Способ получения варианта липолитического фермента и липолитический фермент (варианты)

Способ получения варианта липолитического фермента и липолитический фермент (варианты)

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения варианта фермента путем создания модификаций в аминокислотной последовательности в определенной области липолитического фермента. Данное изобретение включает также варианты липолитического фермента с модифицированной аминокислотной последовательностью и с модифицированной специфичностью к субстрату. Данное изобретение позволяет увеличить уровень желательной активности или снизить уровень нежелательной активности липолитического фермента. 3 с. и 41 з.п. ф-лы,1 ил., 8 табл.

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу изменения субстратной специфичности липолитического фермента путем модификации аминокислотной последовательности и к вариантам липолитических ферментов, полученным посредством такой модификации. Настоящее изобретение также относится к способу скрининга липолитических ферментов.

Предпосылки создания изобретения

Липолитические ферменты (такие как липазы и фосфолипазы) обладают способностью гидролизовать связи сложных эфиров карбоновых кислот в субстрате с высвобождением этих карбоновых кислот. Гидролитическая активность в отношении различных сложноэфирных связей имеет важное значение для использования липолитического фермента в различных промышленных целях.

Таким образом, ферменты с высокой фосфолипазной активностью могут иметь широкое применение, такое как хлебопекарное производство (патент США 4567046), фильтрация гидролизата пшеничного крахмала (патент США 5264367) и обработка растительного масла для снижения содержания в нем фосфолипида (патент США 5264367). Для обработки растительного масла этот фермент должен иметь низкую липазную активность, то есть низкую гидролитическую активность в отношении сложно-эфирных связей в триглицеридах.

В WO 98/45453 показано, что фермент с высокой гидролитической активностью по отношению к дигалактозилдиглицериду (ДГДГ) может быть использован в хлебопекарном производстве.

Хорошо известно, что добавление липазы в моющие средства для стирки способствует удалению жирных пятен (например, ЕР 258068).

Высвобождение короткоцепочечных жирных кислот в качестве свободных жирных кислот (СЖК) может оказаться желательным для формирования нужного запаха в пищевых продуктах, например при созревании сыра (M.Hanson, ZFL, 41 (10), 664-666 (1990)).

Трехмерная структура (3D) некоторых липолитических ферментов известна, и также известно, что некоторые структуры содержат так называемую "крышку", которая может находиться в открытом или закрытом состоянии, покрывая активный центр. Brady et al., Nature, 343, 767-770 (1990). Brzozowski A.M. et al., Nature, 351, 491 (1991). Derewenda et al., Biochemistry, 31(5), 1532-1541 (1992).

F.Hara et al., JAOCS, 74(9), 1129-32 (1997) указывают, что некоторые липазы обладают определенной фосфолипазной активностью, тогда как большинство липаз обладают слабой активностью в отношении фосфолипидов, либо вообще не обладают такой активностью. Так, например, была описана фосфолипазная активность для липаз поджелудочной железы морских свинок, Fusarium oxysporum и Staphylococcus hyicus, и были предприняты попытки установить взаимосвязь фосфолипазной активности со структурой этой липазы. WO 98/26057; M.D.van Kampen et al., Chemistry and Physics of Lipids, 93 (1998), 39-45; A.Hjorth et al.. Biochemistry 1993, 32, 4702-4707.

В предшествующих работах было описано влияние замен аминокислот в липазе от Rhizopus delemar на селективность этих липаз в отношении длины цепи кислот. Таким образом, R.D. Joerger et al., Lipids, 29(6), 377-384 (1994) показал, что варианты F95D, F112W и V209W имеют модифицированную предпочтительность в пользу С₄- и С₈-кислот. R.R. Klein et al., JAOCS, 74 (11), 1401-1407 (1997) показал, что вариант V206T+F95D имеет более высокую селективность по отношению к С₈-кислоте. R.R.Klein et al., Lipids, 32(2), 123-130 (1997) показал, что варианты V209W+F112W, V94W и F95D+F214R обладают более высокой гидролитической активностью в отношении С₄- и С₈-кислот, и высказал предположение, что структурные детерминанты для специфичности в отношении средней длины цепи могут находиться на удаленном конце ацил-связывающего "желобка".

Краткое описание изобретения

Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что субстратная специфичность липолитического фермента может быть модифицирована путем внесения модификаций в аминокислотную последовательность на определенном участке этого липолитического фермента в целях увеличения уровня нужной активности или в целях снижения уровня нежелательной активности. Таким образом, авторы настоящего изобретения получили липолитические ферменты с модифицированной аминокислотной последовательностью (далее называемые вариантами липолитических ферментов или, вкратце, вариантами), с определенной специфичностью к субстрату, и которые могут быть использованы для конкретных целей.

