Внутриклеточный домен белка her-2/neu для предупреждения или лечения малигнизаций

Внутриклеточный домен белка her-2/neu для предупреждения или лечения малигнизаций

Реферат

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии и медицине. В изобретении описаны полипептиды и нуклеиновые кислоты (нуклеотидные последовательности - в описании), кодирующие такие полипептиды, вызывающие или усиливающие иммунный ответ к белку HER-2/neu, а также их использование для лечения малигнизаций, ассоциированных с онкогеном HER-2/neu. Описан также слитый полипептид. Для иммунизации полипептид и слитый полипептид используют в сочетании с адъювантом. Предлагаются композиции для индукции или усиления Т-клеточного ответа на белок HER-2/neu на основе полипептида или ДНК, или вирусного вектора, управляющего экспрессией полипептида, а также композиции для иммунизации теплокровного животного против злокачественного образования на основе полипептида или ДНК, или вирусного вектора, управляющего экспрессией полипептида. Использование изобретения позволит более успешно осуществлять профилактику и терапию рака, в частности рака молочной железы. 10 н. и 20 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение в общем смысле относится к полипептидам и молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим такие полипептиды, вызывающим или усиливающим иммунный ответ к белку HER-2/neu, включающее их использование для лечения малигнизаций, ассоциированных с онкогеном HER-2/neu.

Предпосылки изобретения

Несмотря на громадные финансовые затраты и человеческих ресурсов, рак остается одной из главных причин смертности женщин в возрасте между 35 и 74 годами. Рак молочной железы является наиболее обычной малигнизацией у женщин и частота возникновения рака молочной железы возрастает. Заболевание диагностируют у каждой одной из девяти женщин. Обычные методы для лечения рака молочной железы основаны на сочетании хирургии, радиации и химиотерапии. При лечении некоторых малигниэаций эти методы дают иногда положительный эффект. Однако эти методы не всегда успешны в отношении всех малигнизаций и рак молочной железы является наиболее часто инкурабельным при попытке лечения некоторых стадий. Необходимы альтернативные методы предупреждения и терапии.

Обычным признаком малигнизированности является неконтролируемый клеточный рост. Возникновение раковых клеток связано с процессом превращения клеток нормального фенотипа в клетки с малигнизированным фенотипом, способными автономно расти. Амплификация и сверхэкспрессия генов соматической клетки считается обычным первичным событием, которое приводит к превращению нормальных клеток в малигнизированные клетки. Характеристики малигнизированного фенотипа кодируются онкогенными генами и передаются во время клеточного деления прогенам трансформированных клеток.

Непрерывное исследование онкогенов позволило идентифицировать не менее сорока онкогенов, действующих в малигнизированных клетках и ответственных за трансформацию или связанных с трансформацией. Онкогены распределили в разные группы на основании их предполагаемой функции или местонахождения их генных продуктов (таких как экспрессируемый онкогеном белок).

Полагают, что онкогены важны для некоторых аспектов нормальной клеточной физиологии. В этом отношении онкоген HER-2/neu является членом семейства онкогенов тирозиновых протеинкиназ и в высокой степени обладает гомологией с рецептором эпидермального ростового фактора. Онкоген HER/2-neu, предположительно, играет роль в клеточном росте и/или клеточной дифференциации. По-видимому, HER-2/neu индуцирует малигнизацию через количественные механизмы, которые являются результатом увеличенной или неограниченной экспрессии фактически нормального генного продукта.

HER-2/neu (р185) представляет собой белковый продукт онкогена HER-2/neu. Ген HER-2/neu является амплифицированным, а белок HER-2/neu - сверхэкспрессированным в разнообразных видах рака, включая рак молочной железы, яичников, толстой кишки, легких и предстательной железы. HER-2/neu связан с малигнизацией. Обнаружено, что 50-60% карциномы протоков in situ и 20-40% всех видов рака молочной железы, а также субстанциальная фракция аденокарцином, возникает в яичниках, предстательной железе, толстой кишке и легких. HER-2/neu, прямо связанный не только с малигнизированным фенотипом, но и с агрессивностью малигнизации, был обнаружен у одной четвертой всех инвазивных видов рака молочной железы. Сверхэкспрессия HER-2/neu коррелирует с плохим прогнозом и рака молочной железы, и рака яичников. HER-2/neu представляет собой трансмембранный белок с относительной молекулярной массой 185 kd, длиной, приблизительно, 1255 аминокислот (аа). Он обладает внеклеточным связывающим доменом (ECD) из, приблизительно, 645 аа, обладающим 40%-ной гомологией с рецептором фактора роста эпидермиса (EGFR), высокогидрофобным трансмембранным якорным доменом (TMD) и карбоксиконцевым цитоплазматическим доменом (CD) из, приблизительно, 580 аа, обладающим 80%-ной гомологией с EGFR.

