Способ получения трансгенной мыши, не содержащей функциональный рецептор-1 рилизинг-фактора кортикотропина, способ идентификации агониста или антагониста рилизинг- фактора кортикотропина, урокортина или лиганда семейства рилизинг-фактора кортикотропина и способ скрининга соединений, которые являются аналогами или агонистами кортикостерона или кортикотропина, с использованием такой мыши

Способ получения трансгенной мыши, не содержащей функциональный рецептор-1 рилизинг-фактора кортикотропина, способ идентификации агониста или антагониста рилизинг- фактора кортикотропина, урокортина или лиганда семейства рилизинг-фактора кортикотропина и способ скрининга соединений, которые являются аналогами или агонистами кортикостерона или кортикотропина, с использованием такой мыши

Реферат

 

Изобретение относится к генной инженерии, эндокринологии и нейроэндокринологии. Предложен способ создания трансгенной мыши, не содержащей функциональный рецептор-1 рилизинг-фактора кортикотропина. Предложенный способ предусматривает получение позитивных эмбриональных стволовых клеток путем введения в них трансгена рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина. Далее полученные позитивные эмбриональные стволовые клетки вводят в мышиную бластоцисту с дальнейшим развитием из нее трансгенной мыши. Кроме того, предложен способ идентификации агониста рилизинг-фактора кортикотропина, урокортина или лиганда семейства рилизинг-фактора кортикотропина. Данный способ предусматривают введение тестируемого соединения или соединения плацебо трансгенной мыши, параллельное введение рилизинг-фактора кортикотропина, урокортина или лиганда семейства рилизинг-фактора кортикотропина мыши дикого типа с последующей оценкой и сравнением уровня реакции тревоги, эндокринного ответа на стресс и ритмов локомоторной активности у трансгенных мышей и мышей дикого типа. Кроме того, предложен способ идентификации антагониста рилизинг-фактора кортикотропина, урокортина или лиганда семейства рилизинг-фактора кортикотропина. Данный способ предусматривает введение тестируемого соединения или соединения плацебо трансгенной мыши, параллельное введение рилизинг-фактора кортикотропина, урокортина или лиганда семейства рилизинг-фактора кортикотропина мыши дикого типа с последующей оценкой и сравнением уровня реакции тревоги, эндокринного ответа на стресс и ритмов локомоторной активности у каждой мыши. Также предложен способ скрининга соединений, которые являются аналогами или агонистами кортикостерона или кортикотропина, с использованием такой мыши. Данный способ предусматривает введение самке трансгенной мыши после зачатия тестируемого соединения с последующим определением состояния легких у потомства, полученного от данной самки. Предложенная трансгенная мышь может быть использована в эндокринологии и нейроэндокринологии как модельное животное для анализа роли рецептора рилизинг-фактора в развитии организма, оценки его биологических функций. Предложенные способы могут быть использованы для получения антагонистов рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина, которые могут быть использованы для лечения или диагностики различных нейропсихиатрических нарушений и для улучшения обучаемости и памяти в случаях слабоумия. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 20 ил.

Перекрестная ссылка на близкие заявки

Данная заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США, имеющей порядковый номер 60/079874, поданной 30 марта 1998 г., которая в настоящее время отозвана.

Сведения о государственном финансировании

Данное изобретение частично было выполнено благодаря финансированию, полученному по гранту DK-26741 от National Institutes of Health. Поэтому федеральное правительство имеет определенные права на данное изобретение.

Область изобретения

Данное изобретение в основном относится к области эндокринологии и нейроэндокринологии. Более конкретно, данное изобретение связано с вопросами, касающимися рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина и животных с недостаточностью рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина.

Описание уровня техники

Выживаемость организма зависит от поддержания гомеостаза в ответ на условия стресса. Гомеостаз поддерживается благодаря адаптивным ответам, направленным на нейтрализацию действия неблагоприятных стимулов (Chrousos et al., 1992). Как правило, эти адаптивные ответы возникают в результате стимуляции нервных путей, связанных с самозащитой, а именно с вниманием, возбуждением и агрессивностью, и в результате ингибирования путей, которые обеспечивают вегетативные функции, такие как рост, размножение и питание (Chrousos et al., 1992). Рилизинг-фактор кортикотропина (РФК) является основным интегрирующим звеном эндокринного, нейроэндокринного, вегетативного и поведенческого ответов на стресс у млекопитающих (Owens and Nemeroff, 1991; Vale et al., 1981). Нарушение регуляции ответа на стресс приводит в итоге к довольно тяжелым психологическим и физиологическим последствиям. Действительно, хроническая гиперактивация системы рилизинг-фактора кортикотропина связана со многими аффективными расстройствами, такими как страх, неврастеническая анорексия и меланхолическая депрессия (Chrousos et al., 1992; Orth, 1992).