В соответствии с этим настоящее изобретение относится к способу продуцирования варианта липолитического фермента и вариантов липолитических ферментов, полученных данным способом. Указанный способ предусматривает:

a) выбор субстрата и нужной сложноэфирной связи,

b) выбор исходного липолитического фермента,

c) выбор, по крайней мере, одного аминокислотного остатка в области возле активного сайта, в области возле С-конца или в области "крышки" исходного липолитического фермента, описанного ниже,

d) создание модификаций, каждая из которых представляет собой инсерцию, делецию или замену аминокислотного остатка,

e) необязательно, создание модификаций, каждая из которых представляет собой инсерцию, делецию или замену аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях, отличающихся от положений, указанных в с),

f) получение сконструированного варианта,

g) тестирование на активность данного варианта по отношению к сложноэфирной связи в данном субстрате, и

h) отбор варианта, обладающего модифицированной активностью по отношению к сложноэфирной связи.

Таким образом, в одном из аспектов настоящего изобретения, исходный липолитический фермент имеет спирт-связывающий сайт, содержащий глицериновую часть в положении sn2, а аминокислотная модификация находится в пределах 10 от С-атома в положении sn2 глицериновой части триглицеридного субстрата.

В другом аспекте настоящего изобретения исходный липолитический фермент имеет структуру, содержащую каталитическую триаду, состоящую из активного остатка Ser, активного остатка Asp и активного остатка His, а модифицируемая аминокислота расположена либо между активным остатком His каталитического остатка и С-концом, либо принадлежит к серии Е, определенной нижеследующими стадиями:

i) сопоставление первичной структуры липолитического фермента со структурой липазы 4TGL Rhizomucor miehei, содержащей каталитическую триаду и атом фосфора ингибитора (4TGL-inhP), для минимизации суммы квадратов отклонения между атомами каталитических триад двух структур,

ii) определение серии А, состоящей из атомов липолитического фермента внутри сферы радиусом 18 с центром в 4TGL-inhP,

iii) формирование первой плоскости, определенной 4TGL-inhP, атомом С активного остатка Ser исходного липолитического фермента и атомом С активного остатка Asp исходного липолитического фермента и определение серии В как субсерии серии А, состоящей из атомов на той же самой стороне первой плоскости, на которой расположен атом С активного остатка His исходного липолитического фермента,

iv) формирование второй плоскости, определенной 4TGL-inhP, атомом С активного остатка Ser исходного липолитического фермента и атомом С активного остатка His исходного липолитического фермента и определение серии С как субсерии серии А, состоящей из атомов на противоположной стороне второй плоскости, на которой расположен атом С активного остатка Asp исходного липолитического фермента,

v) формирование набора D, состоящего из атомов, принадлежащих к объединенным наборам В и С, и имеющего доступность к растворителю 15 или выше, и

vi) формирование набора Е, состоящего из аминокислотных остатков в структуре, который содержит атом, принадлежащий к набору D, или атом, принадлежащий к объединенным наборам В и С и расположенный на расстоянии, менее чем 3,5 от атома, принадлежащего к набору D.

В третьем аспекте настоящего изобретения данный липолитический фермент имеет активный центр, содержащий активный остаток His, а модификацию в аминокислотной последовательности создают между активным остатком His и С-концом.

В еще одном аспекте настоящего изобретения аминокислотную модификацию создают в пределах 10 аминокислотных остатков у С-конца.

В другом аспекте настоящего изобретения исходный липолитический фермент имеет "крышку", и данную модификацию создают в области этой крышки.

Настоящее изобретение также относится к ДНК-последовательности, кодирующей данный вариант, к экспрессирующему вектору, содержащему эту ДНК-последовательность, к трансформированной клетке-хозяину, содержащей указанную ДНК-последовательность или указанный экспрессирующий вектор, и к способу получения данного варианта путем культивирования указанной трансформированной клетки-хозяина так, чтобы эта клетка продуцировала данный вариант, с последующим выделением данного варианта из полученной питательной среды. Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию указанных вариантов.

Авторами настоящего изобретения было также обнаружено, что липолитический фермент, обладающий липазной и фосфолипазной активностью, а также активностью по отношению к дигалактозилдиглицериду, может быть с успехом использован в хлебопекарном производстве, и ими был разработан способ скрининга липолитических ферментов путем их тестирования на указанные активности.

Краткое описание чертежа

На чертеже проиллюстрировано сопоставление последовательностей липаз.

Подробное описание изобретения

Модифицированная активность по отношению к выбранной сложноэфирной связи в субстрате

Целью настоящего изобретения является изменение, по сравнению с исходным липолитическим ферментом, активности по отношению, по крайней мере, к одной выбранной сложноэфирной связи, по крайней мере, в одном субстрате, то есть увеличение нужной активности, снижение нежелательной активности или изменение специфичности к субстрату путем уменьшения отношения нежелательной активности к желательной активности.

