Полинуклеотид, обладающий способностью ускорять биосинтез предшественника правастатина ml- 236b (варианты), плазмидный вектор экспрессии (варианты), штамм peniccillium citrinum (варианты), штамм е.coli(варианты), полипептид, ускоряющий биосинтез ml-236b (варианты), предшественник правастатина ml-236b, способ изготовления правастатина

Патент 2236463

Авторы

Классы МПК

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой полинуклеотиды, обладающие способностью ускорять биоситнез предшественника правастатина ML-236В в микроорганизмах, вырабатывающих ML-236В, при введении в эти микроорганизмы. Данные полинуклеотиды встраиваются в вектора, которыми трансформируют клетки микроорганизмов - продуцентов предшественника правастатина, который является ингибитором HMG-CoA редуктазы. 20 c. и 26 з.п. ф-лы, 14 табл., 6 ил.

Настоящее изобретение касается генного кластера, точнее - генов из генного кластера.

В частности, изобретение касается полинуклеотидов, таких как ДНК, ускоряющих биосинтез ML-236B - ингибитора HMG-CoA-редуктазы - в микроорганизмах, вырабатывающих ML-236B, при введении в эти микроорганизмы. Кроме того, изобретение касается векторов, в которые встраиваются эти полинуклеотиды, клетки-хозяина, трансформируемой этими векторами, белков, экспрессируемых этими векторами, способа получения ML-236B с помощью этих полинуклеотидов и/или белков, включающего получение ML-236B из культуры клетки-хозяина, а также касается других связанных с этим вопросов.

Правастатин является ингибитором HMG-CoA-редуктазы. Правастатин натрия применялся при лечении гиперлипидемии, он обладает полезным фармакологическим свойством - способностью снижать уровень холестерина в крови. Правастатин можно получить с помощью Streptomyces carbophilus путем микробиологического превращения ML-236B, вырабатываемого Penicillium citrinum (как описано в Endo A. et al., J. Antibiot., 29, 1346 (1976); Matsuoka T. et al., Eur. J. Biochem., 184, 707 (1989), и в японской патентной заявке №57-2240).

Было показано, что ML-236B - предшественник правастатина и ловастатин - ингибитор HMG-CoA-редуктазы обладают одинаковой частичной структурой. Они синтезируются биологическим путем через поликетиды (как описано в Moore R.N. et al., J. Am. Chem. Soc., 107, 3694 (1985); Shiao M. and Don H.S., Proc. Natl. Sci. Counc. Repub. China.B, 11, 223 (1987)).

Поликетиды - это соединения, происходящие из -кето углеродных цепей; они образуются в ходе реакции конденсации низкомолекулярных карбоксикислот, таких как уксусная кислота, пропионовая кислота, масляная кислота и т.п. В зависимости от способа конденсации или восстановления каждой из карбонильных -кетогрупп могут образовываться различные структуры (как описано в Hopwood D.A. and Sherman D.H., Annu. Rev. Genet., 24, 37-66 (1990); Hutchinson C.R. and Fujii I., Annu. Rev. Microbiol., 49, 201-238 (1995)).

Известно, что ферменты поликетидсинтетазы (в дальнейшем именуемые ПКС), участвующие в синтезе поликетидов, имеются у нитчатых грибов-гифомицетов и бактерий. Ферменты нитчатых грибов исследовались методами молекулярной биологии (как описано в Feng G.H. and Leonard T.J., J. BacterioL, 177, 6246 (1995); Takano Y. et al., Mol. Gen. Genet., 249, 162 (1995)). У микроорганизма Aspergillus terreus, вырабатывающего ловастатин, ген ПКС, связанный с биосинтезом ловастатина, подвергался анализу (как описано в открытой международной заявке в Японии (KOHYO) №9-504436, а также в соответствующем патенте WO 9512661 на ДНК, кодирующую триол-поликетидсинтетазу).

Гены, связанные с биосинтезом вторичных метаболитов у нитчатых грибов, часто образуют кластеры в геноме. Известно, что существуют кластеры генов, участвующих в путях биосинтеза поликетидов. Гены, кодирующие белки ферментов (типа ПКС), участвующих в биосинтезе афлатоксина - поликетида, вырабатываемого Aspergillus flavus и Aspergillus parasiticus, как известно, образуют кластерную структуру. Проводился геномный анализ и сравнение генов, участвующих в биосинтезе афлатоксина в этих микроорганизмах (Yu J. et al., Appl. Environ. Microbiol., 61, 2365 (1995)). Сообщали, что гены, участвующие в биосинтезе стеригматоцистина у Aspergillus nidulans, образуют кластерную структуру, занимающую непрерывный участок размером около 60 kb в геноме (как описано в Brown D.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1418 (1996)).

Исследовалась модуляция поликетидсинтетазной активности вспомогательными белками при синтезе ловастатина (Kennedy J. et al., Science, vol. 284, 1368 (1999)).

