Выделенный полинуклеотид, способный придавать растению устойчивость или толерантность к глифосатному гербициду, вектор, способ получения растений, толерантных или устойчивых к глифосатному гербициду, способ регенерации трансформированного растения и способ селективной борьбы с сорняками

Патент 2235778

Авторы

Классы МПК

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии рекомбинантных ДНК, необходимых для получения трансгенных растений, устойчивых или проявляющих значительную толерантность к гербицидам. Выделяют полинуклеотид, кодирующий хлоропластный сигнальный пептид и глифосат-устойчивую 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS) риса, расположенную по ходу транскрипции за участком, кодирующим хлоропластный сигнальный пептид. Экспрессия указанного участка находится под контролем растительного функционального промотора, который не явлется гетерологичным по отношению к указанному участку, и хлоропластный сигнальный пептид не является гетерологичным по отношению к указанной синтазе. Указанные компоненты находятся в последовательности по направлению 5’3’ транскрипции, с возможностью вариантов расположения энхансеров. Вместе с тем последовательность, кодирующая EPSPS риса, модифицирована таким образом, что по первому положению консервативного участка GNAGTAMRPLTAAV фермента дикого типа Thr заменен Ile, а по второму положению Pro заменен Ser, таким образом модифицированная последовательность представляет собой GNAGIAMRSLTAAV. Указанный полинуклеотид включают в векторную конструкцию, с помощью которой трансформируют растительный материал. Полученный трансформированный материал подвергают отбору и дальнейшей регенерации для получения целых растений, устойчивых или толерантных к глифосатному гербициду. Регенерация включает в себя получение ткани из растения, подлежащего трансформированию, помещение трансформированной указанным выше полинуклеотидом или вектором ткани на питательную среду, содержащую соединение для обеспечения возможности идентификации или отбора трансформированной регенерируемой ткани, перенос образовавшегося, по меньшей мере, одного побега во вторую среду, способствующую продуцированию корней, и выращивание указанного побега до стадии взрослого растения, способного к воспроизведению. Обрабатывают поле сельскохозяйственных трансгенных растений, засоренное сорняками, глифосатом в количестве, эффективном для борьбы с сорняками без существенного влияния на сельскохозяйственные растения. Изобретение позволяет снизить производственные затраты и повысить сбор сельскохозяйственной продукции. 5 н. и 9 з.п. ф-лы, 18 ил., 2 табл.

Настоящее изобретение касается технологии рекомбинантных ДНК и, в частности, получения трансгенных растений, которые проявляют существенную резистентность (невосприимчивость) или существенную устойчивость к гербицидам по сравнению с подобными нетрансгенными растениями. Также изобретение, помимо прочего, касается нуклеотидных последовательностей (и продуктов их экспрессии), которые используются в получении указанных трансгенных растений или вырабатываются ими.

Растения, которые по существу “устойчивы” к гербициду тогда, когда они подвергаются его воздействию, формируют кривую зависимости ответа от дозы, смещенную вправо в случае сравнения с той кривой, которую получают на подобных неустойчивых растениях, обработанных сходным образом. При построении таких кривых зависимости ответа от дозы на ось абсцисс наносят “дозу”, а на ось ординат наносят “долю уничтоженных растений”, “эффект действия гербицида” и т.д. Для устойчивых растений обычно должно требоваться вдвое больше гербицида по сравнению с подобными, не обладающими устойчивостью растениями с целью достижения данного эффекта действия гербицида. Растения, которые по существу “резистентны” к гербициду, проявляют незначительные некротические, литические, хлоротические или иные повреждения или не проявляют их вовсе, когда подвергаются действию гербицида при концентрации и интенсивности, которые обычно используют в сельскохозяйственной практике для уничтожения сорняков в полевых условиях, где культурные растения должны быть выращены в промышленных целях.

Особенно предпочтительным является то, что растения по существу резистентны или по существу устойчивы к гербицидам (здесь и далее “глифосат”), мишенью действия которых является 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтаза (здесь и далее “EPSPS”) и прекрасным примером которых является N-фосфонометилглицин (и различные его соли).

Гербицид может быть нанесен как до, так и после появления всходов в соответствии с обычными методами применения гербицидов на полях, на которых выращивают культуры, которые резистентны к гербициду. Настоящее изобретение, помимо прочего, представляет нуклеотидные последовательности, применимые для получения указанных растений, устойчивых или резистентных к гербициду.

