2236252 - Аттенуированные вирусы с минус-цепью с измененной антагонистической в отношении интерферона активностью для применения в качестве вакцин и фармацевтических веществ

Аттенуированные вирусы с минус-цепью с измененной антагонистической в отношении интерферона активностью для применения в качестве вакцин и фармацевтических веществ

Реферат

Данное изобретение относится в общем к аттенуированным РНК-вирусам с минус-цепью, имеющим нарушенную способность противодействовать клеточному интерферон-(ИФН)-ответу, и применению таких аттенуированных вирусов в вакцинных и фармацевтических композициях, также к развитию и применению ИФН-недостаточных систем для отбора таких аттенуированных вирусов. В частности, данное изобретение относится к аттенуированным вирусам гриппа, имеющим модификации, относящиеся к гену NS1, которые уменьшают или устраняют способность продукта гена NS1 противодействовать клеточному ИФН-ответу. Эти мутантные вирусы реплицируются in vivo, но демонстрируют уменьшенную патогенность и, следовательно, хорошо пригодны для применения в живых вирусных вакцинах и фармацевтических композициях. Преимущество изобретения заключается в разработке препаратов на основе аттенуированных вирусов, позволяющих обеспечить иммунный ответ, достаточный для удовлетворения последующих заражений. 23 н. и 27 з.п. ф-лы, 10 табл., 3 ил.

Исследование, отраженное в данной заявке, поддерживалось, частично, грантом от Национального Института здравоохранения, и правительство может иметь определенные права в отношении данного изобретения.

Данная заявка является частичным продолжением заявки с регистрационным номером 60/117 683, поданной 29 января 1999 года; заявки с регистрационным номером 60/108 832, поданной 18 ноября 1998 года, и заявки с регистрационным номером 60/089 103, поданной 12 июня 1998 года, каждая из которых включена здесь в качестве ссылки в полном виде.

1. ВВЕДЕНИЕ

В конкретном варианте, данное изобретение относится к аттенуированным вирусам гриппа, имеющим модификации, относящиеся к гену NS1, которые уменьшают способность продукта гена NS1 противодействовать клеточному ИФН-ответу. Эти мутантные вирусы реплицируются in vivo, но демонстрируют уменьшенную патогенность и, следовательно, хорошо пригодны для применения в живых вирусных вакцинах и фармацевтических композициях.

2. ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

2.1 ВИРУС ГРИППА

Семейства вирусов, содержащие оболочку и одноцепочечную РНК негативного (негативно-смыслового) генома, классифицируются на группы, имеющие несегментированные геномы (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae и вирус болезни Borna), или группы, имеющие сегментированные геномы (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae и Arenaviridae). Семейство Orthomyxoviridae, описанное подробно ниже и используемое здесь в примерах, включает в себя вирусы гриппа, вирусы типов А, В и С, а также вирусы Thogoto и Dhori и вирус инфекционной анемии лосося.

Вирионы гриппа состоят из внутреннего рибонуклеопротеинового кора (спирального нуклеокапсида), содержащего геном в виде одноцепочечной РНК, и наружной липопротеиновой оболочки, выстланной внутри белком матрикса (M1). Сегментированный геном вируса гриппа А состоит из 8 молекул (семь для гриппа С) линейных, имеющих отрицательную полярность, одноцепочечных РНК, которые кодируют десять полипептидов, в том числе: белки РНК-зависимой РНК-полимеразы (РВ2, РВ1 и РА) и нуклеопротеин (NP), которые образуют нуклеокапсид; белки мембраны матрикса (M1, M2); два поверхностных гликопротеина, которые выступают из липидсодержащей оболочки: гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA); неструктурный белок (NS1) и белок ядерного транспорта (NEP). Транскрипция и репликация этого генома имеет место в ядре, а сборка происходит через почкование на плазматической мембране. Эти вирусы могут рекомбинировать гены во время смешанных инфекций.

Вирусы гриппа адсорбируются через НА к сиалилолигосахаридам в гликопротеинах и гликолипидах клеточной мембраны. После эндоцитоза вириона в молекуле НА происходит конформационное изменение в клеточной эндосоме, которое облегчает слияние мембран, запуская декапсидацию вируса. Нуклеокапсид мигрирует в ядро, где транскрибируется вирусная мРНК. Вирусная мРНК транскрибируется по уникальному механизму, в котором вирусная эндонуклеаза отщепляет кэпированный 5'-конец от клеточных гетерологичных мРНК, который затем служит в качестве праймеров для транскрипции вирусных РНК-матриц вирусной транскриптазой. Транскрипты терминируются в сайтах, расположенных на расстоянии 15-22 оснований от концов их матриц, где олиго(U)-последовательности действуют в качестве сигналов для присоединения поли(А)-трактов. Из полученных таким образом восьми вирусных РНК-молекул шесть являются моноцистронными матрицами, которые транслируются непосредственно в белки, представляющие НА, NA, NP и белки вирусной полимеразы, РВ2, РВ1 и РА. Два других транскрипта подвергаются сплайсингу, причем каждый дает две мРНК, которые транслируются в различных рамках считывания с образованием M1, M2, NS1 и NEP. Другими словами, восемь вирусных сегментов РНК кодируют десять белков: девять структурных и один неструктурный. Гены вируса гриппа и их белковые продукты суммированы в таблице 1.