Из-за трудностей в современных методах терапии видов рака, ассоциированных с онкогеном HER-2/neu, существует необходимость совершенствования, в данной области, соединений и композиций. Настоящее изобретение восполняет эту потребность и, кроме того, несет другие, связанные с этим, выгоды.

Краткое изложение существа изобретения

Вкратце отметим, что настоящим изобретением создали полипептиды, молекулы нуклеиновой кислоты (управляющие экспрессией таких полипептидов) и вирусные векторы (управляющие экспрессией таких полипептидов) для применения в иммунизации теплокровных животных или для изготовления лекарственного средства для иммунизации при малигнизациях, ассоциированных с онкогеном HER-2/neu. Полипептид или молекулу нуклеиновой кислоты, в соответствии с этим изобретением, можно представить в виде композиции, которая включает в себя фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Такой полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты, вирусный вектор или фармацевтическую композицию можно применить для иммунизации однократно (напр., при подозрении на малигнизацию) или периодически (напр., для индивидуумов с повышенным риском приобретенной или повторно приобретенной малигнизации). Лекарственное средство для иммунизации может быть полезным при лечении имеющейся опухоли или для предупреждения возникновения или повторного появления опухоли.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения создали полипептид, кодируемый последовательностью ДНК, выбранной из: (а) нуклеотидов 2026-3765SEQ ID NO:1; и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуют с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидам 2026-3765 из SEQ ID NO: 1 при умеренно строгих условиях, где последовательность ДНК кодирует полипептид, который дает иммунный ответ на белок HER-2/neu. В предпочтительном варианте осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 от лизина, аминокислоты 676, до валина, аминокислоты 1255, или ее вариант, который дает, как минимум, эквивалентный иммунный ответ. Предусмотрено создание композиции, которая включает в себя полипептид настоящего изобретения, в соединении с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается создание полипептида или композиции настоящего изобретения для иммунизации теплокровного животного против малигнизации, ассоциированной с онкогеном HER-2/neu. В следующем варианте настоящего изобретения такой полипептид или композицию используют для изготовления лекарственного средства для иммунизации теплокровного животного против малигнизации, ассоциированной с онкогеном HER-2/neu.

В очередном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается создать молекулу нуклеиновой кислоты, управляющую экспрессией полипептида, в соответствии с настоящим изобретением, для иммунизации путем трансфекции клеток теплокровного животного молекулой нуклеиновой кислоты. В следующем варианте осуществления настоящего изобретения такую молекулу нуклеиновой кислоты используют для изготовления лекарственного средства для иммунизации теплокровного животного против малигнизации, ассоциированной с онкогеном HER-2/neu.

В очередном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается создать вирусный вектор, управляющий экспрессией полипептида, в соответствии с настоящим изобретением, для иммунизации, путем инфицирования клеток теплокровного животного данным вектором. В следующем варианте осуществления настоящего изобретения такой вирусный вектор используют для изготовления лекарственного средства для иммунизации теплокровного животного против малигнизации, ассоциированной с онкогеном HER-2/neu.