Таким образом, фермент с повышенной фосфолипазной активностью может быть использован, например, в хлебопечении или для очистки растительного масла. Может оказаться желательным увеличение гидролитической активности фермента по отношению к дигалактозилдиглицериду (ДГДГ) в целях его использования в хлебопекарном производстве.

Увеличение липазной активности может оказаться желательным для любого промышленного производства, в котором используются липазы. Для использования в моющих средствах или при выпечке хлеба может оказаться желательным увеличение активности по отношению к длинноцепочечным (C₁₆-C₂₀)триглицеридам, и может оказаться желательным увеличение специфичности к длинноцепочечным жирным кислотам путем снижения отношения активности, направленной на короткоцепочечные или среднецепочечные (С₄-С₈)жирные кислоты, к активности, направленной на длинноцепочечные жирные кислоты.

Увеличение липазной активности в отношении короткоцепочечных или среднецепочечных (С₄-С₈)триглицеридов может оказаться желательным для использования в целях формирования запаха в пищевых продуктах (например, при созревании сыра).

При использовании в качестве фосфолипаз для очистки растительного масла может оказаться желательным снижение отношения липазной активности, направленной на длинноцепочечные (C₁₆-C₂₀)триглицериды, к фосфолипазной активности.

Исходный липолитический фермент

Липолитическим ферментом, используемым в настоящем изобретении, является фермент, который может гидролизовать сложноэфирные связи. Такими ферментами являются, например, липазы, такие как триацилглицеринлипаза (ЕС 3.1.1.3), липопротеинлипаза (ЕС 3.1.1.34), моноглицеридлипаза (ЕС 3.1.1.23), лизофосфолипаза, (феруловая кислота)-эстераза и эстераза (ЕС 3.1.1.1, ЕС 3.1.1.2). Цифры в скобках означают систематические номера, присвоенные Комиссией по ферментам Международного биохимического союза в соответствии с типом ферментативной реакционной способности данного фермента.

Исходный липолитический фермент может быть прокариотическим, а в частности, бактериальным ферментом, например, происходящим от Pseudomonas. Примерами являются липазы Pseudomonas, например P.cepacia (патент США № 5290694, pdb file 10IL), P.glumae (N.Frenken et al. (1992), Appl. Envir. Microbiol. 58 3787-3791, pdb files 1TAH and 1QGE), P.pseudoalcaligenes (EP 334462) и штамм SD705 вида Pseudomonas sp. (FERM BP-4772) (WO 95/06720, EP 721981, WO 96/27002, EP 812910). Последовательность липазы P.glumae идентична аминокислотной последовательности Chromobacterium viscosum (DE 3908131 A1). Другими примерами являются бактериальные кутиназы, происходящие, например, от Pseudomonas, таких как P.mendocina (US 5389536) или P.putida (WO 88/09367).

Альтернативно, исходным липолитическим ферментом может быть эукариотический, например, липолитический фермент грибов, такой как липолитические ферменты семейства Humicola и семейства Zygomycetes и кутиназы грибов.

Примерами кутиназ грибов являются кутиназы Fusarium solani pisi (S. Longhi et al., Journal of Molecular Biology, 268 (4), 779-799 (1997)) и Humicola insolens (США 5827719).

Семейство липолитических ферментов, происходящих от Humicola, состоит из липазы штамма DSM 4109 Н.lanuginosa и липаз, имеющих более чем 50%-ную гомологию с указанной липазой. Липаза Н.lanuginosa (синоним Thermomyces lanuginosus) описана в ЕР 258068 и ЕР 305216 и имеет аминокислотную последовательность, показанную в положениях 1-269 SEQ ID NO: 2 в патенте США 5869438.

Семейство Humicola также включает следующие липолитические ферменты: липазу от Penicillinum camembertii (P25234), липазу/фосфолипазу от Fusarium oxysporum (EP 130064, WO 98/26057), липазу от F.heterosporum (R87979), лизофосфолипазу от Aspergillus foetidus (W33009), фосфолипазу Al от А.oryzae (JP-A 10-155493), липазу от A.oryzae (D85895), липазу/(феруловая кислота)-эстеразу от A.niger (Y09330), липазу/(феруловая кислота)-эстеразу от A.tubingensis (Y09331), липазу от A.tubingensis (WO 98/45453), лизофосфолипазу от A.niger (WO 98/31790), липазу от F.solanii, имеющую изоэлектрическую точку 6,9 и очевидно молекулярную массу 30 кДа (WO 96/18729).

