Способ бесклеточной транскрипции днк-матрицы, способ идентификации испытуемого вещества, днк-матрица

Способ бесклеточной транскрипции днк-матрицы, способ идентификации испытуемого вещества, днк-матрица

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для анализа ин витро транскрипции вирусных и клеточных генов. Бесклеточную транскрипцию ин витро ДНК-матрицы осуществляют с использованием обогащенного экстракта из клеточных ядер и маркированного нуклеотида. Маркированный транскрипт определяют. ДНК-матрица содержит уникальные сайты рестрикции для рестрикционных эндонуклеаз Pst1, EcoR1, Sac1, Kpu1, Sac11, BamH1, Swa1, часть плазмиды pUC19, пять сайтов связывания для протеина дрожжей Ga14, “TATA”-блок человеческого рецептора Т-клеток V 8.1 между сайтами рестрикции Sac11 и BamH1, инициаторный участок аденовирусного главного позднего промотора между сайтами рестрикции BamH1 и Swa1 и G-свободную последовательность длиной примерно 800 нуклеотидов. Изобретение позволяет осуществлять детектирование специфического транскрипта в автоматическом режиме. 3 н. и 47 з.п.ф-лы, 3 ил. 1 табл.

Изобретение относится к автоматизированному способу ин витро для анализа транскрипции вирусных и клеточных генов, который рациональным и экономически приемлемым образом пригоден для массового скрининга в целях обнаружения специфических, селективно влияющих на активность гена химических главных структур.

Скрининг природных соединений в отношении биологически активных ингредиентов получил новый стимул для развития после того, как оказалось, что только с помощью рациональной конструкции биологически активного вещества невозможен успешный поиск биологически активных веществ. Так, наряду с химическими библиотеками веществ и комбинационными библиотеками в центре внимания снова находятся экстракты природных соединений в качестве источников веществ. Это связано прежде всего с многообразием содержащихся в этих экстрактах веществ. С помощью современных аналитических методов можно обнаружить, что экстракты микробной ферментации содержат около 500 соединений, структурно различающихся классов. Тем самым в отношении своего разнообразия они намного превосходят химические и комбинационные библиотеки веществ.

Число приемлемых информативных способов, с помощью которых можно испытывать потенциальные биологические активные вещества, ограничено для фармакологического использования богатого и до сих пор в значительной степени неисследованного потенциала природных соединений. В особенности необходимы способы, которые можно использовать для идентификации высокоспецифических фармакологически активных веществ, введение которых связано по возможности с незначительными побочными действиями.

Нижеописываемый способ основывается на исходной смеси, в которой испытывают вещества на их потенциал, путем вмешательства уже на первой стадии преобразования генетической информации регулируют транскрипцию генов. С помощью такого способа можно идентифицировать вещества, которые могут прямо или косвенно, положительно или отрицательно влиять на транскрипцию.

Сила транскрипции гена определяется ген-регулирующими элементами этого гена, в особенности промотором, энхансером или силенсером. Действию ген-регулирующих элементов способствуют и преобразовывают его факторы транскрипции и кофакторы. Эти факторы транскрипции могут влиять как отрицательно, так и также положительно на скорость транскрипции гена и благодаря этому способствуют силе транскрипции. Между тем, идентифицировано множество факторов транскрипции в качестве важных "молекулярных переключателей" в ходе многих клеточных процессов, включая сигнальную трансдукцию, контроль клеточного цикла, дифференциацию и контролируемую гибель клетки (апоптоз).

В большинстве случаев получаемые клеткой сигналы, которые влияют на силу транскрипции генов, "регистрируются" трансмембранными протеинами, передаются дальше внутриклеточно через цепи сигнальной трансдукции и преобразуются факторами транскрипции. Примерами протеинов, получающих сигналы снаружи, являются протеины, связывающие циклический аденозинмонофосфат, сенсоры сигналов роста (как сывороточный ответный фактор, SRF), гормональные рецепторы или факторы транскрипции, которые принимают участие в экспрессии цитокинов, так называемые SТАТ-протеины (сигнальные трансдукторы и активаторы транскрипции).

Между тем, известен целый ряд веществ, которые прямо или косвенно влияют на силу транскрипции генов. Такие вещества используют, в частности, в качестве фармакологически активных веществ в лекарственных средствах, хотя действие этих веществ часто не является специфическим. Поэтому прием таких лекарственных средств часто также связан с нежелательными побочными действиями.