В соответствии с настоящим изобретением представляется выделенный полинуклеотид, включающий последовательность, приведенную в SEQ ID No 43. Также изобретение представляет полинуклеотид, исключая кДНК, кодирующую EPSPS риса и кукурузы, который кодирует EPSPS и который комплементарен полинуклеотиду, который в случае инкубации при температуре 65-70°С в 0,1 конц. цитратном солевом буфере, содержащем 0,1% ДСН, с последующей промывкой при той же температуре в 0,1 конц. цитратном солевом буфере, содержащем 0,1% ДСН, гибридизирует с последовательностью, приведенной в SEQ ID No 43. Полинуклеотид по настоящему изобретению, кодирующий EPSPS, может, однако, быть получен путем скрининга библиотек геномной ДНК растений нуклеотидом, составляющим интрон в составе последовательности SEQ ID No 43, и изобретение также охватывает такую последовательность, полученную в указанном скрининге.

Также настоящее изобретение охватывает выделенный полинуклеотид, включающий сегмент, кодирующий хлоропластный сигнальный (транзитный) пептид и глифосат устойчивую 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS), при этом последний расположен по ходу транскрипции за сегментом, кодирующим хлоропластный сигнальный пептид, причем экспрессия указанного сегмента находится под контролем функционального растительного промотора, при условии, что указанный промотор является негетерологичным по отношению к указанному сегменту и что хлоропластный сигнальный пептид является негетерологичным по отношению к указанной синтазе.

Термин “гетерологичный” подразумевает происхождение от отличающегося источника, и, соответственно, “негетерологичный” означает происхождение от одного и того же источника, но на генном уровне, а не на уровне организма или ткани. Например, промотор CaMV35S очевидно гетерологичен по отношению к кодирующей последовательности EPSPS петунии, поскольку промотор происходит от вируса, а последовательность, экспрессию которой он контролирует, от растения. Однако термин “гетерологичный” в соответствии с настоящим изобретением имеет еще более узкое значение. Например, “гетерологичный”, упоминаемый в связи с настоящим изобретением, означает, что кодирующая последовательность EPSPS петунии “гетерологична” по отношению, например, к промотору, также происходящему от петунии, но экспрессию гена EPSPS. В этом смысле промотор петунии, происходящий от гена EPSPS петунии и затем используемый для контроля экспрессии кодирующей последовательности EPSPS, также происходящей от петунии, является “негетерологичным” по отношению к указанной кодирующей последовательности. Однако термин “негетерологичный” не означает того, что промотор и кодирующая последовательность обязательно должны быть получены из состава одного и того же (исходного или предкового) полинуклеотида. То же самое касается сигнальных пептидов. Например, хлоропластный сигнальный пептид Rubisco, происходящий от подсолнечника, “гетерологичен” по отношению к кодирующей последовательности гена EPSPS, также происходящего от подсолнечника (того же растения, ткани или клетки). Последовательность, кодирующая сигнальный пептид Rubisco, происходящая от подсолнечника, “негетерологична” по отношению к последовательности, кодирующей фермент Rubisco, также происходящей от подсолнечника, даже если исходные для обеих последовательностей полинуклеотиды являются разными и могут присутствовать в разных клетках, тканях или растениях подсолнечника.

Предпочтительная форма полинуклеотида включает следующие компоненты, перечисленные в направлении транскрипции 5’ 3’:

(i) по крайней мере один транскрипционный энхансер, являющийся энхансерным элементом, расположенным выше старт-сайта транскрипции в последовательности, от которой энхансер был получен, причем указанный энхансер сам по себе не функционирует в качестве промотора ни в последовательности, в которой он является эндогенным, ни в случае, когда он присутствует гетерологически как часть конструкции;

(ii) промотор гена EPSPS риса;

(iii) геномная последовательность риса, которая кодирует хлоропластный сигнальный пептид EPSPS риса;

(iv) геномная последовательность, которая кодирует EPSPS риса;

(v) терминатор транскрипции;

причем кодирующая последовательность EPSPS риса модифицирована таким образом, что первое положение мутировано так, что остатком в этом положении является Il вместо Thr, и второе положение мутировано так, что остатком в этом положении является Ser вместо Pro, причем мутации внесены в последовательности EPSPS, которые включают следующий консервативный сегмент GNAGTAMRPLTAAV в ферменте дикого типа, таким образом, что модифицированная последовательность читается как GNAGIAMRSLTAAV.

