Полифункциональный биосовместимый гидрогель и способ его получения
Патент 2236872
Авторы
Классы МПК
Полифункциональный биосовместимый гидрогель и способ его получения
Реферат
Изобретение относится к области медицины и касается материала медицинского назначения, в частности носителя для клеток человека и животных, имплантированных в организм млекопитающего, или депо для лекарственных средств, представляющего собой полифункциональный биосовместимый гидрогель, содержащий поперечно-сшитый сополимер акриламида, метакриламида, и сшивающего агента - 2-гидроксиэтил метакрилата и N,N'-метилен-бис-акриламида и воду, а также способа его получения путем сополимерации указанных мономеров в три стадии. 2 н. и 13 з. п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.
Область техники
Изобретение относится к рецептуре и способу получения биосовместимого полиакриламидного гидрогеля, который может быть использован в качестве материала медицинского назначения, в частности как носитель для клеток человека и животных, имплантированных в организм млекопитающих; в качестве депо для лекарственных препаратов при длительном медикаментозном лечении, например, опухолей или абсцессов.
Предшествующий уровень техники
Известно, что полиакриламидные гидрогели (ПААГ) являются достаточно дешевыми и простыми в изготовлении материалами и обладают химической и биологической инертностью. Их достаточно легко синтезировать желаемой плотности и в форме, удобной для введения подкожно и/или в мягкие ткани с минимальными травмами для организма пациента.
В медицине известен способ лечения сахарного инсулинзависимого диабета (RU 2165263) путем трансплантации гетерогенных -клеток поджелудочной железы в предварительно введенный больному, например, подкожно полиакриламидный гель, вокруг которого сформировалась капсула.
Известен также способ культивирования гетерогенных клеток млекопитающих (RU 2152800), в частности клеток Лейдига и клеток меланомы, путем их трансплантации в предварительно введенный млекопитающим полиакриламидный гель.
Это открывает возможности лечения ряда заболеваний путем трансплантации в организм больного гетерогенных клеток, вырабатывающих необходимые ему ферменты и/или гормоны, а также осуществления вакцинотерапии онкологических заболеваний.
Однако, как было экспериментально установлено, длительность продуцирования гетерогенными клетками необходимых для организма больного веществ при прочих равных условиях зависит от свойств полиакриламидного геля (ПААГ).
Как известно, при имплантации ПААГ в организм млекопитающего вокруг него образуется соединительнотканная капсула (A.B.Shekhter et all "Injectable hydrophilic polyacrylamide gel Formacryl and tissue response to its implantation", в журн. "Анналы пластической, реконструктивной и эстетической хирургии", 1997, №2, стр.19), которая на какое-то время препятствует проникновению Т-лимфоцитов к имплантированным в ПААГ гетерогенным клеткам и уничтожению имплантированных клеток.
Однако не только наличие соединительнотканной капсулы влияет на длительность продуцирования гетерогенными клетками необходимых для организма больного веществ.
Известен биосовместимый полиакриламидный гидрогель, описанный в заявке ЕР №742022, содержащий от 3,5 до 9,0 мас.% поперечно-сшитого сополимера акриламида со сшивающим агентом - метилен-бис-акриламидом и 96,5-99,0 мас.% воды.
Этот гидрогель получен способом, описанным там же (ЕР №742022), заключающимся в том, что проводят реакцию сополимеризации акриламида с метилен-бис-акриламидом в водной среде в присутствии пероксидных инициаторов полимеризации с выдержкой реакционной смеси при комнатной температуре в течение 20 минут для сшивки сополимера. При этом процесс сополимеризации проводят в одну стадию, в качестве пероксидных инициаторов полимеризации используют смесь персульфата аммония и тетраметилэтилендиамина, а в качестве водной среды берут апирогенную воду или раствор хлорида натрия.
