинантные ДНК векторы, клетки хозяина и способы рекомбинантного получения нативного IL-2. Taniguchi et al. не описывают варианты мутантных белков и не указывают положения в белке, отвечающие за сигнальную и связывающую активности.

Ясно, что мутантные белки IL-2, не обладающие ограничивающей дозу токсичностью получаемых ранее рекомбинантных белков IL-2, необходимы для использования терапевтических преимуществ этого цитокина.

Краткое изложение изобретения

Изобретение описывает полипептид, включающий мутантный белок человеческого IL-2, нумерованный согласно IL-2 дикого типа, где указанный человеческий IL-2 замещен по крайней мере по одному из положений 20, 88 или 126, посредством чего указанный мутантный белок активирует Т-клетки предпочтительно перед NK-клетками. Данное изобретение представляет менее токсичный мутантный белок IL-2, дающий возможность более широкого использования этого интерлейкина.

Кроме того, изобретение включает мутантные белки IL-2, содержащие единичные мутации по положениям Аспартат 20, Аспарагин 88 и Глутамин 126. Специфические мутантные белки обозначены D20X, N88X и Q126X, где X - специфическая аминокислота, которая, будучи замещенной в человеческий IL-2, обусловливает избирательную активность клеток, экспрессирующих IL-2R рецептор (например. Т-клеток), преимущественно перед клетками, экспрессирующими IL-2R рецептор (например, NK-клетками). Мутантные белки, обладающие более чем 1000-кратной селективностью, включают D20H, D20I, N88G, N88I, N88R и Q126L. В частности, эти белки демонстрируют также существенную активность IL-2 дикого типа на Т-клетках. Также идентифицированы другие мутации, обеспечивающие менее чем 1000-, но более чем 10-кратную селективность. Изобретение включает также полинуклеотиды, кодирующие входящие в изобретение мутантные белки, векторы, содержащие полинуклеотиды, трансформированные клетки хозяина, фармацевтические композиции, включающие мутантные белки, и терапевтические способы лечения с использованием этих белков.

Изобретение также включает способ отбора мутантных белков IL-2 по результатам анализов с использованием IL-2R в сравнении с IL-2R, где активность мутантного белка IL-2 в одном анализе по сравнению с другим возрастает по отношению к IL-2 дикого типа. IL-2R и IL-2R представляют собой индивидуальные рецепторные субъединичные эктодомены в соответствующей конфигурации и используются для прямого измерения связывания мутантных белков IL-2 с каждым рецепторным комплексом. Анализ с использованием IL-2 учитывает ответ от IL-2-несущих клеток, а анализ с использованием IL-2 - ответ от IL-2-несущих клеток. IL-2-несущими клетками являются ФГА-бласты, а IL-2-несущими - NK-клетки. В анализе исследуется пролиферация и IL-2-, и IL-2-несущих клеток.

Изобретение также относится к вектору, включающему полинуклеотид, кодирующий указанный в этом изобретении мутантный белок, вектору, обусловливающему экспрессию мутантного белка человеческого IL-2, обладающего способностью активировать ФГА-бласты и сниженной способностью активировать NK-клетки, вектору, способному обеспечить трансфекцию организма-мишени и последующую экспрессию in vivo мутантного белка человеческого IL-2, кодируемого указанным полинуклеотидом.

Изобретение относится также к способу лечения больных, пораженных IL-2-излечиваемым заболеванием, путем назначения терапевтически эффективных количеств мутантного белка человеческого IL-2, нумерованного в соответствии с IL-2 дикого типа, обладающего способностью активировать ФГА-бласты и сниженной способностью активировать NK-клетки. Этот способ применим при состояниях, поддающихся лечению IL-2, таких как ВИЧ, рак, аутоиммунное заболевание, инфекционное заболевание; как адъювант при противораковой вакцине и обычной вакцинотерапии, для иммунной стимуляции в преклонном возрасте или при иммунитете, ослабленном другим образом, а также у пациентов с ГКИ (глубокий комбинированный иммунодефицит) и для других терапевтических целей, требующих стимуляции иммунной системы.

Краткое описание чертежей

Фиг.1-7 показывают кривые зависимости от доз для человеческого IL-2 дикого типа (IL-2) и D20H (фиг.1), IL-2 и D20I (фиг.2), IL-2 и N88G (фиг.3), IL-2 и N88I (фиг.4), IL-2 и N88R (фиг.5), IL-2 и Q126E (фиг.6), IL-2 и Q126L (фиг.7). А: Индивидуальный ответ на дозу IL-2 (закрашенные кружки) и мутантного белка (незакрашенные кружки) в исследовании пролиферации первичных Т-клеток человека (ФГА-бластов). В: Индивидуальный ответ на дозу IL-2 (закрашенные кружки) и мутантного белка (незакрашенные кружки) в исследовании пролиферации первичных NK-клеток.