Энхансерный сегмент предпочтительно включает последовательность, 3’-конец которой находится по крайней мере на 40 нуклеотидов выше ближайшего старт-сайта транскрипции в последовательности, от которой энхансер получен. В следующем варианте полинуклеотида энхансерный сегмент включает сегмент, 3’-конец которого находится по крайней мере на 60 нуклеотидов выше указанного ближайшего старт-сайта, и еще в одном варианте полинуклеотида указанный энхансерный сегмент включает последовательность, 3’-конец которой находится по крайней мере на 10 нуклеотидов выше первого нуклеотида в консенсусном боксе ТАТА в последовательности, от которой энхансер получен.

Полинуклеотид в соответствии с настоящим изобретением может включать два или большее число транскрипционных энхансеров, которые в конкретном варианте полинуклеотида могут быть организованы тандемно (один за другим).

В заявляемом настоящим изобретением полинуклеотиде 3’-конец энхансера или первый энхансер, если их присутствует более одного, может находиться на расстоянии от примерно 100 до примерно 1000 нуклеотидов вверх от кодона, соответствующего старт-кодону трансляции сигнального пептида EPSPS, или первого нуклеотида интрона в 5’-нетранслируемом сегменте в случае, когда указанный сегмент включает интрон. В более предпочтительном варианте полинуклеотида 3’-конец энхансера или первый энхансер находится на расстоянии от примерно 150 до примерно 1000 нуклеотидов вверх от кодона, соответствующего старт-кодону трансляции сигнального пептида EPSPS, или первого нуклеотида интрона в 5’-нетранслируемом сегменте, и в еще более предпочтительном варианте 3’-конец энхансера или первый энхансер может находиться на расстоянии от примерно 300 до примерно 950 нуклеотидов вверх от кодона, соответствующего старт-кодону трансляции сигнального пептида EPSPS, или первого нуклеотида интрона в 5’-нетранслируемом сегменте. В еще более предпочтительном варианте 3’-конец энхансера или первый энхансер может находиться на расстоянии от примерно 770 до примерно 790 нуклеотидов вверх от кодона, соответствующего старт-кодону трансляции сигнального пептида EPSPS, или первого нуклеотида интрона в 5’-нетранслируемом сегменте.

В альтернативном заявляемом полинуклеотиде 3’-конец энхансера или первый энхансер может находиться на расстоянии от примерно 300 до примерно 380 нуклеотидов вверх от кодона, соответствующего старт-кодону трансляции сигнального пептида EPSPS, или от первого нуклеотида интрона в 5’-нетранслируемом сегменте, а в предпочтительном варианте указанного альтернативного полинуклеотида 3’-конец энхансера или первый энхансер расположен на расстоянии от примерно 320 до примерно 350 нуклеотидов вверх от кодона, соответствующего старт-кодону трансляции сигнального пептида EPSPS или первого нуклеотида интрона в 5’-нетранслируемом сегменте.

В полинуклеотиде по настоящему изобретению сегмент вверх от промотора гена EPSPS может включать по крайней мере один энхансер, происходящий из последовательности, которая находится выше старт-сайта транскрипции в промоторах CaMV35S или FMV35S.

Следовательно, полинуклеотид может включать в направлении 5’ 3’ первый энхансер, включающий сегмент энхансера транскрипции, происходящий от последовательности, которая находится выше старт-сайта транскрипции промотора GOS-2, и второй энхансер, включающий сегмент энхансера транскрипции, происходящий от последовательности, которая расположена выше старт-сайта транскрипции промоторов CaMV35S или FMV35S.

Альтернативно, полинуклеотид может включать в направлении 5’ 3’ первый энхансер, включающий сегмент энхансера транскрипции, происходящий от последовательности, которая находится выше старт-сайта транскрипции промотора гена актина риса, и второй энхансер, включающий сегмент энхансера транскрипции, происходящий от последовательности, которая расположена выше старт-сайта транскрипции промоторов CaMV35S или FMV35S.

Альтернативно, полинуклеотид может включать в направлении 5’ 3’ первый энхансер, включающий сегмент энхансера транскрипции, происходящий от последовательности, которая находится выше старт-сайта транскрипции промотора гена пластоцианина ячменя, и второй энхансер, включающий сегмент энхансера транскрипции, происходящий от последовательности, которая расположена выше старт-сайта транскрипции промоторов CaMV35S или FMV35S.

Альтернативно, полинуклеотид может включать в направлении 5’ 3’ первый энхансер, включающий сегмент энхансера транскрипции, происходящий от последовательности, которая находится выше старт-сайта транскрипции промотора гена полиубихитина кукурузы, и второй энхансер, включающий сегмент энхансера транскрипции, происходящий от последовательности, которая расположена выше старт-сайта транскрипции промоторов CaMV35S или FMV35S.

