Последовательность днк, кодирующая полипептид, который связывается с mort-1 (варианты), полипептид (варианты) и способ его получения, вектор, способ модулирования действия лиганда fas-r или tnf на клетки (варианты), способ обработки клеток, способ выделения и идентификации белков, способ модулирования индуцируемого mort-1 действия или индуцируемого mort-1 связывающим белком действия на клетки

Последовательность днк, кодирующая полипептид, который связывается с mort-1 (варианты), полипептид (варианты) и способ его получения, вектор, способ модулирования действия лиганда fas-r или tnf на клетки (варианты), способ обработки клеток, способ выделения и идентификации белков, способ модулирования индуцируемого mort-1 действия или индуцируемого mort-1 связывающим белком действия на клетки

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и может быть использовано для модулирования действия лиганда FAS-R или TNF на клетки. Полипептид, способный связываться с MORT-1 и воздействовать на внутриклеточный процесс передачи сигнала, инициируемый связыванием FAS лиганда с его рецептором или связыванием TNF с р55-TNF-R, получают путем культивирования клеток, трансформированных вектором, содержащим ДНК, кодирующую полипептид. Модуляцию действия лиганда FAS-R или TNF на клетки или модуляцию индуцируемого MORT-1 действия осуществляют с помощью полипептида, связывающегося с MORT-1, или нуклеотидной последовательности, кодирующей его. Фармацевтическая композиция для модулирования действия лиганда FAS-R или TNF на клетки содержит полипептид, связывающийся с MORT-1. Изобретение позволяет разрабатывать средства для обработки опухолевых или ВИЧ-инфицированных клеток. 13 н. и 42 з.п. ф-лы, 37 ил., 4 табл.

Область изобретения

Данное изобретение относится в общем к области рецепторов, принадлежащих к суперсемейству рецепторов TNF/NGF, и регуляции их биологических функций. TNF/NGF-суперсемейство рецепторов включает в себя такие рецепторы, как р55- и р75-рецепторы фактора некроза опухолей (TNF-R, далее называемые p55-R и p75-R) и рецептор FAS-лиганда (также называемый FAS/APO1 или FAS-R и далее называемый FAS-R) и другие. Более конкретно, данное изобретение относится к новым белкам, которые связываются с белком MORT-1 (или FADD), и более конкретно, оно относится к одному такому MORT-1-связывающему белку, называемому здесь МАСН.

Таким образом, данное изобретение относится, в общем, к новым белкам, которые способны модулировать или медиировать функцию MORT-1 или других белков, которые прямо или опосредованно связываются с MORT-1. В частности, данное изобретение относится к МАСН, его получению и его применениям, а также к различным новым изоформам МАСН, их получению и применениям.

Предпосылки родственной области знаний

Фактор некроза опухолей (TNF-) и Лимфотоксин (TNF-) (далее TNF будет относиться как к TNF-, так и к TNF-) являются мультифункциональными про-воспалительными цитокинами, образуемыми в основном мононуклеарными фагоцитами, которые оказывают многие воздействия на клетки (Wallach, D. (1986) In: Interferon 7 (Ion Gresser, ed.), pp.83-122, Academic Press, London; и Beutler and Cerami (1987)). Как TNF-, так и TNF- инициируют их эффекты путем связывания со специфическими рецепторами поверхности клетки. Некоторые из этих эффектов являются, по-видимому, благоприятными для организма: например, они могут разрушать опухолевые клетки или инфицированные вирусом клетки и увеличивать антибактериальные активности гранулоцитов. Таким путем TNF способствует защите организма против опухолей и инфекционных агентов и содействует выздоровлению от повреждения. Таким образом, TNF может быть использован в качестве противоопухолевого агента, при использовании которого он связывается с его рецепторами на поверхности опухолевых клеток и тем самым инициирует события, приводящие к гибели опухолевых клеток. TNF может быть также использован в качестве антиинфекционного агента.

Однако как TNF-, так и TNF- оказывают также неблагоприятные воздействия. Имеется доказательство того, что сверхпродуцирование TNF- может играть основную патогенную роль в некоторых заболеваниях. Например, известно, что действия TNF-, первично на сосудистую сеть, являются главной причиной симптомов септического шока (Tracey et al., 1986). В некоторых заболеваниях TNF может вызывать потерю веса (кахексия) путем супрессии активности адипоцитов и индуцирования анорексии, и поэтому TNF- был назван кахетином. Он был описан также как медиатор повреждения тканей в ревматических заболеваниях (Beutler and Cerami, 1987) и как основной медиатор повреждения, наблюдаемого в реакциях трансплантат-против-хозяина (Piquet et al., 1987). Кроме того, известно, что TNF участвует в воспалительном процессе и во многих других заболеваниях.