В настоящее время, однако, молекулярно-биологический анализ биосинтеза ML-236В и факторов его регуляции нельзя считать достаточным.

Настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотид, который может применяться для ускорения биосинтеза ML-236B.

Типичным полинуклеотидом является полинуклеотид, кодирующий белок, включающий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID No. 38, 42, 44, 46, 48 или 50. Также представлены варианты этого полинуклеотида, кодирующие модифицированную аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну делецию, вставку, замену или изменение.

Перечень последовательностей в виде таблицы

Перечень последовательностей входит в состав описания настоящего патента. Для облегчения понимания он представлен в виде следующей таблицы А.

Полинуклеотиды, кодирующие аминокислотные последовательности SEQ ID No. 38, 42, 44, 46, 48 или 50, могут представлять собой кДНК, геномную ДНК или мРНК. Геномная ДНК, кодирующая эти 6 последовательностей, называется mlcE, mlcR, mlcA, mlcB, mlcC и mlcD соответственно. Независимо от этих обозначений мы полагаем, что эти структурные гены кодируют белки со следующими функциями:

mlcA Поликетидсинтетаза

mlcB Поликетидсинтетаза

mlcC Р450-Монооксигеназа

mlcD HMG-CoA-Редуктаза

mlcE Выводная помпа

mlcR Транскрипционный фактор

Мы открыли, что введение mlcE или кДНК, соответствующей mlcE, ускоряет биосинтез ML-236B, и введение mlcR или кДНК, соответствующей mlcR, тоже ускоряет биосинтез ML-236B. Кроме того, mlcR стимулирует транскрипционную экспрессию генов от mlcA до mIcD. Как показали опыты по инактивации генов, mlcA, В, С и D участвуют в продукции ML-236B независимо или в сочетании.

Варианты mlcA, В и/или С, которые можно получить природным или искусственным способом, используются для получения производных ML-236B, включая такие статины, как правастатин и ловастатин. В этом плане становится возможным получение правастатина непосредственно с помощью таких вариантов, при единственной стадии ферментации и без микробиологического превращения ML-236B в правастатин, которое сейчас проводится с помощью Streptomyces carbophilus.

Предпочтительным полинуклеотидом является последовательность, включающая SEQ ID No. 37, или мутант, или вариант таковой, способный ускорить биосинтез ML-236B. Такой ДНК-полинуклеотид можно получить из Escherichia coli, трансформированных pSAKexpE SANK 72499 (FERM BP-7005).

Другим предпочтительным полинуклеотидом является последовательность, включающая SEQ ID No. 41, или мутант, или вариант таковой, способный ускорить биосинтез ML-236B. Такой ДНК-полинуклеотид можно получить из Escherichia coli, трансформированных pSAKexpR SANK 72599 (FERM BP-7006).

Полинуклеотиды настоящего изобретения могут применяться в рабочем сочетании с одним или несколькими полинуклеотидами. Предпочтительны те комбинации, которые способны повысить продукцию ML-236B в микроорганизмах-продуцентах.

Примеры таких комбинаций включают полинуклеотид SEQ ID No. 37 или его вариант с подобной функцией в сочетании с одной или несколькими последовательностями, выбранными из числа самой SEQ ID No. 37 и 41, 43, 45, 47 и 49, а также полинуклеотид SEQ ID No. 41 или его вариант с подобной функцией в сочетании с одной или несколькими последовательностями, выбранными из числа самой SEQ ID No. 41, 37, 43, 45,47 и 49.

В одном воплощении полинуклеотидом предпочтительно является полинуклеотид, кодирующий белок, включающий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID No. 38, 42, 44, 46, 48 или 50 и способный ускорить биосинтез ML-236B сам по себе или вместе с полинуклеотидом SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 41 или их вариантов, обладающих подобной функцией.

Настоящее изобретение также распространяется на полинуклеотиды, способные к гибридизации в строгих условиях с полинуклеотидом настоящего изобретения. К ним относятся полинуклеотиды, способные ускорить биосинтез ML-236B в продуцирующем ML-236B микроорганизме при введении в этот микроорганизм.

В типичном случае полинуклеотидом служит ДНК, кДНК или геномная ДНК, или РНК, и они могут быть смысловыми или антисмысловыми. Полинуклеотид обычно является очищенным, например очищенным от других клеточных компонентов.

Настоящее изобретение распространяется на варианты полинуклеотидов, кодирующих аминокислотные последовательности SEQ ID No. 38, 42, 44, 46, 48 или 50, в которых имеются замены одного или нескольких нуклеотидов. Эти замены могут произойти естественным путем или могут быть сделаны в пределах вырожденности триплетов генетического кода. Таким образом, эти вырожденные полинуклеотиды кодируют все ту же аминокислотную последовательность. К этим вариантам полинуклеотидов мы относим геномную ДНК с экзонами и интронами, а не только простые последовательности кДНК.