Например, для лечения иммунологических заболеваний используют лекарственные средства, которые содержат циклоспориновые и стероидные производные в качестве активных веществ. Циклоспорин А образует комплекс с циклофилином, который ингибирует кальцийнейрин, находящуюся повсюду фосфатазу, дефосфорилирует протеины различными реакциями обмена веществ. Кальцийнейрин регулирует, например, перемещение субъединицы фактора транскрипции NFAT от цитозола в клеточное ядро (Liu J., Immynology Today, 14, 290-295 (1993)). NFAT (нуклеарный фактор активированных Т-клеток) принимает участие в активации некоторых иммунологически релевантных генов. Циклоспорин А (СsА) косвенно, через влияние NFAT (нуклеарный фактор активированных Т-клеток) регулирует экспрессию этих генов. Так как циклоспорин А, однако, только косвенно, а именно через находящийся повсюду кальцийнейрин, регулирует активность NFAT, этот циклоспорин А действует также через другие метаболические пути сосудосужающе, а также нефротоксически и нейротоксически.

Если бы было известно фармакологически активное вещество, с помощью которого можно было специфически, возможно непосредственно, ингибировать NFAT, то лекарственное средство, содержащее это активное вещество, вероятно вызывало бы меньшие побочные действия.

К фармакологически активным веществам причисляют также глюкокортикоиды, которые наряду с желательным действием вызывают также сильное побочное действие. Глюкокортикоиды уже много лет используют для стандартной терапии при аллергиях, ревматических заболеваниях, воспалениях и других заболеваниях, которые сводятся к сверхреактивной иммунной системе. Они вызывают, в частности, ингибирование активации фактора транскрипции NFkB специфического для типа клеток (Scheinmann R.I., Cogswell Р.С., Lofquist А.К. и Baldwin A.S., Jr.Science, 270, 283-286 (1995); Auphan N., DiDonato J.A., Rosette C., Helmberg A, и Karin M., Science, 270, 286-290 (1995 )), тем они стимулируют образование клеточного ингибитора NFkB IkB-протеином. IkB в свою очередь предотвращает перенос активных NFkB-димеров в клеточное ядро и таким образом активацию важных иммунологических генов-мишеней. Влияние глюкокортикоидов на ген-экспрессию, подобно как и в случае СsА, относительно неспецифическое, так как глюкокортикоиды действуют не только на NFkB, но и также на другие протеины.

Эти примеры показывают, что существует большая потребность в фармакологически активных веществах, которые обладают по возможности специфическим профилем действия. При поиске новых химических структур с соответствующими свойствами нужно испытывать множество веществ в отношении их специфической активности.

Несмотря на идентичное "ген-обеспечение", в зависимости от типа клетки и/или определенных заболеваний или дефектов, а также соответствующей степени развития и дифференциации отдельных клеток всегда экспрессируются только определенные протеины. В качестве основы этой индивидуальности клеток можно рассматривать специфический набор ген-регуляторных протеинов, например, специфическое для типа клетки и развития обеспечение определенными факторами транскрипции и кофакторами (примесные протеины), которые регулируют координируемую и контролируемую транскрипцию отдельных генов.

Специфические фармакологически активные вещества поэтому должны селективно активировать или ингибировать транскрипцию патологически релевантных генов в клетках определенного типа. Для идентификации таких активных веществ необходим способ транскрипции, в случае которого при определенных условиях можно непосредственно определять воздействие испытываемых активных веществ на транскрипцию отдельных генов, то есть на регуляцию участвующих в транскрипции протеинов и на ген-регуляторные элементы. Так как нужно подвергать испытанию множество потенциально активных веществ, способ, сверх того, должен быть прост в осуществлении и автоматизируемым.

Первый бесклеточный способ транскрипции описан Вайлом и др. (Weil P.A., Luse D.S., Segall J., Roeder R.G., Cell, 18, 469-484 (1979)). При этом обогащенные экстракты из клеточных ядер, так называемые S100-экстракты (Weil P.A., Segall J., Harris В., Ng S.Y., Roeder R.G., Biol. Chem., 254, 6163-6173 (1979)), и очищенную РНК-полимеразу II используют для транскрипции ин витро. Без экзогенной РНК-полимеразы II эти обогащенные, однако, далее не очищенные ядерные экстракты неспособны к транскрипции (Weil P.A., Luse D.S., Segall J., Roeder R.G., Cell, 18, 469-484 (1979)); Dignam J.D., Martin P.L., Shastry B.S., Roeder R.G., Methods in Enzymology, 101, 582-598 (1983)).