Два различных, независимо экспрессируемых, рецептора, TNF-R р55 и р75, которые связывают специфически как TNF-, так и TNF-, инициируют и/или медиируют описанные выше биологические эффекты TNF. Эти два рецептора имеют структурно непохожие внутриклеточные домены, что позволяет предположить различную передачу ими сигнала (См. Hohmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990; Brockhaus et al., 1990; Leotscher et al., 1990; Schall et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al., 1990; Heller et al., 1990. Однако клеточные механизмы, например, различные белки и, возможно, другие факторы, которые участвуют во внутриклеточной передаче сигнала TNF-R р55 и р75, пока еще не выяснены. Именно эта внутриклеточная передача сигнала, которая происходит обычно после связывания этого лиганда, т. е. TNF ( или ), с рецептором, ответственна за начало каскада реакций, которые в конце концов приводят к наблюдаемому ответу клетки на TNF.

Что касается вышеупомянутого вызывающего гибель клеток действия TNF, в большинстве исследованных до сих пор клеток этот эффект запускается в основном TNF-R р55. Антитела против внеклеточного домена (лигандсвязывающего домена) TNF-R р55 могут сами запускать вызывающее гибель клеток действие (см. ЕР 412486), которое коррелирует с эффективностью перекрестного связывания рецептора этими антителами, что считают первой стадией в генерировании внутриклеточного процесса передачи сигнала. Далее, мутационные исследования (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993) показали, что биологическая функция TNF-R р55 зависит от целостности его внутриклеточного домена, и поэтому было сделано предположение, что инициация внутриклеточной передачи сигнала, приводящего к вызывающему гибель клеток действию TNF, происходит как следствие ассоциации двух или более внутриклеточных доменов TNF-R р55. Кроме того, TNF ( и ) встречается в виде гомотримера и предполагалось, что, как таковой, он индуцирует внутриклеточную передачу сигнала через TNF-R р55 через его способность связываться и перекрестно реагировать с рецепторными молекулами, т.е. вызывать агрегацию рецептора.

Другим членом суперсемейства TNF/NGF-рецепторов является FAS-рецептор (FAS-R), который называли также FAS-антигеном, белок клеточной поверхности, экспрессируемый в различных тканях и имеющий гомологию с рядом рецепторов клеточной поверхности, в том числе, с TNF-R и NGF-R. FAS-R медиирует гибель клетки в форме апоптоза (Itoh et al., 1991) и, по-видимому, служит в качестве негативного селектирующего агента аутореактивных Т-клеток, т.е. во время созревания Т-клеток FAS-R медиирует апоптопическую гибель Т-клеток, узнающих аутологичные антигены. Было также обнаружено, что мутации в гене FAS-R (lрr) вызывают нарушение лимфопролиферации у мышей, подобное аутоимунному заболеванию человека системной красной волчанке (SLE) (Watanabe-Fukunaga et al., 1992). Лиганд для FAS-R является, по-видимому, связанной с клеточной поверхностью молекулой, которую несут, среди прочих, киллерные Т-клетки (или цитотоксичные Т-лимфоциты - CTL), и, следовательно, когда такие CTL приходят в контакт с клетками, несущими FAS-R, они способны индуцировать апоптопическую гибель несущих FAS-R клеток. Далее, были получены антитела, которые являются специфическими для FAS-R, причем эти антитела способны индуцировать апоптопическую гибель несущих FAS-R клеток, в том числе, мышиных клеток, трансформированных кДНК, кодирующей FAS-R человека (Itoh et al., 1991).

Хотя некоторые цитотоксические эффекты лимфоцитов медиируются взаимодействием продуцируемого лимфоцитами лиганда с широко встречающимся рецептором клеточной поверхности FAS-R (CD95), который обладает способностью запускать гибель клеток, было также обнаружено, что различные другие нормальные клетки, кроме Т-лимфоцитов, экспрессируют FAS-R на их поверхности и могут быть убитыми запуском этого рецептора. Есть подозрение, что неконтролируемая индукция такого процесса убивания клеток способствует разрушению тканей в некоторых заболеваниях, например, деструкции клеток печени в случае острого гепатита. Поэтому нахождение путей сдерживания цитотоксической активности FAS-R может иметь терапевтический потенциал.