Настоящее изобретение также распространяется на варианты полинуклеотидов, кодирующих аминокислотные последовательности SEQ ID No. 38, 42, 44, 46, 48 или 50, в которых имеется по меньшей мере одна модификация типа делеции, вставки или замены. Таким образом, настоящее изобретение распространяется на полинуклеотидные варианты, кодирующие аминокислотные последовательности, укороченные, удлиненные или неизмененные по размеру относительно указанных последовательностей. Эти варианты полинуклеотидов сохраняют способность ускорять синтез ML-236B и обладают активностью, сравнимой или большей, чем у исходной последовательности, из которой происходит данный вариант.

Полинуклеотидные варианты в определенной степени идентичны исходной последовательности. Степень идентичности должна составлять не менее 60%, не менее 80%, не менее 90% или не менее 95% или 100%. Степень идентичности варианта предпочтительно оценивают с помощью компьютерных программ типа программы BLAST, в которой применяется алгоритм проведения поиска гомологий.

В одном из воплощений предпочтительным полинуклеотидом настоящего изобретения является ДНК, выбранная из группы, состоящей из:

(а) ДНК, включающей одну или несколько нуклеотидных последовательностей, представленных в нуклеотидах №1-1662 SEQ ID No. 37 из Перечня последовательностей, и отличающейся тем, что она ускоряет биосинтез ML-236B в продуцирующем ML-236B микроорганизме при введении в этот микроорганизм;

(б) ДНК, гибридизирующейся в строгих условиях с ДНК, описанной в пункте (а), и отличающейся тем, что она ускоряет биосинтез ML-236B в продуцирующем ML-236B микроорганизме при введении в этот микроорганизм;

(в) ДНК, включающей одну или несколько нуклеотидных последовательностей, представленных в нуклеотидах №1-1380 SEQ ID No. 41 из Перечня последовательностей, и отличающейся тем, что она ускоряет биосинтез ML-236B в продуцирующем ML-236B микроорганизме при введении в этот микроорганизм;

(г) ДНК, гибридизирующейся в строгих условиях с ДНК, описанной в пункте (в), и отличающейся тем, что она ускоряет биосинтез ML-236B в продуцирующем ML-236B микроорганизме при введении в этот микроорганизм.

Полинуклеотиды настоящего изобретения ускоряют биосинтез ML-236B в микроорганизме-продуценте. Примерами микроорганизмов, продуцирующих ML-236B, являются такие виды Penicillium, как Penicillium citrinum, Penicillium brevicompactum (описано в Brown A.G. et al., J. Chem. Soc. Perkin-1, 1165 (1976)), Penicillium cyclopium (описано в Doss S.L. et al., J. Natl. Prod., 49, 357 (1986)) и т.п. Другими примерами являются Eupenicillium sp. M6603 (описано в Endo A. et al., J. Antibiot. - Tokyo, 39, 1609 (1986)), Paecilomyces viridis FERM P-6236 (описано в японской патентной заявке №58-98092), Paecilomyces sp. M2016 (описано в Endo A. et al., J. Antibiot. -Tokyo, 39, 1609 (1986)), Trichoderma longibrachiatum M6735 (описано в Endo A. et al., J. Antibiot. - Tokyo, 39, 1609 (1986)), Hypomyces chrysospermus IFO 7798 9описано в Endo A. et al., J. Antibiot. - Tokyo, 39, 1609 (1986)), Gliocladium sp. YJ-9515 (описано в WO 9806867), Trichoderma viride IFO 5836 (описано в японской патентной заявке №62-19159), Eupenicillium reticulisporium IFO 9022 (описано в японской патентной заявке №62-19159) или любой другой подходящий организм.

Из этих продуцирующих ML-236B микроорганизмов предпочтителен Penicillium citrinum и более предпочтителен штамм Penicillium citrinum SANK 13380. Штамм Penicillium citrinum SANK 13380 депонирован в Research Institute of Life Science and Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 22 декабря 1992 г. под кодовым номером PERM BP-4129 в соответствии с Будапештским договором о депонировании микроорганизмов. Примерами продуцирующих ML-236B микроорганизмов также являются те, которые выделены из природных источников, и те, которые мутировали естественным или искусственным путем.

Изобретение также обеспечивает векторы, включающие полинуклеотид настоящего изобретения, такие как вектор, получаемый из Escherichia coli pSAKexpE SANK 72499 (PERM BP-7005) или Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599 (PERM BP-7006). К таким векторам настоящего изобретения относятся экспрессионные векторы.

Также обеспечиваются клетки-хозяев, трансформированные вектором настоящего изобретения, включая микроорганизмы, продуцирующие ML-236B. Клетки-хозяева по настоящему изобретению включают Penicillium citrinum и Escherichia coli, например, Escherichia coli pSAKexpE SANK 72499 (PERM BP-7005) или Escherichia coli pSAKexpR SANK 72599 (PERM BP-7006).