Геном вируса гриппа А содержит восемь сегментов одноцепочечной РНК отрицательной полярности, кодирующих один неструктурный и девять структурных белков. Неструктурный белок NS1 находится в избытке в инфицированных вирусом гриппа клетках, но не детектировался в вирионах. NS1 является фосфопротеином, обнаруживаемым в ядре в начале инфекции, а также в цитоплазме на более поздних стадиях вирусного цикла (King et al., 1975, Virology 64: 378). Исследования с чувствительными к температуре (ts) мутантами гриппа, несущими повреждения в гене NS, предполагают, что белок NS1 является транскрипционным и посттранскрипционным регулятором механизмов, при помощи которых этот вирус способен ингибировать экспрессию генов клетки-хозяина и стимулировать синтез вирусных белков. Подобно многим другим белкам, которые регулируют посттранскрипционные процессы, белок NS1 взаимодействует со специфическими последовательностями и структурами РНК. Сообщалось, что белок NS1 связывается с различными типами РНК, в том числе: vPHK, поли-А, snPHK U6, 5'-нетранслируемым районом как вирусных мРНК, так и dsPHK (Qiu et al., 1995, RNA 1: 304; Qiu et al., 1994, J.Virol. 68: 2425; Hatada Fukuda 1992, J.Gen. Virol. 73:3325-9. Экспрессия белка NS1 из кДНК в трансфицированных клетках была связана с несколькими эффектами: ингибированием ядерно-цитоплазматического транспорта мРНК, ингибированием сплайсинга пре-мРНК, ингибированием полиаденилирования мРНК хозяина и стимуляцией трансляции вирусной мРНК (Fortes et al., 1994, EMBO J. 13: 704; Enami, et al., 1994, J. Virol. 68: 1432; de la Luna, et al., 1995, J. Virol. 69:2427; Lu, et al., 1994, Genes Dev. 8: 1817; Park, et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 28433; Nemeroff et al., 1998, Mol. Cell. 1: 1991; Chen, et al., 1994, EMBO J. 18: 2273-83).

2.2 АТТЕНУИРОВАННЫЕ ВИРУСЫ

Инактивированные вирусные вакцины получают “уничтожением” вирусного патогена, например, нагреванием или обработкой формалином, так чтобы он не был способен к репликации. Инактивированные вакцины имеют ограниченную применимость, так как они не обеспечивают долгосрочного иммунитета и, следовательно, дают ограниченную защиту. Альтернативный подход к получению вирусных вакцин включает в себя применение аттенуированных живых вирусных вакцин.

Аттенуированные вирусы способны к репликации, но не являются патогенными и, следовательно, обеспечивают долгосрочный иммунитет и дают большую защиту. Однако общепринятые способы получения аттенуированных вирусов включают в себя случайное выделение мутантов с измененным спектром литического действия (круга хозяев), многие из которых является чувствительными к температуре; например, вирус пассируют через неприродных хозяев и отбирают потомство вирусов, которое является иммуногенным, но еще не патогенным.

Общепринятым субстратом для выделения и выращивания вирусов гриппа для целей получения вакцин являются яйца кур с развивающимися эмбрионами. Вирусы гриппа обычно выращивают в течение 2-4 дней при 37С в 10-11-дневных яйцах. Хотя большая часть первичных изолятов вирусов гриппа А и В человека растет лучше в амниотическом мешке эмбрионов, после 2-3 пассажей вирусы становятся адаптированными к росту в клетках аллантоисной полости, которая доступна снаружи яйца (Murphy B.R. and R.G.Webster, 1996. Orthomyxoviruses, p.1397-1445. In Fields Virology, Lippincott-Raven P.A.).