В противоположность этому, поскольку было также обнаружено, что некоторые злокачественные клетки и ВИЧ-инфицированные клетки несут на их поверхности FAS-R, антитела против FAS-R или лиганда FAS-R могут быть использованы для запуска медиируемых FAS-R цитотоксических эффектов в этих клетках и тем самым обеспечить средство борьбы с такими злокачественными клетками или ВИЧ-инфицированными клетками (см. Itoh et al., 1991). Нахождение других путей увеличения цитотоксической активности FAS-R может, следовательно, также иметь терапевтическую перспективу.

Уже давно ощущалась необходимость обеспечения пути модулирования клеточного ответа на TNF ( или ) и лиганд FAS-R. Например, в вышеупомянутых патологических ситуациях, где происходит сверхэкспрессия TNF или лиганда FAS-R, желательно ингибирование индуцируемых TNF или лигандом FAS-R вызывающих гибель клеток эффектов, хотя в других ситуациях, например, при использовании в заживлении ран, желательно усиление эффекта TNF, или в случае FAS-R, в опухолевых или ВИЧ-инфицированных клетках, желательно усиление опосредованного FAS-R эффекта.

Ряд подходов был предпринят лабораторией заявителей (см., например, European Application Nos. EP 186833, ЕР 308378, ЕР 398327 и ЕР 412486) для регуляции губительных эффектов TNF путем ингибирования связывания TNF с его рецепторами при помощи антител против TNF или при помощи растворимых рецепторов TNF (которые являются по существу растворимыми внеклеточными доменами этих рецепторов) для конкурирования за связывание TNF со связанными с клеточной поверхностью TNF-R. Далее, на основании того, что связывание TNF с его рецепторами является необходимым для индуцируемых TNF клеточных эффектов, лабораторией заявителей (см., например, ЕРО 568925) были предприняты подходы для модулирования этого эффекта TNF путем модулирования TNF-R.

Вкратце, ЕРО 568925 описывает способ модулирования передачи сигнала и/или расщепления TNF-R, в результате чего пептиды или другие молекулы могут взаимодействовать либо с самим рецептором, либо с эффекторными белками, взаимодействующими с рецептором, модулируя таким образом нормальную функцию TNF-R. В ЕРО 568925 описаны конструирование и характеристика различных мутантов рецепторов TNF, имеющих мутации во внеклеточных, трансмембранных и внутриклеточных доменах TNF-R р55. Таким путем, районы в указанных выше доменах TNF-R р55 были идентифицированы как существенные для функционирования этого рецептора, т.е., связывания лиганда (TNF) и последующей передачи сигнала и внутриклеточной передачи сигнала, которая в конце концов приводит к наблюдаемому эффекту TNF на этих клетках. Далее, описан также ряд подходов для выделения и идентификации белков, пептидов или других факторов, которые способны связываться с различными районами в вышеуказанных доменах TNF-R, причем эти белки, пептиды и другие факторы могут участвовать в регуляции или модулировании активности TNF-R. Ряд подходов для выделения и клонирования последовательностей ДНК, кодирующих такие белки и пептиды; для конструирования экспрессирующих векторов для получения этих белков и пептидов; и для получения антител или их фрагментов, которые взаимодействуют с TNF-R или с указанными выше белками и пептидами, которые связывают различные районы TNF-R, также изложены в ЕРО 568925. Однако, ЕРО 568265 не дает характеристику фактических белков и пептидов, связывающихся с внутриклеточными доменами TNF-R (например, TNF-R р55) и не описывает дрожжевой двухгибридный подход для выделения и идентификации таких белков и пептидов, которые связываются с внутриклеточными доменами TNF-R. Подобным образом, до настоящего времени не были описаны белки или пептиды, способные связывать внутриклеточный домен FAS-R.

Таким образом, в случае, когда желательно ингибирование эффекта TNF или лиганда FAS-R, было бы желательным уменьшение количества или активности рецепторов TNF или FAS-R на поверхности клеток, тогда как увеличение количества или активности рецепторов TNF или FAS-R было бы желательным, когда необходим усиленный эффект TNF или лиганда FAS-R. Для этой цели промоторы как TNF-R р55, так и TNF-R р75 были секвенированы, проанализированы, и был обнаружен ряд ключевых мотивов последовательности, которые являются специфическими для различных регулирующих транскрипцию факторов, и сама экспрессия этих рецепторов TNF может регулироваться на уровне их промоторов, т.е. ингибирования транскрипции от этих промоторов для уменьшения числа рецепторов и увеличения транскрипции от этих промоторов для увеличения числа этих рецепторов (ЕР 606869 и WO 9531206). Должны быть сообщены соответствующие исследования, касающиеся регуляции FAS-R на уровне промотора гена FAS-R.