Кроме того, изобретение распространяется на полипептиды, кодируемые полинуклеотидом настоящего изобретения. Примерами полипептидов настоящего изобретения служат последовательности SEQ ID No. 38 или 42 или варианты таковых, имеющие определенную степень идентичности с SEQ ID No. 38 или 42 и способные к ускорению продукции ML-236B в микроорганизмах-продуцентах. Другие полипептиды - те, что кодируются другими полинуклеотидными последовательностями настоящего изобретения и их вариантами, сохраняющими определенную степень идентичности.

Степень идентичности полипептидных вариантов с SEQ ID No. 38 или 42 должна составлять не менее 80%, не менее 90%, или не менее 95%, или 100%. Степень идентичности варианта предпочтительно оценивают с помощью компьютерных программ типа программы BLAST, в которой применяется алгоритм проведения поиска гомологий.

К полипептидам настоящего изобретения относятся последовательности, укороченные или удлиненные по сравнению с SEQ ID No. 38 или 42 или их вариантами. Укороченные полипептиды включают частичные аминокислотные последовательности SEQ ID No. 38, 42 или их вариантов и сохраняют способность ускорять биосинтез ML-236B. Удлиненные полипептиды включают полные или частичные аминокислотные последовательности SEQ ID No. 38, 42 или их вариантов и сохраняют способность ускорять биосинтех ML-236B. Удлиненные полипептиды включают слитые (fusion) белки типа Fc-слитого белка.

К полипептидам настоящего изобретения относятся полипептиды, имеющие последовательность SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 48, или варианты таковых с одинаковой функцией. Антитела к полипептидам настоящего изобретения также включены. Как поликлональные, так и моноклональные антитела включены в настоящее изобретение. Они могут применяться для регуляции продукции ML-236B и для получения таких производных ML-236B, как статины, включая правастатин и ловастатин. Кроме того, антитела могут предпочтительно использоваться для анализа биосинтеза ML-236B и механизмов его регуляции. Такой анализ может применяться для модуляции продукции ML-236B и для получения производных ML-236B.

Клетки-хозяева по настоящему изобретению, содержащие вектор настоящего изобретения, могут применяться в способе получения ML-236B, включающем выращивание таких клеток и затем выделение ML-236B из культуры. В одном из способов вектор содержит m1сЕ или mlcR, но не содержит других генов, таких как mlcA, mlcB, mlcC или mlcD.

Продукция способом настоящего изобретения может происходить в отсутствие рекомбинантных полипептидов mlcA, mlcB, mlcC и/или mlcD, которые соответствуют SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 48 и SEQ ID No. 50.

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.

Авторы настоящего изобретения клонировали геномную ДНК, содержащую гены, участвующие в биосинтезе ML-236B в Penicillium citrinum. Эта геномная ДНК, в дальнейшем именуемая связанной с биосинтезом ML-236B, клонирована из геномной библиотеки ДНК микроорганизма, продуцирующего ML-236B. Геномную ДНК анализировали с целью выявления находящихся там структурных генов, а затем получали соответствующие этим структурным генам кДНК с помощью обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (в дальнейшем именуемой "ОТ-ПЦР"), используя тотальную РНК, содержащую мРНК Penicillium citrinum в качестве матрицы. Было обнаружено, что биосинтез ML-236B в микроорганизме-продуценте ускоряется, когда этот микрорганизм трансформирован вектором, несущим рекомбинантные кДНК.

Настоящее изобретение особенно касается кДНК (в дальнейшем именуемых ускоряющими биосинтез ML-236B), ускоряющих биосинтез ML-236B в продуцирующем ML-236B микроорганизме при введении в этот микроорганизм.

К ускоряющим биосинтез ML-236B полинуклеотидам настоящего изобретения, таким как ускоряющие биосинтез ML-236B кДНК, относятся, к примеру:

(I) ДНК, получаемая путем синтеза с применением в качестве матрицы продукта транскрипции (матричной РНК, в дальнейшем именуемой мРНК) структурного гена, участвующего в биосинтезе ML-236B и существующего в геномной ДНК продуцирующего ML-236B микроорганизма;

(II) двухцепочечная ДНК, полученная в результате ассоциации ДНК (I) и второй цепи ДНК, синтезированной с помощью ДНК (I) в качестве первой цепи;

(III) двухцепочечная ДНК, полученная путем репликации или амплификации двухцепочечной ДНК (II), например, методом клонирования или ему подобным;

(IV) ДНК, способная к гибридизации с одной из указанных выше ДНК или мРНК в строгих условиях.

В качестве ДНК (IV) могут служить любые из приведенных последовательностей структурных генов, например нуклеотиды от №1 до 1662 в SEQ ID No. 37 из Перечня последовательностей или нуклеотиды от №1 до 1380 в SEQ ID No. 41, в которых необязательно имеется замена, делеция и/или добавление одного или нескольких нуклеотидов и которые способны ускорять биосинтез ML-236B в продуцирующем ML-236B микроорганизме при введении в этот микроорганизм.

