Гибридные полипептиды с улучшенными фармакокинетическими свойствами
Реферат
Настоящее изобретение относится к последовательностям пептида-усилителя, происходящим от различных последовательностей белка оболочки ретровируса (gp41), которые улучшают фармакокинетические свойства любого корового полипептида, к которому они присоединены, и основано на обнаружении того факта, что гибридные полипептиды, содержащие последовательности пептида-усилителя, присоединенные к коровому полипептиду, обладают улучшенными фармакокинетическими свойствами, такими как более продолжительное время полужизни. Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу улучшения фармакокинетических свойств любого корового полипептида посредством присоединения указанных последовательностей пептида-усилителя к указанному коровому полипептиду. Коровыми полипептидами, используемыми для осуществления настоящего изобретения, могут быть любые фармакологически приемлемые пептиды, которые могут быть использованы, например, в качестве терапевтического или профилактического агента. Преимущество изобретения заключается в повышении эффективности биологически активных пептидов в кровотоке. 3 н. и 35 з.п.ф-лы, 13 табл., 26 ил.
1. Введение
Настоящее изобретение относится к последовательностям пептида-усилителя, исходно происходящим от различных последовательностей белка оболочки ретровируса (gp41) и улучшающим фармакокинетические свойства любого корового полипептида, с которым они связаны. Настоящее изобретение частично основано на обнаружении того факта, что гибридные полипептиды, содержащие последовательности пептида-усилителя, присоединенные к коровому полипептиду, обладают улучшенными фармакокинетическими свойствами, такими как более продолжительное время полужизни. Настоящее изобретение также относится к новым антифузогенным и/или антивирусным пептидам, включая пептиды, содержащие вышеуказанные последовательности пептида-усилителя, и к способам использования таких пептидов. Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам улучшения фармакокинетических свойств любого корового полипептида посредством присоединения к этому коровому полипептиду указанных последовательностей пептида-усилителя. Коровые полипептиды, используемые в настоящем изобретении, могут включать любые фармакологически приемлемые пептиды, которые могут быть использованы, например, в качестве терапевтического или профилактического реагента. В неограничивающем примере, иллюстрирующем вариант осуществления настоящего изобретения, было продемонстрировано, что гибридный полипептид, содержащий, например, коровый полипептид ВИЧ, присоединенный к последовательностям пептида-усилителя, является сильным нетоксичным ингибитором ВИЧ-1-, ВИЧ-2- или SIV-инфекции. Кроме того, последовательности пептида-усилителя настоящего изобретения были присоединены к коровому полипептиду респираторно-синцитиального вируса (RSV) и коровому полипептиду рецептора лютеинизирующего гормона (LH-RH). В каждом случае было обнаружено, что этот гибридный полипептид обладает улучшенными фармакокинетическими свойствами, а гибридный полипептид на основе RSV обладает значительной активностью против RSV.
2. Предпосылки создания изобретения
Полипептидные продукты широко используются в качестве терапевтических и/или профилактических агентов для предупреждения и лечения заболеваний. Многие из этих полипептидов способны регулировать биохимические или физиологические процессы, что приводит либо к предупреждению заболевания, либо к ослаблению симптомов, ассоциированных с этими заболеванием. Так, например, полипептиды, такие как вирусные или бактериальные полипептиды, могут быть с успехом использованы в качестве вакцин для предупреждения патологических состояний. Кроме того, пептиды могут быть с успехом использованы в качестве терапевтических агентов для лечения симптомов заболевания. Такие пептиды входят в состав белков различных категорий, таких как, например, гормоны, ферменты, иммуномодуляторы, белки сыворотки и цитокины.
Для того чтобы эти полипептиды оказывали присущее им биологическое и терапевтическое действие на сайты-мишени, они должны присутствовать в этих сайтах в соответствующих концентрациях. Кроме того, должна, в основном, сохраняться их структурная целостность. Следовательно, композиция полипептидов для их терапевтического использования в качестве лекарственных средств зависит от химической природы и характеристик этих полипептидов, таких как размер и структура, от конформационных требований, а часто от трудно предсказуемой стабильности и параметров растворимости. Фармакокинетические свойства любого конкретного терапевтического пептида зависят от биологической доступности, распределения и выведения указанного пептида.
Поскольку многие биологически активные вещества, такие как пептиды и белки, быстро разрушаются в организме, то для увеличения эффективности таких пептидов и для минимизации случаев возникновения опасных побочных эффектов и их тяжести в настоящее время крайне необходимо разработать эффективные системы для поддержания устойчивой концентрации пептида в кровотоке.
3. Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение, главным образом, относится к последовательностям пептида-усилителя, исходно происходящим от различных последовательностей белка оболочки ретровируса (gp41), т.е. ВИЧ-1, ВИЧ-2 и SIV, и улучшающим фармакокинетические свойства любого корового полипептида, к которому они присоединены. Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что в случае, когда описанные последовательности пептида-усилителя присоединены к любому коровому полипептиду, то полученный в результате этого гибридный полипептид обладает улучшенными фармакокинетическими свойствами, включая, например, более продолжительное время полужизни и более низкую скорость его выведения из кровотока, по сравнению с коровым полипептидом, взятым отдельно. Настоящее изобретение, кроме того, относится к указанным гибридным полипептидам и к коровым полипептидам, а также к новым пептидам, которые обладают антифузогенной активностью, антивирусной активностью и/или способностью модулировать внутриклеточные процессы, ассоциированные с биспиральными пептидными структурами. Такими пептидами являются пептиды, которые содержат последовательности пептида-усилителя.
Коровые полипептиды могут включать в себя любые пептиды, которые могут быть введены в живую систему, например любые пептиды, которые способны функционировать как терапевтические, профилактические или визуализирующие агенты, используемые для лечения или предупреждения заболеваний, или которые могут быть использованы в диагностических или прогностических методах, включая методы визуализации in vivo. Такими пептидами являются, например, факторы роста, гормоны, цитокины, ангиогенные факторы роста, внеклеточные полипептиды матрикса, лиганды рецепторов, агонисты, антагонисты или обратные агонисты, пептидные агенты для доставки, такие как визуализирующие агенты или цитотоксические агенты для доставки, либо полипептиды, которые обладают антифузогенной и/или антивирусной активностью, а также пептиды или полипептиды, которые функционируют как антигены или иммуногены, включая, например, вирусные и бактериальные полипептиды.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам улучшения фармакокинетических свойств любого коревого полипептида посредством присоединения этого корового полипептида к последовательностям пептида-усилителя с образованием гибридных полипептидов.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам использования описанных здесь пептидов, включая гибридные полипептиды, содержащие последовательности пептида-усилителя. Так, например, способами настоящего изобретения являются способы ослабления или ингибирования вирусной инфекции, например вируса ВИЧ-1, ВИЧ-2, RSV, кори, гриппа, парагриппа, Эпштейна-Барра и гепатита, и/или событий индуцированного вирусом слияния клеток. Эти последовательности пептида-усилителя настоящего изобретения, кроме того, могут быть использованы для увеличения времени полужизни in vitro или ex-vivo корового полипептида, к которому присоединены последовательности пептида-усилителя, например последовательности пептида-усилителя могут увеличивать время полужизни присоединенных коровых полипептидов в образцах клеточных культур, клеток или тканей.
Настоящее изобретение продемонстрировано в примерах, где показано, что гибридные полипептиды, содержащие коровый полипептид ВИЧ, присоединенный к последовательностям пептида-усилителя, обладают в значительной степени улучшенными фармакокинетическими свойствами и действуют как сильные нецитотоксические ингибиторы ВИЧ-1-, ВИЧ-2- и SIV-инфекции. Настоящее изобретение, кроме того, продемонстрировано в примерах, где показано, что гибридные полипептиды, содержащие коровый полипептид RSV или полипептид лютеинизирующего гормона, обладают в значительной степени улучшенными фармакокинетическими свойствами. Кроме того, гибридный полипептид на основе RSV обладает значительной активностью против RSV.
3.1. Определения
Пептиды, полипептиды и белки определены в настоящем описании как органические соединения, включающие две или несколько аминокислот, ковалентно связанных между собой, например, пептидными амидными связями. Пептиды, полипептиды и белки могут также включать неприродные аминокислоты и любые их модификации, а также дополнительные амино- и карбоксильные группы, описанные в настоящей заявке. Следовательно, термины "пептид", "полипептид" и "белок" используются здесь как взаимозаменяемые понятия.