Кроме этой роли в ответе на стресс рилизинг-фактор кортикотропина также вовлечен в контроль познавательной деятельности. Известно, что рилизинг-фактор кортикотропина повышает обучаемость и улучшает память у грызунов (Behan et al., 1995, Diamant and de Wied, 1993, Koob and Bloom, 1985, Liang and Lee, 1988), и изменения в системе рилизинг-фактора кортикотропина связаны с некоторыми нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера и Паркинсона (De Souza, 1995). Однако влияние на развитие и физиологию этих зависящих от рилизинг-фактора кортикотропина путей, вовлеченных в явления, связанные со стрессом, и в познавательную деятельность, недостаточно выяснены.

Представления о плейотропной природе системы рилизинг-факторов кортикотропина недавно были расширены в результате открытия урокортина (УКН), второго представителя семейства рилизинг-факторов кортикотропина млекопитающих. Охарактеризованная последовательность урокортина среднего мозга крыс только на 45% сходна с последовательностью рилизинг-фактора кортикотропина (Vaughan et al., 1995). Хотя точная функция урокортина неизвестна, этот пептид может имитировать многие биологические воздействия рилизинг-фактора кортикотропина in vitro и in vivo (Spina et al., 1996; Turnbull et al., 1996; Vaughan et al., 1995) несмотря на то, что отличается по параметрам эффективности действия.

Биологическое действие представителей семейства рилизинг-факторов кортикотропина опосредовано связыванием со специфичными высоко аффинными мембранными рецепторами, которые относятся к подсемейству связывающих G-белки рецепторов, которые связывают небольшие лиганды, включая секретин, вазоактивный пептид кишечника и рилизинг-фактор гормона роста (Serge and Goldring, 1993). У нескольких видов были охарактеризованы два различных подтипа рецепторов рилизинг-фактора кортикотропина, рецептор-1 рилизинг-фактора кортикотропина и рецептор-2 рилизинг-фактора кортикотропина (Grigoriadis et al., 1996; Vale et al., 1997). Аминокислотные последовательности рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина и рецептора-2 рилизинг-фактора кортикотропина сходны примерно на 71% (Grigoriadis et al., 1996; Vale et al., 1997), рецепторы отличаются по фармакологическим свойствам и уникальны по характеру экспрессии в головном мозгу и периферических тканях. Во взрослом организме экспрессия рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина ограничена в основном отделами головного мозга, включая ствол мозга, мозжечок, кору головного мозга и медиальную перегородку, а также гипофиз (Chalmers et al., 1995; Potter et al., 1994).

В отличие от этого рецептор-2 рилизинг-фактора кортикотропина экспрессируется в некоторых периферических тканях, включая сердце, скелетную мускулатуру, желудочно-кишечный тракт и эпидидимис (Kishimoto et al., 1995; Lovenberg et al., 1995; Perrin et al., 1995; Stenzel et al., 1995), и экспрессия в мозгу преобладает в области латеральной перегородки и области гипоталамуса (Chalmers et al., 1995; Perrin et al., 1995). Хотя рецепторы каждого из подтипов могут связывать и рилизинг-фактор кортикотропина и урокортин, урокортин проявляет примерно в 40 раз более высокое сродство к рецептору-2 рилизинг-фактора кортикотропина, чем рилизинг-фактор кортикотропина (Vaughan et al., 1995). Эти результаты свидетельствуют о том, что урокортин может быть предполагаемым эндогенным лигандом рецептора-2 рилизинг-фактора кортикотропина. Однако специфичные молекулы рецептора рилизинг-фактора кортикотропина, которые инициируют каждый из различных адаптивных ответов на неблагоприятные стимулы, точно не установлены.