Гидрогель, полученный этим способом, имеет недостаточную степень сшивки, что обусловлено низким температурным режимом проведения процесса сополимеризации и его одностадийностью. Это приводит к быстрому прорастанию соединительной ткани в имплантированный гель и к его быстрой усадке и резорбции (A.B.Shekhter et all "Injectable hydrophilic polyacrylamide gel Formacryl and tissue response to its implantation", в журн. "Анналы пластической, реконструктивной и эстетической хирургии", 1997, №2, стр.19).
Кроме того, полученный таким способом гидрогель содержит несвязанные молекулы тетраметилэтилендиамина, свободные NH2 радикалы и мономеры акриламида в количестве 1,0-1,2 мкг на 1 грамм полимера (1,0-1,2 ppm), что может вызывать активную асептическую воспалительную реакцию на ранней стадии введения гидрогеля в организм (см. A.B. Shekhter et all "Injectable hydrophilic polyacrylamide gel Formacryl and tissue response to its implantation", в журн. "Анналы пластической, реконструктивной и эстетической хирургии", 1997, №2, стр.19).
Известен биосовместимый гидрогель, описанный в патенте RU №2127129, содержащий от 1,0 до 8,0 мас.% поперечно-сшитого сополимера акриламида со сшивающим агентом - метилен-бис-акриламидом и 92,0-99,0 мас.% воды. Способ получения этого материала также описан в патенте RU №2127129 и заключается в сополимеризации акриламида с метилен-бис-акриламидом в водной дисперсионной среде в присутствии пероксидного инициатора полимеризации. При этом в качестве водной среды берут подвергнутую электролизу воду, имеющую рН 9,0-9,5. Сшивку сополимера ведут при инкубации реакционной смеси в две стадии: при температуре 20-90С в течение 2-24 часов и затем при температуре 100-105С в течение 2-4 часов.
Полученный этим способом гидрогель не содержит тетраметилэтилендиамина, содержит чуть больше 1% свободных NН2 радикалов и мономеры акриламида в количестве 0,6-0,8 мкг на 1 грамм полимера (0,6-0,8 ppm). Однако и он разработан и предназначен преимущественно для пластики мягких тканей и не обеспечивает достаточной длительности активного функционирования гетерогенных клеток при использовании его в качестве носителя имплантированных клеток.
Раскрытие изобретения
Основной задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является увеличение продолжительности активной жизнедеятельности помещенных в полиакриламидный гидрогель гетерогенных клеток в организме реципиента.
Другой задачей является уменьшение степени резорбции гидрогеля и возможности проникновения в него макрофагов после его имплантации в организм реципиента.
Еще одной задачей является уменьшение тканевой реакции организма на имплантированный гидрогель путем уменьшения содержания в нем свободных радикалов и мономеров.
Поставленные задачи решены тем, что предложен полифункциональный биосовместимый гидрогель, содержащий полиакриламид и воду, который согласно изобретению в качестве полиакриламида содержит сополимер акриламида, метакриламида, 2-гидроксиэтилметакрилата и N,N'-метилен-бис-акриламида.
При этом указанный полиакриламид содержит следующее соотношение компонентов, мас.%:
акриламид 65,0-80,0
метакриламид 18,0-30,0
2-гидроксиэтилметакрилат 0,1-4,0
N,N'-метилен-бис-акриламид 0,2-6,0
Указанный полиакриламид составляет от 3,0 до 10,0 мас.% от общей массы биосовместимого гидрогеля.
Указанный биосовместимый гидрогель содержит следующее соотношение компонентов, мас.%:
акриламид 1,95-8,0
метакриламид 0,54-3,0
2-гидроксиэтилметакрилат 0,003-0,4
N,N'-метилен-бис-акриламида - 0,006-0,6
вода до 100
В качестве воды гидрогель содержит бидистиллированную апирогенную воду.
Полифункциональный биосовместимый гидрогель имеет рН 3,5-4,5.
Указанный гидрогель удобен для инъецирования и расфасован в шприцы.
Указанный гидрогель удобен для образования капсул в организме животных и человека, для чего его имплантируют в организм человека или животных, а затем помещают в него желаемую культуру клеток.
