Композиции подвергнутых рестрикции клеток, способных к быстрому росту, которые продуцируют вещества, подавляющие пролиферацию клеток, и их применение

Композиции подвергнутых рестрикции клеток, способных к быстрому росту, которые продуцируют вещества, подавляющие пролиферацию клеток, и их применение

Реферат

 

Изобретение относится к медицине. Заявлены композиции, которые содержат ограниченные в размножении пролиферирующие клетки. При таком ограничении клетки продуцируют неожиданно высокое количество вещества, которое подавляет пролиферацию клеток и имеет молекулярную массу около 30 кД. Это явление не зависит ни от типа клеток, ни от их видовой принадлежности. Раскрыты также способы получения таких композиций и их применение. Изобретение обеспечивает возможность использования клеток, отличных от раковых, для лечения рака и других состояний. 16 н. и 94 з.п.ф-лы, 22 табл.

Настоящее изобретение относится к ограничению пролиферации клеток, находящихся на логарифмической фазе роста, или их способности к быстрому росту в логарифмической фазе, которые при физическом ограничении их размножения биосовместимым полупроницаемым материалом, продуцируют в норме неэкспрессируемые или повышенные количества обычно экспрессируемого фактора или факторов, способных ингибировать рост других быстро пролиферирующих клеток того же самого или другого типов и/или происхождения. Эти подвергнувшиеся рестрикции клетки здесь называются пролиферативными клетками. Нелимитирующий перечень пролиферативных клеток, принадлежащих к указанной категории, включает опухолевые клетки, раковые клетки и незлокачественные клетки, в том числе (но без ограничения ими) клетки эмбриона, стволовые клетки и клетки в фазе восстановления после повреждения ткани, включая гепатоциты, фибробласты и эпителиальные клетки. Структуры, которые являются одним из признаков данного изобретения, могут использоваться сами по себе или для получения некоего материала, например, концентратов с приблизительно установленным молекулярным весом, которые также обладают антипролиферативным действием на быстро размножающиеся клетки, связанные с заболеваниями или соответствующими состояниями, например, раком, или для контроля за ростом клеток с целью предотвращения некоторых медицинских проблем, которые могут возникать при неконтролируемом росте клеток, например, при образовании послеоперационных рубцов.

Предпосылки создания изобретения и предшествующий уровень техники

Инкапсулирование различных биологически активных веществ в биологически совместимые материалы, которое достаточно полно описано в литературе, является методикой, которая использовалась в течение некоторого периода времени, хотя и с ограниченным успехом. Примерами из данной области могут служить US патенты 5227298 (Weber et al.); 5053332 (Cook et al.); 4997443 (Walthall et al.); 4971833 (Larsson et al.); 4902295 (Walthall et al.); 4798786 (Tice et al.); 4673566 (Goosen et al.); 4647536 (Mosbach et al.); 4409331 (Lim); 4392909 (Lm); 4352883 (Lm) и 4663286 (Tsang et al.). Также следует отметить US патент 5643569, выданный Jain et al. Jain et al., довольно подробно обсуждают инкапсулирование островков в различные биосовместимые материалы. Островки вырабатывают инсулин, и потому там раскрыто применение описанных Jain et al. продуктов при лечении диабета. В US патенте 5888497, выданном Jain et al., описываются агарозные шарики, покрытые слоем пригодной для имплантации агарозы, содержащие раковые клетки, подвергнутые рестрикции, которые продуцируют больше вещества, подавляющего рост не подвергаемых рестрикции раковых клеток, по сравнению с тем же количеством тех же самых (ранее упомянутых), но не подвергнутых рестрикции раковых клеток.

В патентах Jain et al. довольно подробно обсуждаются методики, используемые ранее в трансплантационной практике. Кроме того, они там обобщены.

Известны пять главных подходов к защите трансплантированной ткани от иммунной реакции хозяина. Все они основаны на стремлении изолировать трансплантированную ткань от иммунной системы хозяина. Методы по иммуноизолированию на сегодняшний день обычно включают: внесосудистые диффузионные камеры, внутрисосудистые диффузионные камеры, внутрисосудистые ультрафильтрационные камеры, микроинкапсулирование и макроинкапсулирование. Существует множество проблем, связанных с ранее используемыми методами, включающих фиброзную реакцию хозяина на имплантируемый материал, нестабильность имплантируемого материала, ограниченную диффузию питательных веществ через полупроницаемые мембраны, проницаемость стимулятора секреции и продукта и лаг-фазу диффузии через полупроницаемые мембранные фильтры.