Исходя из таких ядерных экстрактов затем разработаны способы, с помощью которых можно выделять факторы транскрипции путем многоступенчатых стадий очистки. В частности эти способы включают стадии очистки, при которых ядерные экстракты очищают хромотографически при использовании материалов, связывающих нуклеарные протеины, как, например, с помощью фосфоцеллюлозных колонок. В рамках этих дорогостоящих, многоступенчатых способов для одной из стадий очистки Дигнам и др. впервые описали применение продажной Р11-системы^R (Ватман, Мидстоун, Великобритания) (Dignam J.D., Martin P.L., Shastry B.S., Roeder R.G., Methods in Enzymology, 101, 582-598 (1983)).

Многоступенчатые способы очистки всегда более адаптируются, так что между тем можно с помощью дорогостоящих способов из экстрактов клеточных ядер выделять отдельные факторы транскрипции. Сверх того, отдельные факторы, соответственно, их субъединицы, в настоящее время являются рекомбинантно доступными, как, например, TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIE и TFIIF (Zawel L. и Reinberg D., Annu Rev. Biochem., 64, 533-561 (1995)).

Поэтому в настоящее время уже имеются системы транскрипции, которые состоят из смеси рекомбинантных и природных очищенных факторов. Для способа скрининга с высокой производительностью в отношении числа анализируемых образцов такие системы транскрипции до сих пор, однако, слишком дорогостоящие с точки зрения технологии. В других системах транскрипции, например, при использовании экстрактов из клеточных ядер вместо рекомбинантных или очищенных факторов, напротив, возникает много побочных реакций. В недостаточной степени очищенных или в неочищенных ядерных экстрактах (грубые экстракты) прежде всего нуклеиновые кислоты и ДНК-связывающие протеины, например, репрессоры, как, например, гистон, мешают транскрипции ин витро. В случае содержащихся в грубых экстрактах нуклеиновых кислот в особенности мешают ДНК- последовательности, которые кодируют транспортные рибонуклеиновые кислоты (тРНК). Так как гены транспортных рибонуклеиновых кислот транскрибируются примерно в 100 раз сильнее, чем гены матричных рибонуклеиновых кислот (мРНК), то кодирующие эти тРНК последовательности приводят к избытку неспецифических транскриптов. Неспецифические транскрипты затем нужно отделять лишь с помощью дорогостоящих стадий очистки, прежде, чем можно обнаружить специфические транскрипты.

Для того чтобы можно было количественно определять результаты транскрипции ин витро, созданы векторы, в случае которых транскрибируемая последовательность ДНК не содержит никаких гуаниновых оснований (так называемая G-свободная последовательность, соответственно, G-свободная кассета), причем за G-свободной последовательностью при необходимости следует отрезок последовательности, который содержит очень много гуанинов. Благодаря использованию этих векторов можно осуществлять транскрипцию в отсутствие гуанозинтрифосфата (GTP). Благодаря этому транскрибируются только G-свободные последовательности, но не другие, G-содержащие последовательности. Таким образом получают специфические транскрипты, которые, сверх того, имеют (почти) одинаковую длину. Sawadogo и Roeder впервые описали использование вектора для транскрипций, в котором имеется последовательность длиной 400 нуклеотидов при контроле ML-(аденовирусного главного позднего промотора). С помощью этого вектора получают транскрипты длиной примерно 400 нуклеотидов (Sawadogo М. и Roeder R.G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4394-4398 (1985)).

С помощью этих векторов получают отчетливо менее неспецифические транскрипты, вследствие чего с тех пор многократно описано использование этих векторов в реакциях транскрипции. (Goppelt A., Stelzer G., Lottspeich F., Meisterernst M., EMBO J., 15, 3105-3115 (1996); Kretzschmar M., Kaiser K., Lottspeich F., Meisterernst M., Cell, 78, 525-534 (1994); Meisterernst M., Roy A.L., Lieu H.M. и Roeder R.G., Cell, 66, 981-993 (1991)). До сих пор, однако, используют исключительно векторы, в которых длина G-свободной последовательности не превышает 400 нуклеотидов.