Технология рекомбинантных ДНК и способы генной инженерии, теоретически, могли бы предоставить превосходный подход к получению аттенуированного вируса, так как могли бы быть целенаправленно сконструированы специфические мутации в вирусном геноме. Однако генетические изменения, требующиеся для аттенуации вирусов, не являются известными или предсказуемыми. Обычно, попытки использования технологии рекомбинантных ДНК к конструированию вирусных вакцин были в основном направлены на получение субъединичных вакцин, которые содержат только белковые субъединицы патогена, участвующие в иммунном ответе, экспрессируемые в рекомбинантных вирусных векторах, таких как вирус коровьей оспы или бакуловирус. Не так давно, способы рекомбинантных ДНК были использованы в попытке получить делеционные мутанты герпесвируса или полиовирусы, которые имитируют аттенуированные вирусы, обнаруживаемые в природе, или известные мутанты с измененным спектром литического действия (т.е. мутанты, расширяющие круг хозяев). До 1990 года РНК-вирусы с минус-цепью не поддавались сайт-специфическим манипуляциям вообще и, следовательно, не могли быть генетически сконструированными.

Аттенуированные живые вирусы гриппа, полученные до сих пор, не могут быть способными к супрессии интерферонового ответа в хозяине, в котором они реплицируются. Таким образом, хотя эти вирусы являются выгодными, поскольку они являются иммуногенными, но не патогенными, их трудно размножать в общепринятых субстратах для целей приготовления вакцин. Кроме того, аттенуированные вирусы могут обладать свойствами вирулентности, которые являются такими слабыми, что не позволят хозяину обеспечить иммунный ответ, достаточный для удовлетворения последующих заражений.

3. СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к аттенуированным РНК-вирусам с минус-цепью, имеющим ослабленную способность противодействовать клеточному ИФН-ответу, и применению таких вирусов в вакцинных и фармацевтических композициях. Эти мутантные вирусы с нарушенной антагонистической в отношении ИФН активностью являются аттенуированными - они являются инфекционными, могут реплицироваться in vivo с обеспечением субклинических уровней инфекции и не являются патогенными. Таким образом, они являются идеальными кандидатами для живых вирусных вакцин. Кроме того, аттенуированные вирусы могут индуцировать сильный ИФН-ответ, который имеет другие биологические последствия in vivo, обеспечивая защиту против последующих инфекционных заболеваний, и/или индуцируя противоопухолевые ответные реакции. Таким образом, аттенуированные вирусы могут быть использованы фармацевтически, для предупреждения или лечения других инфекционных заболеваний, рака у индивидуумов с высоким риском в отношении рака и/или заболеваний, излечиваемых посредством ИФН.

РНК-вирусы с минус-цепью, используемые в соответствии с данным изобретением, включают в себя как сегментированные, так и несегментированные вирусы; предпочтительные варианты включают в себя, но не ограничиваются ими, вирус гриппа, респираторно-синцитиальный вирус (RSV), вирус ньюкаслской болезни (NDV), вирус везикулярного стоматита (VSV) и вирус парагриппа (PIV). Вирусы, используемые в данном изобретении, могут быть выбраны из природно встречающихся штаммов, вариантов или мутантов; мутагенизированных вирусов (например, генерируемых экспонированием мутагенами, повторяемыми пассированиями и/или перепрививками в непермиссивных хозяевах); вирусных рекомбинантов (реассортантов) (в случае сегментированных вирусных геномов) и/или генетически сконструированных вирусов (например, с использованием способов "обратной генетики"), имеющих желательный фенотип, т.е. нарушенную способность противодействовать клеточному ИФН-ответу. Мутант или генетически сконструированный вирус может быть выбран на основе различающегося роста в ИФН-недостаточных системах в сравнении с ИФН-компетентными системами. Например, могут быть выбраны вирусы, которые растут в ИФН-недостаточной системе, но не в ИФН-компетентной системе (или растут хуже в ИФН-компетентной системе).

Аттенуированный вирус, выбранный таким образом, может быть сам использован в качестве активного ингредиента в вакцинных или фармацевтических композициях. Альтернативно, аттенуированный вирус может быть использован в качестве вектора или "каркаса" рекомбинантно полученных вакцин. Для этой цели, способ "обратной генетики" может быть использован для конструирования мутаций или введения чужеродных эпитопов в аттенуированный вирус, который может служить в качестве "родительского" штамма. Таким путем, могут быть сконструированы вакцины для иммунизации против вариантов штаммов или, альтернативно, против полностью отличающихся инфекционных агентов или антигенов заболеваний. Например, может быть сконструирован аттенуированный вирус для экспрессии нейтрализующих эпитопов других предварительно выбранных штаммов. Альтернативно, эпитопы вирусов, иных, чем РНК-вирусы с минус-цепью, могут быть встроены в этот аттенуированный мутантный вирус (например, gp160, gp120 или gp41 ВИЧ). Альтернативно, в этот вирус могут быть встроены эпитопы невирусных инфекционных патогенов (например, паразитов, бактерий, гибков). Еще в одной альтернативе, могут быть приготовлены противораковые вакцины, например, встраиванием опухолевых антигенов в аттенуированный вирусный каркас.