Пептидные последовательности, определенные в настоящем описании, представлены однобуквенными символами, используемыми для обозначения нижеследующих аминокислотных остатков:
А (аланин)
R (аргинин)
N (аспарагин)
D (аспарагиновая кислота)
С (цистеин)
Q (глутамин)
Е (глутаминовая кислота)
G (глицин)
Н (гистидин)
I (изолейцин)
L (лейцин)
К (лизин)
М (метионин)
F (фенилаланин)
Р (пролин)
S (серин)
Т (треонин)
W (триптофан)
Y (тирозин)
V (валин)
Х (любая аминокислота)
"Последовательности пептида-усилителя" определены как пептиды, имеющие нижеследующие "консенсусные" аминокислотные последовательности: "WXXWXXXI", "WXXWXXX", "WXXWXX", "WXXWX", "WXXW", "WXXXWXWX", "XXXWXWX", "XXWXWX", "XWXWX", "WXWX", "WXXXWXW", "WXXXWX", "WXXXW", "IXXXWXXW", "XXXWXXW", "XXWXXW", "XWXXW", "XWXWXXXW", "XWXWXXX", "XWXWXX", "XWXWX", "XWXW", "WXWXXXW" или "XWXXXW", где Х и может быть любой аминокислотой, W означает триптофан, а I означает изолейцин. Как описано ниже, последовательности пептида-усилителя настоящего изобретения также представляют собой пептидные последовательности, которые в той или иной степени аналогичны консенсусным аминокислотным последовательностям, но которые содержат аминокислотные замены, вставки или делеции, не влияющие на способность этого пептида улучшать фармакокинетические свойства корового пептида, с которым он связан, по сравнению с фармакокинетическими свойствами указанного корового полипептида, взятого отдельно.
Используемый здесь термин "коровый полипептид" означает любой полипептид, который может быть введен в живую систему и, таким образом, представляет собой биологически активную молекулу, например любой полипептид, который может функционировать как фармакологически эффективный пептид для лечения или предупреждения заболевания.
Используемый здесь термин "гибридный полипептид" означает любой полипептид, содержащий амино-, карбокси- или амино- и карбоксиконцевую последовательность пептида-усилителя и коровый полипептид. Обычно последовательность пептида-усилителя присоединена непосредственно к коровому полипептиду. Следует отметить, что пептид-усилитель может быть также присоединен к промежуточной аминокислотной последовательности, локализованной между последовательностью пептида-усилителя и коровым пептидом.
Используемые здесь термины "антифузогенный" и "направленный против слияния мембран" относятся к способности пептида ингибировать или снижать число событий слияния между двумя или более структурами, например между клеточными мембранами или вирусными оболочками или пилями, по сравнению с числом событий слияния мембран, происходящих между структурами в отсутствие этого пептида.
Используемый здесь термин "антивирусный" означает способность пептида ингибировать вирусную инфекцию клеток, например, посредством слияния клеток или инфицирования свободной вирусной частицей. Такое инфицирование может включать в себя слияние мембран, как это происходит в случае вирусов с оболочкой, или другое событие слияния, происходящее между вирусной структурой и клеточной структурой, например слияние вирусных пилей и бактериальной мембраны во время конъюгации бактерий.
4. Краткое описание чертежей
Фиг.1. Гибридные полипептиды. Показаны последовательности пептида-усилителя, происходящие от предполагаемых N-концевой и С-концевой интерактивных областей и присоединенные к коровому полипептиду соответствующего вида. Консервативные последовательности пептида-усилителя заштрихованы. Следует отметить, что последовательности пептида-усилителя могут быть использованы либо как N-концевые, С-концевые, либо как N- и С-концевые добавления. Кроме того, последовательности пептида-усилителя могут быть добавлены к коровому полипептиду в прямой или обратной ориентации, отдельно или в любых возможных комбинациях, в целях улучшения фармакокинетических свойств данного пептида.
Фиг.2А. Последовательности пептида-усилителя, происходящие от различных последовательностей белка оболочки (gp41) и представляющие собой N-концевую интерактивную область, наблюдаемую во всех известных последовательностях изолятов ВИЧ-1, ВИЧ-2 и SIV. Конечная последовательность "WXXWXXXI" представляет собой "консенсусную" последовательность.
Фиг.2В. Варианты последовательности пептида-усилителя, происходящие от различных последовательностей белка оболочки (gp41) и представляющие собой С-концевую интерактивную область, наблюдаемую по всех известных последовательностях изолятов ВИЧ-1, ВИЧ-2 и SIV. Конечная последовательность "WXXXWXWX" представляет собой консенсусную последовательность.