Хотя известно, что рецепторы фактора некроза опухолей (TNF) и структурно-родственный рецептор FAS-R запускают в клетках, при стимуляции продуцируемыми лейкоцитами лигандами, деструктивные активности, которые приводят к их собственной гибели, механизмы этого запуска все еще мало понятны. Мутационные исследования показывают, что в передаче сигнала FAS-R и TNF-R p55 (p55-R) для цитотоксичности участвуют различные районы в их внутриклеточных доменах (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993). Эти районы ("домены гибели") имеют сходство последовательности. "Домены гибели" обоих рецепторов FAS-R и p55-R имеют тенденцию к самоассоциации. Их самоассоциация, очевидно, усиливает ту агрегацию рецепторов, которая необходима для инициации передачи сигнала (см. Song et al., 1994; Wallach et al., 1994; Boldin et al., 1995) и при высоких уровнях экспрессии рецепторов может приводить к запуску лиганд-независимой передачи сигнала (Bolding et al., 1995).

Таким образом, до WO 9531544 и данного изобретения не были обеспечены белки, которые могут регулировать действие лигандов, принадлежащих к суперсемейству TNF/NGF, такое как действие TNF или лиганда FAS-R на клетки, путем медиирования внутриклеточного процесса передачи сигнала, которая, как считают, управляется в большой степени внутриклеточными доменами (IC) рецепторов, принадлежащих к суперсемейству рецепторов TNF/NGF, такими как внутриклеточные домены рецепторов TNF, т.е. TNF-R р55 и р75 (р55IС и р75IС, соответственно), а также FAS-R.

Некоторые цитотоксические эффекты лимфоцитов опосредованы взаимодействием продуцируемого лимфоцитами лиганда с FAS-R (CD95), широко встречающегося рецептора клеточной поверхности, который способен запускать гибель клеток (см. Nagata and Goldstein, 1995). В убивании клеток мононуклеарными фагоцитами участвует пара лиганд-рецептор, TNF и его рецептор p55-R (CD120), которая структурно родственная FAS-R и его лиганду (см. также Vandenabeele et al., 1995). Подобно другим индуцируемым рецепторами эффектам, индукция гибели клеток рецепторами TNF и FAS-R осуществляется через ряд белок-белковых взаимодействий, ведущих от связывания лиганда с рецептором до конечной активации функций ферментативного эффектора, что в случае этих конкретных рецепторов приводит к гибели клеток. Прежние исследования выяснили взаимодействия неферментативный белок-белок, которые инициируют передачу сигнала для гибели клеток: связывание молекул тримерного TNF или лиганда FAS-R с их рецепторами, полученные взаимодействия их внутриклеточных доменов (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993), увеличивали предрасположение мотивов доменов гибели к самоассоциации (Boldin et al., 1995a) и индуцировали связывание двух цитоплазматических белков (которые могут также связываться друг с другом) с внутриклеточными доменами рецепторов - MORT-1 (или FADD) с FAS-R (Boldin et al., 1995b; Chinnaiyan et al., 1995; Kischkel et al., 1995) и TRADD с p55-R (Hsu et al., 1995; Hsu et al., 1996).

Три белка, которые связываются с внутриклеточным доменом FAS-R и p55-R при районе "домена гибели", которые участвуют в индукции гибели клеток рецепторами через гетероассоциацию гомологичных районов и которые независимо способны также к запуску гибели клеток, были идентифицированы при помощи способа дрожжевого двухгибридного скрининга. Одним из них является белок MORT-1 (Boldin et al., 1995b), также известный как FADD (Chinnaiyan et al., 1995), который связывается специфически с FAS-R. Второй, TRADD (см. также Hsu et al., 1996), связывается с p55-R и третий, RIP (см. также Stranger et al., 1995), связывается как с FAS-R, так и с p55-R. Кроме их связывания с FAS-R и p55-R, эти белки также способны связываться друг с другом, что обеспечивает функциональный "перекрестный разговор" между FAS-R и p55-R. Эти связывания осуществляются через консервативный мотив последовательности, "модуль домена гибели", общий для этих рецепторов и их связываемых белков. Кроме того, хотя в дрожжевом двухгибридном тесте было показано, что MORT-1 связывается самопроизвольно с FAS-R, в клетках млекопитающих это связывание имеет место только после стимуляции рецептора, что заставляет предположить, что MORT-1 участвует в инициирующих событиях передачи сигнала FAS-R. MORT-1 не содержит какого-либо мотива последовательности, характерного для ферментативной активности, и, следовательно, его способность запускать гибель клеток, по-видимому, не связана с присущей MORT-1 собственной активностью, а скорее с активацией некоторых других белков (белка), которые связывают MORT-1 и действуют далее в каскаде передачи сигнала. Было показано, что клеточная экспрессия мутантов MORT-1, не имеющих N-концевой части молекулы, ингибирует индукцию цитотоксичности FAS/APO1 (FAS-R) или р55-R (Hsu et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996), что свидетельствует о том, что этот N-концевой район участвует в передаче сигнала о вызывающем гибель клеток действии обоих рецепторов через белок-белковые взаимодействия.