Для того чтобы количественно и качественно определить результаты описанных до сих пор способов транскрипции, осуществляют транскрипцию в присутствии радиоактивно маркированных нуклеотидов и после фенолизации и осаждения на геле отделяют радиоактивно маркированные транскрипты. Таким образом не только ошибочно инициированные или ошибочно терминированные транскрипты, а также неспецифически маркированные нуклеиновые кислоты (например, вызываемые благодаря плазмиде транскрипты или транспортные рибонуклеиновые кислоты), но и также избыточные нуклеотиды отделяют от специфического транскрипта. Соотношение активностей избыточных, радиоактивно маркированных нуклеотидов к радиоактивно маркированным транскриптам составляет в нежелательных случаях примерно 10000:1, так что маркированные транскрипты нужно обогащать примерно в 10000 раз. Это обогащение специфического транскрипта достигается благодаря стадии осаждения и благодаря электрофоретическому отделению. Эти стадии обогащения, однако, непригодны для автоматизированного массового скрининга, вследствие чего необходимо разрабатывать альтернативные способы, чтобы удалять маркированные нуклеотиды в той степени, которая уже позволяет проводить количественную оценку результатов транскрипции.

Транскрипцию можно также осуществлять путем нанесения реакционного раствора на мембрану, например мембрану из диэтиламиноэтилцеллюлозы. Радиоактивно маркированные транскрипты затем можно детектировать прямо на мембране. Однако до сих пор успешно используют мембраны только для обнаружения транскриптов из транскрипций ин витро, которые осуществляют в присутствии очищенных РНК-полимераз II (Roeder R.G., J.Biol.Chem., 249, 241-248 (1974)) или очищенных базальных факторов транскрипции (Ohkuma Y., Sumimoto H., Horikoshi M., Roeder R.G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9163-9167 (1990)). Не дается никакого указания на то, что транскрипты, которые получают с помощью обогащенных и при необходимости предварительно очищенных экстрактов из клеточных ядер, таким образом можно определять.

Использование транскрипции генов для скрининга активных веществ уже описано в международной заявке WO 96/26959. В этой заявке описываются последовательности человеческих NFATs (hNFAT) и их возможное применение в количественных анализах транскрипции, которые в свою очередь должны использоваться для массового скрининга природных соединений по возможности автоматизированного. В противоположность нижеописываемому способу транскрипции, в случае этого количественного анализа транскрипции речь идет о чистом анализе на связывание, при котором не осуществляется никакой реакции транскрипции.

Дальнейший анализ на связывание, который можно использовать для скрининга веществ, способных ингибировать связывание факторов транскрипции нуклеиновыми кислотами, описывается в патенте США 5563036. Также в случае этого анализа не осуществляется никакой транскрипции.

Следующий пример в отношении анализа на связывание, который также используют для обнаружения веществ, способных ингибировать связывание протеина, в этом случае ассоциированного с рецептором фактора некроза опухоли (TRADD), с определенными ДНК-последовательностями, описывается в патенте США 5563039.

Задачей настоящего изобретения является разработка простого и воспроизводимого, универсально используемого, в особенности пригодного для массового скрининга способа анализа транскрипции генов, например, клеточных и вирусных генов, при определенных реакционных условиях.

Изобретение относится к способу бесклеточной транскрипции ин витро ДНК-матрицы, которая содержит транскрибируемую ДНК-последовательность, находящуюся под контролем одного или нескольких ген-регуляторных элементов, и причем

а) для транскрипции используют обогащенный и при необходимости очищенный экстракт клеточных ядер, который при необходимости может быть дополнен факторами транскрипции и/или кофакторами, соответственно, частично или полностью заменен ими, и, по крайней мере, один маркированный нуклеотид;

б) после транскрипции содержащиеся в смеси протеины при необходимости отделяют и/или подвергают деградации;

в) маркированный транскрипт связывают с твердым носителем;

г) удаляют избыточные маркированные нуклеотиды; и

д) определяют количество маркированного транскрипта. Способ включает собственно реакцию транскрипции (а), отделение специфического транскрипта (б, в, г) и определение специфического транскрипта (д).

Способ включает особые формы осуществления отделения специфического транскрипта, причем указанная очередность б, в, и г представляет собой только один возможный вариант. Последовательность отделения специфического транскрипта при необходимости может также представлять собой в, г, б или г, б, в. Далее, в случае определенных вариантов осуществления изобретения можно отказаться от отдельной стадии отделения. Например, способ транскрипции может включать только стадии а, в, г и д или только стадии а, в и д или только а, б, вид или только а, б, г и д или только а, б и д или только а, г и д.

Особым признаком способа является то, что все стадии способа, следовательно, собственно реакция транскрипции (транскрипция), а также отделение и детектирование специфического транскрипта, могут быть автоматизированы, причем возможно простое и достоверное определение количества специфического транскрипта, полученного при соответствующих реакционных условиях, и тем самым скорости транскрипции.