Например, метод микроинкапсулирования для заключения жизнеспособных клеток, тканей и других лабильных мембран внутрь оболочки, представляющей собой полупроницаемую мембрану, был разработан Lim в 1978 г. (Lim, Research report to Damon Corporotion (1978)). Lim использовал микрокапсулы из альгината и поли L-лизина для инкапсулирования островков Лангерганса (называемых здесь "островками"). В 1980 г. было сообщено о первом успешном применении in vivo этой новой методики при исследовании диабета (Lim, et al., Science 210:908 (1980)). Имплантация этих микроинкапсулированных островков поддержала эугликемическое состояние у животных с диабетом. Однако, при повторении этих опытов другие исследователи обнаружили, что альгинат вызывает тканевую реакцию, и не смогли воспроизвести результаты Lim, et al. (Lamberti, et al. Applied Biochemistry and Biotechology 10:101 (1984); Dupuy, et al., J. Biomed. Material and Res. 22:1061 (1988); Weber, et al., Transplantation 49:396 (1990); Doon-shiong, et al., Transplantation Proceedings 22:754 (1990)). В настоящее время полагают, что растворимость этих полимеров в воде обусловлена ограниченной стабильностью и биосовместимостью этих микрокапсул in vivo (Dupuy, et al., см. выше; Weber et al., см. выше; Doon-shiong, et al., см. выше; Smidsrod, Faraday Discussion of Chemical Society 57:263 (1974)).

Iwata et al., (Iwata, et al., Jour. Biomedical Material and Res. 26:967 (1992)) использовал агарозу для микроинкапсулирования аллогенных панкреатических островков и обнаружил, что она может использоваться как материал для изготовления микрогранул. В этом исследовании 1500-2000 островков были микроинкапсулированы каждый по отдельности в 5% агарозу и имплантированы мышам со стрептозотоцин - индуцируемым диабетом. Трансплантат сохранялся живым в течение длительного периода времени и у реципиентов неограниченно долго сохранялась нормогликемия.

Однако, этот метод обладает рядом недостатков. Он трудоемок и неточен. Например, много гранул остаются не полностью покрытыми, а несколько сотен гранул остаются в форме свободной агарозы. Таким образом, требуется дополнительное время, чтобы отделить микроинкапсулированные островки от "незанятых" (пустых) гранул. Кроме того, большая часть имплантированных микрокапсул скапливается в тазовой полости и для того, чтобы достичь нормогликемии, требуется большое количество отдельных гранул, абсолютно полностью покрытых островками. К тому же трансплантируемые гранулы не подлежат восстановлению и извлечению, довольно хрупки и при малейшем повреждении островки легко отсоединяются.

Способ макроинкапсулирования также исследовался. Для иммуновыделения островков были изготовлены макрокапсулы из самых различных материалов, например, поли-2-гидроксиэтил-метакрилата, поливинилхлорид - с - акриловой кислоты и ацетата целлюлозы (См. Altman, et al., Diabetes 35:625 (1986); Altman, et al., Transplantation: American Society of Artificial Internal Organs 30:382 (1984); Ronel, et al., Jour. Biomedical Material Research 17:855 (1983); Klomp, et al., Jour. Biomedical Material Research 17:865-871 (1983)). Во всех этих опытах достигалось только скоропреходящая нормализация гликемии.

Archer, et al., Journal of Surgical Research 28:77 (1980), использовали полые волокна из акрилового сополимера для того, чтобы на время предотвратить отторжение островковых ксенотрансплантатов. Они сообщили об удлинении продолжительности жизни включенных в полые волокна неонатальных мышиных панкреатических трансплантатов, которые были трансплантированы хомякам с диабетом. Недавно Lacy, et al., Science 254:1782-1784 (1991) подтвердили эти результаты, но было обнаружено, что эугликемическое состояние является временным. Авторы работы установили, что когда островки вводятся внутрь волокна, они агрегируют внутри пустого канала волокна, что приводит к некрозу в сердцевинной части островковых масс. Этот некроз в центре препятствует пролонгированию жизни трансплантата. Для решения этой проблемы используют альгинат для диспергирования островков в волокне.

Однако, этот эксперимент не был воспроизведен многократно. Поэтому роль мембраны как средства для трансплантации островков у человека сомнительна.

В патенте Jain et al., упомянутом выше, сообщается, что микроинкапсулирование секреторных клеток в проницаемый гидрофильный гель приводит к получению функционально полезного неиммуногенного материала, который может быть имплантирован животным, может храниться в течение продолжительного времени и является полезным в терапевтическом плане in vivo. Макроинкапсулирование секреторных клеток предусматривало более эффективную и усовершенствованную методику для трансплантации этих секреторных клеток.