Недавние исследования показали участие группы цитоплазматических тиоловых протеаз, которые структурно близки протеазе CED3 Caenorhabditis elegans и превращающему интерлейкин-1 млекопитающих ферменту (ICE), в наступлении различных физиологических процессов гибели клеток (обзор в Kumar, 1995 и Henkart, 1996). Были также некоторые указания на то, что протеаза (протеазы) этого семейства могут принимать участие в клеточной цитотоксичности, индуцируемой FAS-R и TNF-R. Было обнаружено, что специфические ингибиторы этих протеаз и кодируемые двумя вирусами белки, которые блокируют их функцию, белок вируса коровьей оспы crmA и белок р35 бакуловируса обеспечивают защиту клеток против клеточной цитотоксичности (Enari et al., 1995; Los et al., 1995; Tewari et al., 1995; Xue et al., 1995; Beidler et al., 1995). Быстрое расщепление некоторых специфических клеточных белков, по-видимому, опосредованное протеазой (протеазами) семейства CED3/ICE, наблюдали в клетках вскоре после стимуляции FAS-R или рецепторов TNF. До настоящего времени не было сообщений об идентичности специфической СЕD3/IСЕ-родственной протеазы (протеаз) и о механизмах активации этих протеаз рецепторами.

Сущность изобретения

Целью данного изобретения является обеспечение новых белков, в том числе, всех их изоформ, аналогов, фрагментов или производных, которые способны связываться с MORT-1, который сам связывается с внутриклеточным доменом FAS-R, причем эти новые белки влияют на процесс внутриклеточной передачи сигнала путем связывания лиганда FAS с его рецептором.

Другой целью данного изобретения является обеспечение антагонистов (например, антител, пептидов, органических соединений или даже некоторых изоформ) вышеупомянутых новых белков, их аналогов, фрагментов и производных, которые могут использоваться для ингибирования процесса передачи сигнала или, более конкретно, клеточной цитотоксичности, когда это желательно.

Дальнейшей целью данного изобретения является использование этих новых белков, их аналогов, фрагментов и производных для выделения и характеристики дополнительных белков или факторов, которые могут участвовать в регуляции активности рецепторов, например, других протеаз, которые расщепляют новые белки, делая их биологически активными, и/или для выделения и идентификации других рецепторов, находящихся выше по ходу передачи сигнала, с которыми эти новые белки, их аналоги, фрагменты и производные связываются (например, других рецепторов FAS или родственных им рецепторов) и, следовательно, в функционировании которых они также участвуют.

Еще одной целью данного изобретения является обеспечение ингибиторов, которые могут быть введены в клетки для связывания или взаимодействия с протеазами МАСН и ингибирования их протеолитической активности.

Кроме того, целью данного изобретения является использование вышеупоминаемых новых белков и их аналогов, фрагментов и производных в качестве антигенов для получения к ним поликлональных и/или моноклональных антител. Эти антитела, в свою очередь, могут быть использованы, например, для очистки новых белков из различных источников, таких как клеточные экстракты или трансформированные клеточные линии.

Далее, эти антитела могут быть использованы для диагностических целей, например, для идентификации расстройств, связанных с аномальным функционированием клеточных эффектов, опосредованных FAS-R или другими родственными рецепторами.

Дальнейшей целью данного изобретения является обеспечение фармацевтических композиций, содержащих вышеупомянутые новые белки или их аналоги, фрагменты или производные, а также фармацевтических композиций, содержащих вышеупомянутые антитела или другие антагонисты.