Поставленные задачи решаются также тем, что предложен способ получения полифункционального биосовместимого гидрогеля путем сополимеризации мономеров и сшивающих агентов в водной среде в присутствии пероксидного инициатора полимеризации в несколько стадий, в котором согласно изобретению в качестве мономеров берут акриламид и метакриламид, в качестве сшивающих агентов берут 2-гидроксиэтил метакрилат и N,N'-метилен-бис-акриламид при следующем соотношении компонентов, мас.%:
акриламид 1,95-8,0
метакриламид 0,54-3,0
2-гидроксиэтилметакрилат 0,003-0,4
N,N'-метилен-бис-акриламид 0,006-0,6
вода до 100
Сополимеризацию проводят в три стадии: первую стадию - при температуре 20-30С в течение 12-24 часов, вторую стадию - путем -облучения в дозе 0,4-1,0 мегарад и третью стадию - при температуре 100-130С и давлении 0-1,2 атм в течение 20-40 минут.
Указанный гидрогель после первой стадии сополимеризации промывают в горячей воде, имеющей температуру 70-110С, в течение по меньшей мере 3 часов при массовом соотношении гидрогеля и воды 1:8-10 и давлении 0-1,2 атм.
В качестве инициатора сополимеризации берут перекись водорода и/или персульфат аммония в количестве не более 0,33 мас.% от суммарного веса исходных компонентов.
В качестве водной среды берут бидистиллированную апирогенную воду.
Полученный гидрогель помещают или фасуют в шприцы и применяют для имплантирования в организм человека или животных с образованием капсулы и последующим введением в капсулу желаемых культур клеток.
Предложенный гидрогель может быть получен разными способами и заявленный способ получения полиакриламидного гидрогеля никоим образом не ограничивает других возможных вариантов его получения, как прямых, так и косвенных, и иллюстрирует один из возможных путей получения гидрогеля данного состава с определенными заданными свойствами.
Как известно, гидрогель, содержащий полиакриламид, представляет собой трехмерную сеть поперечносшитых сшивающими агентами мономеров, в ячейках которой удерживается водная среда, в которой содержится некоторое неустановленное количество несвязанного инициатора полимеризации, так как некоторое, также неустановленное количество инициатора полимеризации непосредственно встраивается в структуру сополимера (см. М.Н.Савицкая, Ю.Д.Холодова "Полиакриламид", Изд-во "Техника" 1969 г., стр. 103) или же вымывается из гидрогеля при его промывке.
При этом биологически активные свойства такого гидрогеля в значительной степени зависят от структуры сетчатого полимера, которая в свою очередь зависит от условий его синтеза, а именно качественного и количественного соотношения исходных реагентов, в том числе сшивающих агентов и инициаторов полимеризации, которые химическими и водородными связями встраиваются в структуру сополимера (по группам NH, СН, СООН, NН2, СН2), а также режима осуществления полимеризации.
Сущность изобретения заключается в том, что был подобран качественный и количественный состав полиакриламидного геля и условия проведения сополимеризации, позволяющие увеличить продолжительность активной жизнедеятельности имплантированных в организм гетерогенных клеток.
Условия получения предлагаемого полиакриламидного гидрогеля позволили уменьшить количество несвязанных аминогрупп, свободных NH2 радикалов и непредельных двойных связей. Также удалось увеличить степень сшивки за счет образования структурных групп (-H2C-NH-CH2-), (-CO-NH-CR2-O-R), (-CO-NH-NH-CO-), (H-COR-NH-CR-O-R), (-CONH-R-NH-CO), где R - СН3, CH2, NH2, C2H5, C3H7 и увеличения количества поперечных сшивок - N-N связей.
Все это позволило обеспечить высокую устойчивость предлагаемого гидрогеля к резорбции и усадке в организме пациента и условия для переживания имплантированных в гель клеток.