Альтернативно, полинуклеотид может включать в направлении 5’ 3’ первый энхансер, включающий сегмент энхансера транскрипции, происходящий от последовательности, которая находится выше старт-сайта транскрипции промотора FMV35S, и второй энхансер, включающий сегмент энхансера транскрипции, происходящий от последовательности, которая расположена выше старт-сайта транскрипции промотора CaMV35S.

При любых идентичности и взаиморасположении различных энхансеров в составе полинуклеотида нуклеотиды с 5’-конца от кодона, который составляет старт-кодон трансляции хлоропластного сигнального пептида EPSPS риса, могут быть выбраны по Козаку. То, что это означает, хорошо известно специалистам в данной области техники и дополнительно станет понятным из приводимых далее примеров.

В частности, в предпочтительных вариантах настоящего изобретения полинуклеотид включает нетранслируемый сегмент, который включает последовательность, которая выполняет функции интрона, расположенного с 5’-конца от геномной последовательности риса, которая кодирует хлоропластный сигнальный пептид EPSPS риса. Нетранслируемый сегмент может включать последовательность, приведенную в SEQ ID No 55. В частности, нетранслируемый сегмент может включать интрон гена ADHI кукурузы, характеризующийся последовательностью SEQ ID No 55.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может включать происходящий от вируса трансляционный энхансер, находящийся в пределах нетранслируемого сегмента 5’-конца от геномной последовательности риса, которая кодирует хлоропластный сигнальный пептид EPSPS риса. Специалистам в данной области техники известны индивидуальные свойства таких подходящих трансляционных энхансеров - таких как последовательности Omega и Omega-prime, происходящие от TMV, и те, которые происходят от вируса гравировки табака, а также известно, как такие трансляционные энхансеры могут быть внесены в полинуклеотид так, чтобы обеспечить желательный результат.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может дополнительно включать сегменты, кодирующие белки, способные обеспечивать содержащему их растительному материалу по крайней мере один из следующих агрономически-полезных признаков: резистентность к насекомым, грибкам, вирусам, бактериям, нематодам, стрессам, обезвоживанию и гербицидам. При том, что такой полинуклеотид предусматривает иной ген, обеспечивающий резистентность к гербицидам, нежели ген EPSPS, такой как, например, ген глифосатоксидоредуктазы (GOX), гербицид может и не являться глифосатом, причем в этом случае гены, обеспечивающие резистентность, могут быть выбраны из группы генов, кодирующих следующие белки: фосфинотрицин-ацетилтрансфераза (PAT), гидроксифенилпируватдиоксигеназа (HPPD), глутатион-S-трансфераза (GST), цитохром Р-450, ацетил-КоА-карбоксилаза (АККаза), ацетолактатсинтаза (ALS), протопорфириногеноксидаза (РРО), дигидроптероатсинтаза, белки-переносчики полиаминов, супероксиддисмутаза (SOD), бромоксинилнитрилаза, фитоендесатураза (PDS), продукт гена tfdA, выделенного из Alcaligenes eutrophus, и известные мутированные или по-иному модифицированные варианты указанных белков. В случае, когда полинуклеотид обеспечивает множественную гербицидную резистентность, такие гербициды могут быть выбраны из группы, которая включает динитроанилиновый гербицид, триазолопиримидины, урацил, фенилмочевину, трикетон, изоксазол, ацетанилид, оксадиазол, триазинон, сульфонанилид, амид, анилид, RP201772, фторхлоридон, норфлуразон и гербицид триазолинонового типа, а гербициды, применяемые после появления всходов, выбирают из группы, которая включает глифосат и его соли, глуфозинат, асулам, бентазон, биалафос, бромацил, сетоксидим или иной циклогександион, дикамба, фозамин, флупоксам, феноксипропионат, квизалофоп или иной арилоксифеноксипропаноат, пиклорам, флуорметрон, атразин или иной триазин, метрибуцин, хлоримурон, хлорсульфурон, флуметсулам, галосульфурон, сульфометрон, имазахин, имазетапир, изоксабен, имазамокс, метосулам, пиритробак, римсульфурон, бенсульфурон, никосульфурон, фомесафен, флурогликофен, KIH9201, ЕТ751, карфентразон, ZA1296, сулькотрион, паракват, дикват, бромоксинил и феноксапроп.