Роль различных компонентов системы рилизинг-факторов кортикотропина в развитии освещена неполно. В ходе эмбрионального и неонатального развития происходит временная и пространственная регуляция экспрессии рилизинг-фактора кортикотропина, и у мышей, содержащих молчащий ген рилизинг-фактора кортикотропина, проявляются эндокринные нарушения и аномалии развития (Muglia et al., 1995). Кроме того, рецепторы рилизинг-фактора кортикотропина присутствуют в отдельных областях головного мозга крыс уже на 15 день эмбрионального развития, и их экспрессия регулируется в ходе развития в ранний неонатальной период жизни (Avishai-Eliner et al., 1996; Insel et al., 1988). Однако существование различных подтипов рецептора рилизинг-фактора кортикотропина и дополнительных родственных рилизинг-фактору кортикотропина лигандов делает необходимым проведение систематического анализа биологических путей, опосредованных каждым из подтипов рецепторов рилизинг-фактора кортикотропина.

Таким образом, для предшествующего уровня техники характерен недостаток в понимании роли в развитии организма системы рилизинг-фактора кортикотропина, подтипов рецепторов рилизинг-фактора кортикотропина и отсутствие линий животных с недостаточностью рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина. Данное изобретение представляет собой осуществление этой давно необходимой и долгожданной работы в этой области.

Сущность изобретения

Чтобы проанализировать специфическую роль в развитии и биологические функции путей, опосредованных рецептором рилизинг-фактора кортикотропина, благодаря гомологичной рекомбинации в эмбриональных стволовых клетках были получены мыши с недостаточностью рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина. Обнаружено, что рецептор-1 рилизинг-фактора кортикотропина совершенно необходим как для развития надпочечника, так и для обеспечения нормального эндокринного ответа на стресс. Кроме того, у мутантных по рецептору-1 рилизинг-фактора кортикотропина мышей проявлялась ослабленная реакция тревоги и изменялся циркадный ритм локомоторной активности. Мыши с недостаточностью рецептора-1 рилизикг-фактора кортикотропина представляют собой удобную модельную систему для характеристики подтипов рецепторов рилизинг-фактора кортикотропина, участвующих в обеспечении различных адаптивных ответов на стресс и в познавательной деятельности.

Целенаправленное нарушение гена рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина отчетливо показало специфическую роль в развитии организма рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина, который позволяет обеспечить секрецию АКТГ, достаточную для постнатального развития, и функционирование продуцирующей кортикостероиды области надпочечника. Мутация гена рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина позволила также доказать ключевую роль этого рецептора в опосредовании эндокринного и поведенческого ответов на стресс и выявить новую функцию зависимых от рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина путей в модулировании ритмов локомоторной активности. Для четкого разграничения вклада каждого из представителей системы рилизинг-фактора кортикотропина в развитие организма и поддержания гомеостаза необходимо создание животных с мутациями, которые затрагивают другие компоненты сигнальных путей рилизинг-фактора кортикотропина, причем эти животные затем могут быть скрещены с линиями мышей, описанными в данном изобретении.

Одной из целей данного изобретения является создание трансгенных мышей с недостаточностью рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина.

В одном осуществлении данного изобретения разработан способ получения трансгенных мышей, имеющих существенную недостаточность рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина.

В еще одном осуществлении данного изобретения разработан способ, с помощью которого может быть идентифицирован агонист или антагонист рилизинг-фактора кортикотропина, урокортин или близкие лиганды, которые действуют не через рецептор-1 рилизинг-фактора кортикотропина, а через другие рецепторы.

Следующий и дальнейшие аспекты, признаки и преимущества данного изобретения будут очевидны из последующего описания предпочтительных в настоящее время осуществлении. Эти осуществления даны с целью раскрытия сущности изобретения.

Краткое описание чертежей

Прилагаемые чертежи включены сюда с тем, чтобы перечисленные выше признаки, преимущества и объекты изобретения стали очевидными и могли быть поняты в деталях. Эти чертежи являются частью подробного описания. Однако следует отметить, что прилагаемые чертежи лишь иллюстрируют предпочтительные осуществления изобретения и их не следует рассматривать как ограничение объема притязаний изобретения.