Краткое описание иллюстраций
Для лучшего понимания изобретения ниже приведены примеры конкретного получения предлагаемого биосовместимого гидрогеля со ссылками на прилагаемые иллюстрации, где:
На фиг.1а представлен инфракрасный (ИК) спектр поглощения предлагаемого гидрогеля;
фиг.1б - ИК-спектр поглощения гидрогеля-прототипа, выпускаемого в России по патенту RU №2127129 под торговым наименованием “Формакрил”. Оба ИК-спектра выполнены в области 4000-500 см-1 (по оси "х" указана длина волны света (см-1); по оси "у" - степень поглощения света Т (в %).
На фиг.2а представлена фотография предлагаемого гидрогеля, полученная с помощью растровой (РЭМ) электронной микроскопии; на фиг.2б - фотография гидрогеля “Формакрил”, также полученная с помощью растровой (РЭМ) электронной микроскопии. Обе фотографии получены с использованием электронного микроскопа Hitachi S 405A.
Примеры осуществления изобретения
Для получения предлагаемого биосовместимого гидрогеля берут:
- акриламид (acrylamide): C3H5NO, мол. масса 71.08, белый кристаллический порошок без запаха; температура плавления 84,5С; производство фирмы Sigma (Каталог “Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук” SIGMA, 1999, с.47, каталожный №А8887);
- метакриламид (methacrylamide): С3Н7NО; мол. масса 73.08, белый порошок; температура плавления 111С; производство фирмы Fluka (Fluka Katalogue "Chemica-Biochemica", Fluka AG, Switzerland, 1986/87, p.1151);
- 2-гидроксиэтилметакрилат -(2-hydroxyethylmethacrylate): С6Н10О3, мол. масса 130.1, жидкость; температура кипения 205-208С; плотность 1,07 г/мл; производство фирмы Sigma (Каталог “Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук” SIGMA, 1999, с.567, каталожный №Н8633);
-N,N'-метилен-бис-акриламид (N,N'-methylene-bis-acrylamide): C7H10N2O2, мол. масса 154,16, белый кристаллический порошок без запаха, температура плавления 185С, производство фирмы Sigma (Каталог “Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук” SIGMA, 1999, с.696, каталожный №М7256);
- персульфат аммония: (NH4)2S2O8 -мол. масса 228.19; бесцветные плоские кристаллы; температура разрушения 120С; производство фирмы Sigma (Каталог “Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук” SIGMA, 1999, с.117);
- перекись водорода: Н2О2 - мол.масса 34,0; бесцветная жидкость, плотность при 0С - 1,465; температура плавления - 0,89С; производство фирмы Sigma (Каталог “Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук” SIGMA, 1999, с.556, каталожный №Н6520);
Все вышеуказанные мономеры берут пригодными для биологических целей и не требующими дополнительной очистки.
Воду берут бидистиллированную апирогенную (рН 5,6).
Способ осуществляют следующим образом.
Для приготовления реакционной смеси берут бидистиллированную апирогенную воду, имеющую рН 5,6.
Готовят водный раствор, содержащий акриламид, метакриламид, 2-гидроксиэтилметакрилат и N,N'-метилен-бис-акриламид, взятые в соотношении 65,0-80,0:18,0-30,0:0,1-4,0:0,2-6,0.
Общая масса исходных мономеров в растворе составляет при этом от 3,0 до 10,0% (варьируя количество исходных мономеров в смеси, получают гидрогель различной плотности и эластичности).
В полученный раствор вводят инициаторы полимеризации перекись водорода в количестве 0,1-0,3 мас.%, или персульфат аммония в количестве 0,0006-0,03 мас.%, или их смесь в любом соотношении и в количестве, не превышающем сумму их максимальных значений. Варьируя количество перекиси водорода и персульфата аммония, получают материал, имеющий желаемый рН в диапазоне 3,5-4,5.