В конкретном варианте, включающем в себя РНК-вирусы с сегментированными геномами, способы реаранжировки (вирусной рекомбинации) могут быть использованы для переноса аттенуированного фенотипа из родительского сегментированного РНК-вирусного штамма (природного мутанта, мутагенизированного вируса или генетически сконструированного вируса) в отличающийся вирусный штамм (вирус дикого типа, природный мутант, мутагенизированный вирус или генетически сконструированный вирус).

Аттенуированные вирусы, индуцирующие сильные ИФН-ответы в хозяевах, могут быть также использованы в фармацевтических композициях для профилактики или лечения других вирусных инфекций или излечиваемых ИФН заболеваний, таких как рак. В этом отношении тропизм аттенуированного вируса может быть изменен для нацеливания вируса на желательные, являющиеся мишенями орган, ткань или клетки in vivo или ex vivo. С использованием этого подхода ИФН-ответ может быть индуцирован локально, в сайте-мишени, что позволяет таким образом избежать или минимизировать побочные эффекты системного введения ИФН. Для этой цели аттенуированный вирус может быть сконструирован для экспрессии лиганда, специфического для рецептора этих являющихся мишенями органа, ткани или клетки.

Данное изобретение основано, частично, на открытии заявителей, что NS1 вируса гриппа дикого типа действует в качестве антагониста ИФН в том смысле, что NS1 ингибирует опосредованный ИФН ответ инфицированных вирусом клеток-хозяев. Было обнаружено, что вирусные мутанты, недостаточные по активности NS1, являются сильнодействующими индукторами клеточного ИФН-ответа и демонстрируют аттенуированный фенотип in vivo; т.е. эти мутантные вирусы реплицируются in vivo, но имеют пониженные патогенные эффекты. Не желая связывать себя с какой-либо теорией или с каким-либо объяснением, как действует данное изобретение, авторы изобретения считают, что аттенуированные признаки вирусов данного изобретения предположительно обусловлены их способностью индуцировать сильный клеточный ИФН-ответ и их ослабленной способностью противодействовать ИФН-ответу хозяина. Однако эти полезные признаки аттенуированных вирусов данного изобретения не могут приписываться только действиям на клеточный опосредованный интерфероном ответ. В самом деле, изменения в других активностях, ассоциированных с NS1, могут вносить вклад в желательный аттенуированный фенотип.

Показано, что мутантные вирусы гриппа с ослабленной антагонистической активностью в отношении ИФН реплицируются in vivo, давая титры, которые являются достаточными для индукции иммунологических ответов и ответов цитокинов. Например, вакцинация аттенуированным вирусом гриппа уменьшала вирусный титр в животных, которых затем заражали вирусом гриппа дикого типа. Аттенуированные вирусы гриппа продемонстрировали также антивирусную и противоопухолевую активность. Предварительное инфицирование аттенуированным вирусом гриппа ингибировала репликацию других штаммов вируса гриппа дикого типа и других вирусов (таких как вирус Sendai), суперинфицированных в яйцах с развивающимися эмбрионами. Инокуляция аттенуированного вируса гриппа в животных, инъецированных опухолевыми клетками, уменьшала число образованных очагов патологии. Поскольку известно, что вирус гриппа индуцирует CTL-ответ (ответ цитотоксических Т-лимфоцитов), аттенуированный вирус является очень привлекательным кандидатом для противораковых вакцин.

Мутации, которые уменьшают, но не уничтожают полностью антагонистическую в отношении ИФН активность вируса, являются предпочтительными для вакцинных композиций - такие вирусы могут быть выбраны для выращивания как в общепринятых, так и в нестандартных субстратах, и для получения промежуточной вирулентности. В частности, авторы изобретения показали, что мутант с укороченным на С-конце NS1 реплицируется до высоких титров в ИФН-недостаточных субстратах, таких как 6- и 7-дневные развивающиеся куриные эмбрионы, а также в аллантоисной мембране 10-дневных развивающихся куриных с эмбрионов, общепринятом субстрате для вируса гриппа, который не допускает роста мутантов вируса гриппа, в которых делетирован весь ген NS1 (называемых здесь также "нокаут"-мутантами). Однако репликация мутанта с укороченным на С-конце NS1 является сниженной в яйцах с 12-дневными развивающимися эмбрионами. Этот подход впервые позволяет генерирование и идентификацию живых аттенуированных вирусов с минус-цепью, которые имеют измененную, но не устраненную антагонистическую в отношении ИФН активность и которые способны расти в субстратах, пригодных для получения вакцин. Этот подход обеспечивает также впервые эффективную систему отбора/идентификации для вируса гриппа или других вирусов, содержащих мутации, которые придают им измененную, но не устраненную, антагонистическую в отношении интерферона активность.