Фиг.3. Сравнение титров ВИЧ-1 в тканях мыши SCID-HuPBMC, инфицированной ВИЧ-1 9320, как было измерено по уровням Р24 в анализах при культивировании вместе с НЧРВМС человека. На этой фигуре проиллюстрировано сравнение in vivo-ингибирования вирусной инфекции полипептидами Т20 и Т1249.
Фиг.4А-4В. Фармакокинетический профиль Т1249 в плазме по сравнению с фармакокинетическим профилем контрольного корового полипептида Т1387 у CD-крыс после внутривенной инъекции в течение периода времени вплоть до 2 часов (Фиг.4А) и 8 часов (Фиг.4В). Полипептид Т1387 представляет собой коровый полипептид, а полипептид Т1249 представляет собой коровый полипептид, присоединенный к последовательностям пептида-усилителя.
Фиг.5. Фармакокинетический профиль Т1249 в плазме по сравнению с профилем Т20-контроля у CD-крыс после внутривенного введения. Полипептид Т1249 представляет собой гибридный полипептид, содержащий коровый полипептид (Т1387), присоединенный к последовательностям пептида-усилителя. Т20: n=4; Т1249: n=3.
Фиг.6. Сравнение активности и цитотоксичности Т20/Т1249, направленной против ВИЧ-1/IIIb.
Фиг.7. Прямое связывание Т1249 с gp41-конструкцией М41178. 125I-T1249 был очищен с помощью ВЭЖХ до максимальной специфической активности. Показано связывание до состояния насыщения с М41178 (гибридный белок с эктодоменом gp41, не содержащий аминокислотной последовательности Т20), иммобилизованным на микротитрационных планшетах при 0,5 мг/мл.
Фиг.8. Кривая ассоциации/диссоциации Т1249 в зависимости от времени. Полученные результаты продемонстрировали, что 125I-T1249 и 125I-T20 имеют идентичные аффинности связывания, составляющие 1-2 нМ. Первоначальные скорости ассоциации и диссоциации для 125I-T1249 значительно ниже, чем скорости для 125I-T20. Диссоциацию связанного радиолиганда измеряли после присоединения немеченого пептида до конечной концентрации 10 мкм в 1/10 всего объема анализа.
Фиг.9. Сравнение связывания Т1249 с М41178. Немеченые Т1249 и Т20 титровали в присутствии одной концентрации либо 125I-T1249, либо 125I-T20. Лиганд добавляли сразу после начала инкубирования немеченого пептида.
Фиг.10А-10В. Фармакокинетический профиль RSV-гибридных полипептидов Т1301 (10А) и Т1302 (10В) в плазме по сравнению с Т786 у крыс CD.
Фиг.11А. Анализ на снижение числа бляшек. Гибридный полипептид способен ингибировать RSV-инфекцию с IC50=2,6 мкг/мл.
Фиг.11В. Анализ на снижение числа бляшек продемонстрировал способность RSV-гибридных полипептидов Т1301, Т1302 и Т1303 ингибировать RSV-инфекцию.
Фиг.12А и 12В. Фармакокинетический профиль гибридного полипептида лютеинизирующего гормона Т1324 в плазме по сравнению с Т1323 у самцов CD-крыс. Полипептид Т1323 представляет собой коровый полипептид лютеинизирующего гормона, а полипептид Т1324 представляет собой гибридный полипептид, содержащий коровый полипептид, присоединенный к последовательностям пептида-усилителя.
Фиг.13. Последовательности гибридного полипептида, происходящие от различных коровых полипептидов. Последовательности корового полипептида заштрихованы. Не заштрихованные амино- и карбоксиконцевые последовательности представляют собой последовательности пептида-усилителя.
Фиг.14А-В. Спектр кругового дихроизма (CD) для Т1249 в растворе (забуференном фосфатом солевом растворе, рН 7) отдельно (10 мкм при 1С, Фиг.14А) и в комбинации с пептидом из 45 остатков от связывающего домена HR1 др41 (Т1346); заштрихованные квадраты (n) представляет теоретический спектр CD, предсказанный для "неинтерактивной модели", а истинные спектры CD представлены заштрихованными кружками (l).
Фиг.15. Электрофорез в полиакриламидном геле продемонстрировал Т1249-защиту gp41-конструкции М41178 от гидролиза протеиназной К; дорожка 1: маркер-затравка; дорожка 2: необработанный М41178; дорожка 3: М41178, инкубированный с протеиназой К; дорожка 4: необработанный Т1249; дорожка 5: Т1249, инкубированный с протеиназой К; дорожка 6: М41178, инкубированный с Т1249; дорожка 7: инкубирование Т1249 и М41178 перед добавлением протеиназы К.