На фигуре 1 показано создание мышей с недостаточностью рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина. Фигура 1А: (вверху) геномная организация гена рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина, показаны экзоны 4-13. (В середине) конструкция, которая целенаправленно используется для гомологичной рекомбинации. Фрагмент HindIII-Xbal (экзоны 5-8), кодирующий последние двенадцать аминокислот первого внеклеточного домена и последовательность до четвертого трансмембранного домена, был удален и замещен кассетой PGK-neo. (Внизу) полученный в результате гомологичной рекомбинации мутантный локус. Фигура 1В: нарушенный аллель рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина был идентифицирован путем Саузерн-анализа с использованием внешней по отношению к отделу делеции BamHI-HindIII пробы, которая позволяет выявить полосу дикого типа длиной 8,0 т.п.н. и мутантную полосу длиной 6,3 т.п.н. соответственно; J1 (родительская линия ЭС клеток), J1- +/- по рецептору-1 рилизинг-фактора кортикотропина (ЭС клон гетерозиготный по мутации). Фигура 1С: стимулированная рилизинг-фактором кортикотропина (РФК) секреция АКТГ в монослойных культурах из целых гипофизов, собранных от мышей дикого типа и мутантов по рецептору-1 рилизинг-фактора кортикотропина (рецептор-1 рилизинг-фактора кортикотропина -/-).

На фигуре 2 показаны мутантные мыши с недостаточностью рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина (РФКР-1) в надпочечниках. Фигура 2А: заметно сниженные концентрации кортикостерона в плазме мышей с недостаточностью рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина. Образцы крови собирали от самцов и самок дикого типа и мышей, мутантных по рецептору-1 рилизинг-фактора кортикотропина (рецептор-1 рилизинг-фактора кортикотропина -/-) утром (6 утра) и после полудня (4 после полудня), и определяли концентрации кортикостерона в плазме (среднее ± стандартное отклонение; ***Р<0,001). Фигура 2В: мутантные по рецептору-1 рилизинг-фактора кортикотропина мыши с выраженной атрофией надпочечников. Сделаны срезы надпочечников самок мышей дикого типа и мышей -/- по рецептору-1 рилизинг-фактора кортикотропина, окрашены гематоксилином и эозином. Отмечена явная гипоплазия отдела пучковой зоны zona fasciculata (ZF), в котором происходит наработка кортикостерона. Отделы клубочковой зоны zona glomerulosa (ZG), сетчатой зоны zona retlcularis (ZR) и мозгового вещества (М) оставались относительно неизменными. Фигура 2С: развитие клеток, вырабатывающих кортикотропины у мышей, мутантных по рецептору-1 рилизинг-фактора кортикотропина. Приготовлены срезы гипофизов мышей дикого типа и мышей -/- по рецептору-1 рилизинг-фактора кортикотропина, и клетки, вырабатывающие кортикотропины были локализованы с помощью анти-АКТГ антител. Не наблюдалось различий в количестве кортикотропинвырабатывающих клеток. (А) передняя доля гипофиза, (I) промежуточная доля.

На фигуре 3 показан повышенный уровень экспрессии рилизинг-фактора кортикотропина при неизменном уровне экспрессии аргинин вазопрессина в гипоталамусе мышей с недостаточностью рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина. В результате иммуногистохимической локализации рилизинг-фактора кортикотропина (фигура 3А) и аргинин вазопрессина (фигура 3В) в паравентрикулярных ядрах гипоталамуса (ПВЯ) мышей дикого типа и мышей -/- по рецептору-1 рилизинг-фактора кортикотропина показан повышенный уровень экспрессии рилизинг-фактора кортикотропина у мутантных животных. В других отделах мозга, продуцирующих рилизинг-фактор кортикотропина, в частности в миндалевидном теле, уровень экспрессии не был увеличен (данные не показаны).

На фигуре 4 показан ослабленный эндокринный ответ на стресс у мышей с недостаточностью рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина. Были измерены базальные уровни и уровни после стресса АКТГ (фигура 4А) и кортикостерона (фигура 4В) у мышей дикого типа и мутантных мышей обоих полов, которых подвергали 10-минутному физическому ограничению движения (среднее ± стандартное отклонение; *Р<0,05, ***Р<0,001).

На фигуре 7 показано гормональное восстановление дефекта надпочечников у мышей с недостаточностью рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина. Фигура 7А: на окрашенных гематоксилином и эозином срезах надпочечников, собранных от мышей дикого типа и мышей с недостаточностью рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина на 3 день постнатального развития, не выявляются различия в морфологии надпочечников во время раннего постнатального периода. Фигура 7В: надпочечники, собранные от мышей -/- по рецептору-1 рилизинг-фактора кортикотропина, которых дважды в день, начиная с 10-21 дня постнатального развития, обрабатывали АКТГ или одним растворителем. Отмечен увеличенный размер и толщина отдела zona fasciculata надпочечников, мутантных по рецептору-1 рилизинг-фактора кортикотропина мышей, обработанных АКТГ. Фигура 7С: концентрации АКТГ в плазме на 10 день постнатальной жизни в образцах, собранных от мышей -/- по рецептору-1 рилизинг-фактора кортикотропина или мышей дикого типа (среднее ± стандартное отклонение; **Р<0,02).