Данное изобретение относится также к применению ИФН-недостаточных систем для размножения аттенуированных вирусов, которые не могут быть выращены в общепринятых системах, используемых в настоящее время для получения вакцин. Термин "ИФН-недостаточные системы" в применении здесь относится к ситемам, таким как, например, клетки, клеточные линии и животные, такие как мыши, куры, индейки, кролики, крысы и т.д., которые не продуцируют ИФН или продуцируют низкие уровни ИФН, не отвечают или отвечают менее эффективно на ИФН и/или являются недостаточными в активности антивирусных генов, индуцируемых интерфероном. Для этой цели авторы изобретения идентифицировали или сконструировали ряд ИФН-недостаточных систем, которые могут быть использованы, в том числе, но не только, яйца с развивающимися эмбрионами на ранней стадии, ИФН-недостаточные клеточные линии (такие как клетки VERO или генетически сконструированные клеточные линии, такие как STAT1-нокауты). Альтернативно, яйца с развивающимися эмбрионами или клеточные линии могут быть предварительно обработаны соединениями, которые ингибируют ИФН-систему (в том числе лекарственными средствами, антителами, антисмысловыми нуклеиновыми кислотами, рибозимами и т.д.). Еще один вариант включает в себя применение яиц, недостаточных по ИФН-системе, например, яиц, продуцируемых STAT1-негативными птицами, в частности, домашней птицей, включая, но не ограничиваясь трансгенными курами, утками или индейками.

4. ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1. Вирус delNS1 ингибирует репликацию вируса гриппа А дикого типа в яйцах. Яйца с десятидневными развивающимися куриными эмбрионами инокулировали указанными БОЕ вируса delNS1. Спустя восемь часов эти яйца инфицировали 10³ БОЕ вируса WSN. После двух дней инкубации при 37С аллантоисную жидкость собирали и титры вируса WSN определяли методом бляшек в клетках MDBK. Результаты представляют среднее для двух яиц.

Фиг.2. Индукция антивирусного ответа в яйцах с развивающимися эмбрионами вирусом delNS1. Яйца с десятидневными развивающимися эмбрионами инокулировали ЗФР (необработанные) или 210⁴ БОЕ вируса delNS1 (delNS1-обработанные). Спустя восемь часов эти яйца инфицировали теперь 10³ БОЕ вируса гриппа A/WSN/33 (H1N1), вируса гриппа A/PR8/34 (H+N1), вируса гриппа А/Х-31 (H3N2), вируса гриппа B/Lee/40 или вируса Sendai. После двух дней инкубации аллантоисную жидкость собирали и титры вирусов определяли при помощи метода гемагглютинации. Результаты являются средними величинами для двух яиц.

Фиг.3. Клетки CV1 трансфицировали плазмидой, экспрессирующей IRF-3, слитый с зеленым флуоресцентным белком (GFP). Это делает возможным определение локализации IFR-3 в клетках при помощи флуоресцентной микроскопии. В некоторых случаях, экспрессирующую NS1 плазмиду котрансфицировали с экспрессирующей IRF-3 плазмидой в указанных соотношениях. Спустя 24 ч после трансфекции клетки инфицировали при высокой множественности заражения (МЗ) PR8 (WT) или вирусом delNS1, как указано. Спустя 10 ч после инфицирования клетки анализировали флуоресцентной микроскопией в отношении локализации IRF-3-GFP. Показан процент клеток, обнаруживших исключительно цитоплазматическую локализацию (Цит) и как цитоплазматическую, так и ядерную локализации IRF-3 (Ядро+Цит).

5. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к генерированию, селекции и идентификации аттенуированных РНК-вирусов с минус-цепью, которые имеют ухудшенную способность противодействовать клеточному ИФН-ответу, и применению таких вирусов в вакцинных и фармацевтических композициях.