В соответствии с данным изобретением, был обнаружен новый белок, МАСН, который способен связываться или взаимодействовать с MORT-1, который сам связывается с внутриклеточным доменом FAS-R. МАСН, возможно, функционирует как эффекторный компонент пути гибели клеток, инициируемого связыванием лиганда FAS с FAS-R на клеточной поверхности, и это происходит благодаря тому факту, что по меньшей мере некоторые изоформы МАСН, по-видимому, являются активными внутриклеточными протеазами. Высказывалось предположение, что протеазы семейства CED3/ICE причастны к процессу апоптоза, запускаемому FAS-R. MORT-1 (или FADD) связывается с внутриклеточным доменом FAS-R при активации этого рецептора, а новые белки МАСН данного изобретения связываются с MORT-1. Белок МАСН, клонированный и охарактеризованный в соответствии с данным изобретением, действительно существует в виде многочисленных изоформ, причем некоторые из изоформ имеют район гомологии CED3/ICE, который имеет протеолитическую активность (домен протеолитической активности), и вызывает гибель клеток при экспрессии в этих клетках. Таким образом, активация этого нового гомолога CED3/ICE (т.е. различных изоформ МАСН, имеющих протеолитический домен) FAS-R (через взаимодействие с MORT-1), по-видимому, составляет эффекторный компонент опосредованного FAS-R пути (каскада реакций) гибели клеток.

Кроме того, МАСН, по-видимому, функционирует также как эффекторный компонент пути гибели клеток, инициируемого связыванием TNF с p55-R на клеточной поверхности, что происходит посредством непрямого механизма связывания MORT-1 с TRADD, белком, который связывается с внутриклеточным доменом p55-R (Hsu et al., 1995), с последующим (или одновременным) связыванием МАСН с MORT-1 с активацией МАСН до активной протеазы, участвующей в осуществлении гибели клеток.

Следует также отметить, что, хотя МАСН, в частности, изоформа MACH1, проявляет все признаки последовательности, решающие для функции протеаз CED3/ICE, она, однако, действительно имеет некоторые отличающиеся свои собственные признаки последовательности, которые могут обеспечивать ее уникальным, и, возможно, ткане/клеткоспецифическим способом действия.

MORT-1 ("Медиатор Токсичности Рецептора", Boldin et al., 1995b), прежде называемый HF1, способен связываться с внутриклеточным доменом FAS-R. Этот FAS-IC-связывающий белок, по-видимому, действует как медиатор или модулятор действия лиганда FAS-R на клетки путем медиирования или модулирования процесса внутриклеточной передачи сигнала, который обычно имеет место после связывания лиганда FAS-R при клеточной поверхности. Было показано, что, кроме его FAS-IC-связывающей специфичности, MORT-1 имеет другие характеристики (см. Пример 1), например, он имеет район, гомологичный районам "домена смерти" (DD) TNF-R р55 и FAS-R (p55-DD и FAS-DD), и вследствие этого также способен к самоассоциации. MORT-1 способен также сам активировать клеточную цитотоксичность, причем эта его способность, возможно, связана с его способностью к самоассоциации. Также было обнаружено, что коэкспрессия этого района в MORT-1 (HF1), который содержит последовательность гомологии "домена гибели" (MORT-1-DD, присутствующий в С-концевой части MORT-1), сильно противодействует индуцируемой FAS гибели клеток, как и следовало ожидать на основании его способности связываться с "доменом гибели" FAS-IC. Далее, в некоторых экспериментальных условиях, было обнаружено, что коэкспрессия части MORT-1, которая не содержит района MORT-DD (N-концевой части MORT-1, аминокислот 1-117, "головки MORT-1") приводила к отсутствию противодействия индуцируемой FAS гибели клеток и к несколько увеличенной индуцируемой FAS клеточной цитотоксичности (если она вообще была).

Таким образом, вероятно, что MORT-1 связывается также с другими белками, участвующими в процессе внутриклеточной передачи сигнала. Следовательно, MORT-1-связывающие белки могут также действовать как непрямые медиаторы или модуляторы действия лиганда FAS-R на клетки посредством медиирования или модулирования активности MORT-1; или эти MORT-1-связывающие белки могут действовать непосредственно как медиаторы или модуляторы связанного с MORT-1 внутриклеточного процесса передачи сигнала посредством медиирования или модулирования активности MORT-1, который, как отмечалось выше, имеет, по-видимому, независимую способность активировать клеточную цитотоксичность. Эти MORT-1-связывающие белки могут быть также использованы в любом из стандартных способов скрининга для выделения, идентификации и характеристики дополнительных белков, пептидов, факторов, антител и т.д., которые могут участвовать в связанном с MORT-1 или связанном с FAS-R процессе передачи сигнала или могут быть элементами других внутриклеточных процессов передачи сигнала. Такие MORT-1-связывающие белки были выделены и описаны здесь (см. Пример 2 и Пример 3). Одни из этих MORT-1-связывающих белков, называемый здесь МАСН, был исходно клонирован, секвенирован и частично охарактеризован как имеющий следующие свойства: кДНК МАСН кодирует открытую рамку считывания ORF-B; МАСН связывается с MORT-1 сильно и специфически; сайт связывания МАСН в MORT-1 находится против хода транскрипции от мотива "домена гибели" MORT-1; район ORF-B MACH является его взаимодействующей с MORT-1 частью; и MACH способен к самоассоциации и к самостоятельной индукции клеточной цитотоксичности.