В соответствии с данным изобретением могут быть использованы традиционные молекулярно-биологические, микробиологические технологии и технологии рекомбинантных ДНК, разработанные в данной области. Такие технологии полно раскрыты в литературе. Смотри, например, Maniatis, Fritsch and Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach," Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1984); "Oligonucleotide Synthesis"(M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames and S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription and Translation" [B.D. Hames and S.J. Higgins eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; В. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984). Поэтому, если здесь фигурируют следующие термины, то их следует понимать так, как изложено ниже.

Термин “молекула ДНК” относится к полимерной форме дезоксирибонуклеотидов (аденин, гуанин, тимин или цитозин) либо в одноцепочечной форме, либо в форме двухцепочечной спирали. Этот термин относится только к первичной и вторичной структуре молекулы, при этом молекула может иметь любую третичную форму без ограничения. Таким образом, этот термин включает в себя двухцепочечную ДНК, обнаруживаемую наряду с другими формами в виде линейных молекул ДНК (например, фрагменты рестрикции), вирусов, плазмид и хромосом. При обсуждении здесь приводятся структуры в соответствии со стандартным правилом обозначения последовательностей в направлении от 5' к 3' концу вдоль нетранскрибируемой цепи ДНК (т.е. цепи, имеющей последовательность гомологичную мРНК).

“Вектор” представляет собой репликон, такой как плазмида, фаг или космида, к которому может быть присоединен другой фрагмент ДНК так, чтобы могла осуществляться репликация присоединенного фрагмента. “Репликон” представляет собой генетический элемент (например, плазмиду, хромосому, вирус), который функционирует in vivo как автономная единица репликации ДНК; т.е. способен к репликации под своим собственным контролем. Термин “точка начала репликации” относится к таким последовательностям ДНК, которые принимают участие в синтезе ДНК. “Контролирующая экспрессию последовательность” - это последовательность ДНК, которая контролирует и регулирует транскрипцию и трансляцию другой последовательности ДНК. Кодирующая последовательность в клетке является “оперативно сцепленной” или “под контролем” последовательности, контролирующей транскрипцию или трансляцию, тогда, когда РНК-полимераза транскрибирует мРНК с кодирующей ее последовательности, с этой мРНК затем транслируется белок, информация о котором записана в кодирующей последовательности.

Как правило, экспрессирующие векторы, содержащие промоторные последовательности, которые способствуют эффективной транскрипции и трансляции встроенного фрагмента ДНК, используются в соответствии с выбранным хозяином. Обычно экспрессирующий вектор содержит начало репликации, промотор(ры), терминатор(ры), а также специфичные гены, которые способны обеспечить селекцию клеток по фенотипу, обычно называемые “селектируемыми маркерными генами” или “селектируемыми маркерами”. Ферментация и культивирование трансформированных хозяев может проводиться в соответствии со способами, известными в данном области, с помощью которых достигается оптимальный рост клеток.

“Кодирующая последовательность” ДНК представляет собой двухцепочечную последовательность ДНК, с которой in vivo транскрибируется и транслируется полипептид в том случае, когда эта последовательность помещена под контроль соответствующей регуляторной последовательности. Границы кодирующей последовательности определяются стартовым кодоном на 5' (амино) конце и стоп кодоном трансляции на 3' (карбоксильном) конце. Кодирующая последовательность может включать в себя прокариотические последовательности, кДНК, синтезированную на мРНК эукариот, геномные последовательности ДНК эукариот (например, млекопитающих) и даже синтетические последовательности ДНК, но при этом, не ограничиваясь только названными последовательностями. Сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции обычно будут локализованы вблизи 3' конца кодирующей последовательности.

“кДНК” является сокращенным определением ДНК-копии или комплементарной ДНК и является продуктом реакции обратной транскрипции с мРНК транскрипта. “Экзон” представляет собой экспрессируемую последовательность, транскрибируемую в генном локусе, тогда как “интрон” представляет собой неэкспрессируемую последовательность, находящуюся в генном локусе.

Последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию, представляют собой регуляторные последовательности ДНК, такие как промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, терминаторы и им подобные, которые обеспечивают экспрессию кодирующей последовательности в клетке-хозяине. “Цис-элемент” - это нуклеотидная последовательность, называемая также “консенсусной последовательностью” или “мотивом”, которая взаимодействует с другими белками, которые могут стимулировать или подавлять экспрессию специфичного генного локуса. В состав кодирующей последовательности может быть также включена “сигнальная последовательность”. Эта последовательность кодирует сигнальный пептид, расположенный на N-конце полипептида, который сообщается с клеткой-хозяином и направляет полипептид в соответствующее место в клетке. Сигнальная последовательность может быть ассоциирована с рядом белков, присущих прокариотам и эукариотам.

“Промоторная последовательность” представляет собой регуляторный отдел ДНК, способный связывать РНК полимеразу в клетке и инициировать транскрипцию кодирующей последовательности ниже по течению (3’ направление). В соответствии с целью данного изобретения промоторная последовательность определена как последовательность, ограниченная на 3' конце сайтом инициации транскрипции и расположенная выше по течению (5' направление) так, чтобы включить минимальное число нуклеотидов или элементов, необходимых для инициации транскрипции на уровне, который превышает фоновый уровень и может быть обнаружен. В составе промоторной последовательности может быть выявлен сайт инициации транскрипции, а также связывающий белки домен (последовательность консенсуса), ответственный за связывание РНК-полимеразы. Часто, но не всегда промоторы эукариот содержат ТАТА-боксы и САТ-боксы. Промоторы прокариот содержат в дополнение к -10 и -35 последовательностям консенсуса последовательности Шайн-Далгарно (Shine-Dalgarno).

Термином “олигонуклеотид” обозначается молекула, состоящая из двух или более дезоксирибонуклеотидов, предпочтительно более чем из трех. Его точный размер зависит от многих факторов, которые, в свою очередь, зависят от основного назначения и применения олигонуклеотида. Используемый здесь термин “праймер” относится к олигонуклеотиду, который получают либо естественным путем в виде очищенного продукта переваривания рестриктазами, либо синтетическим путем и который способен действовать как точка инициация синтеза, если помещается в условия, при которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера, который комплементарен "цепи нуклеиновой кислоты”, т.е. в присутствии нуклеотидов и индуцирующих агентов, таких как ДНК-полимераза, и соответствующий температуре и рН. Праймер может быть либо одноцепочечным, либо двухцепочечным и должен быть достаточно длинным, чтобы направлять синтез продукта необходимой протяженности в присутствии индуцирующего агента. Точная длина праймера будет зависеть от многих факторов, включая температуру, источник получения праймера и используемый способ. Например, для применения в целях диагностики в зависимости от сложности последовательности мишени олигонуклеотидный праймер обычно содержит 15-25 или более нуклеотидов, хотя он может содержать меньше нуклеотидов.

Праймеры выбираются так, чтобы они существенно были комплементарны разным цепям конкретной последовательности ДНК мишени. Это означает, что праймеры должны быть комплементарны в такой степени, которая достаточна для гибридизации с соответствующими им цепями. Поэтому не требуется, чтобы последовательность праймера была точным отражением последовательности матрицы. Например, к 5' концу праймера может быть присоединен некомплементарный нуклеотидный фрагмент, при этом сохраняется комплементарность цепи ДНК остальной части последовательности праймера. В альтернативном случае некомплементарные основания или более длинные последовательности могут быть встроены в праймер при условии, что последовательность праймера будет достаточно комплементарна последовательности или будет к тому же гибридизоваться и тем самым формировать матрицу для синтеза протяженного продукта.

Термины “эндонуклеазы рестрикции” и “ферменты рестрикции” в том смысле, в котором здесь используются, относятся к ферментам, которые разрезают двухцепочечную ДНК внутри или вблизи специфичной нуклеотидной последовательности.

Термин “технология рекомбинантной ДНК” относится к технологиям объединения двух гетерологичных молекул ДНК обычно в результате лигирования ДНК различных организмов в условиях in vitro. Рекомбинантные молекулы ДНК, как правило, получают в экспериментах, используемых в генетической инженерии. К синонимам термина относятся “сплайсинг генов”, “молекулярное клонирование” и “генетическая инженерия”. Конечным продуктом этих манипуляций является “рекомбинант”, “рекомбинантная молекула” или “трансген”.