В случае, когда полинуклеотид включает последовательности, кодирующие инсектицидные белки, такие белки могут быть выбраны из группы, которая включает кристаллические токсины, происходящие от Bacillus thuringiensis (Bt), включая секретируемые Bt-токсины; протеазные ингибиторы, лектины, токсины Xenorhabdus/Photorhabdus; гены, обеспечивающие резистентность к грибкам, могут быть выбраны из группы, которая включает гены, кодирующие известные AFP, дефензины, хитиназы, глюканазы, Avr-Cf9. В частности, предпочтительными инсектицидными белками являются cryIAc, cryIAb, сrу3А, Vip-1A, Vip-1B, ингибиторы цистеиновых протеаз и лектин подснежника. В случае, когда полинуклеотид включает гены, обеспечивающие резистентность к бактериям, такие гены могут быть выбраны из группы, которая включает гены, кодирующие цекропины и техиплезин и их аналоги. Гены, обеспечивающие резистентность к вирусам, могут быть выбраны из группы, которая включает гены, кодирующие вирусные капсидные белки, двигательные белки, вирусные репликазы и антисмысловые и рибозимные последовательности, для которых известно обеспечение резистентности к вирусам; кроме того, гены, обеспечивающие резистентность к стрессам, засолению и обезвоживанию, могут быть выбраны из генов, кодирующих глутатион-S-трансферазу и пероксидазу, последовательности которых включают известную регуляторную последовательность CBF1, и генов, для которых известно участие в накоплении трегалозы.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может быть модифицирован с целью усиления экспрессии кодирующих белок последовательностей таким образом, что мотивы, приводящие к нестабильности мРНК, и/или случайные сайты сплайсинга могут быть удалены, или же предпочитаемые библиотекой кодонов данного растения кодоны могут быть использованы таким образом, что экспрессия модифицированного таким путем полинуклеотида в растении даст по существу такой же белок, обладающий по существу такими же активностью и функциями по сравнению с тем белком, который получают в результате экспрессии немодицифированного полинуклеотида в организме, для которого кодирующие белок сегменты немодифицированного полинуклеотида являются эндогенными. Степень идентичности между модифицированным полинуклеотидом и полинуклеотидом, являющимся эндогенным для указанного растения и кодирующего по существу такой же белок, может быть такой, чтобы предотвращать эффект взаимного подавления модифицированной и эндогенной последовательностей. В этом случае степень идентичности между последовательностями предпочтительно должна быть меньше, чем примерно 70%.

Далее настоящее изобретение охватывает биологический или трансформационный вектор, включающий заявляемый настоящим изобретением полинуклеотид. Следовательно, “вектор” означает, помимо прочего, одно из следующего: плазмиду, вирус, космиду или бактерию, трансформированную или трансфицированную таким образом, что она несет полинуклеотид.

Далее настоящее изобретение охватывает растительный материал, который был трансформирован указанным полинуклеотидом или вектором, а также такой трансформированный растительный материал, который был дополнительно трансформирован полинуклеотидом, включающим сегменты, которые кодируют белки, способные обеспечивать несущему их растительному материалу по крайней мере один из следующих агрономически-полезных признаков: резистентность к насекомым, грибкам, вирусам, бактериям, нематодам, стрессу, обезвоживанию и гербицидам.

Также настоящее изобретение охватывает морфологически нормальные фертильные цельные растения, которые были регенерированы из материала, представленного в предыдущем абзаце, образуемые на них семена и части потомства, которые несут полинуклеотид или вектор по настоящему изобретению, стабильно интегрированный в их геном и наследуемый по менделевскому типу.

Далее настоящее изобретение дополнительно охватывает морфологически нормальные фертильные цельные растения, несущие данный заявляемый полинуклеотид и которые получены в результате скрещивания растений, которые были регенерированы из материала, трансформированного данным заявляемым полинуклеотидом или вектором, а также растения, которые были трансформированы полинуклеотидом, включающим участки, которые кодируют белки, способные обеспечивать несущему их растительному материалу по крайней мере один из следующих агрономически-полезных признаков; резистентность к насекомым, грибкам, вирусам, бактериям, нематодам, стрессу, обезвоживанию и гербицидам, а также потомство получаемых в результате растений, их семена и части.