При гибридизации двух одноцепочечных нуклеиновых кислот образуется двухцепочечная молекула в том участке, где они комплементарны или сильно комплементарны друг другу, а "строгие условия" в данном случае означает, что гибридизационным раствором является 6SSC (1SSC состоит из 150 мМ NaCl, 15 мМ цитрата натрия), а температура при гибридизации равна 55С.

Ускоряющую биосинтез ML-236B кДНК можно получить, например, путем выделения содержащего кДНК клона из библиотеки кДНК микроорганизма, продуцирующего ML-236B. В качестве альтернативы можно использовать ОТ-ПЦР с помощью пары праймеров, составленных на основе нуклеотидной последовательности связанной с биосинтезом ML-236B геномной ДНК, вместе с мРНК или тотальной РНК из микроорганизма, продуцирующего ML-236B.

Продуцирующим ML-236B микроорганизмом является любой микроорганизм, обладающий способностью продуцировать ML-236B. Как указано ранее, примерами микроорганизмов, продуцирующих ML-236B, являются такие виды Penicillium, как Penicillium citrinum, Penicillium brevicompactum, Penicillium cyclopium и т.д., а другими примерами являются Eupenicillium sp. M6603, Paecilomyces viridis FERM P-6236, Paecilomyces sp. M2016, Trichoderma longibrachiatum M6735, Hypomyces chrysospermus IFO 7798, Gliocladium sp. YJ-9515, Trichoderma viride IFO, Eupenicillium reticulisporium IFO 9022 и любые другие подходящие организмы.

Связанную с биосинтезом ML-236B геномную ДНК можно получить скринированием геномной библиотеки ДНК продуцирующего ML-236B микроорганизма с помощью соответствующего зонда. Зонд разрабатывают на основе последовательности ДНК, предположительно играющей роль в биосинтезе ML-236B, предпочтительно из нитчатого гриба.

Выбор методов создания геномной библиотеки ДНК не ограничен - можно применять любые подходящие методы, предпочтительно общие методы создания геномных библиотек ДНК эукариотических организмов. Примеры таковых включают метод Maniatis et al. (Maniatis T. et al., Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Известны и другие методы в этой области.

Вкратце, геномную ДНК из микроорганизма, продуцирующего ML-236B, можно получить путем сбора клеток из культуры этого микроорганизма, физического разрушения клеток, экстракции ДНК, находящейся в ядрах, и очистки этой ДНК.

Выращивать микроорганизм, продуцирующий ML-236B, можно в условиях, подходящих для данного микроорганизма. Например, Penicillium citrinum, предпочтительный микроорганизм, продуцирующий ML-236B, можно выращивать, инокулируя клетки в среду MBG3-8 (состав (вес/об.): 7% глицерина, 3% глюкозы, 1% соевого порошка, 1% пептона (фирмы Kyokuto Seiyaku Kogyo), 1% кукурузного экстракта (фирмы Honen), 0,5% нитрата натрия, 0,1% сульфата магния семиводного (рН 6,5)) и инкубируя со встряхиванием при 22-28С в течение 3-7 дней. Косяки для хранения можно приготовить, заливая расплавленную агарную среду PGA (состав: 200 г/л картофельного экстракта, 15% глицерина, 2% агара) в пробирку и удерживая пробирку под углом до затвердения агара. Затем можно инокулировать Penicillium citrinum на косяк с помощью платиновой иглы с последующей инкубацией при 22-28С в течение 7-15 дней. Выращенные таким образом микроорганизмы или бактерии можно долгое время хранить на косяке при 0-4С.

Клетки микроорганизма, продуцирующего ML-236B, выращенные в жидкой культуре, можно собрать центрифугированием, а те, что выращены на твердой среде, можно собрать скребком или чем-то вроде этого.

Разрушить клетки можно путем растирания клеток в ступке с пестиком после замораживания их жидким азотом. Ядерную ДНК из разрушенных клеток можно экстрагировать с помощью детергента, например додецилсульфата натрия (в дальнейшем именуемого ДСН) или другого подходящего детергента. Экстрагированную геномную ДНК желательно обработать фенол-хлороформной смесью для удаления белка, а затем высадить в осадок этанолом.

Полученную геномную ДНК расщепляют на фрагменты соответствующим рестрикционным ферментом. Не имеется ограничений на применение рестрикционных ферментов для расщепления ДНК; предпочтительны общедоступные рестрикционные ферменты. К таковым относится Sau3AI. Другие ферменты известны в этой области. После расщепления ДНК подвергают гель-электрофорезу, затем из геля выделяют геномную ДНК требуемого размера. Нет особых ограничений на размер фрагмента ДНК, но предпочтительно он составляет 20 kb и больше.