Готовую реакционную смесь фильтруют через бактерицидные полимерные фильтры, например, марки F8273 с размером пор 0,45 mm CA/CN, производитель Sigma (США), и помещают для сополимеризации мономеров на инкубацию при температуре 20-30С в течение 12-24 часов. После этой инкубации производят промывание гидрогеля, уже имеющего вид геля, горячей водой, для чего помещают гель в емкость с водой, имеющей температуру 70-110С, при давлении 0-1,2 атм и соотношении объема геля и воды 1:8-10 на 4-6 часов.
Затем проводят вторую стадию сополимеризации, обрабатывая полупродукт -облучением в дозе 0,4-1,0 мегарад. После этого полупродукт фасуют в необходимом объеме во флаконы или шприцы и проводят третью стадию сополимеризации, выдерживая гель при температуре 120С и давлении 1,2 атм в течение 20-40 минут.
Были проведены физико-химические, санитарно-химические и токсикологические исследования образцов предлагаемого гидрогеля в соответствии со стандартом ИСО 10993 "Оценка биологического действия медицинских изделий", "Методическими указаниями по санитарно-гигиенической оценке резиновых и латексных изделий медицинского назначения" (Минздрав СССР, М., 1988 г.) и Методическими рекомендациями "Допустимые количества миграции химических веществ, выделяющихся из полимерных и других материалов, контактирующих с пищевыми гидрогелями, и методы их определения" СанПиН 42-122-42-40-86.
Определение содержания в образцах полученного гидрогеля мономеров акриламида и N,N'-метилен-бис-акриламида проводили в соответствии с методикой, описанной в работе V.V. Kuznetsov et al. “Determination of Acrylamide in Polyacrylamidic gels"// The 52-nd Pittsburgh Conference on Analytical Chemistry and Applied Spectroscopy. -New Orleany, LA, 2001, Abstract Book №1648.
Этими исследованиями было установлено, что предлагаемый гидрогель имеет следующие физико-химические характеристики:
- Внешний вид - гель;
- Цвет - от бесцветного до полупрозрачного темнокоричневого, опалесцирующего;
- Показатель преломления - 1,328-1,360;
- Плотность - 1,0-1,2 г/см3;
- рН-3,5-4,5;
- Содержание мономеров - до 0,4 ppm;
- Уровень бромируемости - не выше 1,0 (мг брома на 1л). Санитарно-химические испытания показали, что
- миграция металлов - Сu, Fe, Ni, Zn, Al, Ti, Ag в водную вытяжку из гидрогеля, определяемая атомно-абсорбционным методом, не найдена в пределах чувствительности метода (0,02; 0,05; 0,05; 0,02; 0,005; 0,04 мг/л соответственно), что существенно ниже допустимых уровней, принятых для питьевой воды;
- миграция натрия составила не более 0,12 мг/л при допустимом уровне в питьевой воде 200 мг/л.
Токсикологические испытания показали, что водные вытяжки из гидрогеля не проявили гемолитического эффекта в опытах "in vitro" с изолированными эритроцитами кроликов. Установлен гемолиз 0,04% при допустимом значении показателя 2%.
В остром опыте на белых мышах при парентеральном введении образцов гидрогеля в дозе 50,0 мл на 1 кг массы тела не отмечено гибели животных и клинических признаков интоксикации: общее состояние опытных мышей, их поведение, поедание корма, состояние шерстного покрова не отличались от контрольных.
При вскрытии опытных мышей установлено, что ткани в месте введения гидрогеля, региональные лимфатические узлы, внутренние органы (печень, почки, селезенка) были в пределах физиологической нормы и контроля.
Не было отмечено статистически достоверных отличий динамики массы тела, клинико-биохимических показателей крови, коэффициентов внутренних органов у опытных животных по сравнению с контролем при подкожной имплантации геля сроком на 2,5 месяца.
Не выявлено сенсибилизирующего эффекта гидрогеля при проведении иммунологической диагностической реакции дегрануляции тучных клеток (РДТК).