Семейство Zygomycetes включает липазы, имеющие, по крайней мере, 50% гомологию с липазой Rhizomucor miehei (Р19515). Это семейство также включает липазы от Absidia reflexa, A.sporofhora, A.corymbifera, A.blakesleeana, A.griseola (все они описаны в WO 96/13578 и WO 97/27276) и Rhizopus oryzae (P21811). Цифры в скобках указывают на публикацию или номер доступа к базам данных EMBL, GenBank, GeneSeqp или Swiss-Prot.

Особый интерес представляет получение варианта с фосфолипазной активностью из исходного липолитического фермента, не обладающего или обладающего очень незначительной фосфолипазной активностью, например, соответствующей отношению фосфолипазной активности к липазной активности, равному менее 0,1 PHLU/LU или менее 50 PHLU/мг.

Модификация, созданная возле спирт-связывающего сайта

Как было уже установлено, аминокислотная последовательность исходного липолитического фермента может быть модифицирована в положении, которое находится возле глицериновой части триглицеридного субстрата. Эта область будет далее называться "спирт-связывающим участком" липазы, и она описана в Brzozowski A.M. et al., Nature, 351: 491 (1991); Uppenberg et al., Biochemistry, 1995, 34, 16838-16851; A. Svendsen, Inform, 5(5), 619-623 (1994).

Для липазы Rhizomucor miehei протяженность спирт-связывающего сайта может быть определена из файла PDB "5tgl.pdb", доступного в "Структурной классификации белков" (SCOP) в Интернете, в сайте http://www.rcsb.org/pdb/, где показан комплекс с ингибиторным, этиловым сложным эфиром н-гексилфосфоновой кислоты, имитирующим субстрат. Он описан у Derewenda et al. (см. выше), Brzozowski et al. (см. выше) и Brady et al. (см. выше). Положением sn2 этой модели является атом СЕ2.

Указанный вариант обычно содержит не более 10 модификаций в спирт-связывающем сайте, например 1, 2, 3, 4, 5 или 6 модификаций.

Эта модификация может, в частности, находиться в той части спирт-связывающего сайта, которая входит в 20 положений (например, в 10 положений) С-конца.

Как указывалось выше, аминокислотная последовательность исходного липолитического фермента может быть модифицирована в положении, которое находится в пределах 10 (например, в пределах 8 , а в частности в пределах 6 ) от С-атома в положении sn2 глицериновой части триглицеридного субстрата. В липазе Rhizomucor miehei в пределах 10 от положения sn2 находятся следующие аминокислотные положения: 25, 28, 80-84, 88, 143-146, 175, 203, 205, 254-255, 257-259, 264-267. В пределах 8 находятся следующие аминокислотные положения: 81-83, 144, 257-258, 265-267, а в пределах 6 находятся следующие аминокислотные положения: 82, 144, 257, 266.

В липазе Humicola lanuginosa в пределах 10 от положения sn2 находятся следующие аминокислотные положения: 18, 21, 81-85, 89, 145-148, 172, 201, 203, 255-256, 258-260, 264-267. В пределах 8 находятся следующие аминокислотные положения: 82-84, 89, 146, 258-259, 265-267, а в пределах 6 находятся следующие аминокислотные положения: 83, 146, 258, 266.

Модификация возле каталитической триады

Как уже указывалось в одном из аспектов настоящего изобретения, исходный липолитический фермент имеет структуру, содержащую каталитическую триаду, состоящую из активного остатка Ser, активного остатка Asp и активного остатка His, a модифицируемая аминокислота принадлежит к набору, определенному конкретным способом, описанным выше. Данная структура может быть открытой или замкнутой структурой, и она может включать, а может и не включать субстрат или ингибитор.

Эту процедуру обычно проводят с использованием программного обеспечения, такого как MSI's Insight II. Она предусматривает сопоставление с 4TGL, кристаллической структурой липазы от Rhizomucor miehei, обратимо ингибируемой диэтил-п-нитрофенилфосфатом. Эта структура доступна в "Структурной классификации белков" (SCOP) в Интернете, в сайте http://www.rcsb.org/pdb/, и описана у Derewenda et аl. (см.выше). Липаза от Rhizomucor miehei включает каталитическую триаду, состоящую из аминокислотных остатков S144, D203 и Н257.

Для липазы Humicola lanuginosa, может быть использована структура 1tib; она доступна в "Структурной классификации белков" (SCOP) в Интернете. С использованием этой структуры набор, определенный с помощью указанной процедуры, включает следующие положения: 10-23, 26, 40, 55-64, 80-87, 116-117, 119, 145-149, 151, 168, 170, 194, 196-201, 220-222, 224-227 и 254-269.

Модификация между С-концом и активным остатком His

Как указывалось выше, одна или несколько модификаций в аминокислотной последовательности могут быть созданы между активным остатком His и концом, а в частности, в 12-ти аминокислотах со стороны С-конца от активного остатка His.