Растения по настоящему изобретению могут быть выбраны из группы, которая включает посевные культуры, фруктовые и овощные культуры, такие как брюква “canola”, подсолнечник, табак, сахарная свекла, хлопчатник, кукуруза, пшеница, ячмень, рис, сорго, помидор, манго, персик, яблоко, груша, земляника, банан, дыня, картофель, морковь, латук, капуста, лук, соя разных видов, сахарный тростник, горох, бобы, тополь, виноград, цитрусовые, люцерна, рожь, овес, дерновые и фуражные травы, лен и брюква, а также орехоносные растения, если только они уже не упоминались выше, а также их потомство, семена и части.

Особенно предпочтительными такими растениями являются кукуруза, соя, хлопчатник, сахарная свекла и брюква “canola”.

Далее настоящее изобретение представляет способ избирательной борьбы с сорняками в полевых условиях, причем на поле находятся сорняки и растения по настоящему изобретению или резистентное к гербициду их потомство, включающий нанесение на поле гербицида глифосатного типа в количестве, достаточном для борьбы с сорняками без существенного негативного влияния на культурные растения. В соответствии с данным способом один или большее число гербицидов, инсектицидов, фунгицидов, нематоцидов, бактериоцидов и антивирусных средств можно наносить на поле (и, соответственно, на растения, растущие на нем) как до, так и после применения глифосатного гербицида.

Далее изобретение предусматривает способ получения растений, которые по существу устойчивы или по существу резистентны к глифосатному гербициду, включающий следующие стадии:

(i) трансформацию растительного материала полинуклеогидом или вектором по настоящему изобретению;

(ii) отбор трансформированного таким путем материала; и

(iii) регенерацию отобранного таким путем материала в морфологически нормальные фертильные цельные растения.

Трансформация может включать внесение полинуклеотида в материал с помощью любого известного метода, в частности, с помощью: (i) биолистической бомбардировки материала частицами, покрытыми полинуклеотидом; (ii) прокалывания материала волокнами из карбида кремния, покрытыми раствором, содержащим полинуклеотид; или (iii) внесения полинуклеотида или вектора в Agrobacterium и совместного культивирования трансформированной таким образом Agrobacterium с растительным материалом, который тем самым трансформируется, с последующим регенерированием. Методы трансформации, отбора и регенерации растений, которые могут потребовать рутинной модификации по отношению к конкретным видам растений, хорошо известны специалистам. Трансформированный таким образом растительный материал может быть отобран по его резистентности к глифосату.

Далее настоящее изобретение представляет использование заявляемого здесь полинуклеотида или вектора в получении растительных тканей и/или морфологически нормальных фертильных цельных растений, которые по существу устойчивы или по существу резистентны к глифосатному гербициду.

Настоящее изобретение далее охватывает способ отбора биологического материала, трансформированного так, чтобы он экспрессировал интересующий ген, причем трансформированный материал несет полинуклеотид или вектор по настоящему изобретению и где данный отбор включает обработку трансформированного материала глифосатом или его солью с последующим отбором выживающего материала. Указанный материал может иметь растительное происхождение и может, в частности, происходить от однодольного растения, выбранного из группы, которая включает ячмень, пшеницу, кукурузу, рис, овес, рожь, сорго, ананас, сахарный тростник, банан, лук, спаржу и черемшу.

Кроме того, изобретение представляет способ регенерирования фертильного трансформированного растения, несущего чужеродную ДНК, включающий следующие стадии:

(a) получение способной к регенерации ткани от указанного растения, которое предстоит трансформировать;

(b) трансформацию указанной регенерируемой ткани указанной чужеродной ДНК, где указанная чужеродная ДНК включает селективную последовательность ДНК, где указанная последовательность функционирует в регенерируемой ткани в качестве селективного агента;

(c) по прошествии срока от одного дня до примерно 60 дней после стадии (b) помещение указанной регенерируемой ткани стадии (b) в среду, способную продуцировать побеги на указанной ткани, где указанная среда дополнительно содержит соединение, используемое для отбора регенерируемой ткани, несущей указанную селективную ДНК-последовательность, для обеспечения идентификации или отбора трансформированной регенерированной ткани;

(d) после того, как на отобранной ткани (с) сформировался по крайней мере один побег, перенос указанного побега во вторую среду, способную образовывать корни на указанном побеге с получением проростка, где вторая среда необязательно содержит указанное соединение; и

(e) выращивание указанного проростка в фертильное трансгенное растение, где чужеродная ДНК передается растениям-потомкам по менделевскому типу, характеризующееся тем, что чужеродная ДНК является или включающая селективную последовательность ДНК чужеродная ДНК включает полинуклеотид по настоящему изобретению, а указанное соединение является глифосатом или его солью. Растение может быть однодольным растением в соответствии с указанным выше: более предпочтительно выбранным из банана, пшеницы, риса, кукурузы и ячменя, а указанная регенерируемая ткань может включать эмбриогенные каллюсы, соматические зародыши, недоразвитые зародыши и т.п.