В патенте, во всем его тексте, не обсуждается включение клеток, способных к быстрой пролиферации.

Обзор литературы по инкапсулированию клеток свидетельствует о том, что вследствие инкапсулирования клетки почти всегда продуцируют меньше веществ, чем они продуцируют без инкапсулирования. См. Lloyd - George, et al., Biomat.Art. Cell & Immob. Biotech. 21(3): 323-333 (1993); Schinstine, et al., Cell Transplant 4 (I): 93-102 (1995); Chicheportiche, etal., Diabetologica 31:54-57 (1988); Jaeger, et al., Progress In Brain Research 82:41-46 (1990); Zekorn, et al., Diabetologica 29:99-106 (1992); Zhou, et al., Am. J. Physiol. 274: C.1356-1362 (1998); Darquy, et al., Diabetologica 28:776-780 (1985); Tse, et al., Biotech. & Bioeng. 51:271-280 (1996); Jaeger, et al., Neurol. 21:469-480 (1992); Hortelano, et al., Blood 87(12): 5095-5103 (1996); Gardiner, et al., Transp. Proc. 29:2019-2020 (1997). Ни в одной из этих ссылок не упоминается о включении клеток, способных к быстрой пролиферации, внутрь структуры, которая поглощает их и в то же время ограничивает их рост, но тем не менее обеспечивает диффузию веществ внутрь этой структуры и наружу из нее.

Некая теория, рассматривающая канцероподобные образования, уподобляет такого рода образования, например, опухоли нормальным органам. Здоровые органы, например, печень, растут до определенного размера и далее рост прекращается, однако, если часть печени удалить, она до определенной степени восстановится. Такое же явление наблюдается и в отношении опухолей. В заключение следует отметить, что если часть опухоли удалить, клетки в оставшейся части опухоли начнут размножаться очень быстро, пока получившаяся опухоль не достигнет своего определенного размера, после чего размножение идет на спад и прекращается. Это дает возможность предположить, что существует некий внутренний механизм регулирования роста раковых клеток.

Сущность изобретения

Изобретение, сущность которого раскрыта в данном описании, показывает, что когда клетки, способные быстро размножаться, физически ограничены, например, путем включения в какую-либо структуру, скорость их размножения заметно падает и они продуцируют неожиданно большие количества вещества, которое, будучи применено по отношению к клеткам, не подвергнутым ограничению и быстро размножающимся, ингибирует размножение этих не подвергнутых ограничению клеток. Возможность торможения пролиферации раковых клеток является изначальной целью онкологии. Следовательно, будет понятной терапевтическая полезность данного изобретения в отношении лечения рака и других заболеваний и состояний, вызванных быстрой пролиферацией клеток, и это далее будет подробно разъяснено. По-видимому, продуцируемое вещество не ограничено ни типом быстро размножающихся используемых клеток, ни видом животного, от которого получены быстро размножающиеся клетки. Далее, этот эффект, по-видимому, не является видоспецифичным, так как подвергнутые рестрикции клетки первого вида продуцируют вещество, ингибирующее размножение не подвергнутых рестрикции клеток второго вида. Далее, что касается рака, по всей видимости, данный эффект не зависит от типа рака, так как подвергнутые рестрикции клетки одного типа рака продуцируют вещество, которое ингибирует размножение не подвергнутых рестрикции клеток другого типа рака.

Данный эффект не требует также, по-видимому, и иммунного ответа. Антипролиферативный эффект просматривается в системах in vitro, где используются неиммунные клетки. Отсюда ясно, что антипролиферативный эффект не может быть отнесен к классическим иммунологическим реакциям.

Таким образом, предпочтительный вариант изобретения относится к композиции вещества, имеющего биосовместимую, ограничивающую размножение, избирательно проницаемую структуру. Эта структура ограничивает быстро размножающиеся клетки, которые в результате продуцируют больше вещества, подавляющего быструю клеточную пролиферацию, по сравнению с равным количеством таких же быстро размножающихся клеток, но не подвергнувшихся рестрикции.

Другой предпочтительный вариант настоящего изобретения относится к способу создания биосовместимой, ограничивающей размножение избирательно проницаемой структуры путем формирования этой структуры взаимодействием быстро размножающихся клеток с биосовместимым ограничивающим размножение веществом с получением вышеуказанной структуры и культивирование этих структур в течение продолжительного периода времени для того, чтобы ограничить быстро размножающиеся клетки с тем, чтобы они продуцировали вещество, подавляющее пролиферацию быстро размножающихся клеток, которую следует подавить, по сравнению с равным количеством не подвергнувшихся рестрикции быстро размножающихся клеток того же типа.