Фиг.16А-С. Фармакокинетика полипептида Т1249 у крыс-альбиносов Sprague-Dawley; Фиг.16А: фaрмакокинетика полипептида Т1249 при введении разовой дозы путем непрерывной подкожной инфузии; Фиг.16В: фармакокинетика полипептида Т1249, введенного путем подкожной инъекции (s.c.) или путем внутривенной инъекции (i.v.); Фиг.16С: кинетический анализ Т1249 в лимфе и плазме после внутривенного введения.
Фиг.17А-В. Фармакокинетика полипептида Т1249 у собакоподобных обезьян; Фиг.17А: фармакокинетика полипептида Т1249 в плазме при введении разовой дозы 0,8 мг/кг Т1249 путем подкожной (s.c.), внутривенной (i.v.) или внутримышечной (i.m.) инъекции; Фиг.17В: фармакокинетика полипептида Т1249 в плазме, введенного путем подкожной инъекции Т1249 в трех различных дозах (0,4 мг/кг, 0,8 мг/кг и 1,6 мг/кг).
5. Подробное описание изобретения
Описанные здесь пептидные последовательности, называемые последовательностями пептида-усилителя, были получены из различных последовательностей белка оболочки (gp41) ретровируса, способных улучшать фармакокинетические свойства коровых полипептидов, к которым они присоединены. Такие последовательности пептида-усилителя могут быть использованы в способах улучшения фармакокинетических свойств любого корового полипептида посредством присоединения последовательностей пептида-усилителя к коровому полипептиду с образованием гибридного полипептида, обладающего улучшенными фармакокинетическими свойствами по сравнению с коровым полипептидом, взятым отдельно. Время полужизни корового пептида, к которому присоединена (или присоединены) последовательность (или последовательности) пептида-усилителя, может быть также увеличено in vitro. Так, например, присоединенные последовательности пептида-усилителя могут увеличивать время полужизни корового полипептида при их присутствии в клеточной культуре, в тканевой культуре или в образцах, взятых от пациента, таких как клетки, ткань или другие образцы.
Коровые полипептиды гибридных полипептидов настоящего изобретения включают любой пептид, который может быть введен в живую систему, например любой пептид, который может функционировать как терапевтический или профилактический агент, используемый для лечения или предупреждения заболевания, или как визуализирующий агент, используемый для визуализации структур in vivo.
В настоящей заявке также описаны пептиды, включая пептиды, содержащие последовательности пептида-усилителя, которые обладают антифузогенной и/или антивирусной активностью. Кроме того, в настоящей заявке описаны способы использования таких пептидов, включая способы ослабления или ингибирования вирусной инфекции и/или вирус-индуцированного слияния клеток.
5.1. Гибридные полипептиды
Гибридные полипептиды настоящего изобретения содержат, по крайней мере, одну последовательность пептида-усилителя и коровый полипептид. Гибридные полипептиды настоящего изобретения предпочтительно содержат, по крайней мере, две последовательности пептида-усилителя и коровый полипептид, при этом, по крайней мере, один пептид-усилитель присутствует в указанном гибридном полипептиде со стороны аминоконца по отношению к коровому полипептиду, и, по крайней мере, одна последовательность пептида-усилителя присутствует в указанном гибридном полипептиде со стороны карбоксиконца по отношению к коровому полипептиду.
Последовательности пептида-усилителя настоящего изобретения содержат пептидные последовательности, исходно происходящие от различных последовательностей белка оболочки (gp41) ретровируса, включая последовательности ВИЧ-1, ВИЧ-2 и SIV, и их специфические варианты или модификации, описанные ниже. Коровый полипептид может содержать любую пептидную последовательность, предпочтительно любую пептидную последовательность, которая может быть введена в живую систему, включая, например, пептиды, предназначенные для использования в терапевтических или профилактических целях либо в целях визуализации.
Обычно гибридный полипептид имеет длину, составляющую от около 10 до около 500 аминокислотных остатков, а предпочтительно от около 10 до около 100 аминокислотных остатков и наиболее предпочтительно от около 10 до около 40 аминокислот.