Далее настоящее изобретение дополнительно будет очевидно из нижеследующего описания, совместно с прилагающимися чертежами и списком последовательностей.

Список последовательностей

SEQ ID NO. 1-42 - праймеры для ПЦР.

SEQ ID NO. 43 - геномная последовательность EPSPS риса (от кодона ATG).

SEQ ID NO. 44 - геномная последовательность EPSPS риса, содержащая двойную мутацию.

SEQ ID NO. 45 - энхансер FMV.

SEQ ID NO. 46 - 1-й энхансер CaMV35S.

SEQ ID NO. 47 - 2-й энхансер CaMV35S.

SEQ ID NO. 48 - энхансер полиубихитина кукурузы.

SEQ ID NO. 49 - энхансер актина риса.

SEQ ID NO. 50 - энхансер GOS2 риса.

SEQ ID NO. 51 - энхансер пластоцианина ячменя.

SEQ ID NO. 52 - промотор EPSPS риса G1 + 5’ “верхний” конец.

SEQ ID NO. 53 - промотор EPSPS риса G3 + 5’ “верхний” конец.

SEQ ID NO. 54 - промотор EPSPS риса G2 + интрон Adhl в составе 5’ “верхнего” конца.

SEQ ID NO. 55 - интрон Adhl кукурузы.

Список чертежей

Фиг.1 - схематическая геномная карта EPSPS риса.

Фиг.2 - вектор pCR4-OSEPSPS (ген dmEPSPS риса в векторе pCR4-Blunt).

Фиг.3 - схематическое изображение стратегии, использованной для внесения двойной мутации.

Фиг.4 - вектор pTCV1001.

Фиг.5 - вектор pTCV1001OSEPSPS (включает ген dmEPSPS риса в векторе pTCV1001).

Фиг.6 - вектор pTCV1001EPSPSPAC (включает ген dmEPSPS риса в векторе pTCV1001).

Фиг.7 - вектор pBluSK + EPSPS (включает ген dmEPSPS риса в векторе pBluescript SK+).

Фиг.8 - вектор pPAC1.

Фиг.9 - вектор pTCVEPSPSPH.

Фиг.10 - вектор pTCVEPSPSADH.

Фиг.11 - вектор pBluSKEPSPSADH (включает ген dmEPSPS риса и интрон Adh1).

Фиг.12 - вектор pIGPD9.

Фиг.13 - вектор Zen-9.

Фиг.14 - вектор Zen-12.

Фиг.15 - вектор Zen-18.

Фиг.16 - внесение векторов Zen в супербифункциональные векторы.

Получение растений, устойчивых к обработке глифосатом за счет сверхэкспрессии мутантного EPSPS под контролем негетерологичного промотора

Термин “энхансер” в соответствии с использованием его в данной заявке обозначает те последовательности, расположенные выше промотора, которые сами не включают промотор, но действие которых проявляется в усилении или регуляции инициации транскрипции с промотора. Термин “делеция промотора EPSPS” по использованию в данной заявке относится к промотору EPSPS наряду с нуклеотидами, отделяющими его от энхансера, являющегося нативным для гена EPSPS, - т.е. нуклеотидами, расположенными выше (т.е. с 5’-конца) данного промотора.

В отношении трансформации растительного материала для специалиста в данной области техники должно быть понятно, что, хотя конкретные типы материала-мишени (например, суспензионная культура зародышевых клеток или дедифференцированные недоразвитые зародыши) и конкретные способы трансформации (например, с использованием Agrobacterium или бомбардировки частицами) описаны далее в примерах, при этом настоящее изобретение не ограничено данными конкретными вариантами, и указанные материалы-мишени и способы можно использовать в разных сочетаниях. Более того, термин “растительные клетки” по использованию в данном описании может относиться к выделенным клеткам, включая суспензионные культуры, а также к клеткам в интактной или частично интактной ткани, такой как зародыш, щиток, микроспора, производный от микроспоры зародыш или соматические клетки растительных органов. Сходным образом, хотя конкретные примеры ограничиваются кукурузой, пшеницей и рисом, настоящее изобретение в равной степени применимо к любому из широкого круга сельскохозяйственных культур и домашних растений, которые могут быть трансформированы с помощью подходящих методов трансформации растительных клеток.