Клетка оказывается “трансформированной”, “трансфицированной” или “трансдуцированной” экзогенной или гетерологичной ДНК тогда, когда такая ДНК введена внутрь клетки. Трансформирующая ДНК может быть либо интегрирована в геном клетки (ковалентно связана), либо оставаться неинтегрированной. Например, в клетках прокариот, дрожжей и млекопитающих трансформирующая ДНК может сохраняться в эписомном элементе, таком как вектор или плазмида. Что касается клеток эукариот, стабильно трансформированная клетка - это такая клетка, в которой трансформирующая ДНК оказывается интегрированной в хромосому, так что она наследуется дочерними клетками посредством репликации хромосомы. Показателем этой стабильности является способность эукариотической клетки порождать линии клеток или клоны, состоящие их популяции дочерних клеток, которые содержат трансформирующую ДНК. “Клон” - это популяция клеток, полученных от одной единственной клетки или клетки-предшественницы путем митоза. “Линия клеток” - это клон исходной клетки, который способен стабильно расти в условиях in vitro, сменяя много поколений. Организм, такой как растение или животное, который трансформирован экзогенной ДНК, называется “трансгенным”.

Термин “хозяин” в используемом здесь смысле относится не только к прокариотам, но также и к эукариотам, таким как клетки дрожжей, растений и животных. Молекула рекомбинантной ДНК или ген, который кодирует белок по данному изобретению, может быть использован для трансформации хозяина с помощью любой технологии, общеизвестной специалистам, постоянно работающим в этой области. Одним из предпочтительных вариантов является применение векторов, содержащих кодирующие последовательности гена, в целях трансформации прокариот. В качестве хозяина могут использоваться прокариоты Е. coli, S. tymphimurium, Serratia marcescens и Bacillus subtilis. К хозяевам эукариотам относятся дрожжи, такие как Pichia pastoris, клетки млекопитающих и клетки насекомых, и более предпочтительно клетки растений, такие как Arabidopsis thaliana и Tabaccum nicotiana.

Две последовательности ДНК “в достаточной степени гомологичны” в том случае, когда, по меньшей мере, примерно 75% (предпочтительно, по меньшей мере, примерно 80% и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 90% и 95%) нуклеотидов совпадают на участке последовательности ДНК определенной протяженности. Последовательности, которые в достаточной степени гомологичны, могут быть идентифицированы путем сравнения последовательностей с помощью стандартных компьютерных программ, имеющихся для банков данных последовательностей, или в экспериментах по Саузерн-гибридизации, например, в жестких условиях, которые установлены для конкретной системы. Подходящие условия гибридизации подбираются специалистами в данной области. Смотри, например, Maniatis et al., указано выше; DNA Cloning, Vols. I and II, указано выше; Nucleic Acid Hybridization, указано выше.

“Гетерологичный” отдел конструкции ДНК - это идентифицируемый участок ДНК в пределах большей по размеру молекулы ДНК, который в природе не ассоциирован с этой большей по размеру молекулой ДНК. Таким образом, в том случае, когда гетерологичный отдел кодирует ген млекопитающих, ген будет, как правило, фланкирован ДНК, которая не фланкирует геномную последовательность ДНК млекопитающих в геноме исходного организма. В другом примере кодирующая последовательность представляет собой конструкцию, в которой кодирующая последовательность как таковая не встречается в природе (например, кДНК, в которой геномная кодирующая последовательность содержит интроны или синтетические последовательности, имеющие кодоны, отличные от таковых в нативном гене). Как было здесь установлено, аллельные варианты или мутационные события, происходящие естественным путем, не увеличивают гетерологичный отдел ДНК.

Стандартное Нозерн-блот исследование может быть использовано для установления относительных количеств мРНК в клетке или ткани, полученных из растений или других трансгенных тканей, в соответствии с традиционной технологией Нозерн-гибридизации, которая известна специалистам, постоянно работающим в этой области. В альтернативном случае может быть использовано стандартное Саузерн-блот исследование для подтверждения наличия и определения числа копий гена в трансгенных системах в соответствии с традиционной технологией Саузерн-гибридизации, известной специалистам, постоянно работающим в данной области. И в случае применения Нозерн-блота, и в случае Саузерн-блота используются гибридизационные зонды, например радиоактивно-меченная кДНК, или фрагмент последовательности ДНК, длиной, по меньшей мере, равной 20 (предпочтительно, по меньшей мере, 30, более предпочтительно, по меньшей мере, 50 и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 100), следующих друг за другом нуклеотидов. Зонд для ДНК гибридизации может быть помечен любым из многочисленных способов, известных специалистам в данной области.