Не претендуя на какую-либо конкретную теорию, можно отметить, что структура белка оболочки построена, очевидно, таким образом, что предполагаемая область -спирали, локализованная в С-концевой области белка, ассоциирована с областью "лейциновой молнии", локализованной в N-концевой области этого белка. Проводили сравнительный анализ первичных N-концевых и С-концевых последовательностей пептида-усилителя с областями gp41, наблюдаемыми во всех известных идентифицированных "консенсусных" аминокислотных последовательностях изолятов ВИЧ-1, ВИЧ-2 и SIV.
В частности, были идентифицированы нижеследующие "консенсусные" аминокислотные последовательности, представляющие собой консенсусные последовательности пептида-усилителя (ниже перечислены консенсусные последовательности в прямой и обратной ориентации, поскольку указанные последовательности пептида-усилителя могут быть использованы либо в прямой, либо в обратной ориентации): "WXXWXXXI", "WXXWXXX", "WXXWXX", "WXXWX", "WXXW", "WXXXWXWX", "XXXWXWX", "XXWXWX", "XWXWX", "WXWX", "WXXXWXW", "WXXXWX", "WXXXW", "IXXXWXXW", "XXXWXXW", "XXWXXW", "XWXXW", "XWXWXXXW", "XWXWXXX", "XWXWXX", "XWXWX", "XWXW", "WXWXXXW" или "XWXXXW", где Х может быть любой аминокислотой, W означает триптофан, а I означает изолейцин. Консенсусные аминокислотные последовательности в прямой ориентации показаны на Фиг.1 и 2.
Обычно длина последовательности пептида-усилителя составляет около 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 аминокислотных остатков, а предпочтительно от около 4 до около 20 остатков, более предпочтительно от около 4 до около 10 остатков, а наиболее предпочтительно от около 6 до около 8 остатков.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательности пептида-усилителя, которые могут быть использованы для улучшения фармакокинетических свойств полученных гибридных полипептидов, содержащих специфические последовательности пептида-усилителя, представлены на Фиг.2, 13 и ниже в Таблице 1. Наиболее предпочтительными последовательностями пептида-усилителя являются пептиды, содержащие нижеследующие аминокислотные последовательности: "WQEWEQKI" и WASLWEWF.
В качестве неограничивающих примеров, ниже в Таблице 1, перечислены аминокислотные последовательности, которые входят в предпочтительные варианты последовательностей пептида-усилителя настоящего изобретения. Следует отметить, что, хотя нижепривиденные последовательности представлены в прямой ориентации, однако, в объем настоящего изобретения также входят последовательности в обратной ориентации. Так, например, хотя нижеуказанная последовательность "WMEWDREI" пептида-усилителя приводится в прямой ориентации, однако, эта последовательность в обратной ориентации, то есть "IERDWEMW", также входит в объем настоящего изобретения.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения конкретные последовательности настоящего изобретения содержат последовательности пептида-усилителя, показанные на Фиг.2, 13 и в Таблице 1 и имеющие консервативные аминокислотные замены в одном, двух или трех положениях, где указанные замены не влияют на способность последовательности пептида-усилителя улучшать фармакокинетические свойства гибридного полипептида по сравнению с его соответствующим коровым полипептидом.
Особенно предпочтительно, чтобы такие замены приводили к образованию пептида-усилителя, имеющего в своей последовательности одну из консенсусных последовательностей. Обычно такие замены осуществляют в аминокислотных остатках, соответствующих положениям "X", показанных в консенсусных аминокислотных последовательностях, представленных выше и на Фиг.1 и 2. Термин "консервативные замены" означает замены на аминокислотные остатки, имеющие такой же заряд и размер и/или такие же гидрофобные/гидрофильные свойства, как заменяемый аминокислотный остаток. Такие характеристики аминокислот хорошо известны специалистам.
Настоящее изобретение также относится к последовательностям пептида-усилителя, содержащим аминокислотные последовательности, представленные на Фиг.1, 2 и 13 и в Таблице 1, которые в той или иной степени являются аналогичными, но при этом указанные последовательности пептида-усилителя имеют одно или несколько аминокислотных добавлений (обычно не более чем примерно 15 аминокислотных остатков), делеций (например, усечения по амино- или [карбокси]-концу) или неконсервативных замен, которые, тем не менее, не влияют на способность полученного пептида-усилителя улучшать фармакокинетические свойства коровых полипептидов, к которым они присоединены, по сравнению с коровыми полипептидами без таких последовательностей пептида-усилителя.