В соответствии с данным изобретением, в настоящее время было показано (как упоминалось выше), что MACH действительно существует в виде ряда изоформ. Кроме того, ORF-B MACH, упомянутая выше, в самом деле является одной из изоформ MACH, названной здесь МАСН1 (см. ниже).

Таким образом, данное изобретение обеспечивает последовательность ДНК, кодирующую белок, его аналоги или фрагменты, способные связываться или взаимодействовать с MORT-1, причем этот белок, его аналоги или фрагменты способны медиировать внутриклеточный эффект, медиируемый FAS-R или p55-TNF-R.

В частности, данное изобретение обеспечивает последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из:

(a) последовательности кДНК, происходящей из кодирующего района нативного MORT-1-связывающего белка;

(b) последовательностей ДНК, способных гибридизоваться с последовательностью (а) при условиях умеренной строгости и кодирующих биологически активный MORT-1-связывающий белок;

(c) последовательностей ДНК, которые являются вырожденными в результате вырожденности генетического кода, относительно последовательностей ДНК, определенных в (а) и (b), и которые кодируют биологически активный MORT-1-связывающий белок.

Другим характерным вариантом упомянутой выше последовательности ДНК данного изобретения является последовательность ДНК, содержащая по меньшей мере часть последовательности, кодирующей одну изоформу белка МАСН, выбранную из изоформ МАСН, названных здесь MACH1, MACH2, MACH3, MACH1, МАСН2, МАСН3, МАСН4 и МАСН5.

Другими характерными вариантами последовательности ДНК данного изобретения, как отмечалось выше, являются последовательности ДНК, кодирующие:

(a) изоформу МАСН, выбранную из MACH1, MACH1 и МАСН3, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID №№7, 5 и 8, соответственно, и аналогов и фрагментов каждой из них;

(b) MACH1, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID №1, и ее аналоги и фрагменты;

(c) MACH1, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID №5, и ее аналоги и фрагменты;

(d) МАСН3, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID №8, и ее аналоги и фрагменты.

Данное изобретение обеспечивает MORT-1-связывающие белки и их аналоги, фрагменты или производные, кодируемые любой из указанных выше последовательностей изобретения, причем эти белки, аналоги, фрагменты и производные способны связываться или взаимодействовать с MORT-1 и медиировать внутриклеточный эффект, медиируемый FAS-R или р55 TNF-R.

Характерным вариантом данного изобретения является MORT-1-связывающий белок, его аналоги, фрагменты и производные, которые выбраны из по меньшей мере одной изоформы МАСН группы, содержащей MACH1, MACH2, MACH3, MACH1, MACH2, МАСН3, МАСН4 и MACH5, которые имеют по меньшей мере часть его аминокислотной последовательности.

Данное изобретение обеспечивает также векторы, кодирующие упомянутый выше MORT-1-связывающий белок и его аналоги, фрагменты или производные данного изобретения, которые содержат указанную выше последовательность ДНК данного изобретения, причем эти векторы способны экспрессироваться в подходящих эукариотических или прокариотических клетках-хозяевах; трансформированные эукариотические или прокариотические клетки-хозяева, содержащие такие вектора; и способ получения MORT-1-связывающего белка или аналогов, фрагментов или производных данного изобретения путем выращивания трансформированных клеток-хозяев при условиях, пригодных для экспрессии указанного белка, аналогов, фрагментов или производных, выполнения пост-трансляционных модификаций этого белка, как это необходимо для получения этого белка, и экстракции экспрессируемых белка, аналогов, фрагментов или производных из культуральной среды трансформированных клеток или клеточных экстрактов трансформированных клеток. Данные выше определения предназначены для включения всех изоформ белка МАСН.