Фиг.8А-8D. Токсичность пролейкина PROLEUKIN у шимпанзе оценивалась на двух животных (Х-159, треугольники, и Х-124, квадраты) по сравнению с наполнителем в качестве контроля (Х-126, ромбы). Токсичность оценивали по почечным параметрам (азот мочевины крови (BUN), А; креатинин, В) и функции печени (общий билирубин, С; аланин аминотрансфераза (ALT), D).

Фиг.9. График процентного изменения массы тела в течение 30 дней. Масса тела животных, которым давали IL-2/N88R (треугольники), пролейкин (квадраты) или наполнитель (ромбы), измерялась в указанные дни.

Фиг.10А-10D. Количество лимфоцитов (А), общих лейкоцитов (В), нейтрофилов (С) и тромбоцитов (D) у животных, которым давали IL-2/N88R (треугольники), пролейкин (квадраты) или наполнитель (ромбы), измерялось в указанные дни.

Фиг.11А-11D. Показатели азота мочевины крови (A, BUN), креатинина (В), фосфора (С) и времени активированного протромбина (D) у животных, которым давали IL-2/N88R (треугольники), пролейкин (квадраты) или наполнитель (ромбы), измерялись в указанные дни.

Фиг.12А-12D. Показатели общего билирубина (A), ALT (В), фибриногена (С) и времени активированного протромбина (D) у животных, которым давали IL-2/N88R (треугольники), пролейкин (квадраты) или наполнитель (ромбы), измерялись в указанные дни.

Фиг.13А-13D. Уровни натрия (А), хлорид-ионов (В), кальция (С) и калия (D) в крови у животных, которым давали IL-2/N88R (треугольники), пролейкин (квадраты) или наполнитель (ромбы), измерялись в указанные дни.

Фиг.14А-14С. Уровни альбумина (А), гематокрита (В) и гемоглобина (С) в крови у животных, которым давали IL-2/N88R (треугольники), пролейкин (квадраты) или наполнитель (ромбы), измерялись в указанные дни.

Фиг.15А-15С. Действие IL-2/N88R (квадраты), пролейкина (ромбы) и наполнителя (треугольники) указано для общей популяции Т-клеток (A, CD3+ клеток), популяции CD4+ Т-клеток (В) и CD8+ Т-клеток (С).

Фиг.16А-16С. Действие IL-2/N88R (квадраты), пролейкина (ромбы) и наполнителя (треугольники) указано для общей популяции Т-клеток (А, CD3+ клеток), популяции CD4+ Т-клеток (В) и CD8+ Т-клеток (С).

Фиг.17. Действие IL-2/N88R и пролейкина на активацию Т-клеток по отношению к значению флуоресценции CD25-положительных клеток. Действие IL-2/N88R (квадраты), пролейкина (ромбы) и наполнителя (треугольники) указано для популяции CD3+CD4+ Т-клеток. Было получено недостаточное количество CD3+/CD8+ клеток для оценки значения флуоресценции на этой популяции.

Фиг.18А-18D. Действие IL-2/N88R (квадраты), пролейкина (ромбы) и наполнителя (треугольники) указано для популяции CD4+ Т-клеток (A, CD3+/CD4+ клетки), популяции CD8+ Т-клеток (В, CD3+/CD8+ клетки), общей популяции Т-клеток (С, CD3+ клетки) и популяции NK-клеток (D, CD3-/CD16+ клетки).

Фиг.19. График количества метастазов в легких по отношению к дозе у мышей, которым давали пролейкин (незакрашенные кружки) или IL-2/N88R (закрашенные кружки). Метастазы в легких подсчитывали по окончании исследования.

Фиг.20. Плазмидная карта IL-2/Н88К-вектора pBC1IL2SA.

Описание предпочтительных вариантов осуществления

А. Предшествующий уровень техники

Действие IL-2 на Т-клетки опосредуется связыванием с IL-2-рецепторными белками. Определенные белки на поверхности Т-клеток связывают IL-2. Первым был идентифицирован единичный белок, называемый IL-2R, составляющий 55 kD (p55), он появляется при активации Т-клеток и был первоначально назван Тас-антигеном (от слов Т activation). IL-2R связывается с IL-2 с константой К_d, равной приблизительно 10^-8М, он также известен как “низкоаффинный” рецептор. Связывание IL-2 с клетками, экспрессирующими только IL-2R, не приводит к какому-либо различимому биологическому ответу.