Липаза Humicola lanuginosa имеет активный His в Н258 и С-концевой остаток в L269, так что эта область включает положения 259-269. Липаза P.cepacia имеет активный остаток в Н286 и С-концевой остаток в 297, так что эта область включает остатки 287-297.

Модификация возле С-конца

Как указывалось выше, одна или несколько модификаций могут быть сделаны в 10 аминокислотных положениях от С-конца зрелого белка или в положениях, соответствующих указанным положениям в липазе Н.lanuginosa, то есть в положениях 260-269 липазы H.lanuginosa. Соответствующие положения могут быть обнаружены путем сопоставления двух последовательностей, как описано далее в настоящей заявке.

Вариант липолитического фермента может быть усечен путем делеции аминокислотных остатков, соответствующих первым положениям 1, 2, 3, 4, 5 или 6 у С-конца. Усеченный вариант может иметь улучшенную термостабильность.

Альтернативно, данный вариант может иметь пептидное удлинение у С-конца и/или у N-конца. С-концевое удлинение может состоять из 1-10 аминокислотных остатков, например А, Р, AG, DG, PG, AGG, PVGF, AGRF, PRGF, AGGF или AGGFS; либо оно может состоять из 40-50 остатков, например из 48 С-концевых остатков AGGFSWRRYRSAESVDKRATMTDAELEKKLNSYVQMDKEYVKNNQARS липазы Fusarium oxysporum. С-концевое удлинение может повышать фосфолипазную активность.

Ниже описаны некоторые модификации в области, перекрывающейся со спирт-связывающим участком.

Конкретной модификацией является замена в положении, соответствующем G266 в липазе Humicola lanuginosa, в частности, на аминокислоту промежуточного размера, например А, С, D, N, L, I, S, Т, Р или V. Было обнаружено, что одной такой модификации достаточно для повышения фосфолипазной активности.

Другими конкретными модификациями являются такие модификации, которые изменяют третичную структуру, например, путем введения объемных боковых цепей или путем разрушения углов связи, например путем введения Pro. Такие модификации могут быть введены в положения, соответствующие положениям G263, L264, I265, Т267 или L269 в липазе Humicola lanuginosa. Некоторыми конкретными заменами являются G263A, Е, Q, R; L264A, С, Р, Q; I265L, N, Т; Т267А, Q, или L269N.

Модификация в "крышке"

Как было уже установлено выше, аминокислотная последовательность исходного липолитического фермента может быть модифицирована в области "крышки" исходного липолитического фермента. Эта область описана Brady et al., Nature 343, 1990, pp. 767-770 и Brzozowski A.M. et al., Nature, 351: 491 (1991). В липазе Humicola lanuginosa "крышка" расположена в положениях 80-100, и указанная модификация может быть введена в положения 82-98, например 91-98.

Этот вариант обычно содержит не более 5 модификаций в области "крышки"; он может содержать 0, 1, 2 или 3 модификации. Конкретной модификацией является замена аминокислоты, соответствующей G91, L93, N94, D96, К98, L97 и/или Е99 в липазе Humicola lanuginosa на нейтральную или положительно заряженную аминокислоту, например замена, соответствующая G91A,T, L93K, N94D, D96S,W,G, L97Q, K98D,F,E и/или E99K,D.

В частности, вариант с модификацией в области "крышки" также содержит одну или несколько модификаций возле каталитической триады, возле субстрат-связываюшего сайта или возле С-конца.

Варианты липолитического фермента

Вариант липолитического фермента настоящего изобретения содержит одну или несколько модификаций аминокислотного остатка в любой из областей, описанных выше. Каждая модификация может представлять собой делецию или замену аминокислотного остатка, либо она может представлять собой инсерцию перед данным аминокислотным остатком или после него. Если данный аминокислотный остаток находится у С-конца, то указанная инсерция может представлять собой С-концевое удлинение. Инсерция обычно состоит из 1-5 аминокислотных остатков, например 1-2 аминокислотных остатка, а С-концевое удлинение может состоять из 1-50 или 2-10 аминокислотных остатков.

Общее число модификаций в вышеуказанных областях обычно не превышает 20, например не превышает 10 или не превышает 5, и может составлять не более 1 или 2 модификаций в вышеуказанных областях.

Кроме того, указанный вариант липолитического фермента настоящего изобретения может, но необязательно, включать другие модификации исходного фермента, обычно не более 10, например не более 5 таких модификаций.

Указанный вариант обычно имеет гомологию с исходным липолитическим ферментом, составляющую, по крайней мере, 80%, например, по крайней мере, 85%, а обычно, по крайней мере, 90%, или по крайней мере, 95%.