Микроядерным тестом на препаратах костного мозга не установлено мутагенного эффекта действия гидрогеля. Гистологическое изучение области имплантации гидрогеля и внутренних органов (печень, почки, селезенка, семенники) показало наличие слабо выраженной тканевой реакции на гидрогель только в первые дни после имплантации и отсутствие дистрофических и некротических изменений в органах.
Ниже приведены конкретные примеры получения предлагаемого биосовместимого гидрогеля и применения его для культивирования гетерогенных клеток в организме реципиента.
Пример 1
Для получения гидрогеля брали 384 мл бидистиллированной апирогенной воды, имеющей рН 5,6, и растворяли в ней 11,2 г акриламида, 3,6 г метакриламида, 0,48 г 2-гидроксиэтилметакрилата и 0,72 г N,N'-метилен-бис-акриламида, пригодных для биологических целей. Затем в исходный раствор вносили 0,04 г персульфата аммония и 2 мл 30%-ной перекиси водорода. Полученную смесь фильтровали через бактерицидный полимерный фильтр марки F8273 с размером пор 0,45 mm CA/CN, производитель Sigma (США), и помещали в емкость, которую ставили для инкубации на водяную баню при температуре 30С в течение 22 часов.
Затем гидрогель в виде геля промывали в горячей воде при соотношении воды и геля 10:1 при температуре 90 в течение 4 часов и проводили вторую стадию сополимеризации, обрабатывая полупродукт -облучением в дозе 0,8 мегарад. После этого полупродукт фасовали в шприцы объемом 0,5-3,0 мл и проводили третью стадию сополимеризации, выдерживая гель при температуре 120С и давлении 1,2 атм в течение 30 минут.
Полученный гель содержит 96 мас.% водной фазы и 4 мас.% сополимера, в котором на 70,0 мас.% акриламида приходится 22,5 мас.% метакриламида, 0,3 мас.% 2-гидроксиэтилметакрилата и 0,4 мас.% N,N'-метилен-бис-акриламида и имеет рН 4,3.
Полученный образец гидрогеля имеет следующие физико-химические характеристики:
Внешний вид - бесцветный, полупрозрачный, опалесцирующий гель;
Показатель преломления - 1,348;
рН 4,3;
Плотность - 1,0 г/см3;
Содержание мономеров 0,1 ppm;
Уровень бромируемости - 0,1 (мг брома на 1 л).
Были получены ИК-спектр и проведены электронно-микроскопические исследования высушенного образца этого гидрогеля, представленные соответственно на фиг.1а и 2а.
Для сравнения на фиг.1б и фиг.2б представлены ИК-спектр и хроматограмма экстракта известного гидрогеля-прототипа, выпускаемого в России по патенту RU №2127129 под торговым названием “Формакрил”, который содержит 96 мас.% водной фазы и 4 мас.% сополимера, где на 96 мас.% акриламида приходится 4,0 мас.% N,N'-метилен-бис-акриламида, имеет рН 5,4, уровень бромируемости 0,27 (мг брома на 1 л), и получен при инкубации исходной смеси в присутствии перекиси водорода и персульфата аммония в суммарном количестве 0,3 мас.% при температуре 60С в течение 12 часов, а затем при температуре 100С еще 2 часа.
Как видно из спектра, представленного на фиг.1а, в нем отсутствует пик в районе полосы 1620 см-1. Это свидетельствует о том, что в структуре полимера отсутствуют свободные NH2 радикалы, которые могли бы образовать координационные связи со структурной сеткой гидрогеля.
Как видно из спектра, представленного на фиг.1б, в нем присутствует полоса - 1620 см-1, что указывает на наличие NH2 радикалов в количестве чуть более 1%.
Для проведения электронно-микроскопических исследований заявленного гидрогеля и гидрогеля “Формакрил” образцы гелей, полученных, как описано в этом примере, высушивали до постоянного веса. При этом образцы приобретали вид пленки. Структуру гидрогелей исследовали методом растровой (РЭМ) электронной микроскопии с использованием электронного микроскопа Hitachi S 405A, для чего проводили препарирование методом скола замороженных в жидком азоте высушенных образцов гидрогелей. Перед просмотром методом растровой электронной микроскопии на поверхность образцов напыляли золото.