Еще один предпочтительный вариант изобретения относится к способу увеличения продуцирования вещества, которое подавляет клеточный рост быстро размножающихся клеток, включающему ограничение быстро размножающихся клеток в биосовместимой, избирательно проницаемой структуре и культивирование быстро размножающихся клеток таким образом, чтобы они продуцировали вышеуказанное вещество. При помещении указанных структур в культуральную среду упомянутое вещество покидает эти структуры и переходит в культуральную среду. Получившаяся культуральная среда также является признаком данного изобретения.

Кроме того, установлено, что сильный антипролиферативный эффект может быть достигнут в результате фильтрации кондиционированной среды, полученной при культивировании структур данного изобретения в культуральной среде. Полученные концентраты обладают исключительно сильными антипролиферативными свойствами.

Упомянутое вещество, кондиционированная среда и/или концентраты, полученные из нее, также могут оказаться полезными для индуцирования выработки указанного антипролиферативного вещества не подвергнутыми рестрикции быстро размножающимися клетками.

В предпочтительных вариантах подвергнутые рестрикции клетки являются раковыми клетками, но преимущества использования клеток, отличных от раковых, для лечения рака и других состояний обеспечивает дополнительную выгоду, что очевидно специалисту в данной области.

Эти и другие признаки изобретения будут поняты из нижеследующего описания.

Подробное описание предпочтительных вариантов

Пример 1

В этом примере и следующих за ним используют RENCA клетки. Это клетки спонтанной аденокарциномы почки от BALB/C мышей, которые широко доступны, сохраняемые как в культурах in vitro, так и in vivo. См. Franco, et al., Cytokine Induced Tumor Immunoqenecity, 181-193 (1994).

Образцам замороженных RENCA клеток дали оттаять при 37С и затем перенесли в колбы с модифицированной средой Dulbecco (D-MEM), в которую было добавлено 10% бычьей сыворотки, пенициллин (100 ед/мл) и стрептомицин (50 мкг/мл) с получением среды, которая далее будет называться "полная среда".

Клетки выращивали до слияния, затем обрабатывали их трипсином с последующим промыванием сбалансированным солевым раствором Хэнкса, а затем средой, названной выше "полной средой".

Для того чтобы определить, насколько эффективно продуцируют опухоли RENCA клетки, двум BALB/C мышам внутрибрюшинно вводили эти клетки в количестве 10⁶. За животными наблюдали в течение периода 3-4 недель. В первые две недели по клиническим признакам они выглядели здоровыми и проявляли обычную активность. Затем клинические проявления рака стали очевидными. Одна мышь умерла через 23 дня, а вторая - через 25 дней. После смерти мышей обследовали и были обнаружены многочисленные опухоли разных размеров. Кроме того, некоторые из опухолей были кровоточащими.

Пробу из одной опухоли, взятой от одной из мышей, зафиксировали в 10% формалине для дальнейшей гистологической проверки.

Пример 2

После того, как было показано, что RENCA клетки растут in vivo, приступили к исследованию с целью определить, растут ли эти клетки, когда они ограничены в структуре согласно изобретению.

RENCA клетки выращивали до слияния, как было описано выше, обрабатывали трипсином и промывали так, как описано выше. Затем приготовили пробы с содержанием от 60000 до 90000 клеток. Клетки затем центрифугировали при 750 об/мин и жидкость удаляли. Клетки затем суспендировали в растворах 1% ателоколлагена, в фосфатно-солевом буферном растворе при рН 6,5.

Готовили 1% раствор агарозы с низкой вязкостью на минимальной необходимой среде (MEM), сохраняли при 60С и затем 100 мкл этого раствора добавляли к суспензии RENCA клеток и ателоколлагена, описанной выше. Затем эту смесь немедленно перенесли в виде одной большой капли в стерильное минеральное масло с комнатной температурой. Эта смесь образовала одну единственную ровную полутвердую гранулу. Эту процедуру повторяли, чтобы получить несколько гранул.

Спустя минуту гранулы перенесли в полную среду, которая описана выше, при температуре 37С. Гранулы затем были трижды промыты в минимальной необходимой среде (MEM), содержащей антибиотики, перечисленные выше. Гранулы затем выдерживали в течение ночи при 37°С в увлажненной атмосфере воздуха, содержащего 5% СО₂. После инкубации гранулы, теперь уже ставшие твердыми, были перенесены в стерильную ложку, которая содержала 1 мл 5% агарозы в MEM. Гранулы прокатывали 2-3 раза в растворе, чтобы достигнуть единообразного нанесения на них агарозы. Прежде чем агароза затвердеет, гранулы переносили в минеральное масло, чтобы получить гладкую внешнюю поверхность. Через 60 с гранулы пять раз промывали полной средой при 37С, чтобы удалить масло. После этого осуществляли выдержку в течение ночи при 37С в увлажненном воздухе с 5% СO₂.