В другом аспекте, данное изобретение обеспечивает также антитела или их активные производные или фрагменты, специфические для MORT-1-связывающего белка и его аналогов, фрагментов и производных данного изобретения.

Еще одним аспектом изобретения обеспечены различные применения описанных выше последовательностей ДНК или белков, которые они кодируют, в соответствии с данным изобретением, причем эти применения включают (среди прочих):

(i) Способ модулирования действия лиганда FAS-R или TNF на клетки, несущие FAS-R или p55-R, предусматривающий обработку этих клеток одним или несколькими MORT-1-связывающими белками, аналогами, фрагментами или производными данного изобретения, способными связываться с MORT-1, который связывается с внутриклеточным доменом FAS-R, или способными связываться с MORT-1, который связывается с TRADD, который связывается с внутриклеточным доменом p55-R, и вследствие этого способными модулировать/медиировать активность FAS-R или р55 TNF-R, причем обработка этих клеток предусматривает введение в клетки одного или нескольких белков, аналогов, фрагментов или производных в форме, пригодной для внутриклеточного введения, или введение в клетки последовательности ДНК, кодирующей один или несколько белков, аналогов, фрагментов или производных, в форме подходящего вектора, несущего эту последовательность, причем этот вектор способен осуществлять введение этой последовательности в эти клетки таким образом, что эта последовательность экспрессируется в клетках.

(ii) Способ модулирования действия лиганда FAS-R или TNF на клетки по (i) выше, в котором обработка клеток предусматривает введение в клетки MORT-1-связывающего белка или его аналогов, фрагментов или производных в форме, пригодной для внутриклеточного введения, или введение в клетки последовательности ДНК, кодирующей MORT-1-связывающий белок или аналоги, фрагменты или производные, в форме подходящего вектора, несущего эту последовательность, причем этот вектор способен осуществлять введение этой последовательности в эти клетки таким образом, что эта последовательность экспрессируется в клетках.

(iii) Способ по (ii) выше, в котором обработку клеток выполняют посредством трансфекции клеток рекомбинантным вирусным вектором животного, включающей в себя стадии:

(a) конструирования рекомбинантного вирусного вектора животного, несущего последовательность, кодирующую вирусный поверхностный белок (лиганд), который способен связываться со специфическим рецептором клеточной поверхности на поверхности несущей FAS-R или p55-R клетки, и вторую последовательность, кодирующую белок, выбранный из MORT-1-связывающего белка и его аналогов, фрагментов и производных, который при экспрессии в этих клетках способен модулировать/медиировать активность FAS-R или p55-R; и

(b) инфицирования этих клеток вектором (а).

(iv) Способ модулирования действия лиганда FAS-R или TNF на клетки, несущие FAS-R или p55-R, предусматривающий обработку этих клеток антителами или их активными фрагментами или производными, в соответствии с данным изобретением, причем эту обработку выполняют предоставлением подходящей композиции, содержащей эти антитела, их активные фрагменты или производные, этим клеткам, причем при экспонировании MORT-1-связывающего белка или его частей из этих клеток на внеклеточной поверхности указанную композицию готовят для внеклеточного применения, а когда MORT-1-связывающие белки являются внутриклеточными, указанную композицию готовят для внутриклеточного применения.

(v) Способ модулирования действия лиганда FAS-R или TNF на клетки, несущие FAS-R или p55-R, предусматривающий обработку указанных клеток олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей антисмысловую последовательность по меньшей мере части белковой последовательности MORT-1-связывающего белка данного изобретения, причем эта олигонуклеотидная последовательность способна ингибировать экспрессию MORT-1-связывающего белка.

(vi) Способ по (ii) выше для обработки опухолевых клеток или ВИЧ-инфицированных клеток или других имеющих патологию клеток, предусматривающий:

(a) конструирование рекомбинантного вирусного вектора животного, несущего последовательность, кодирующую вирусный поверхностный белок, способный связываться со специфическим рецептором поверхности опухолевых клеток или рецептором других имеющих патологию клеток, и последовательность, кодирующую белок, выбранный из MORT-1-связывающего белка, аналогов, фрагментов и производных данного изобретения, который при экспрессии в опухолевой, ВИЧ-инфицированной или иной имеющей патологию клетке способен убивать эту клетку;

(b) инфицирование опухолевых или ВИЧ-инфицированных или иных имеющих патологию клеток вектором (а).

(vii) Способ модулирования действия лиганда -FAS-R или TNF на клетки, предусматривающий применение рибозимного способа, в котором вектор, кодирующий последоват