Скорость транскрипции указывает на то, как часто определенный ген транскрибируется в единицу времени, соответственно, в описываемом способе транскрипции, как часто транскрибируемая ДНК-последовательность транскрибируется в единицу времени. Для определения скорости транскрипции определяют количество радиоактивно маркированного транскрипта, которое получают спустя определенную единицу времени.

Способ заключается в том, что транскрипцию осуществляют в присутствии активаторов и/или ингибиторов, то есть в присутствии компонентов, которые положительно или отрицательно влияют на транскрипцию. Например, можно использовать способный к транскрипции экстракт клеточных ядер для базальной транскрипции. Эту базальную систему транскрипции можно дополнять активаторами и/или ингибиторами. По сравнению с базальной транскрипцией ингибирование транскрипции ведет к пониженной скорости транскрипции и тем самым к меньшему количеству специфического транскрипта в единицу времени, в то время как активация транскрипции ведет к повышенной скорости транскрипции и тем самым к большему количеству специфического транскрипта в единицу времени.

Транскрипцию генов можно подразделять на несколько стадий: образование прединициирующего комплекса (PIC), активация PIC, инициация, очищение промотора, элонгация и терминация. Для инициации транскрипции в случае эукариотов необходимы РНК-полимеразы (для транскрипции кодирующих протеины генов - РНК-полимераза II) и связывающие ДНК протеины, которые позволяют протекать специфическому взаимодействию РНК-полимеразы II с ДНК. Эти связывающие ДНК протеины обозначают как факторы транскрипции, причем общие факторы транскрипции участвуют по существу во взаимодействии с промотором, в то время как специфические факторы транскрипции способствуют действию ген-регуляторных элементов, которые локализованы ниже и выше промотора.

В транскрипции эукариотических генов принимают участие общие факторы транскрипции TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIF и TFIIH. Способная к транскрипции протеиновая фракция, которая ответственна за незначительную, базальную активность генов, в зависимости от промотора содержит все, соответственно, большинство этих общих факторов транскрипции и РНК- полимеразу II (РНК Pol II). Базальная активность ML-промотора достигается, например, благодаря ТВР (ТАТА-связывающая субъединица TFIID), TFIIB, TFIIE, TFIIF и РНК Pol II. Протеиновые фракции, которые вызывают такую базальную активность, обозначают как базальные системы транскрипции. Это понятие согласно изобретению также используют для обогащенного и при необходимости очищенного экстракта клеточных ядер. Транскрипцию, которую осуществляют с помощью базальной системы транскрипции, обозначают как базальную транскрипцию. Для осуществления бесклеточной транскрипции ин витро требуется по крайней мере одна система транскрипции, нуклеотиды и транскрибируемая ДНК-матрица.

Для активированной транскрипции дополнительно к общим факторам транскрипции, соответственно, к базальной системе транскрипции необходимы специфические факторы транскрипции и кофакторы (примесные протеины) (Kaiser К., Stelzer G. и Meisterernst M., EMBO J., 14, 3520-3527 (1995)). Специфические факторы транскрипции способны многократно усиливать только незначительную базальную транскрипцию определенных генов и регулировать частоту инициации транскрипции. Связывающие ДНК протеины таким образом в значительной степени ответственны за то, как часто ген транскрибируется (скорость транскрипции). В этом процессе регуляции принимают участие также другие протеины, которые не прямо связываются с ДНК, а через протеин-протеиновые взаимодействия влияют на активности факторов транскрипции или РНК-полимераз II, как, например, кофакторы.

Способ заключается также в том, что для базальной транскрипции используют обогащенный экстракт клеточных ядер (экстракт клеточных ядер, соответственно, ядерный экстракт). Что касается этого параметра, способ применяется универсально; это относится как к используемой клетке, так и к используемому эукариотическому виду. Например, можно получать, например, обогащенные ядерные экстракты из человеческих или животных линий клеток. В особенности пригодны клетки, которые можно культивировать и размножать в ферментерах в большом масштабе, как, например, HeLa-клетки. Далее, можно использовать экстракты клеточных ядер выбранных типов клеток, в особенности таких, которые отличаются, например, своим специфическим в отношении типа клетки, клеточного цикла, развития, дифференциации или заболевания обеспечением факторами транскрипции и/или кофакторами. В особенности можно использовать типы клеток, которым отводится центральная роль при возникновении заболеваний, как, например, клетки иммунной системы (например. В- и Т-клетки).