Электронно-микроскопические (РЭМ) фотографии предлагаемого гидрогеля и гидрогеля “Формакрил” представлены соответственно на фиг.2а и 2б.
Как видно из сравнения представленных на фиг.2 фотографий, предлагаемый гидрогель имеет более мелкоячеистую структуру по сравнению с гидрогелем “Формакрил”.
Пример 2
Использование предлагаемого гидрогеля для культивирования ксеногенных опухолевых клеток
Полученный, как описано в примере 1, гидрогель имплантировали подкожно в объеме 1 мл мышам линии С57 Black. Через 1,5 мес в имплантированный гель, вокруг которого сформировалась соединительно-тканая капсула, вносили клетки меланомы человека линии SKMEL-1 по 1 млн клеток на каждую капсулу с гидрогелем.
Через 3, 6 и 9 месяцев гелевые капулы извлекали из животных и тестировали жизнеспособность и физиологическую активность находящихся в этих капсулах клеток меланомы человека.
Установлено, что клетки меланомы человека линии SKMEL-1 сохраняли жизнеспособность даже через 9 месяцев после культивирования их в капсуле предлагаемого гидрогеля.
При переводе выделенных из капсулы клеток меланомы в культуру установили с помощью обычного метода полимеразной цепной реакции полную идентичность консервативного миоглобина человека в клетках меланомы, культивированных в питательной среде, и клеток, культивированных в течение 9 мес. в капсуле гидрогеля, имплантированного в организм мыши.
Этот пример свидетельствует о возможности длительного культивирования при помощи предлагаемого гидрогеля имплантированных клеток в организме реципиента при сохранении ими жизнеспособности.
Пример 3
Использование предлагаемого гидрогеля для культивирования свиных клеток Лейдига в организме человека для лечения бесплодия
Полученный, как описано в примере 1, гидрогель имплантировали больным людям мужского пола. После образования соединительно-тканой капсулы вокруг геля в него вносили клетки Лейдига, полученные от половозрелых поросят.
Уровень тестостерона в крови пациентов определяли с помощью диагностического набора фирмы ХемаМедика (Россия) согласно инструкции производителя.
Уровень тестостерона у пациентов после имплантации им свиных клеток Лейдига представлен в таблице.
Как видно из этой таблицы, предлагаемый гидрогель обеспечивает возможность культивирования свиных клеток Лейдига в организме человека при сохранении этими клетками способности синтезировать тестостерон в течение 22 месяцев, в то время как при имплантации клеток в гель-прототип (формакрил) их способность к активному синтезу гормона начинает снижаться уже через 10 месяцев.
Пример 4
Использование предлагаемого гидрогеля для культивирования гетерогенных клеток поджелудочной железы в организме человека для лечения инсулинозависимого сахарного диабета
1. Больная Ф., 37 лет. Инсулинозависимый сахарный диабет диагносцирован 11 лет назад, через год после родов.
Беременность у больной протекала тяжело: с токсикозом второй половины срока беременности, нефропатологией, значительным до 26 кг увеличением веса. Заболевание носило все годы нестабильный характер, что требовало больших усилий в подборе адекватной инсулинотерапии. Потребление экзогенного инсулина варьировало с 58 до 30 ед/сут. В последние два года диагносцированы патологические изменения со стороны почек, что определяется как диабетическая нефропатия. В анализах мочи отмечено увеличение верхней границы протеинурии в 10-12 раз. Повышение артериального давления до 170/110 мм рт.ст.
Полученный, как описано в примере 1, гидрогель имплантировали этой больной. После образования соединительно-тканой капсулы вокруг геля в него ввели культуру клеток поджелудочной железы новорожденных кроликов.