Эти вирусы могут иметь сегментированный или несегментированный геномы и могут быть выбраны из природно встречающихся штаммов, вариантов или мутантов; мутагенизированных вирусов (например, посредством УФ-облучения, действия мутагенов и/или пассирования); вирусных рекомбинантов (реассортантов) (для вирусов с сегментированными геномами); и/или генетически сконструированных вирусов. Например, мутантные вирусы могут быть получены природной изменчивостью, экспонированием УФ-излучению, экспонированию химическим мутагенам, пассированием в непермиссивных хозяевах, реаранжировкой (рекомбинацией) (т.е. совместным инфицированием аттенуированного сегментированного вируса с другим штаммом, имеющим желательные антигены), и/или генетической инженерией (например, с использованием "обратной генетики"). Вирусы, отобранные для использования в данном изобретении, имеют дефектную антагонистическую в отношении ИФН активность и являются аттенуированными; т.е. они являются инфекционными и могут реплицироваться in vivo, но дают только низкие титры, приводящие к субклиническим уровням инфекции, которые не являются патогенными. Такие аттенуированные вирусы являются идеальными кандидатами для живых вакцин.

В предпочтительном варианте, аттенуированные вирусы, выбранные для применения в данном изобретении, должны быть способны к индукции сильного ИФН-ответа в хозяине - признака, который способствует генерированию сильной иммунной реакции при использовании в качестве вакцины и который имеет другие биологические последствия, что делает эти вирусы применимыми в качестве фармацевтических агентов для предупреждения и/или лечения других вирусных инфекций или опухолеобразования в индивидуумах с высоким риском или других заболеваний, которые могут лечиться интерфероном.

Данное изобретение основано, частично, на ряде открытий и наблюдений, сделанных заявителями при работе с мутантами вируса гриппа. Однако, эти принципы могут быть аналогично применены и экстраполированы к другим сегментированным и несегементированным РНК-вирусам с минус-цепью, в том числе, но не ограничиваясь, к парамиксовирусам (вирусу Sendai, вирусу парагриппа, вирусу эпидемического паротита, вирусу Ньюкаслской болезни), морбилливирусу (вирусу кори, вирусу чумы собачьих и вирусу чумы крупного рогатого скота); пневмовирусу (респираторно-синцитиальному вирусу и бычьему респираторному вирусу) и рабдовирусу (вирусу везикулярного стоматита и вирусу бешенства).

Во-первых, ИФН-ответ является важным для вирусной инфекции in vivo. Авторы изобретения обнаружили, что рост вируса гриппа дикого типа A/WSN/33 в ИФН-недостаточных мышах (мышах STAT1-/-) приводил к пан-органной инфекции (инфекции всех органов); т.е. вирусная инфекция не ограничивалась легкимми, как это имеет место у мышей дикого типа, которые генерируют ИФН-ответ (статья Garcia-Sastre, et al., 1998, J.Virol. 72:8550, включенная здесь в качестве полной ссылки). Во-вторых, авторы изобретения установили, что мутант вируса гриппа с делецией всего гена NS1 (т.е. с NS1-"нокаутом") не мог расти до высоких титров в ИФН-компетентных клетках-хозяевах и мог размножаться только в ИФН-недостаточных хозяевах. Вирус с нокаутом NS1 продемонстировал аттенуированный фенотип (т.е. он был летальным в ИФН-недостаточных мышах STAT-/-, но не в мышах дикого типа), и было обнаружено, что он является сильным индуктором ИФН-ответов в клетках-хозяевах (статья Garcia-Sastre, et al., 1998, J.Virology 252: 324-330, включенная здесь в качестве полной ссылки). Предынкубация с мутантным вирусом с NS1-нокаутом снижала титры вируса гриппа дикого типа и других вирусов (например, вируса Sendai), суперинфицированных в яйцах с развивающимися эмбрионами. В другом эксперименте, инфекция мутантным вирусом гриппа с NS1-нокаутом уменьшала образование очагов заболевания в животных, инокулированных опухолевыми клетками. Таким образом, вирус гриппа с NS1-нокаутом демонстрировал представляющие интерес биологические свойства. Однако, мутантные вирусы с NS1-нокаутом не могли бы размножаться в общепринятых системах для получения вакцин. Для преодоления этой проблемы авторы изобретения использовали и разработали ИФН-недостаточные системы, которые позволяют получать разумные выходы аттенуированного вируса.

Кроме того, авторы изобретения сконструировали делеционные мутанты NS1, которые не делегируют полный ген. Неожиданным образом было обнаружено, что эти NS1-мутанты проявляют "промежуточный" фенотип - этот вирус может быть выращен в общепринятых хозяевах для размножения вируса гриппа (хотя рост его происходит лучше в ИФН-недостаточных системах, которые дают более высокие титры). Наиболее важным является то, что эти делеционные мутанты являются аттенуированными in vivo и индуцируют сильный ИФН-ответ. Вакцинация мутантами с укороченным NS1 приводила к низким титрам вируса в животных, зараженных затем вирусом дикого типа, и давала защиту против заболевания.