Особым преимуществом способа является то, что можно выделять и использовать также ядерные экстракты из тканей или опухолевых клеток. Это особенно предпочтительно в случаях, в которых нет никаких пригодных линий клеток. В особенности можно выделять и использовать в способе ядерные экстракты из легко доступных тканей, как из животных или человеческих пупочных канатиков, животных или человеческих отходов после трансплантации, животного или человеческого материала биопсии или животной, или человеческой опухолевой ткани (например, удаленная путем операции ткань), животной или человеческой плаценты.

В целях обогащения ядерных протеинов из клеточных ядер свежих или подвергнутых глубокому замораживанию клеток или из свежих или подвергнутых глубокому замораживанию клеточных ядер способ включает получение обогащенных ядерных экстрактов по известным способам, например по способу, описанному Дигнамом и др. (Dignam J.D., Martin P.L., Shastry B.S., Roeder R.G., Methods in Enzymology, 101, 582-598 (1983); Dignam J.D., Lebovitz R.M., Roeder R/G/, Nucleic Acid Res., 11, 1475-1489 (1983)). Особым вариантом осуществления способа является то, что для получения обогащенного ядерного экстракта используют способы, которые включают гомогенизацию клеточных ядер с последующим диализом гомогената.

Важный вариант осуществления способа состоит в том, что обогащенный экстракт клеточных ядер очищают путем одной или нескольких стадий очистки, в особенности однократной очисткой, в такой степени, что он способен к транскрипции, то есть из него при осуществлении способа получают специфический транскрипт. Например, экстракт можно очищать путем хроматографии. Очистку можно осуществлять, например, при использовании связывающих ядерный протеин материалов, как фосфоцеллюлоза, диэтиламиноэтилцеллюлоза или также гепарин-сефароза. Альтернативно, для очистки можно использовать колонки с катионо- и/или анионообменными смолами или специфические колонки для аффинной хроматографии, например, такие, в случае которых с материалом колонки связаны антитела или олигонуклеотиды.

Особый вариант осуществления способа включает очистку обогащенного ядерного экстракта при использовании колонки с фосфоцеллюлозой, в особенности Р11^R-колонки (Р11^R-система, Ватман, Мидстоун, Великобритания). Другой особенно предпочтительный вариант осуществления способа включает очистку обогащенного ядерного экстракта только в одну-единственную стадию, например, при использовании одной-единственной Р11^R-колонки или одной-единственной колонки с материалом, который содержит диэтиламиноэтилцеллюлозу или гепарин-сефарозу.

В случае специального варианта осуществления Р11^R-очистки, ядерный экстракт сначала в присутствии буфера, содержащего наряду с другими компонентами 0,05-0,15 моль, предпочтительно 0,1 моль, хлорида калия, связывают с фосфоцеллюлозой. Благодаря промывке нагруженной колонки с помощью пригодных буферов, предпочтительно с помощью буфера, который содержит 0,05-0,15 моль хлорида калия, предпочтительно 0,1 моль хлорида калия, из колонки вымывают неспецифические и побочные компоненты. Способные к транскрипции компоненты элюируют из колонки предпочтительно в виде двух фракций, причем сначала используют буфер, содержащий, например, от 0,4 до 0,6 моль хлорида калия, и затем буфер, который содержит, например, от 0,7 до 1 моль хлорида калия, предпочтительно 0,85 моль хлорида калия.

Особый вариант осуществления способа состоит в осуществлении транскрипции с помощью обогащенного, при необходимости очищенного ядерного экстракта в присутствии экзогенной РНК-полимеразы II. В качестве РНК-полимеразы можно использовать предпочтительно эукариотическую РНК-полимеразу типа II (РНК-полимеразы II), в особенности животную или человеческую РНК-полимеразу 11.

Следующий вариант осуществления способа состоит в том, что обогащенный и при необходимости очищенный ядерный экстракт можно дополнять, соответственно, частично или полностью заменять за счет добавки протеинов, например факторов транскрипции и/или кофакторов (примесные протеины). Эти протеины можно получать, например, из ядер клеток путем очистки или рекомбинантным путем.

Специальный вариант осуществления способа заключается в том, что ядерный экстракт дополняют только за счет фактора транскрипции и/или кофактора. В другом случае, способ состоит в том, что способную к транскрипции протеиновую фракцию (базальная система транскрипции) составляют полностью из очищенных или рекомбинантным путем полученных факторов транскрипции и/или кофакторов, а также РНК-полимераз.

В качестве факторов транскрипции можно использовать, например, общие и/или специфические факторы транскрипции, соответственно, их части, при необходимости в виде слитых протеинов.