Эти и другие цели настоящего изобретения становятся ясными при обращении к нижеследующему детальному описанию и прилагаемым чертежам.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 представляет результаты праймирования первичных Т-лимфоцитов полипептидом HER-2/neu с помощью дендритных клеток. Производимые костным мозгом DC генерировали с помощью GM-CSF и IL6 из СD34+-стволовых клеток. DC, пульс-меченные по полипептиду HER-2/neu, индуцировали протеин-специфическую пролиферацию автологичных CD4+/CD45RA+-Т-лимфоцитов после 7 дней культивирования Т-клеток с DC. Производимые костным мозгом СD34+-стволовые клетки культивировали в течение одной недели в бессывороточной среде, содержащей GM-CSF и IL-6, использовали в качестве АРС. АРС помещали в 96-луночные круглодонные планшеты (Corning, Corning, NY, США) при различных концентрациях и инкубировали в течение 16-18 часов с 20-25 мкг/мл рекомбинантного полипептида HER-2/neu. Из автологичных моноядерных клеток периферической крови выделяли СD4+-Т-лимфоциты в результате положительной селекции, используя колонки для проведения хроматографии по иммуносродству (CellPro, Inc., Bothell, WA, США). Антиген-меченные АПК- облучали (10 Gy) и в каждую лунку добавляли 10⁵ СD4+-Т-лимфоцитов. Пролиферативный ответ Т-клеток измеряли по поглощению (³H)-тимидина (1 мкКи/лунку), добавляемого на 7-й день в течение 16-18 часов. Анализ пролиферации осуществляли в бессывороточной и цитокин-свободной среде в 5 репликах. Приведенные символы соответствуют: DC + полипептид HER-2/neu + СD4+/СD45RА+-Т-клетки; DC + СD4+/СD45RА+-Т-клетки; и DC + полипетид HER-2/neu.

Фигура 2 показывает ответ СD4+-клеток на полипептид HER-2/neu. Применяя метод праймирования, описанный для Фигуры 1, СD4+-Т-клетки от нормальных доноров тестировали на ответ к человеческому рекомбинантному полипептиду HER-2/neu. Приведенные символы соответствуют: SC-+CD4; и SC+СD4+НЕR-2/nеu-полипептид. "SC" - это стволовые клетки.

Фигура 3 показывает, что крысы, иммунизированные крысиным полипептидом HER-2/neu, вырабатывают специфические крысиные антитела nеu. Крыс иммунизировали рекомбинантным крысиным полипептидом HER-2/neu, 25 а.е.м.г, в MPL или vaccel-адъюванте. Было проведено три иммунизации, каждая с 20-дневным интервалом. Через двадцать дней после последней иммунизации у крыс определяли антительный ответ на крысиный nеu. Животные, иммунизированные крысиным полипептидом HER-2/neu и vaccel-адъювантом, показали высокий титр специфических ответов крысиного nеu. Контрольных животных иммунизировали человеческим полипептидом HER-2/neu (чужеродный белок). В отдельных экспериментах крысы, иммунизированные 100 а.е.м.г и 300 а.е.м.г очищенного целого крысиного nеu, не вырабатывали детектируемых специфических антител nеu (данные не показаны). Данные представляют среднее и стандартное отклонение по 3 животным. Приведенные символы соответствуют: крысиный полипептид HER-2/neu/MPL; крысиный полипептид HER-2/nеu/vaccel; только MPL; только vaccel; и контроль. "MPL" и "vaccel" представляют собой адъюванты (Ribi, Bozeman, МТ, США). "Neu" представляет собой HER-2/neu-белок.

Фигура 4 показывает, что пациенты с раком молочной железы обладают предсуществующим иммунитетом к полипептиду HER-2/neu. Пациента РМВС оценивали по включению тритиированного тимидина в 24 реплики. Отвечающие лунки оценивали как превышающие среднее и 3 стандартных отклонения (372 имп/мин) контрольных лунок. Этот пациент с позитивной стадией II рака молочной железы обладал существенным ответом на рекомбинантный человеческий полипептид HER-2/neu. Символ "р" соответствует пептидам белка HER-2/neu, символ "tt" соответствует столбнячному анатоксину, а символ "hHNP" соответствует рекомбинантному человеческому полипептиду HER-2/neu.

График на фигуре 5 иллюстрирует анализ высвобождения ⁵¹Сr, демонстрирующий ICD-специфичную активность ЦТЛ в линии Т-клеток, полученной путем примирования дендритных клеток (ДК), инфицированных рекомбинантным аденовирусом, экспрессирующим ICD. Анализ представлял собой стандартный 4-часовой анализ высвобождения ⁵¹Сr; мишени представляли собой аутологичные B-LCL, инфицированные рекомбинантным возбудителем коровьей оспы, экспрессирующим ICD, EGFP, или ничем не инфицированные. Каждая точка является усредненным результатом по трем сериям.

На фигуре 6 проиллюстрированы результаты анализа IFNy ELISPOT CD8⁺ Т-клеточных линий, полученных путем примирования ДК, инфицированными аденовирусом-ICD, в качестве антиген-презентирующих клеток. Результаты показаны в трек сериях в двух линиях, стимулированных в одном из циклов либо ДК, инфицированными аденовирусом-ICD (А), либо анти-СD3 (В), протестированных на аутологичных фибробластах, трансдуцированных ICD или EGFP. Фибробласты обрабатывали IFN за 48-72 часа до анализа и промывали для удаления цитокина. На лунку высевали 210³ стимуляторов при 210⁴ респондеров для исходной клеточной линии и при 410⁴ респондеров для стимулированной клеточной линии.