Данное изобретение относится также к субстратам, предназначенным для выделения, идентификации и роста вирусов для целей получения вакцин. В частности, описаны интерферон-недостаточные субстраты для эффективного выращивания мутантов вируса гриппа. В соответствии с данным изобретением, интерферон-недостаточным субстратом является субстрат, который является дефектным в его способности продуцировать или отвечать на интерферон. Субстрат данного изобретения может быть использован для роста любого числа вирусов, которые могут требовать интерферон-недостаточной среды выращивания. Такие вирусы могут включать в себя, при этом не ограничиваясь ими, парамиксовирусы (вирус Sendai, вирус парагриппа, вирус эпидемического паротита, вирус Ньюкаслской болезни), морбилливирус (вирус кори, вирус чумы собачьих и вирус чумы крупного рогатого скота); пневмовирус (респираторно-синцитиальный вирус и бычий респираторный вирус) и рабдовирус (вирус везикулярного стоматита и вирус бешенства).

Данное изобретение относится также к применению аттенуированного вируса данного изобретения в вакцинах и фармацевтических препаратах для человека и животных. В частности, аттенуированные вирусы могут быть использованы в качестве вакцин против широкого круга вирусов и/или антигенов, в том числе, но не только, антигенов вариантов штамма, отличающихся вирусов или других инфекционных патогенов (например, бактерий, паразитов, грибков), или опухолеспецифических антигенов. В другом варианте, аттенуированные вирусы, которые ингибируют репликацию вирусов и образование опухолей, могут быть использованы для профилактики или лечения инфекции (вирусных или невирусных патогенов) или образования опухоли или лечения заболеваний, для которых ИФН является терапевтически эффективным агентом. Многие способы могут быть использованы для введения живых аттенуированных вирусных препаратов человеку или животному для индукции иммунного или подходящего медиируемого цитокинами ответа. Они включают в себя, но не ограничиваются ими, интраназальный, внутритрахеальный, пероральный, интрадермальный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный и подкожный пути. В предпочтительном варианте, аттенуированные вирусы данного изобретения готовят для интраназальной доставки.

5.1 ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТОВ С ИЗМЕНЕННОЙ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ В ОТНОШЕНИИ ИФН АКТИВНОСТЬЮ

Любой мутантный вирус или штамм, который имеет уменьшенную антагонистическую в отношении ИФН активность, может быть выбран и использован в соответствии с данным изобретением. В одном варианте, могут быть выбраны природно встречающиеся мутанты или варианты или спонтанные мутанты, которые имеют ухудшенную способность противодействовать клеточному ИФН-ответу. В другом варианте, мутантные вирусы могут быть получены экспонированием вируса мутагенами, таким как ультрафиолетовое излучение или химические мутагены, или множественными пассированиями и/или перепрививанием в непермиссивных хозяевах. Скрининг в дифференциальной системе роста может быть использован для селекции на мутанты, имеющие ухудшенную антагонистическую в отношении ИФН функцию. Для вирусов с сегментированными геномами, этот аттенуированный фенотип может быть перенесен другому штамму, имеющему желательный антиген для рекомбинации (т.е. посредством совместного инфицирования аттенуированного вируса и этого желательного штамма и отбора на вирусные рекомбинанты, проявляющие оба фенотипа).

В другом варианте, могут быть введены мутации в РНК-вирус с минус-цепью, такой как вирус гриппа, RSV, NDV, VSV и PIV, с использованием подходов "обратной генетики". Таким путем природные или иные мутации, которые придают аттенуированный фенотип, могут быть введены в вакцинные штаммы. Например, могут быть сконструированы делеции, инсерции или замены кодирующего региона гена, ответственного за антагонистическую в отношении ИФН активность (такого как NS1 вируса гриппа). Делеции, замены или вставки в некодирующей области гена, ответственного за антагонистическую в отношении ИФН активность, также обсуждаются. Для этой цели могут быть сконструированы мутации в сигналах, ответственных за транскрипцию, репликацию, полиаденилирование и/или упаковку гена, ответственного за антагонистическую в отношении ИФН активность. Например, в вирусе гриппа такие модификации могут включать в себя, но не ограничиваются ими: замену некодирующих регионов гена вируса гриппа А некодирующими регионами гена вируса гриппа В (Muster, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5177), замены пар оснований в некодирующих регионах гена вируса гриппа (Fodor, et al., 1998, J.Virol. 72: 6283), мутации в районе промотора гена вируса гриппа (Piccone, et al., 1993, Virus Res. 28: 99; Li, et al., 1992, J.Virol. 66: 4331), замены и делеции в сегменте остатков уридина на 5'-конце гена вируса гриппа, влияющего на полиаденилирование (Luo, et al., 1991, J.Virol. 65: 2861; Li, et al., J. Virol. 1994, 68(2): 1245-9). Такие мутации, например, в отношении промотора, могли бы отрицательно регулировать экспрессию гена, ответственного за антагонистическую в отношении ИФН активность. Мутации в вирусных генах, которые могут регулировать экспрессию гена, ответственного за ИФН-антагонистическую активность, находятся также в объеме вирусов, которые могут быть использованы в соответствии с данным изобретением.