В качестве общих факторов транскрипции можно использовать, например; TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH, TFIIJ и ТВТ (ТАТА-связывающий протеин).

В качестве специфических факторов транскрипции можно использовать, например, NFkB, API, NFAT, GATA3, TCF/Lef, CBF, Tat, члены fos/jun-семейства, Oct-семейства (Oct-1, Oct-2) и тем самым взаимодействующие факторы, как, например, Воbl, ОСА-В или OBF, Ets-семейства, активаторы семейства ATF/CREB-протеинов, нуклеарные рецепторы, как, например, PPAR, или соответствующие специфические для типа клеток изоформы факторов транскрипции (Kel O.V., Romaschenko A.G., Kel А.Е., Wingender Е., Kolachenov N.A., Nucl. Acids. Res., 20, 3-16 (1995)).

Другими примерами специфических факторов транскрипции являются следующие:

1) протоонкогены, например jun, fos, ets, myc, bc-изоформы и erb;

2) гормональные рецепторы, например (erb), глюкокортикоидные рецепторы, эстрогенные рецепторы, рецепторы ретинолевой кислоты, рецепторы витамина D или

3) супрессоры опухолей, например р53, NF1, WT1, RB;

4) вирусные патогены, например протеины герпесвируса, как, например, VP16 или ICP4; вируса папилломы, как, например, Е1, Е2, Е6 или Е7; цитомегаловируса, как, например, IE86; вируса гепатита Б, как, например, рХ; вируса иммунодефицита человека, как, например. Tat или Rev;

5) специфические для типа клеток и/или тканей факторы, как, например, миогенные факторы, Pit-1, Oct-2, Pu-1, OCA-B или HNFs, или специфические для Т-клеток факторы, как Ets-1, GATA3, NCF/Lef, CBF;

6) STAT-протеины (сигнальные трансдукторы и активаторы транскрипции), например, активированные цитокином факторы транскрипции, как, например, IL-1 Stat, IL-2 Stat, IL-3 Stat, IL-4 Stat, IL-5 Stat, IL-6 Stat, IL-7 Stat, IL-8 Stat, IL-9 Stat, IL-10 Stat, IL-11 Stat, IL-12 Stat (IL означает интерлейкин; "Stat" означает протеин, который способствует действию); или

7) протеины, которые принимают участие во вторичных информационных каскадах трансдукции, например CREB или аbl;

8) нуклеарные рецепторы, например "вторичные информационные" рецепторы (например, сАМР- или IР₃-рецепторы, Са²⁺-зависимые рецепторы), рецепторы ретинолевой кислоты, глюкокортикоидные рецепторы или стероидные рецепторы;

9) ген-специфические активаторы или ингибиторы, например специфические активаторы IL-2-гена, как NFkB, API или NFAT;

10) факторы транскрипции, экспрессируемые для специфических стадий развития, для специфических стадий клеточного цикла и зависимые от дифференциации.

Кофакторы, например, через протеин-протеиновые взаимодействия и/или протеин-ДНК-взаимодействия прямо или косвенно принимают участие в транскрипции. Некоторые кофакторы уже имеются в базальной системе транскрипции, другие - лишь в активированной системе транскрипции. Кофакторы могут положительно или отрицательно влиять на скорость транскрипции. В качестве кофакторов можно использовать, например, следующие:

- ТВР-ассоциированные факторы (TAFs), например ТАF_II30, TAF_II40, ТАF_II55, ТАF_II60, TAF_II110, ТАF_II150, ТАF_II250 (Verrijzer С.Р. и Tjian R., Trends Biochem. Sci., 21, 338-342 (1996); TAFs вместе с ТВР образуют TFIID-комплекс, причем состав TAFs в TFIID может значительно меняться);

- медиаторы, то есть кофакторы, которые ассоциированы с РНК-полимеразой II, как, например, CTD (карбокситерминальный домен) - взаимодействующие протеины и/или репрессоры, и/или активаторы РНК-полимеразы II, в особенности RAP 30, RAP 74, RAP 38, SR7 (супрессор РНК-полимеразы В, SRB), циклины или киназы (например, CKII);

- общие кофакторы;

- кофакторы, которые содержатся в USA (стимулирующей активность в обратном направлении) - фракции (Kaiser К. и Meisterernst M., Trends Biochem. Sci., 342-345 (1996));

- положительные кофакторы, например, РС1, РС2, РС4(р15), РС5, РС6, Dr2 (D-penpeccop 2)/PC3, ACF (активирующий кофактор), CofA (кофактор А), HMG-протеины (протеины группы высокой подвижности, ассоциированные с хроматином);

- отрицательные кофакторы, например NC1, NC2 и/или

- специфические кофакторы.