Также нет ограничений на выбор ДНК-вектора, применяемого при построении геномной библиотеки ДНК, лишь бы этот вектор имел последовательность ДНК, необходимую для репликации в клетке-хозяине, которая будет им трансформирована. К числу таких векторов относятся плазмидные векторы, фаговые векторы, космидные векторы, ВАС-векторы и т.п., но предпочтительны космидные векторы. ДНК-векторы предпочтительно являются экспрессионными векторами. Более предпочтительно, когда ДНК-вектор включает ДНК или нуклеотидную последовательность, придающую селективный фенотип клеткам, трансформированным этим вектором.

Желательно, чтобы ДНК-вектор подходил как для клонировании, так и для экспрессии. Предпочтительным вектором является челночный вектор, который может применятся для трансформации более чем одного микроорганизма. Желательно, чтобы челночный вектор имел последовательность ДНК, позволяющую его репликацию в клетке-хозяине, и предпочтительно такую последовательность или последовательности, которые позволяют его репликацию в нескольких различных клетках из разных групп микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Кроме того, челночный вектор предпочтительно должен содержать последовательность ДНК, придающую селективный фенотип целому ряда различных клеток-хозяев, например, клеток из разных групп микроорганизмов.

Нет особых ограничений на выбор комбинации групп микроорганизмов и клеток, трансформируемых челночным вектором, при условии, что одна из групп микроорганизмов подходит для клонирования, а другая обладает способностью вырабатывать ML-236B. Такой комбинацией, например, может быть комбинация из бактерий и нитчатых грибов, комбинация из дрожжей и нитчатых грибов, причем комбинация из бактерий и нитчатых грибов предпочтительна. Нет особых ограничений на выбор бактерии, лишь бы она широко применялась в биотехнологии, как Escherichia coli, Bacillus subtilis и им подобные. Предпочтительна Escherichia coli, и более предпочтительна Escherichia coli XLl-Blue MR. Также нет ограничений на выбор дрожжей, лишь бы они широко применялись в биотехнологии, как Saccharomyces cerevisiae и им подобные. Примерами нитчатых грибов являются продуцирующие ML-236B микроорганизмы, описанные выше. Примеры других подходящих микроорганизмов известны в этой области.

В настоящем изобретении микроорганизм можно выбрать из таких групп, как бактерии, нитчатые грибы и дрожжи.

Примером вышеупомянутых челночных векторов является космидный вектор, несущий маркерный ген, пригодный для селекции фенотипа, и cos-участок. Другие подходящие векторы известны в этой области. Предпочтительным вектором является pSAKcos1, построенный путем вставки cos-участка из космидного вектора pWE15 (фирмы Stratagene) в плазмиду pSAK.333, включающую последовательность гена гигромицин В-фосфотрансферазы Escherichia coli (описано в японской патентной заявке №3-262486). Метод построения pSAKcos1 показан на Фигуре 1. Настоящее изобретение не ограничивается этим вектором.

Геномную библиотеку ДНК можно построить путем введения челночного вектора в клетку-хозяин с тем, чтобы вектор содержал фрагмент геномной ДНК из продуцирующего ML-236B микроорганизма. В качестве клетки-хозяина предпочтительно используют Escherichia coli, более предпочтительно Escherichia coli XLl-Blue MR. Когда клеткой-хозяином является Escherichia coli, введение может проводиться путем упаковки in vitro. В настоящем изобретении трансформация также включает введение чужеродной ДНК методом упаковки in vitro, а понятие трансформированной клетки охватывает также клетки, в которые чужеродная ДНК вводится методом упаковки in vitro.

Для идентификации требуемого клона геномную библиотеку можно скринировать с помощью антитела или зонда из нуклеиновой кислоты, причем зонды из нуклеиновой кислоты предпочтительны. Зонд из нуклеиновой кислоты предпочтительно получают на основе нуклеотидной последовательности гена или ДНК, связанной с биосинтезом поликетида, предпочтительно последовательности, происходящей из нитчатого гриба. Нет ограничений на выбор конкретного гена, лищь бы он участвовал в биосинтезе поликетидов и его нуклеотидная последовательность была известна. Примерами таких генов являются гены ПКС афлатоксина Aspergillus flavus и Aspergillus parasiticus, ген ПКС стеригматоцистина Aspergillus nidulans и им подобные.

Подходящие зонды из нуклеиновой кислоты можно получить, например, путем синтеза олигонуклеотидного зонда, включающего часть известной последовательности геномной ДНК, как описано выше, или получения олигонуклеотидных праймеров и амплификации требуемой ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (в дальнейшей именуемой ПЦР, как описано в Saiki R.K. et al; Science, 239, 487 (1988)) и геномной ДНК в качестве матрицы. Другие методы, пригодные для получения таких зондов, хорошо известны в этой области.