Базовые молекулярно-биологические методы осуществляют, как описано Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 nd Edn. Cold Spring Harbor Lab. Press.

Пример 1

Формирование кДНК-зонда для EPSPS риса

Неполную кДНК, кодирующую EPSPS риса, получают с использованием ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР). Общую РНК выделяют из двухнедельных растений риса (Oryza sakiva L. indica, сорт Koshihikari) с использованием метода TRI-ZOL (Life Technologies). Синтез первой цепи кДНК осуществляют с использованием обратной транскриптазы Superscript II (Life Technologies) с 200 нг вырожденного обратного праймера 10 для EPSPS (SEQ ID NO. 1) и 2 мкг общей РНК в соответствии с прилагаемым протоколом. Синтез второй цепи и амплификацию кДНК с помощью ПЦР проводят с использованием вырожденных праймеров 10 и 4 для EPSPS (SEQ ID NO. 1 и SEQ ID NO. 2) и ПЦР-шариков (Pharmacia) в соответствии с инструкциями изготовителя. Все буквенные коды соответствуют стандартным аббревиатурам (Eur. J. Biochem. (1985) 150:15).

SEQ ID NO. 1

Вырожденный обратный праймер 10 для EPSPS

Вырожденный прямой праймер 4 для EPSPS

SEQ ID NO. 2

Полученные продукты клонируют в состав вектора pCR2.1 (Invitrogen) с использованием набора ТА Cloning kit в соответствии с рекомендациями поставщика. Плазмиду выделяют из отобранных колоний и последовательность анализируют с помощью способа, включающего компьютерный анализ гомологии (BLAST), для подтверждения того, что продукт ОТ-ПЦР проявляет высокий уровень гомологии с известными последовательностями EPSPS растений.

Пример 2

Выделение геномной последовательности EPSPS риса и клонирование гена EPSPS риса

Участок геномной ДНК, включающий полноразмерный ген EPSPS риса и 5’-верхний конец, выделяют из геномной библиотеки -EMBLSP6/T7, сконструированной на материале 5-дневных этиолированных побегов риса [Оrуzа sativa L. indica, сорт IR36) (Clontech). 1 10⁶ бляшкообразующих единиц (БОЕ) подвергают скринингу с использованием ³²Р-меченого кДНК-зонда EPSPS риса (пример 1) с использованием протоколов, предоставляемых изготовителем. Позитивные бляшки подвергают последующим раундам гибридизационного скрининга до тех пор, как будет достигнута чистота на уровне перекрестно-гибридизующей бляшки. ДНК фага получают на материале маточного штамма фага в соответствии с методом, описанным у Sambrook et al., 1989. Полученную ДНК анализируют с помощью рестриктазного расщепления и Саузерн-блоттинга с использованием той же самой ³²Р-меченой кДНК EPSPS риса в качестве зонда. У рестрикционных фрагментов, которые перекрестно гибридизуют, затупляют концы с использованием такого метода, как Perfectly Blunt (Novagen), и их клонируют в состав подходящего вектора, такого как pSTBlue (Novagen). Затем ДНК секвенируют с использованием автоматического ДНК-секвенатора ABI 377A PRISM. На фиг.1 схематически показан ген EPSPS риса с рядом отмеченных рестрикционных сайтов.

Фрагмент гена EPSPS риса длиной 3,86 тысячи пар нуклеотидов (т.п.н.), включающий кодирующий сегмент, промотор EPSPS, часть 5’-верхнего конца и терминатор, получают с помощью ПЦР. Олигонуклеотидный праймер OSGRA1 (SEQ ID NO. 3) используют в сочетании с праймером OSEPSPS3 (SEQ ID NO. 4) для амплификации желаемого сегмента. OSEPSPS3 включает дополнительные рестрикционные сайты рестриктаз SacI и SmaI, предназначенные для облегчения субклонирования гена в ходе последующих стадий конструирования вектора. Расположение указанных праймеров схематически показано на фиг.1.

Высокоточную полимеразу Pfu Turbo (Stratagene) используют для осуществления реакции ПЦР с ДНК, полученной из -препарата (описано выше), в качестве амплификационной матрицы. ПЦР-продукт ожидаемого размера клонируют в состав pCRBlunt 4-TOPO (Invitrogen) и секвенируют для проверки целостности.

Пример 3

Мутация Т 1 и Р S в EPSPS риса

Мутацию Т 1 и Р S получают путем внесения двух точковых мутаций. Указанные мутации вносят в геномный ген EPSPS риса с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, включающих желательную мутацию. С