Подробное описание изобретения

Перед изложением данного изобретения и для его понимания полезно разъяснить используемые в нем некоторые термины.

Полипептид HER-2/neu, - как он используется здесь, относится к части белка HER-2/neu (данный белок известен также как р185 или с-еrbВ2), имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2^- от лизина, аминокислота 676, до валина, аминокислота 1255; и может быть получен естественным образом, синтетически, биотехнологически или можно получить его функционально эквивалентный вариант, напр., при замене одной или нескольких аминокислот другой аминокислотой (кислотами) или не аминокислотой (кислотами), что существенно не влияет на получение или усиление иммунного ответа к белку HER-2/neu (напр., вариант стимулирует ответ с помощью хелперных Т-клеток или цитотоксических Т-клеток).

Пролиферация Т-клеток, - как она используется здесь, включает в себя размножение Т-клеток, а также стимуляцию Т-клеток, ведущую к размножению, т.е. инициацию событий, приводящих к митозу, и митозу как таковому. Способы обнаружения пролиферации Т-клеток обсуждаются ниже.

Как отмечено выше, настоящее изобретение относится к соединениям и композициям, вызывающим или усиливающим иммунитет к белковому продукту, экспрессированному онкогеном HER-2/neu, включающего малигнизацию у теплокровного животного, у которого амплифицированный ген HER-2/neu ассоциирован с малигнизациями. Ассоциация амплифицированного гена HER-2/neu с малигнизацией не требует, чтобы экспрессируемый белковый продукт гена присутствовал в опухоли. Например, сверхэкспрессия экспрессируемого белкового продукта может быть вовлечена в инициацию опухоли, но экспрессия белка может быть затем утрачена. Настоящее изобретение можно применить для того, чтобы вызвать или усилить эффективный аутохтонный иммунный ответ для превращения HER-2/neu-позитивной опухоли в HER-2/neu-негативную.

Более конкретно, раскрытие настоящего изобретения, в соответствии с одной из целей, показывает, что полипептид, базирующийся на отдельной части (полипептид HER-2/neu) экспрессируемого белкового продукта гена HER-2/neu, может быть узнан тимус-зависимыми лимфоцитами (в дальнейшем "Т-клетки") и поэтому аутохтонный иммунный Т-клеточный ответ можно использовать профилактически или для лечения малигнизаций, в которых такой белок есть или был сверхэкспрессирован. Раскрытие настоящего изобретения показывает также, в соответствии с другой целью, что молекулы нуклеиновой кислоты, управляющие экспрессией такого пептида, можно использовать для иммунизации отдельно взятыми или в вирусном векторе.

Вообще, популяции CD4+ Т-клеток рассматривают по функции в качестве хелперов/индукторов, благодаря высвобождению лимфокинов при стимулировании специфическим антигеном; однако, подгруппа СD4⁺-клеток может действовать в качестве цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). Аналогично рассматриваются по функции СD8⁺-Т-клетки, вследствие прямого лизиса антигенных мишеней; однако, в различных обстоятельствах они могут секретировать лимфокины, осуществляя хелперную или DTH-функцию. Несмотря на возможную перекрывающуюся функцию, фенотипические маркеры CD4 и CD8 сопряжены с узнаванием пептидов, связанных с антигенами МНС класса II или класса I. Узнавание антигена в контексте МНС класса II или класса I обязывает CD4⁺- и СD8⁺-Т-клетки отвечать на разные антигены или на один и тот же антиген, представленный в разных обстоятельствах. Связывание иммуногенных пептидов с антигенами МНС класса II наиболее обычно наблюдается для антигенов, поглощаемых антигенпрезентирующими клетками. Поэтому, CD4⁺-T-клeтки обычно узнают антигены, которые находились вовне опухолевых клеток. Напротив, при нормальных условиях, связывание пептидов с МНС класса II наблюдается только для белков, представленных в цитозоле и синтезированных самой мишенью, для белков внешней среды такая возможность исключается. Исключением из этого является связывание экзогенных пептидов с определенным мотивом, связывающим класс I, который находится за пределами клетки в высокой концентрации. Таким образом, CD4⁺- и СD8⁺-клетки обладают широко отличающимися функциями и тенденцией к узнаванию различных антигенов как отражением того, где эти антигены обычно пребывают.