Вариант настоящего изобретения может, кроме того, содержать пептидное удлинение у N-конца, например, состоящее из 1-15 (в частности, 4-10) аминокислотных остатков, а в частности, содержащих 1, 2 или 3 положительно заряженных аминокислоты. Некоторыми конкретными N-концевыми пептидными удлинениями являются AS, SPIRR, E1RP, E1SPIRPRP, E1SPPRRP и E1SPIRPRP. Кроме того, может быть использовано любое пептидное удлинение, описанное в WO 97/04079 и WO 97/07202.

Конкретные варианты

Для получения вариантов липолитического фермента, происходящего от семейства Humicola, могут быть, в частности, созданы модификации в положениях, соответствующих 20-25, 56-64, 81-85 или 255-269 в липазе Humicola lanuginosa. Так, например, такой модификацией может быть замена, делеция или инсерция в положении, соответствующем А20, Y21, G23, К24, N25, V63, R81, G82, R84, А257, W260, Y261, F262 или G266 (например, исключая G23C, К24С, R81C), замена аминокислоты в положении, соответствующем С268 или L269.

Некоторыми конкретными модификациями являются замены, соответствующие нижеследующим положениям в липазе Н. lanuginosa:

Y21V/I/L/A/G/M/W/P/F/N/Q/S/T, V60V/I/L/A/G/M/W/P/F/N/Q/S/T, G61V/I/L/A/G/M/W/P/F/N/Q/S/T, D62E/A/V, S83T, R84K/L/W, Р256А, G263E,Q,R,F, L264A,С,Р,F,G,I, I265L,N,F, G266D/E или T267A,Q,P,S,E, или вставка, соответствующая T267GS или T267GL.

Для изменения активности по отношению к короткоцепочечным (C₄-C₈)жирным кислотам в триглицеридах могут быть сделаны модификации в положениях, соответствующих Y21, Е56, D57, V60, G61, D62, R81, S83, R84, L259, Y261 или G266, например, замена, соответствующая Y21V/I, V60G, D62E/A/V, S83T, R84K/L/W или G266D/E.

Для повышения активности ДГДГ могут быть сделаны модификации в положениях, соответствующих Y21, G23, N26, D57, D62, R81, S83, R84, S85, G266, Т267 или L269; например, могут быть сделаны две или несколько таких модификаций, например, вместе с одной или несколькими модификациями в области "крышки". Для повышения фосфолипазной активности могут быть сделаны модификации в положениях, соответствующих R81, R84, S85 или 263-267, например G266 или Т267.

Для получения вариантов липазы Pseudomonas могут быть сделаны аминокислотные модификации в положениях, соответствующих 12-13, 16-34, 45-52, 59-66, 68, 86-87, 107-109, 111, 143-153, 155, 157-158, 207-212, 228, 230, 242-249, 264, 279-280, 282-297, 301-302, 304-305, 307-308 в липазе P.cepacia, а в частности, L17/L17, Т18/А18, Y29/Y29, L287/L286, Е289/Е288, I290/I289, Q292/Q291 или L293/L292 в липазе Р.cepacia/P.glumae.

Конкретные варианты липазы Н.lanuginosa описаны в примерах. Соответствующие модификации могут быть сделаны в других исходных липолитических ферментах. Из них могут быть получены другие варианты путем исключения аминокислотных модификаций в положениях 1, 106, 186, 225, 232, 237, 239 или 274. Варианты с 274S могут, но не обязательно, иметь дополнительное С-концевое удлинение WRRYRSAESVDKRATMTDAELEKKLNSYVQMDKEYVKNNQARS (соответствующее С-концу липазы F.oxysporum) в полной или усеченной форме.

Номенклатура для аминокислотных модификаций

Используемая здесь номенклатура для определения мутаций является, в основном, такой, как она была описана в WO 92/05249. Так, например, G91A означает замену G в положении 91 на A. T267A,Q означает замену Т в положении 267 на А или Q. E1E,D,A означает, что Е1 остается неизмененным или замену на D или А.

T267stop означает стоп-кодон, т.е. делецию Т267 и всех последующих аминокислот (то есть С268 и L269). 270Р, 271V означают С-концевое удлинение PV (то есть в новых положениях 270 и 271). -G266 обозначает делецию G в положении 266. Скобки указывают на то, что эта модификация является необязательной или, например, что данная модификация является неточной. SPIRR означает N-концевое удлинение. D266 может означать положение или замену на любую аминокислоту (за исключением D).

E1SPPCGRRP или SPPCGRRP (-Е) означают замену Е1 на SPPCGRRP, то есть присоединение пептида к N-концу. T267GS означает замену Т267 на GS или, другими словами, замену T267G и инсерцию S между G267 и С268.