Полученные RENCA содержащие гранулы использовали в дальнейших экспериментах.

Пример 3

Прежде, чем осуществлять исследования in vivo, необходимо было определить, будут ли RENCA клетки расти внутри гранул, приготовленных как описано выше.

Для этого гранулы, полученные как объяснено в примере 2, инкубировали в среде, описанной в примере 2, в течение трех недель при описанных выше условиях. Три гранулы были разрезаны на маленькие кусочки и их культивировали в стандартных культуральных колбах, допуская прямой контакт как с колбой, так и культуральной средой.

Наблюдение за этими культурами показало, что клетки растут и образуют стандартные RENCA колонии. Это доказывает, что клетки в гранулах остались жизнеспособными.

Пример 4

Затем были приведены опыты in vivo. В этих экспериментах гранулы инкубировали в течение 7 дней при 37°С. Опытным животным ввели гранулы. Для этого каждой из четырех мышей сделали срединный надрез, выполненный внутрибрюшинно. Три гранулы, каждая из которых содержала 60000 RENCA клеток, были трансплантированы. Надрезы были затем сшиты (двуслойное смыкание) с помощью рассасывающейся нити. Четверо мышей (BALB/C) были нормальными (мыши - самцы, весом 24-26 г) и казались здоровыми. Были сделаны 2 серии контролей. В первой серии двум мышам вводили 3 гранулы без RENCA клеток, двух мышей не обрабатывали ничем.

Спустя 3 недели после имплантации все мыши получили внутрибрюшинные инъекции 10⁶ RENCA клеток. Спустя 18 дней одна контрольная мышь умерла. Все оставшиеся мыши были затем умерщвлены и исследованы на предмет наличия или отсутствия опухоли.

У контрольных мышей были многочисленные опухоли, в то время как у мышей, получивших имплантаты инкапсулированных в гранулы клеток, обнаружились только отдельные маленькие узелки по всей полости.

Эти обнадеживающие результаты легли в основу плана экспериментов, описанных в следующем примере.

Пример 5

В этих опытах моделировали заранее определенные типы рака путем введения RENCA клеток под одну почечную капсулу каждой из шести BALB/C мышей. Через 15 дней мышей разделили на две группы. Трем мышам в первой группе ввели по три гранулы, как описано в примере 4, выше. Второй группе (контрольной) ввели гранулы, не содержащие RENCA клеток.

В первые 4-5 дней мыши, которые получили имплантаты, содержащие RENCA клетки, выглядели вялыми, апатичными, шерсть у них топорщилась.

После они вернулись к нормальному состоянию. Животные контрольной группы оставались полными сил, их шерсть не претерпела изменений.

Спустя 10 дней после имплантации (25 дней после введения RENCA клеток), однако, мыши из контрольной группы стали медлительными, брюшная полость вздулась. Одна из трех контрольных мышей умерла на 14-й день после трансплантации гранул. Затем мыши были умерщвлены.

В полости тела у контрольных мышей обнаружили профузное кровотечение с многочисленными опухолями по всему пищеварительному тракту, печени, желудку и легким.

Все органы брюшной полости стали неузнаваемыми вследствие поражения быстро растущей опухолью. У мышей, которым ввели гранулы с инкапсулированными RENCA клетками, не наблюдалось, однако, кровотечения, а только несколько узелков в пищеварительном тракте. Кроме того, сравнение опытной и контрольной групп показало, что в опытной группе узелки не увеличивались по сравнению с их первоначальным ростом под почечной капсулой и до имплантации макрогранул.

Пример 6

In vitro рост свободно инокулируемых RENCA клеток ингибируется, когда такие клетки инкубируют наряду с инкапсулированными в макрогранулы RENCA клетками.

Следующая серия экспериментов выполнялась для того, чтобы определить, наблюдается ли данный эффект для других клеток.

Линия клеток аденокарциномы, т.е. ММТ (опухоль молочной железы мыши) была получена из Американской коллекции типовых культур. Как описано выше, готовили инкапсулированные ММТ клетки на основе ММТ клеток, получали гранулы, содержащие от 120000 до 240000 клеток на гранулу. После получения гранул их использовали для определения, будут ли они ингибировать пролиферацию RENCA клеток in vitro. В частности, подготовили две 6-луночные чашки Петри и инокулировали по 1х10⁴ RENCA клеток в 4 мл среды в лунку. В каждой чашке три лунки служили контролем, а три были опытными. В одну из трех контрольных лунок в каждой чашке помещали одну пустую гранулу. В каждую из остальных лунок помещали или 2, или 3 пустых гранул. Вторая серия лунок обрабатывалась аналогично с введением в лунки по 1, 2 и 3 гранулы, содержащие 120000 - 240000 ММТ клеток. Чашки инкубировали при 37С в течение одной недели, после чего RENCA клетки обрабатывали трипсином, промывали и обсчитывали с помощью гемоцитометра.