Добавления обычно не превышают около 15 аминокислотных остатков и могут включать добавления около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 следующих друг за другом аминокислотных остатков. Предпочтительно, чтобы полное число аминокислотных остатков, добавленных к исходному пептиду-усилителю, не превышало примерно 15 аминокислотных остатков, более предпочтительно, чтобы это число не превышало примерно десять аминокислотных остатков, а наиболее предпочтительно, чтобы это число не превышало примерно 5 аминокислотных остатков.
Предпочтительными делениями являются делеции, не превышающие в целом примерно 3 аминокислотных остатка (либо следующих друг за другом, либо не следующих друг за другом остатков), более предпочтительными являются делеции из 2 аминокислот, а наиболее предпочтительными являются делеции из одного аминокислотного остатка. Обычно делеции аминокислотных остатков соответствуют остаткам "X" консенсусных последовательностей пептида-усилителя.
Последовательности пептида-усилителя настоящего изобретения также содержат конкретные последовательности пептида-усилителя, показанные на Фиг.2, 13 и в Таблице 1 и имеющие одну, две или три неконсервативные аминокислотные замены, предпочтительно две таких замены, а наиболее предпочтительно одну такую замену. Термин "неконсервативные" замены означает замены на аминокислотные остатки, имеющие другой заряд, размер и/или гидрофобные/гидрофильные свойства по сравнению с заменяемым аминокислотным остатком. Такие свойства аминокислот хорошо известны специалистам.
Кроме того, замены аминокислот желательно не должны ограничиваться, а в некоторых вариантах осуществления изобретения предпочтительно не ограничиваются генетически кодируемыми аминокислотами. Действительно, эти пептиды могут содержать некодируемые генетически аминокислоты. Таким образом, помимо природных генетически кодируемых аминокислот, аминокислотные остатки в этих пептидах могут быть заменены на некодируемые в природе аминокислоты и синтетические аминокислоты.
Некоторыми наиболее часто встречающимися аминокислотами, которые могут быть использованы в качестве подходящих замен, являются, но не ограничиваются ими, -аланин (-Аlа) и другие омега-аминокислоты, такие как 3-аминопропионовая кислота, 2,3-диаминопропионовая кислота (Dpr), 4-аминомасляная кислота и т.п.; -аминоизомасляная кислота (Aib); -аминогексановая кислота (Aha); -аминовалериановая кислота (Ava); N-метилглицин или саркозин (MeGly); орнитин (Оrn); цитруллин (Cit); трет-бутилаланин (t-BuA); трет-бутилглицин (t-BuG); N-метилизолейцин (MeIle); фенилглицин (Phg); циклогексилаланин (Cha); норлейцин (Nle); нафтилаланин (Nal); 4-хлорфенилаланин (Phe(4-Cl)); 2-фторфенилаланин (Phe(2-F)); 3-фторфенилаланин (Phe(3-F)); 4-фторфенилаланин (Phe(4-F)); пеницилламин (Pen); 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота (Tic); -2-тиенилаланин (Thi) ; сульфоксид метионина (MSO); гомоаргенин (hArg); N-ацетиллизин (AcLys); 2,4-диаминомасляная кислота (Dbu); 2,3-ди-аминомасляная кислота (Dab); п-аминофенилаланин (Phe(pNH2)); N-метилвалин (MeVal); гомоцистеин (hCys); гомофенилаланин (hPhe); гомосерин (hSer); гидроксипролин (Hyp); гомопролин (hPro); N-метилированные аминокислоты и пептоиды (N-замещенные глицины).
Хотя в большинстве случаев аминокислоты пептида заменены L-энантиомерными аминокислотами, однако эти замены не ограничиваются L-энантиомерными аминокислотами. Таким образом, определение "мутированных" или "модифицированных" форм относится и к тем случаям, когда L-аминокислота заменена идентичной D-аминокислотой (например, L-Arg - D-Arg) или D-аминокислотой той же категории или подкатегории (например, L-Arg - D-Lys), и наоборот.
Следует отметить, что в настоящем изобретении также рассматриваются пептидные аналоги, где одна или несколько амидных связей необязательно заменены связью, не являющейся амидной, предпочтительно замещенным амидом или изостерой амида. Таким образом, хотя аминокислотные остатки в пептидах, обычно, называют аминокислотами, а предпочтительные варианты осуществления изобретения проиллюстрированы с использованием пептидов, однако в этой связи следует отметить, что в тех вариантах, где описаны не-амидные связи, используемый здесь термин "аминокислота" или "остаток" означает другие бифункциональные составляющие, несущие группы, которые по своей структуре аналогичны боковым цепям аминокислот. Кроме того, эти аминокислотные остатки могут быть блокированными или неблокированными.