Гомология и сопоставление

В целях настоящего изобретения степень гомологии может быть соответствующим образом определена с помощью известных компьютерных программ, таких как программа GAP, имеющаяся в программном пакете GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. & Wunsch C.D.(1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45), где программа GAP предусматривает нижеследующую установку параметров для сравнения полипептидных последовательностей: введения "штрафа на брешь-пропуск" 3,0 и "штрафа на брешь-удлинение" 0,1.

В настоящем изобретении соответствующие (или гомологичные) положения в липазных последовательностях Rhizomucor miehei (rhiml), Rhizopus delemar (rhidi), Thermomyces lanuginosa (первая; Humicola lanuginosa) (SP400), Penicillium camembertii (Pcl) и Fusarium oxysporum (FoLnp11) определены путем сопоставления, показанного на чертеже.

Для обнаружения гомологичных положений в липазных последовательностях, не показанных в сопоставительном анализе, нужную последовательность сравнивают с первичными последовательностями, показанными на чертеже. Новую последовательность сравнивают в соответствии с сопоставлением, показанным на чертеже, с использованием GAP-сопоставления для большей части гомологичной последовательности, найденной с помощью программы GAP. GAP имеется в программном пакете GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. & Wunsch C.D. (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45). Программа GAP предусматривает нижеследующую установку параметров для сравнения полипептидных последовательностей: введения "штрафа на брешь-пропуск" 3,0 и "штрафа на брешь-удлинение" 0,1.

Варианты с фосфолипазной активностью

Как описано выше, вариант настоящего изобретения может иметь более высокую фосфолипазную активность, чем исходный липолитический фермент. Благодаря методу с использованием монослоя, описанному ниже в данной заявке, этот вариант может иметь фосфолипазную активность, составляющую, по крайней мере, 0,1 нмоль/мин при рН 5.

Благодаря PHLU-методу, описанному ниже в данной заявке, этот вариант может иметь фосфолипазную активность, составляющую, по крайней мере, 100 PHLU/мг (мг чистого ферментного белка), а в частности, по крайней мере, 500 PHLU/мг. Этот вариант имеет отношение фосфолипазной активности к липазной активности (обе активности измерены при рН 7), составляющее, по крайней мере, 0,1 PHLU/LU, например, по крайней мере, 0,5, а в частности, по крайней мере, 2.

Варианты настоящего изобретения могут обладать способностью гидролизовать интактный фосфолипид, как было продемонстрировано с помощью PHLU-метода. Они могут обладать A₁- и/или А₂-активностью, а поэтому они могут обладать способностью гидролизовать одну или обе ацильные группы жирных кислот в фосфолипиде.

Оптимальный рН

Многие варианты липазы Humicola lanuginosa имеют щелочной рН, оптимальный для липазной активности, и кислотный рН, оптимальный для фосфолипазной активности (например, рН 9-10 для липазы и рН 4-6 для фосфолипазы). Такие варианты могут быть использованы при кислотном рН (например, при рафинировании масла, описанном ниже) в качестве фосфолипаз с сопутствующей очень низкой липазной активностью.

Однако многие варианты липазы Humicola lanuginosa, которые включают замену G266D,E, имеют оптимальный рН как для липазной, так и для фосфолипазной активности, составляющий приблизительно рН 5-6. Такие варианты могут быть использованы при кислотном рН, в случае, когда желательны как липазная, так и фосфолипазная активность, например при выпечке хлеба.

Термостабильность

Термостабильность данного варианта может быть оценена стандартными методами дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). В зависимости от конкретных мутаций, варианты настоящего изобретения обычно имеют ту же самую или слегка пониженную термостабильность по сравнению с исходным липолитическим ферментом.

Температура на вершине пика денатурации (Т_d) липазы Humicola lanuginosa при ее нагревании при 90С/час и при рН 5 составляет чуть выше 70С (=T_d). Т_d для вариантов настоящего изобретения обычно на 5-10 градусов ниже.

Использование варианта

В зависимости от специфичности к субстрату, варианты настоящего изобретения могут быть использованы, например, для улучшения фильтрации, при обработке растительного масла, в хлебопекарном производстве, в моющих средствах или для получения лизофосфолипидов.

Улучшение фильтрации

Вариант с лизофосфолипазной активностью может быть использован для улучшения фильтруемости водного раствора или суспензии углеводного источника путем его обработки указанным вариантом. Этот метод может быть, в частности, применен к раствору или к суспензии, содержащей гидролизат крахмала, а в частности, гидролизат пшеничного крахмала, поскольку его фильтрация представляет определенные трудности и дает мутные фильтраты. Такая обработка может быть выполнена аналогично обработке, описанной в ЕР 219269 (Международный СРС).