Зонд из нуклеиновой кислоты можно получить из продуцирующего ML-236B микроорганизма, например, с помощью ПЦР или ОТ-ПЦР. Праймеры для ПЦР или ОТ-ПЦР (в дальнейшем именуемые "праймер для ПЦР") предпочтительно составляют на основе нуклеотидной последовательности того гена, связанного с биосинтезом поликетида, нуклеотидная последовательность которого известна. Предпочтительно этим геном является ген ПКС афлатоксина Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus или ген ПКС стеригматоцистина Aspergillus nidulans.

Праймеры для ПЦР желательно проектировать так, чтобы они содержали нуклеотидные последовательности, кодирующие сильно консервативные аминокислотные последовательности в генах ПКС. Методы определения нуклеотидных последовательностей, соответствующих данной аминокислотной последовательности, включают дедукцию на основе употребимости кодонов клетки-хозяина и методы создания смешанных олигонуклеотидных последовательностей с помощью множественных кодонов (в дальнейшем именуемых "вырожденные олигонуклеотиды"). В последнем случае множественность олигонуклеотидов можно снизить введением гипоксантина в их нуклеотидные последовательности.

Праймер для ПЦР может содержать нуклеотидную последовательность, которая при отжиге будет гибридизироваться с матричной цепью, причем праймер присоединяется к дополнительной 5'-последовательности. Нет особых ограничений на выбор такой дополнительной 5'-нуклеотидной последовательности, лишь бы этот праймер мог служить для ПЦР или ОТ-ПЦР. Такой дополнительной 5'-последовательностью, например, может быть нуклеотидная последовательность, удобная для клонирования продукта ПЦР. Такой нуклеотидной последовательностью, например, может быть сайт расщепления для рестрикционного фермента или нуклеотидная последовательность, содержащая такой сайт.

Кроме того, при проектировании праймера для ПЦР предпочтительно, чтобы сумма гуаниновых (G) и цитозиновых (С) оснований равнялась 40-60% от общего числа оснований. Более того, предпочтительно, чтобы почти или совсем не было самогибридизации данного праймера и, в случае пары праймеров, чтобы почти или совсем не было гибридизации между праймерами.

Нет особых ограничений на число нуклеотидов, входящих в состав праймера для ПЦР, лишь бы он подходил для ПЦР. Нижний предел этого числа обычно равен 10-14 нуклеотидам, а верхний - 40-60 нуклеотидам. Предпочтительная длина праймера от 14 до 40 нуклеотидов.

Праймер для ПЦР предпочтительно состоит из ДНК. Нуклеозидами в праймере могут служить дезоксиаденозин, дезоксицитидин, дезокситимидин и дезоксигуанозин, кроме того, также дезоксиинозин. Желательно, чтобы в 5'-позиции нуклеозида, находящегося на 5'-конце праймера для ПЦР, была гидроксильная группа или гидроксигруппа с одним остатком фосфорной кислоты, присоединенным с помощью эфирной связи.

Синтезировать праймер для ПЦР можно методами, которые обычно применяются для синтеза нуклеиновых кислот, например фосфоамидитным методом. В таком методе предпочтительно использовать автоматизованный синтезатор ДНК.

В качестве матрицы для ПЦР или ОТ-ПЦР можно использовать геномную ДНК или мРНК соответственно из продуцирующего ML-236B микроорганизма. Вместо мРНК можно также использовать тотальную РНК в качестве матрицы для ОТ-ПЦР.

Продукт ПЦР или ОТ-ПЦР можно клонировать, встроив его в соответствующий ДНК-вектор. В общем, на выбор ДНК-вектора для стадии клонирования не имеется ограничений. Имеются коммерческие наборы, позволяющие легко клонировать продукты ПЦР и ОТ-ПЦР. К примеру, для такого клонирования подходит набор Original ТА Cloning Kit (фирмы Invitrogen; в качестве ДНК-вектора применяется pCR2.1).

Для того чтобы получить клонированный продукт ПЦР, трансформированные клетки-хозяева, содержащие плазмиды, несущие требуемый продукт ПЦР, выращивают в культуре, а затем из клеток экстрагируют и очищают плазмиды. После этого выделяют встроенный фрагмент ДНК из этой плазмиды.

Трансформированные клетки желательно выращивать в условиях, подходящих именно для этих клеток. Предпочтительная клетка-хозяин - Escherichia coli, ее выращивают в среде LB (1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% хлористого натрия) со встряхиванием при 30-37С от 18 часов до двух дней.

Выделить плазмиды из культуры трансформированных клеток можно путем сбора клеток и выделения плазмид, очищенных от других клеточных компонентов, таких как геномная ДНК или белки хозяина. Выделение плазмидной ДНК из культуры Escherichia coli можно проводить щелочным методом Маниатиса (описано в Maniatis Т. et al., Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed.. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Имеются коммерческие наборы для выделения плазмид более высокой чистоты. Предпочтителен набор Plasmid Mini Kit (фирмы Qiagen AG). Кроме того, имеются коммерческие наборы для массовой продукции плазмид. Предпочтителен набор Plasmid Maxi Kit (фирмы Qiagen AG).