Данное изобретение относится также к мутациям в сегементе гена NS1, которые не приводят к измененной ИФН-антагонистической активности или ИФН-индуцирующему фенотипу, а скорее приводят к измененным вирусным функциям и аттенуированному фенотипу, например, измененному ингибированию ядерного экспорта поли(А)-содержащей мРНК, измененному ингибированию сплайсинга пре-мРНК, измененному ингибированию активации PKR путем связывания dsPHK, измененному влиянию на трансляцию вирусной РНК и измененному ингибированию полиаденилирования мРНК хозяина (например, см. Krug in Textbook of Influenza, Nicholson et al., Ed. 1998, 82-92, и цитированные в этой статье ссылки).

Способ обратной генетики включает в себя получение синтетических рекомбинантных вирусных РНК, которые содержат некодирующие районы вирусной РНК с минус-цепью, которые являются существенными для узнавания вирусными полимеразами и для упаковки сигналов, необходимых для генерирования зрелого вириона. Эти рекомбинантные РНК синтезируют из рекомбинантной ДНК-матрицы и воспроизводят in vitro с очищенным вирусным полимеразным комплексом с получением рекомбинантных рибонуклеопротеинов (РНП), которые могут быть использованы для трансфекции клеток. Более эффективная трансфекция достигается, если белки вирусной полимеразы присутствуют во время транскрипции синтетических РНК либо in vitro, либо in vivo. Синтетические рекомбинантные РНП могут быть спасены введением в инфекционные вирусные частицы. Вышеупомянутые способы описаны в патенте США №5166057, выданном 24 ноября 1992 года; в патенте США №5854037, выданном 29 декабря 1998 года; в Европейской патентной публикации ЕР 0702085А1, опубликованной 20 февраля 1996 года; в патентной заявке США с регистрационным номером 09/152845; в Международных патентных публикациях РСТ WO 97/12032, опубликованной 3 апреля 1997 года; WO 96/34625, опубликованной 7 ноября 1996 года; в Европейской патентной публикации ЕР-А780475; WO 99/02657, опубликованной 21 января 1999 года; WO 98/53078, опубликованной 26 ноября 1998 года; WO 98/02530, опубликованной 22 января 1998 года; WO 99/15672, опубликованной 1 апреля 1999 года; WO 98/13501, опубликованной 2 апреля 1998 года; WO 97/06270, опубликованной 20 февраля 1997 года, и ЕРО 780 47SA1, опубликованной 25 июня 1997 года, каждая из которых включена здесь в виде полной ссылки.

Аттенуированные вирусы, генерируемые подходом обратной генетики, могут быть использованы в вакцинных и фармацевтических композициях, описанных здесь. Способы обратной генетики могут быть использованы для конструирования дополнительных мутаций для других вирусных генов, важных для получения вакцин - т.е. эпитопы ценных вариантов вакцинных штаммов могут быть введены генной инженерией в аттенуированный вирус. Альтернативно, полностью чужеродные эпитопы, в том числе антигены, полученные из других вирусных или невирусных патогенов, могут быть введены генной инженерией в аттенуированный штамм. Например, в аттенуированный штамм могут быть введены генной инженерией антигены неродственных вирусов, таких как ВИЧ (gp160, gp120, gp41), антигены паразитов (например, малярии), бактериальные или грибковые антигены или опухолевые антигены. Альтернативно, эпитопы, изменяющие тропизм вируса in vivo, могут быть введены генной инженерией в химерные аттенуированные вирусы данного изобретения.

В альтернативном варианте, комбинация способов обратной генетики и способов реаранжировки (вирусной рекомбинации) могут быть использованы для конструирования аттенуированных вирусов, имеющих желательные эпитопы в сегментированных РНК-вирусах. Например, аттенуированный вирус (полученный естественным отбором, посредством мутагенеза или при помощи способов обратной генетики) и штамм, несущий желательный вакцинный эпитоп (полученный естественным отбором, посредством мутагенеза или при помощи способов обратной генетики), могут быть коинфицированы в хозяев, которые разрешают рекомбинацию сегментированных геном

Патент 2236252