Как описано в рамках настоящего изобретения, полипептидная часть белкового продукта, экспрессированного онкогеном HER-2/neu, распознается Т-клетками. Циркулирующий полипептид HER-2/neu деградирует до пептидных фрагментов. Пептидные фрагменты данного полипептида связываются с антигенами главного комплекса гистосовместимости (МНС). Благодаря расположению пептида, связанного с антигеном МНС на клеточной поверхности, и узнавания хозяйскими Т-клетками комбинации пептид плюс собственный антиген МНС, полипептид HER-2/neu (в том числе и экспрессированный на малигнизированной клетке) будет иммуногенным для Т-клеток. Тонкая специфичность Т-клеточного рецептора дает возможность отдельным T-клеткам распознавать пептиды, которые отличаются по единственному аминокислотному остатку.

В течение иммунного ответа на пептидный фрагмент данного полипептида Т-клетки, экспрессирующие Т-клеточный рецептор, с высоким сродством связывающие комплекс пептид-МНС, будут связывать данный комплекс пептид-МНС и, таким образом, становиться активированными и индуцированными для того, чтобы пролиферировать. При первом столкновении с пептидом небольшое число иммунных Т-клеток будет секретировать лимфокины, пролиферировать и дифференцироваться на эффекторные и Т-клетки памяти. Первичный иммунный ответ, происходящий in vivo, трудно обнаруживать in vitro. Следующее столкновение с тем же антигеном Т-клеток памяти дает быстрый и более сильный иммунный ответ. Этот второй ответ можно наблюдать и in vivo, и in vitro. Данный in vitro ответ легко оценить путем измерения уровня пролиферации, уровня образования цитокинов или генерацией цитолитической активности Т-клеточной популяции, повторно подверженной действию антигена. Существенную пролиферацию Т-клеточной популяции в ответ на отдельный антиген считают указанием прежнего воздействия или праймирования по антигену.

Соединения этого изобретения повсеместно включают в себя HER-2/neu-полипептид или молекулы ДНК, которые управляют экспрессией таких пептидов, где молекулы ДНК могут присутствовать в вирусном векторе. Как отмечено выше, полипептиды настоящего изобретения включают в себя варианты полипептида SEQ ID NO:2, от аминокислоты 676 до аминокислоты 1255, которые сохраняют способность стимулировать иммунный ответ. Такие варианты включают различные структурные виды естественного полипептида. Благодаря наличию ионизируемых амино- и карбоксильных групп, к примеру, полипептид HER-2/neu может существовать в виде кислой или основной соли или находиться в нейтральной форме. Отдельные аминокислотные остатки можно также модифицировать окислением или восстановлением.

Варианты, в рамках объема настоящего изобретения, включают также полипептиды, в которых первичная аминокислотная структура естественного полипептида HER-2/neu модифицирована в результате образования ковалентных или агрегативных конъюгатов с другими пептидами или полипептидами, или химическими составляющими, такими как гликозильные группы, липидные, фосфатные, ацетильные группы и т.п. Ковалентные производные можно получить, например, путем присоединения отдельных функциональных групп к боковым аминокислотным цепям или к N- или С-концам.

Настоящее изобретение включает также в себя гликозилированные или негликозилированные HER-2/neu-полипептиды. Полипептиды, экспрессируемые в экспрессионных системах дрожжей или млекопитающих, в зависимости от экспрессионной системы, могут быть похожими или незначительно отличаться по молекулярному весу и типу гликозилирования, в сравнении с естественными молекулами. Например, экспрессия ДНК, кодирующей полипептиды в бактериях, таких как Е.coli, обычно дает негликозилированные молекулы. N-гликозилированные сайты эукариотических белков характеризуются аминокислотным триплетом Asn-A₁-Z, где A₁ представляет собой любую аминокислоту, за исключением Pro, a Z представляет собой Ser или Thr. Полипептидные варианты HER-2/neu, имеющие инактивированные N-гликозилированные сайты, можно получить с помощью методик, известных рядовым специалистам в данной области, таких как методики олигонуклеотидного синтеза и лигирования или сайт-специфичного мутагенеза, и представленных в рамках объема этого изобретения. Альтернативно, к полипептиду HER-2/neu можно добавить N-сцепленные гликозилированные сайты.