Результаты показаны в таблице 1.

Пример 7

После получения результатов примера 6 такие же опыты проделали с использованием в качестве инокулята 110⁴ ММТ клеток (т.е. свободных клеток) вместо RENCA клеток. Эксперимент проводили точно так же, как в примере 6.

Результаты приведены в таблице 2.

Эти результаты подтвердили in vivo эксперимент. Эти данные представлены в примере 8.

Пример 8

Использовали клеточную линию опухоли молочной железы мыши (ММТ), описанную выше. С помощью вышеизложенных методик приготовили имплантаты, содержащие 120000 клеток на гранулу и 240000 клеток на гранулу.

Используемой экспериментальной моделью были мыши. 22 мыши были разделены на группы, состоящие из 4 (контроль), 9 и 9 особей. Первая группа (т.е. контрольная) была еще разделена на три группы: две получали имплантат из одной свободной гранулы, одна получала 2 свободные гранулы и одна получала 3 свободные гранулы.

В рамках экспериментальной группы А (9 животных) гранулы содержали 120000 клеток, тогда как в экспериментальной группе В гранулы содержали 240000 клеток. Внутри групп А и В были три подгруппы, в каждой из которых было по 3 мыши. В подгруппах мыши получали одну, две или три гранулы, содержащие ММТ клетки.

В течение нескольких первых дней мыши в группах А и В были вялыми со взъерошенной шерстью. Это продолжалось около пяти дней, после чего наблюдали нормальное поведение мышей. Спустя 21 день после имплантации всем животным ввели 40000 RENCA клеток.

Спустя еще 20 дней у контрольной мыши увеличилась брюшная полость и сильно взъерошилась шерсть. Одна контрольная мышь умерла через 25 дней после инъекции, в то время как остальные контрольные мыши оказались уже мертвы. Все мыши были вскрыты для наблюдения за развившейся опухолью. Эти наблюдения приведены в таблице 3.

Эти результаты показывают, что из 18 обработанных мышей 13 не заболели. Что же касается мышей в группе А, у одной мыши было несколько маленьких узелков (+), а у другой мыши - несколько опухолей (++).

В рамках группы В одна мышь, которая получила одну гранулу, и одна мышь, которая получила 2 гранулы, имели несколько опухолей в кишечнике. У одной из мышей, которая получила 3 гранулы, развилась большая твердая опухоль, и она была явно очень больной (+++). Все контрольные мыши имели многочисленные опухоли (++++).

Результаты показали, что инкапсулированные клетки мышиной опухоли молочной железы ингибируют образование опухолей.

Согласно высказанному выше предположению, реализация данного изобретения приводит к получению вещества, ингибирующего и/или предотвращающего размножение опухолевых клеток. Это изучалось далее в результате эксперимента, который описан выше.

Согласно описанию выше в примере 2, дополнительно приготовили гранулы, но без включения в них ателоколлагена. Следовательно, эти гранулы имели строение агароза - агароза. RENCA клетки, как описано выше, были включены внутрь этих гранул, опять же соответственно вышеданному описанию.

Две серии из трех 6-луночных пластин использовались как контрольная и опытная группы. В контрольной группе в лунки вносили по 4 мл RPMI полной среды (10% эмбриональной телячьей сыворотки и 10 мл/л пенициллина). Каждую ячейку контрольной группы затем инокулировали 10000 RENCA клеток.

В опытной группе RPMI полная среда была кондиционирована путем добавления вещества, полученного в результате инкубирования десяти RENCA содержащих гранул (120000 клеток на 1 гранулу) в чашке Петри размером 35100 мм, содержащей 50 мл RPMI полной среды. После пяти дней инкубации среда с этих чашек собиралась и 4 мл ее помещали в каждую опытную лунку. Эти лунки затем инкубировали, внеся 10000 RENCA клеток в каждую.

Обе пластины (и контрольная, и опытная) инкубировались при 37С в течение пяти дней. По окончании инкубирования клетки обрабатывали трипсином, промывали, собирали и подсчитывали с помощью гемоцитометра.

Результаты показаны в таблице 4.