Второй IL-2-рецептор - это связывающий комплекс, состоящий из IL-2Rb и IL-2Rg; IL-2Rg - это 64kD полипептид, известный также как общая (_с) цепь, так как он обнаруживается у ряда цитокиновых рецепторов. IL-2Rb составляет от 70 до 75 kD (называется либо р70, либо р75) и является членом семейства рецепторов цитокинов типа I, которые характеризуются наличием двух участков цистеин/WSXWS. IL-2R экспрессируется координированно с _с. Аффинность связывания IL-2 с IL-2R_c выше, чем с IL-2R, константа K_d составляет приблизительно 10^-9М; IL-2R_c известен также как IL-2-рецептор “с промежуточной аффинностью”. IL-2 вызывает рост клеток, экспрессирующих IL-2R_с, причем полумаксимальная стимуляция роста наблюдается при концентрации IL-2, приводящей к полумаксимальному связыванию (т.е. 110^-9М). IL-2R_с является тем же сигнальным рецепторным комплексом, который может связываться с IL-15.

Третьим известным IL-2-рецепторным комплексом является комплекс IL-2R_c. Клетки, экспрессирующие и IL-2R, и IL-2R_с, способны связывать IL-2 значительно прочнее с константой К_d, равной приблизительно 10^-11М, таким образом IL-2R_с известен также как “высокоаффинный” комплекс. Стимуляция роста таких клеток происходит соответственно при низких концентрациях IL-2. И связывание с IL-2, и стимуляция роста могут быть заблокированы антителами к IL-2R, IL-2R или _с и более эффективно комбинацией антител к нескольким субъединицам рецептора. Эти наблюдения позволяют предположить, что IL-2R образует комплекс с IL-2R_с, увеличивающий сродство сигнального рецептора к IL-2 и обеспечивающий таким образом доставку сигнала роста при значительно более низких концентрациях IL-2. Полагают, что сначала IL-2 быстро связывается с IL-2R, и это способствует ассоциации с IL-2R_с. Покоящиеся Т-клетки экспрессируют IL-2R_с и только небольшое количество IL-2R; увеличение поверхности, на которой экспрессирован IL-2R, может быть стимулировано IL-2. При активации Т-клеток, опосредованной рецептором антигена, быстро экспрессируется IL-2R, таким образом снижается концентрация IL-2, необходимая для стимуляции роста. Связывание IL-2 с комплексом IL-2R_с приводит к передаче сигнала по сигнальному пути Jac/STAT.

Авторами были обнаружены мутантные белки человеческого IL-2, которые активируют Т-клетки (ФГА-бласты; клетки, экспрессирующие высокоаффинный IL-2-рецептор IL-2R) предпочтительно перед естественньми киллерными (NK) клетками (клетками, экспрессирующими IL-2-рецептор с промежуточной аффинностью IL-2R). Мутантные белки, в которых Asp-20 заменен на гистидин (D20H) или изолейцин (D20I), Asn-88 заменен на аргинин (N88R), глицин (N88G) или изолейцин (N88I), или Gln-126 заменен на лейцин (Q126L) или глутамат (Q126E), демонстрируют неожиданно полную IL-2-активность на ФГА-бластах, и низкую активность (или ее отсутствие) на NK-клетках. Предыдущие исследования мутантных белков человеческого IL-2 основывались на мышиных клеточных системах анализа, а при исследованиях на клетках человека не использовались клетки, экспрессирующие только IL-2R (такие, как NK-клетки). Кроме того, исследования с использованием человеческих ФГА-бластов показали, что замены Asp-20 (на Leu, Arg, Asp или Lys; Xu, et al., Eur. Cytokine Netw, 6, 237-244 (1995)) или Gln-126 (на Asp; Buchli and Ciardelli, Arch. Biochem. Biophys, 307(2): 411-415, (1993)) приводят к мутантным белкам человеческого IL-2 со значительно сниженной активностью. В предыдущих исследованиях с использованием мышиного IL-2 были идентифицированы мутантные белки IL-2 мыши с различными активностями (Zurawski, et al., EMBO J, 12, 5113-5119 (1993)), но ни одна из мутаций, приведших к этим результатам, не предполагала мутаций, идентифицированных в предлагаемой работе. Мутантные белки человеческого IL-2, содержащие идентичные замены в положениях, синонимичных положениям в мутантных белках мышиного IL-2, не обнаруживают схожей активности, таким образом, можно предположить, что примеры на мышах не могут предсказывать функциональности в человеческой системе. Авторам не известны исследования мутантных белков IL-2 человека, сравнивающие относительные активности в клетках, экспрессирующих IL-2-рецептор IL-2R (например, ФГА-бластах) и в клетках, экспрессирующих IL-2-рецептор IL-2R (например, NK-клетках). Ожидается, что анализ in vivo подтвердит, что описанные мутантные белки обладают улучшенным терапевтическим индексом по сравнению с человеческим IL-2 дикого типа благодаря снижению токсичности и обеспечивают терапевтически полезные соединения для лечения заболеваний, требующих стимуляции иммунной системы.