Способ включает использование для транскрипции ДНК-матрицы, которая содержит один или несколько ген-регуляторных элементов и транскрибируемую ДНК-последовательность.

Предметом изобретения является ДНК-матрица, которую можно использовать в описанном способе для бесклеточной транскрипции ин витро. ДНК-матрица содержит один или несколько ген-регуляторных элементов и транскрибируемую ДНК-последовательность. ДНК-матрица дополнительно может содержать другие отрезки последовательностей.

Ген-регуляторный элемент может представлять собой известный или исследуемый ген-регуляторный элемент или конструкцию из одного или нескольких известных или одного или нескольких исследуемых ген-регуляторных элементов.

Ген-регуляторный элемент может содержать любые участвующие в ген-регуляции ДНК-последовательности или их отрезки. В отношении ген-регуляторного элемента ДНК-матрица, соответственно, способ являются универсальными, причем ген-регуляторный элемент происходит предпочтительно от эукариотического гена или соответствует ему. Ген-регуляторный элемент может представлять собой клеточный или вирусный ген-регуляторный элемент или синтетический ген-регуляторный элемент. Ген-регуляторный элемент предпочтительно содержит, в частности, ДНК-последовательности, сайты связывания для связывающих ДНК протеинов (связывающие протеин ДНК-последовательности, например, сайты связывания факторов транскрипции или слитых протеинов). Ген-регуляторный элемент может содержать промотор (промоторная последовательность) и/или один или несколько энхансеров (энхансерная последовательность) и/или один или несколько силенсеров (силенсерная последовательность). Ген-регуляторный элемент предпочтительно может содержать природные и/или искусственно полученные промоторные, энхансерные и/или силенсерные последовательности или их части.

Промотор может содержать "ТАТА"-блок и/или инициирующую область(INR) (исходная точка транскрипции). Промотор может содержать "GС"-блок и/или "GААТ"-блок.

В специальном варианте осуществления ДНК-матрицы ген-регуляторным элементом является модельный промотор.

Модельный промотор содержит промотор и дополнительные, связывающие протеин ДНК-последовательности и при необходимости другие ген-регуляторные элементы. Предпочтительно модельный промотор содержит "ТАТА"-блок и инициирующую область. В специальном варианте осуществления модельный промотор содержит "ТАТА"-блок человеческого Т-клеточного рецептора V 8.1 и инициирующую область ML-промотора. Эти оба базальных промоторных элемента делают возможной базальную транскрипцию ин витро. Сверх того, этот специальный модельный промотор имеет 5 сайтов связывания для протеина дрожжей Ga14. Модельный промотор можно изменять любым образом, например с помощью методов молекулярной биологии, например, тем, что модельный промотор дополняют, например, исследуемым ген-регуляторным элементом и/или тем, что отдельные участки модельного промотора заменяют другими ген-регуляторными элементами, например исследуемым ген-регуляторным элементом.

Для того чтобы можно было манипулировать с модельным промотором, он предпочтительно содержит один или несколько сингулярных сайтов рестрикции для рестрикционных эндонуклеаз. В специальном варианте осуществления модельного промотора по крайней мере один сингулярный сайт рестрикции для рестрикционной эндонуклеазы локализован между "ТАТА"-блоком и сайтом связывания Ga14.

В модельный промотор дополнительно к уже имеющимся связывающим протеины последовательностям (например, дополнительно к Gа14-последовательностям) можно интегрировать другие, связывающие протеины последовательности. Это представляет интерес в особенности тогда, когда, например, к уже исследованной системе транскрипции добавляют другие исследуемые, например, специфические факторы транскрипции.

Способ состоит в том, что в комбинации с модельным промотором можно также использовать слитые протеины в качестве активаторов и/или ингибиторов транскрипции. Такие слитые протеины могут состоять, например, из ДНК-связывающего домена, как, например, ДНК-связывающий домен протеина дрожжей Ga14, и специфического активаторного домена, как, например, активаторный домен HSV-активатора VP16. С помощью слитых протеинов можно без помех анализировать определенные активаторы и/или ингибиторы, соответственно, их части например их активаторные домены, соответственно, ингибиторные домены, в отношении исследуемого ген-регуляторного элемента. Например, это возможно тогда, когда ДНК-связывающие домены происходят от ДНК-связывающего протеина, который не содержится в