Полипептиды этого изобретения включают также варианты полипептида SEQ ID NO:2 (т.е. варианты полипептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, от аминокислоты 676 до аминокислоты 1255), которые имеют аминокислотную последовательность, отличающуюся от этой последовательности из-за одной или нескольких делеций, вставок, замен или других модификаций. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такие варианты, по существу, гомологичны естественному полипептиду HER-2/neu и сохраняют способность стимулировать иммунный ответ. "Существенная гомология", в том смысле как она здесь используется, относится к аминокислотным последовательностям, которые могут быть кодированы последовательностями ДНК, способными гибридизовать в умеренно строгих условиях с нуклеотидной последовательностью, комплементарной естественно встречаемой последовательности ДНК, кодирующей указанную здесь часть SEQ ID NO:2 (т.е. нуклеотиды 2026-3765 SEQ ID NO:1). Соответствующие умеренно строгие условия включают в себя предварительную отмывку в растворе 5 Х SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ EDTA (рН 8,0); гибридизацию при 50-65С, 5 Х SSC, в течение ночи; последующее промывание, дважды, при 65С в течение 20 минут в каждом промывании, 2Х, 0,5Х и 0,2Х SSC (содержащего 0,1% SDS). Такие гибридизующие последовательности ДНК также представлены в рамках объема этого изобретения. Действие любой такой модификации на способность полипептида HER-2/neu давать иммунный ответ можно легко определить (напр., анализируя способность мутантного полипептида HER-2/neu индуцировать Т-клеточный ответ, используя, например, методы, описанные здесь).

Обычно, аминокислотные замены можно произвести различными способами, чтобы создать другие варианты осуществления в рамках настоящего изобретения. Во-первых, аминокислотные замены можно, например, осуществить консервативно, т.е. замещаемую аминокислоту заместить аминокислотой, которая обладает сходными свойствами, так чтобы специалист в области пептидной химии мог бы рассчитывать, что вторичная структура и гидрофильная природа данного полипептида существенно не изменится. В большинстве случаев консервативным изменениям соответствуют нижеследующие группы аминокислот: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; и (5) phe, tyr, trp, his. Примером неконсервативного изменения является замещение аминокислоты одной группы на аминокислоту другой группы.

Другой способ осуществить аминокислотные замены, с образованием вариантов настоящего изобретения, состоит в идентификации и замещении аминокислот в мотивах Т-клеток, для возможного связывания с молекулами МНС класса II (для СD4⁺-Т-клеточного ответа) или с молекулами МНС класса I (для СD8⁺-Т-клеточного ответа). Пептидные сегменты (полипептида HER-2/neu), с мотивом для теоретически возможного связывания с молекулами МНС класса II, можно идентифицировать в компьютерном анализе. Например, можно использовать аналитический пакет белковой последовательности, Т Sites, который включает несколько компьютерных алгоритмов, предназначенных для различения возможных сайтов для Т-клеточного узнавания (Feller и de la Cruz, Nature 349:720-721, 1991). Использовали два поисковых алгоритма: (1) алгоритм AMPHI, описанный Margalit (Feller и de la Cruz, Nature 349:720-721, 1991; Margalit et al., J. Immunol. 138:2213-2229, 1987), идентифицирующий эпитопные мотивы по альфа-спиральной периодичности и амфипатичности; (2) алгоритм Rothbard и Taylor, идентифицирующий эпитопные мотивы по заряду и паттерну полярности (Rothbard и Taylor, EMBO 7:93-100, 1988). Сегменты обоих мотивов более всего подходят для связывания молекул МНС класса II. СD8⁺-Т-клетки узнают пептид, связанный с молекулами МНС класса I. Falk et al. определили, что пептиды, связывающиеся с отдельными молекулами МНС, обладают различимыми последовательностями мотивов (Falk et al., Nature 351:290-296, 1991). Пептидный мотив для связывания в бороздке HLA-A2.1 определили путем Эдмановской деградации пептидов, удаленных из молекул HLA-A2.1, культивируемой клеточной линии (Таблица 2, из Falk et al., см. выше). Способ, идентифицирующий обычный или усредненный, связывающий HLA-A2.1 пептид, состоящий из 9 аминокислот в длину с доминантным якорным остатком, встречается в положении 2 (L) и 9 (V). Обычно наблюдаемые, сильно связывающие, остатки были идентифицированы в положениях 2 (М), 4 (Е, К), 6 (V), и 8 (К). Данный идентифицированный мотив представляет среднее многих связывающих пептидов (см. таблицу)