Интерлейкин 2 (IL-2) используется в настоящее время в клинической практике для лечения метастатического рака почки. Однако его сильная токсичность ограничивает его применение группой наиболее здоровых пациентов, а ограничивающая дозу токсичность снижает его общую эффективность. Предполагают, что острая токсичность IL-2 обусловливается активацией NK-клеток, тогда как эффективность обусловлена прямой активацией Т-клеток (Jacobson, et al., Proc Natl Acad Sci USA (United States), Sep. 17, 1996, 93(19) p. 10405-10; Smith KA, Blood 1993, 81(6), р. 1414-23; Kaplan, et al., Biotechnology, 10 (2), p. 157-62). Т-клетки и NK-клетки экспрессируют различные рецепторы для IL-2 (Т-клетки: IL-2R, высокоаффинный IL-2-рецептор; NK-клетки: IL-2R, IL-2-рецептор с промежуточной активностью). Описанные в данной работе мутантные белки человеческого IL-2 активируют IL-2-рецептор Т-клеток и не активируют IL-2-рецептор NK-клеток.

Для того чтобы избежать активации NK-клеток с некоторым успехом применялась терапия низкими дозами IL-2 (Jacobson, et. еl. (1996). Proc Natl Acad Sci USA 93: 10405-10). Эта стратегия основывалась на концепции о том, что при низких дозах IL-2 будет активироваться только высокоаффинный IL-2-рецептор и не будет активироваться IL-2-рецептор с промежуточной активностью. Форма IL-2-рецептора с промежуточной активностью, IL-2R, экспрессирована на NK-клетках, в то время как Т-клетки экспрессируют высокоаффинную форму, IL-2R.

Однако авторы подошли к проблеме токсичности с другой позиции. Было сделано предположение, что нарушение взаимодействия IL-2 с IL-2R и/или с IL-2R путем определенных модификаций специфических связывающих остатков на связывающей поверхности IL-2 предотвратит эффективное связывание (и таким образом активацию) с клетками, экспрессирующими только IL-2R. Однако на клетках, экспрессирующих IL-2R, первоначально связывается IL-2R, таким образом, связывание с клеткой все равно будет происходить и терапия низкими дозами, предложенная Jacobs et al., может давать токсические побочные эффекты. Благодаря связыванию с IL-2 на поверхности клетки может происходить эффективное использование IL-2R и IL-2R. несмотря на ослабленное взаимодействие модифицированного IL-2 с IL-2R и/или IL-2R. Таким образом, может образоваться способный к сигнализации комплекс IL-2/IL-2R. Мы полагаем, что вариант IL-2, способный селективно активировать высокоаффинные IL-2-рецепторы на Т-клетках предпочтительно по отношению к IL-2-рецепторам с промежуточной активностью на NK-клетках, будет обладать повышенным терапевтическим индексом по сравнению с IL-2 дикого типа благодаря сниженному профилю токсичности. Вариант IL-2 с повышенным терапевтическим индексом будет обладать значительно более широкой областью применения как в лечении рака (при прямой и/или вспомогательной терапии), так и иммунодефицита (например, ВИЧ и туберкулез). Другие возможные применения IL-2 обусловлены его иммуностимулирующей активностью и включают, кроме того, прямое лечение рака, иммунодефицита у пациентов с ВИЧ или ГКИ человека; инфекционных заболеваний типа туберкулеза; применение в качестве адъюванта в методах “раковой вакцины” и при показанной стимуляции иммунной системы, например при совершенствовании стандартных процедур вакцинации или для лечения пожилых людей.

Соответствующие замены в положениях Asp-20, Asn-88 или Gln-126 снижали связывающие взаимодействия либо для IL-2R (Asp-20 и Asn-88), либо для IL-2R (Gln-126). Общий эффект таких замен привел к получению мутантных белков IL-2, которые сохраняли активность на Т-клетках человека и обладали сниженной активностью