Эти результаты показывают, что клетки, при ограничении их включением, например, в гранулы согласно примерам, продуцируют некое вещество, которое приводит к подавлению размножения клеток опухоли.

Пример 10

Эксперимент, описание которого изложено выше, показал, что рост RENCA клеток в кондиционированной среде примерно в два раза меньше роста клеток в контрольной среде. С помощью описываемых здесь опытов проверили, будет ли продолжаться подавление размножения, если кондиционированная среда заморожена.

RENCA кондиционированная среда была приготовлена путем инкубирования десяти RENCA содержащих гранул в течение 5 дней. Инкубирование проводили в 35100 мм чашках Петри с 50 мл RPMI полной средой при 37С. После инкубации среду собирали и хранили при -20С. Кондиционированная среда была приготовлена инкубированием гранул, содержащих клетки ММТ (опухоль молочной железы мыши). Гранулы содержали по 240000 клеток каждая; в других отношениях все условия опыта были такими же.

Замороженной среде дали оттаять при 37С и затем использовали в следующих опытах. Три 6-луночные пластины использовались для каждого вида обработки, т.е. (1) RPMI контрольная среда, (2) RENCA замороженная кондиционированная среда, (3) ММТ замороженная кондиционированная среда. В целом, по 4 мл среды было внесено в каждую ячейку. Все ячейки инокулировали 10000 RENCA клеток и инкубировали при 37С в течение 5 дней. После инкубации отбирали пробы из каждой ячейки двух пластин, обрабатывали трипсином, промывали, собирали и подсчитывали с помощью гемоцитометра. После восьми дней содержимое каждой ячейки трех оставшихся пластин исследовалось таким же образом.

Результаты даны в табл.5.

Если сравнить эти результаты с аналогичными в примере 6, выше, станет ясно, что, несмотря на то, что замороженная и оттаявшая RENCA кондиционированная среда и не подавляет пролиферации в такой же степени, что и замороженная и оттаявшая ММТ кондиционированная среда (сравните примеры 6 и 7), она, тем не менее, подавляет пролиферацию.

Пример 11

Эксперименты, описанные выше, показали, что замороженная кондиционированная среда на основе и RENCA-, и ММТ-содержащих гранул, ингибирует пролиферацию RENCA-клеток in vitro. В экспериментах, описываемых теперь, проверяли, будет ли ингибировать размножение RENCA клеток in vivo среда, кондиционированная RENCA- или ММТ-макрогранулами. Эффекты кондиционированной макрогранулами среды сравнивали с эффектами среды, кондиционированной в присутствии не подвергнутых рестрикции RENCA и ММТ клеток, растущих в монослойных культурах, для того, чтобы определить, будут ли не подвергнутые рестрикции опухолевые клетки, выросшие до слияния, тоже вырабатывать вещество, регулирующее пролиферацию.

Для этих экспериментов 10 макрогранул, каждая из которых содержала 120000 RENCA или ММТ клеток (т.е. 1,210⁶ клеток всего), использовали для кондиционирования среды (полной RPMI) в течение 5-дневного периода. Параллельно 1,210⁶ RENCA или ММТ клеток, т.е. такое же количество клеток, были внесены в культуральную чашку и они затем размножались в виде монослоя в полной RPMI среде в течение 4-дневного периода времени. Среду потом заменили другой и эту среду собрали спустя 24 ч. Причина разной продолжительности выдерживания гранул и не подвергнутых рестрикции клеток состояла в различии между количествами клеток в монослоях по сравнению с гранулами (3-5-кратное превышение числа клеток в монослоях) в конце 5-дневного периода. Другими словами, не подвергнутые рестрикциии клетки росли гораздо быстрее, чем инкапсулированные клетки, так что их было в 3-5 раз больше.

Для получения концентратов кондиционированной среды, которые предположительно должны были содержать активное вещество с исключением токсичных метаболитов и/или отходов жизнедеятельности клеток как сопутствующих факторов эксперимента, использовали фильтры с размером пор 30 килодальтон и 50 килодальтон. Контаминирующие вещества, которые хорошо известны, слишком малого размера, чтобы удерживаться в 30 кД фильтре. Фильтраты также исследовали, но какая-либо интерпретация результатов с этим материалом осложнена присутствием отходов клеточного метаболизма. Бессывороточная среда (AIM V) также использовалась в некоторых опытах для того, чтобы убедиться, что любые эффекты, обусловленные присутствием сыворотки, сами по себе могут контролироваться.