Концентрацию плазмидной ДНК в препарате можно определить, измеряя поглощение при длине волны 260 нм после соответствующего разбавления образца ДНК. Расчеты проводятся на основе того, что раствор со значением поглощения OD₂₆₀, равном 1, содержит 50 мкг/мл ДНК (описано в Maniatis Т. et al., supra).

Чистоту ДНК можно вычислить из соотношения зачений поглощения при длинах волн 280 и 260 нм (описано в Maniatis Т. et al., supra).

Методы мечения зондов нуклеиновых кислот можно в общем разделить на радиоактивные и нерадиоактивные. В общем, нет ограничений на выбор радионуклеотида для метки, которым может служить, например, ³²P, ³⁵S, ¹⁴С и другие. Для метки предпочтительно применять ³²Р. Выбор средства для нерадиоактивной метки тоже в общем не ограничен, лишь бы это было общеприменимое средство для мечения нуклеиновых кислот, которым может быть, например, дигоксигенин, биотин или им подобные, причем предпочтителен дигоксигенин.

В общем, на методы мечения зондов нуклеиновых кислот также не имеется ограничений. Предпочтительны общепринятые методы, например методы внедрения метки в продукт посредством ПЦР или ОТ-ПЦР с помощью меченых нуклеотидных субстратов, ник-трансляция, применение неупорядоченых праймеров, мечение по концам, и методы синтеза олигонуклеотидной ДНК с помощью меченых нуклеотидных субстратов. Из числа этих методов можно выбрать подходящий в зависимости от вида зонда из нуклеиновой кислоты.

Присутствие в геноме продуцирующего ML-236B микроорганизма нуклеотидной последовательности, тождественной нуклеотидной последовательности данного зонда нуклеиновой кислоты, можно подтвердить путем гибридизации по Сазерну с геномной ДНК этого микроорганизма.

Гибридизацию по Сазерну можно проводить согласно методу Маниатиса (описано в Maniatis Т. et al., supra).

Меченый зонд нуклеиновой кислоты, полученный как описано выше, можно применять для скринирования геномной библиотеки ДНК. Выбор метода скринирования не имеет особых ограничений, лишь бы он в общем подходил для клонирования генов, хотя предпочтителен метод гибридизации колоний Маниатиса (описано в Maniatis Т. et al., supra).

Колонии для гибридизации желательно выращивать в условиях, подходящих для клетки-хозяина. Предпочтительная клетка-хозяина - Escherichia coli, ее выращивают путем инкубации в агарной среде LB (1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% хлористого натрия, 1,5% агарозы) при 30-37С от 18 часов до двух дней.

Выделение вектора, несущего рекомбинантную ДНК, из положительного клона, полученного при гибридизации колоний, обычно проводят путем экстракции плазмиды из культуры положительного клона и ее очистки.

Трансформированный штамм Escherichia coli - Escherichia coli pML48 SANK71199, представляющий собой положительный клон, полученный согласно настоящему изобретению, депонирован в Research Institute of Life Science and Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 7 июля 1999 г. в соответствии с Будапештским договором о депонировании микроорганизмов и получил кодовый номер FERM ВР-6780.

Типичный ДНК-вектор, переносимый Escherichia coli pML48 SANK71199, был назван pML48.

Подтвердить то, что рекомбинантный ДНК-вектор, обнаруженный в положительном клоне, содержит геномную ДНК, связанную с биосинтезом ML-236B, можно путем определения нуклеотидной последовательности рекомбинатной вставки ДНК-вектора, гибридизации по Сазерну или экспрессии вставки для выявления функции.

Нуклеотидную последовательность ДНК можно определить методом химической модификации Максама и Гилберта (описано в Maxam A.M.M. and Gilbert W., Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)) или методом дидезокси-терминации цепи (описано в Messing J. and Vieira J., Gene, 19, 269 (1982)). Другие методы хорошо известны в этой области. При определении нуклеотидной последовательности плазмидная ДНК должна быть высокой чистоты, как описано выше.

Нуклеотидная последовательность вставки pML48 показана в SEQ ID No. 1 из Перечня последовательностей. Нуклеотидная последовательность, показанная в SEQ ID No. 2 из Перечня последовательностей, полностью комплементарна нуклеотидной последовательности SEQ ID No. 1. В общем, нуклеотидная последовательность геномной ДНК может обладать генетическим полиморфизмом в пределах вида, иными словами, иметь аллогенные различия. Кроме того, известно, что в процессе клонирования и секвенирования с определенной частотой могут возникать замены нуклеотидов или другие изменения. Соответственно геномная ДНК настоящего изобретения, связанная с биосинтезом ML-236В, также охватывает геномную и другую ДНК, способную гибридизироваться с нуклеотидами №1-34203 SEQ IDО No. 1 или 2 из Перечня последовательностей. Предп