Кроме того, одна или несколько амидных связей могут быть заменены пептидомиметиками или амид-имитирующими составляющими, которые, в основном, не влияют на структуру или активность пептидов. Подходящие амид-имитирующие составляющие описаны, например, Olson et al., 1993, J. Med. Chem. 36:3049.
Для улучшения фармакокинетических свойств корового полипептида последовательности пептида-усилителя могут быть использованы в виде либо N-концевых, либо С-концевых, либо в виде N-концевых и С-концевых добавлений. Хотя последовательности пептида-усилителя предпочтительно использовать в виде пары последовательностей, то есть предпочтительно, чтобы гибридные полипептиды содержали последовательность пептида-усилителя как у амино-, так и у карбоксиконца, однако гибридные полипептиды могут также содержать один пептид-усилитель, где указанный пептид присутствует либо у амино-, либо у карбоксиконца гибридного полипептида. Кроме того, эти пептиды-усилители, связанные с коровым полипептидом, могут быть использованы либо в прямой, либо в обратной ориентации, или в любой подходящей комбинации. Следует отметить, что все пептиды-усилители могут быть введены либо у N-конца, либо у С-конца корового полипептида. Более того, в N-, С- или N- и С-концевые положения гибридных полипептидов может быть введено множество последовательностей пептида-усилителя. Множественные последовательности пептида-усилителя могут быть связаны непосредственно друг с другом посредством тех же самых типов связей, которые используются для присоединения последовательности пептида-усилителя к коровому полипептиду (см. ниже). Кроме того, между одной или несколькими множественными последовательностями пептида-усилителя может также присутствовать промежуточная аминокислотная последовательность того же типа, что и описанная ниже. Эти множественные последовательности пептида-усилителя обычно содержат от 2 до около 10 отдельных последовательностей пептида-усилителя (одинаковых или различных аминокислотных последовательностей), а предпочтительно от около 2 до около 4 последовательностей.
Следует отметить, что указанный коровый полипептид обычно связан с пептидом усилителем посредством пептидной амидной связи, хотя для присоединения последовательностей пептида-усилителя к коровым полипептидами могут быть использованы и неамидные связи. Такие связи хорошо известны специалистам, и ими являются, например, любая из углерод-углеродных, сложноэфирных и химических связей, которая связывает последовательности пептида-усилителя настоящего изобретения с коровым пептидом.
Обычно последовательность пептида-усилителя связана непосредственно с коровым полипептидом. Последовательность пептида-усилителя может быть также присоединена к промежуточной аминокислотной последовательности, присутствующей между последовательностью пептида-усилителя и коровым полипептидом. Обычно размер промежуточной аминокислотной последовательности составляет от около 1 до около 50 аминокислотных остатков, а предпочтительно от около 1 до около 10 остатков. Некоторые типы связей, описанные для связывания пептида-усилителя с коровым полипептидом, могут быть использованы для связывания пептида-усилителя с промежуточным пептидом.
Как обсуждалось выше для последовательностей пептида-усилителя, коровая и промежуточная аминокислотные последовательности необязательно должны быть ограничены генетически кодируемыми аминокислотами, и они могут содержать любые модификации аминокислот и связей, описанные выше.
Амино- и/или карбоксиконцы полученного гибридного полипептида может содержать аминогруппу (-NH2-) или карбоксигруппу (-СООН) соответственно. Альтернативно аминоконец гибридного полипептида может, например, представлять собой гидрофобную группу, включая, но ограничиваясь ими, карбобензильную, данзильную, трет-бутоксикарбонильную, деканоильную, нафтоильную или другую углеводную группу; ацетильную группу; 9-флуоренилметоксикарбонильную (FMOC) группу; или модифицированный неприродный аминокислотный остаток. Альтернативно карбоксиконец гибридного полипептида может, например, представлять амидогруппу; трет-бутоксикарбонильную группу; или модифицированный неприродный аминокислотный остаток. В качестве неограничивающего примера могут служить амино- и/или карбоксиконцы полученного гибридного полипептида, которые могут содержать любые амино- и/или карбо