В основном, кондиционированную среду собирали либо 3-5 дней спустя после того, как макрогранулы были добавлены к ней, или спустя 24 ч после добавления свежей среды к клеткам, не подвергнутым рестрикции. Среду затем помещали в фильтр для опытов в виде пробирки с соответствующим фильтром (или на 30 кД, или на 50 кД), и центрифугировали 90 мин. Массу, которая осталась на фильтре, назвали "концентратом", тогда как то, что прошло через фильтр и собралось на дне пробирки, было фильтратом.

Результаты суммированы в таблицах 6, 7 и 8; они показывают, что когда использовали кондиционированную среду, полученную от RENCA клеток, подвергнутых рестрикции в макрогранулах, это ингибировало пролиферацию RENCA клеток в двух отдельных экспериментах примерно на 52%. Концентрат 50 кД ингибировал пролиферацию примерно на 99% в обоих случаях, в то время как концентрат 30 кД ингибировал пролиферацию примерно на 97%.

Важным моментом в данном эксперименте является тот факт, что и ММТ клетки и RENCA клетки, будучи включенными в макрогранулы и подвергнутыми в результате этого рестрикции, подавляют размножение RENCA клеток, демонстрируя, что ограничивающий размножение эффект не обладает специфичностью к типу опухоли. Эти опыты подтверждают опыты примера 8, в которых ММТ-содержащие макрогранулы подавляли пролиферацию RENCA клеток in vivo. Кроме того, они расширили полученные данные и показали, что вещество, выделившееся из макрогранул в среду, состоит из молекул с массой, по меньшей мере, 30 кД, которые в какой-то мере являются ответственными за ограничивающий пролиферацию эффект. Наконец, эти эксперименты показывают, что ограниченные включением в макрогранулы RENCA и ММТ клетки продуцируют значительно больше подавляющего пролиферацию вещества, чем те же самые клетки, выросшие до состояния монослоя.

Пример 12

Описываемые выше эксперименты показывают, что кондиционированная как ММТ-, так и RENCA - клетками среда содержит вещество, выделившееся из клеток, включенных в макрогранулу и подвергнувшихся в результате этого ограничению в размножении. Это вещество может ингибировать размножение RENCA клеток in vivo и in vitro. Важно, что эксперименты показывают, что эффект ингибирования размножения не специфичен по отношению к типу опухоли. Описываемые здесь эксперименты выявляют, является ли этот эффект независимым от вида животного, у которого естественным путем возникла опухоль.

В этом эксперименте проверяли, оказывает ли клеточная линия рака груди человека подавляющий пролиферацию эффект in vitro на RENCA-клетки (при использовании макрогранул и кондиционированной макрогранулами среды) и ММТ-клетки (при использовании только кондиционированной макрогранулами среды).

Методологически эти in vitro исследования аналогичны опытам, описанным в вышеприведенных примерах. 1000000 MCF-7 клеток (клетки рака груди человека) инкапсулировали в макрогранулы, а получившиеся MCF - 7 макрогранулы инкубировали с RENCA клетками (10000 на ячейку) в течение 5 дней для того, чтобы оценить ингибирующее пролиферацию действие макрогранул. Кроме того, в течение 5 дней инкубирования была приготовлена среда, кондиционированная MCF - 7 макрогранулами; она была испытана и на RENCA, и на ММТ клетках. Клеточную пролиферацию определяли спустя 5 дней.

Полученные результаты приведены в табл.9-11.

Эти результаты показывают, что клетки MCF-7, принадлежащие линии аденокарциномы груди человека, будучи включенными в макрогранулы и ограниченные в отношении размножения, продуцируют вещество, которое ингибирует размножение клеток почечной аденокарциномы мыши и клеток опухоли молочной железы мыши в значительной степени (30-70%), что было продемонстрировано как с помощью самих макрогранул, так и кондиционированной ими среды. Это показывает, что эффект ингибирования размножения, проявляемый ограниченными в росте раковыми клетками, не зависит ни от типа опухоли, ни от вида животного, у которого развилась опухоль, т.е. мыши и человека.

Пример 13

Эксперименты, описанные выше, демонстрируют, что линия клеток, выделенных из аденокарциномы груди человека (MCF-7), будучи ограниченной в росте при включении в макрогранулы, обеспечивает ингибирование размножения клеток почечной аденокарциномы мыши и аденокарциномы молочной железы мыши in vitro. Описываемые здесь эксперименты ставят своей целью проверить, существует ли in vivo параллельный эффект MCF-7 содержащих макрогранул на рост опухоли RENCA клеток.

Восемнадцати Balb/c мышам внутрибрюшинно ввели 200000 RENCA клеток. Спустя 3 дня мышей разделили на две группы. В группе 1 было шесть мышей, а в группе 2 - остальные 12 мышей. Мышам из группы 1, контрольным,