Полученный пептидный мотив, определенный как теоретический, не является особенно строгим. Некоторые связывающие HLA-A2.1 пептиды, не содержащие ни доминантных якорных остатков, ни аминокислот, фланкирующих доминантные якорные остатки, играют главную роль в осуществлении или неосуществлении связывания. Не каждый пептид в представленном связывающем мотиве будет связывать, но некоторые пептиды без данного мотива будут связывать. Однако представленный мотив является достаточно ценным для осуществления идентификации некоторых пептидов, способных к связыванию. Отметим, что представленный HLA-A2.1-мотив несет 6 аминокислот между доминантными якорными аминокислотами по остаткам 2 и 9.

Последующую идентификацию пептидных мотивов в рамках полипептида HER-2/neu, аминокислотных замен, можно осуществить консервативно и неконсервативно. Последний тип замен предназначен для получения улучшенного полипептида, который является более сильным и/или перекрестно реагирует более обширно (МНС полиморфизм). Примером более сильного полипептида является тот, который связан с высоким сходством с той же молекулой МНС в качестве естественного полипептида, не влияя на специфичное узнавание Т-клетками естественного полипептида. Примером полипептида с расширенной перекрестной реактивностью является тот, который более широко индуцирует перекрестно-реагирующие иммунные ответы (т.е. связывается с большим рядом молекул МНС), чем естественный полипептид. Аналогично, одна или несколько аминокислот, находящиеся между пептидными мотивами и обладающие спейсерной функцией (напр., препятствует взаимодействию с молекулой МНС или Т-клеточным рецептором), могут быть замещены консервативно или неконсервативно. Рядовым специалистам в данной области очевидно, что полипептиды, содержащие одну или несколько аминокислотных замен, можно протестировать на полезность или вредность иммунологических взаимодействий в разнообразных опытах, в том числе и в тех, которые описаны здесь, что касается способности стимулировать Т-клеточное узнавание.

Варианты в рамках объема этого изобретения могут также содержать или, напротив, не содержать другие модификации, включая удаление или добавление аминокислот, которые обладают минимальным влиянием на нужные иммунологические свойства данного полипептида. Для рядовых специалистов в данной области понятно, что можно использовать неполные формы или неестественно протяженные формы полипептида HER-2/neu для создания требуемых иммунологических свойств, которые, приблизительно, эквивалентны полноразмерным формам естественного полипептида HER-2/neu. Цистеиновые остатки можно удалить или заместить другими аминокислотами, чтобы при ренатурации предотвратить образование некорректных внутримолекулярных дисульфидных мостиков. Другие подходы в мутагенезе вовлекают модификацию смежных двуосновных аминокислотных остатков, чтобы усилить экспрессию в дрожжевых системах, в которых присутствует активность протеазы КЕХ2.

Обычно полипептид HER-2/neu можно получить, используя геномную или клоновую кДНК, кодирующую белок. Геномная последовательность, которая кодирует полноразмерный HER-2/neu, представлена в SEQ ID NO:1, а предсказанная аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:2. Такие клоны можно выделить путем скринирования надлежащей экспрессионной библиотеки для клонов, которые экспрессируют белок HER-2/neu. Получение и скринирование библиотеки можно осуществить, используя методы, известные рядовым специалистам в данной области, такие как методы, описанные у Sambrook et al. Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, N.Y., 1989, которые включены здесь путем ссылки. Вкратце, их суть состоит в том, что экспрессионную библиотеку бактериофага культивируют на чашках и переносят на фильтры. Затем фильтры можно инкубировать с детектирующим реагентом. В контексте этого изобретения "детектирующий реагент" представляет собой любое соединение, способное связываться с белком HER-2/neu, которое можно затем выявлять любым из многих способов, известных рядовым специалистам в данной области. Обычные детектирующие реагенты, содержащие "связывающий агент", такой как протеин А, протеин G, IgG или лектин, присоединяются к репортерной группе. Предпочтительные репортерные группы включают в себя ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, красители, радионуклиды, люминисцетные группы, флуоресцентные группы и биотин. Более предпочтительно, чтобы репортерная группа представляла собой пероксидазу хрена, которую можно обнаружить в результате инкубации с субстратом, таким как тетра-метилбензидин или 2,2'-азино-ди-3-этилбензтиазолинсульфоновая кислота. Бляшки, содержащие геномную или кДНК последовательность, которые экспрессируют белок HER-2/neu, выделяют и очищают методами, известными рядовым специалистам в данной области. Соответствующие методы можно найти, например, у Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