Обработка растительного масла

Вариант с фосфолипазной активностью может быть использован в способе снижения содержания фосфолипида в пищевых маслах, предусматривающем обработку данного масла указанным вариантом для гидролиза большей части фосфолипида и отделение водной фазы, содержащей гидролизованный фосфолипид, от масла. Этот способ может быть применен для очистки любого пищевого масла, содержащего фосфолипид, например растительного масла, такого как соевое масло, рапсовое масло и подсолнечное масло. Эта обработка может быть осуществлена при кислотном рН, например рН 3-5. Конкретный вариант может быть, предпочтительно, выбран так, чтобы он имел высокую фосфолипазную активность и низкую липазную активность при низком рН, что обусловлено различием оптимальных рН для этих двух активностей.

Данный способ обработки масла может быть проведен в соответствии с методикой, известной специалистам, например по аналогии с методикой, описанной в патенте США 5264367 (Metallgesellschaft, ); K.Dahеke & H.Buchold, INFORM, 6(12), 1284-91 (1995); H.Buchold, Fat Sci. Technol., 95(8), 300-304 (1993); JP-A 2-153997 (Showa Sangyo) или ЕР 654527 (Metallgesellschaft, ).

Использование фосфолипазы в различных целях

Вариант с фосфолипазной активностью может быть использован для получения лизофосфолипида (например, лизолецитина) путем обработки соответствующего фосфолипида указанным вариантом, например, как описано в ЕР 870840, JP-A 10-42884, JP-А 4-135456 или JP-A 2-49593. Этот вариант может быть использован для получения майонеза, например, как описано в ЕР 628256, ЕР 398666 или ЕР 319064.

Вариант с фосфолипазной активностью может быть использован в приготовлении молочных и других пищевых продуктов, например, как описано в ЕР 567662 (Nestle), EP 426211 (Unilever), EP 166284 (Nestle), JP-A 57-189638 (Yakult) или US 4119564 (Unilever).

Данный вариант может быть использован при обработке кожи, как описано в JP-A 7-177884 (Као).

Выпечка хлеба

Вариант с фосфолипазной и/или ДГДГазной активностью может быть использован для приготовления теста, хлеба и пирожных, например для повышения стабильности теста и его пригодности для обработки, либо для улучшения эластичности хлеба или пирожного. Так, например, данный вариант может быть использован в способе приготовления хлеба, предусматривающем добавление указанного варианта в ингредиенты теста, замешивание теста и выпечки хлеба из этого теста. Данный способ может быть осуществлен по аналогии со способом, описанным в патенте США 4567046 (Kyowa Hakko), JP-A 60-78529 (QP Corp.), JP-A 62-111629 (QP Corp.), JP-A 63-258528 (QP Corp.), EP 426211 (Unilever) или в WO 99/53769 (Novo Nordisk).

Особенно предпочтительно использовать данный вариант вместе с эндоамилазой, препятствующей черствению, и также можно, но необязательно, добавлять фосфолипид для уменьшения черствения хлеба, а в частности, для увеличения мягкости хлеба в течение первых 24 часов после его выпечки. Эта эндоамилаза может представлять собой мальтозообразующую -амилазу (например, от Bacillus sp., такую как Novamyl® от Novo Nordisk), либо грибковую или бактериальную -амилазу, например, от Aspergillus или Bacillus, а в частности, А.oryzae, В.lichenformis или В.amyloliquefaciens.

При использовании в хлебопечении данный вариант может обладать низкой активностью по отношению к короткоцепочечным или среднецепочечным (С₄-С₈)жирным кислотам, например активностью, соответствующей отношению SLU/LU выше 3. Использование такого варианта позволяет предотвращать или подавлять возникновение нежелательного запаха, обусловленное высвобождением короткоцепочечных жирных кислот. Этот вариант может обладать активностью по отношению к триглицеридам и фосфолипиду, а также к ДГДГ.

Запах сыра

Вариант фермента с активностью, направленной на ацильные группы короткоцепочечных жирных кислот, может быть использован для высвобождения свободных жирных кислот (СЖК) в целях формирования определенного запаха в пищевых продуктах, например, при созревании сыра, например, как описано Hanson, ZFL, 41 (10), 664-666 (1990)).

Варианты липолитического фермента с повышенной способностью к высвобождению короткоцепочечных жирных кислот, в отличие от высвобождения длинноцепочечных жирных кислот из жирного молока, могут быть использованы при производстве сыра, например, для усиления запаха или для ускорения времени созревания для созревающих сыров, таких как чеддер или пармезан. Другим применением таких вариантов липолитического фермента является их использование для получения ферментативно модифицированного сыра (ЕМС) и в качестве отдушки для различных пищевых продуктов, включая сыры, заправки и легкие завтраки.

Высвобождение короткоцепочечных жирных кисл