В большинстве случаев меткой в этих исследованиях служат радиоактивные элементы, ферменты, химические вещества, которые способны к флуоресценции при действии ультрафиолетового излучения, и другие. Известно большое количество флуоресцирующих материалов, и они могут быть использованы в качестве метки. К ним относятся, например, флуоресцеин, родамин, аурамин, Texas красный, АМСА синий и Lucifer желтый. Особым материалом для регистрации являются антикроличьи антитела, полученные у коз и конъюгированные с флуоресцеином с помощью изотиоцианата. Белки могут быть также помечены радиоактивным элементом или ферментом. Радиоактивную метку можно обнаружить любым доступным в настоящее время способом счета. Предпочтительно изотопы можно выбрать из группы, в которую входят ³H, ¹⁴С, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I и ¹⁸⁶Re.

Также применяются ферментные метки, они могут быть обнаружены с помощью любой используемой в настоящее время колориметрической, спектрофотометрической, флуороспектрофотометрической, амперометрической или газометрической технологии. Фермент конъюгируют с выбранной частицей в результате реакции образования межмолекулярных мостиков, в частности, с помощью карбодиимида, диизоцианатов, глутаральдегида и им подобных. Многие ферменты, которые можно использовать в этих процедурах, известны и могут быть применены. Предпочтительными ферментами являются пероксидаза, -глюкуронидаза, -D-глюкозидаза, -D-галактозидаза, уреаза, глюкозоксидаза плюс пероксидаза и щелочная фосфатаза. Патенты США №№ 3654090, 3850752 и 4016043 посвящены представлению путем примеров альтернативных материалов для мечения и способов мечения.

Целью данного изобретения является создание трансгенных мышей с недостаточностью рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина. Такая недостаточность приводит в итоге к ослабленной реакции тревоги у мышей, ослабленному эндокринному ответу на стресс и измененным ритмам локомоторной активности по сравнению с контрольными мышами. Впоследствии эти мыши могут быть скрещены с мышами других линий, чтобы получить потомство.

Объектом данного изобретения является также способ, с помощью которого могут быть идентифицированы агонисты или антагонисты рилизинг-фактора кортикотропина, урокортин или родственные лиганды, которые действуют не через рецептор-1 рилизинг-фактора кортикотропина, а через другие рецепторы. Способ включает в себя введение тестируемого соединения или плацебо трансгенным мышам с недостаточностью рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина и определение влияния тестируемого соединения или плацебо на уровень развития реакции тревоги, эндокринный ответ на стресс и ритмы локомоторной активности у мышей. Изменение уровня реакции тревоги, эндокринного ответа на стресс или ритмов локомоторной активности служит признаком агониста или антагониста рилизинг-фактора кортикотропина, урокортина или родственных лигандов, действующих не через рецептор-1 рилизинг-фактора кортикотропина, а через другой рецептор. Этими другими рецепторами могут быть рецептор-2 рилизинг-фактора кортикотропина или новые, не известные ранее рецепторы рилизинг-фактора кортикотропина.

Целью данного изобретения является также способ получения трансгенных мышей, обладающих существенной недостаточностью рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина. Этот способ включает в себя получение позитивных ЭС клеток путем введения в эмбриональные стволовые клетки трансгена рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина, полученного на основе гена рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина мышей. Трансген включает в себя ген, кодирующий селектируемый маркер, в положении от 5 до 8 экзона гена рецептора-1 рилизинг-фактора кортикотропина, при этом ЭС клетки, которые выживают и растут в условиях отбора на селектируемый маркер, являются позитивными ЭС клетками, и трансгенных мышей получают путем введения позитивных ЭС клеток в бластоциты C57BL/6. Эти трансгенные мыши могут быть скрещены, чтобы получить трансгенных мышей, гомозиготных по трансгену.

Целью данного изобретения является также способ скрининга соединений, которые являются аналогами или агонистами кортикостерона или корт