Варианты полипептида, которые сохраняют способность стимулировать иммунный ответ, можно, в большинстве случаев, получить путем модификации определенной последовательности для одной или нескольких целей, описанных выше, анализируя полученный полипептид на способность стимулировать иммунный ответ, напр., Т-клеточный ответ. К примеру, такой анализ можно, как правило, осуществить в результате контактирования Т-клеток с модифицированным полипептидом и анализа полученного ответа. Естественно встречаемые варианты полипептида можно также выделить, например, путем скринирования надлежащей кДНК или геномной библиотеки с последовательностью ДНК, кодирующей полипептид или его вариант.

Вышеописанные модификационные последовательности можно интродуцировать, используя стандартные рекомбинантные методики, или путем автоматизированного синтеза модифицированного полипептида. Например, мутации можно интродуцировать в отдельные локусы путем синтеза олигонуклеотидов, содержащих мутантную последовательность, фланкированную сайтами рестрикции, что дает возможность лигирования с фрагментами естественной последовательности. После лигирования, полученная перестроенная последовательность кодирует аналог, обладающий требуемой аминокислотной вставкой, заменой или делецией.

Альтернативно, можно применять методики олигонуклеотид-направленного сайт-специфического мутагенеза для создания гена, в котором отдельные кодоны изменены в соответствии с требуемой заменой, делецией или вставкой. Типичные методы по осуществлению указанных выше изменений описаны Walder et al., Gene 42:133, 1986; Bauer et al., Gene 37:73, 1985; Craik, BioTechniques, January 1985, 12-19; Smith et al., Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981; и в Патентах США №4518584 и №4737462.

Мутации в нуклеотидных последовательностях, сконструированных для экспрессии таких HER-2/neu-полипептидов, должны, конечно, сохранять открытую рамку считывания кодирующих последовательностей и, предпочтительно, не должны создавать комплементарных областей, которые могли бы гибридизовать с произведенными вторичными структурами мРНК, такими как петли или шпильки. Хотя сайт мутации можно заранее определить, нет необходимости в том, чтобы определять природу мутации per se. Например, с целью отбора мутантов с оптимальными характеристиками по данному сайту, можно осуществить случайный мутационный процесс по кодону-мишени, а экспрессированные мутантные полипептиды HER-2/neu скринировать по нужной активности.

Не все мутации в нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид HER-2/neu, будут экспрессироваться в конечный продукт. Например, можно осуществить нуклеотидные замены, которые усиливают экспрессию, в первую очередь, чтобы избежать образования в транскрибированной мРНК вторичной структуры в виде петель (см., напр.. Европейскую Патентную Заявку №75444А) или чтобы создать кодоны, которые более легко транслируются при помощи выбранного хозяина, такие как хорошо известные предпочтительные кодоны Е.coli для экспрессии в Е.coil.

Полипептиды настоящего изобретения, естественно встречаемые и модифицированные, предпочтительно получают с помощью методов рекомбинантных ДНК. Такие методы включают в себя операцию по введению последовательности ДНК, кодирующей полипептид HER-2/neu в рекомбинантный экспрессионный вектор и экспрессирование данной последовательности ДНК в рекомбинантной экспрессионной системе клетки бактерии, млекопитающего или насекомого в условиях, промотирующих экспрессию. Последовательности ДНК, кодирующие полипептиды, созданные с помощью этого изобретения, можно укомплектовать фрагментами кДНК и короткими олигонуклеотидными линкерами или наборами олигонуклеотидов для создания синтетического гена, который может быть вставлен в рекомбинантный экспрессионный вектор и экспрессирован в рекомбинантной экспрессионной единице.

Рекомбинантные экспрессионные векторы, содержащие последовательность ДНК, кодирующей HER-2/neu-полипептид, присоединенный путем сшивки к подходящим транскрипционным или трансляционным элементам, получали из генов млекопитающего, бактерии, вируса или насекомого. Такие регуляторные элементы включают в себя промотор транскрипции, необязательную операторную последовательность для контроля транскрипции, последовательность, кодирующую соответствующую мРНК рибосомных сайтов связывания, и последовательности, которые контролируют терминацию т