Уже через 7 дней после введения клеток поджелудочной железы пациентка отмечала улучшение общего состояния, уменьшение чувства жажды и сухости слизистой полости рта, снижение артериального давления до 140/90 мм рт.ст. Через 15 дней состояние пациентки позволило снизить потребность в экзогенном инсулине с 30 до 18 ед (контроль крови и мочи). Через 30 дней потребность в экзогенном инсулине снизилась до 12 ед/сут, а к исходу 2-го месяца - до 4 ед/сут.
После введения клеток поджелудочной железы больная наблюдается в течение 12 месяцев. Клинических проявлений нефропатии не обнаруживается, артериальное давление в пределах возрастной нормы. Пациентка переведена на пероральные антидиабетические препараты с обязательным условием соблюдения диабетической диеты и контроля глюкозы в крови, в моче и гликозилированного гемоглобина.
2. Больной К., 52 года. Инсулинозависимый сахарный диабет диагносцирован с 18 лет на фоне сильной стрессовой ситуации. Характер заболевания сначала был нестабильно тяжелым. Дозы экзогенного инсулина достигали 70 ед/сут. Со временем характер течения заболевания стабилизировался, но ухудшение состояния возникали после стрессовых ситуаций и погрешностях в диете.
В последние три года отмечалось ухудшение состояния сосудов нижних конечностей, снижение либидо, ухудшение эрекции и качества полового акта. Диагностирована диабетическая ангиопатия нижних конечностей и полового члена. Потребность в экзогенном инсулине за последний год от 20 до 40 ед/сут.
Полученный, как описано в примере 1, гидрогель имплантировали этому больному. После образования соединительно-тканой капсулы вокруг геля в него ввели культуру клеток поджелудочной железы 14-дневных поросят.
Через две недели после введения клеток поджелудочной железы пациент отмечал улучшение общего состояния. Через месяц потребность в экзогенном инсулине снизилась до 12 ед/сут. Через 2 месяца - до 6 ед/сут. Через 4 месяца после трансплантации больной переведен на пероральные антидиабетические препараты. Нормализовалась сексуальная жизнь пациента, значительно улучшилось состояние сосудов нижних конечностей.
Субъективные и объективные симптомы обследуемых пациентов, данные дополнительных методов исследования (крови, мочи) позволяют говорить о высокой эффективности лечения сахарного диабета путем введения гетерогенных клеток поджелудочной железы в гидрогель предлагаемого состава.
Терапевтический эффект длится, как правило, от 10 до 20 месяцев в зависимости от тяжести заболевания. Количество трансплантируемых клеток также определяется тяжестью течения сахарного диабета, в частности количеством потребляемого больным экзогенного инсулина.
Промышленная применимость
Таким образом, приведенные примеры конкретного выполнения подтверждают, что предлагаемый биосовместимый гидрогель может быть получен с помощью предлагаемого способа.
Предлагаемый гидрогель практически не вызывает тканевой реакции, не вызывает сенсибилизации организма, не вызывает дистрофические и некротические изменения и может быть использован для имплантирования в организм животных и человека для образования капсулы и последующего культивирования в ней желаемых клеточных культур.
По сравнению с известным гидрогелем-прототипом (гидрогель “Формакрил”) в структуре предлагаемого гидрогеля отсутствуют свободные NH2 радикалы, которые могли бы образовать координационные связи со структурной сеткой гидрогеля.
Предлагаемый гидрогель в сравнении с прототипом имеет более мелкоячеистую структуру и обеспечивает возможность более длительного культивирования имплантированных клеток в организме реципиента с сохранением ими жизнеспособности и способности производить необходимые для человека продукты, в частности тестостерон и инсулин.
Формула изобретения
1. Полифункциональный биосовместимый гидрогель, содержащий полиакриламид и воду, отличающийся тем, что в качестве полиакриламида он содержит поперечно-сшитый сополимер акриламида, метакриламида и сшивающего агента - 2-гидроксиэтил метакрилата и N,N'-метилен-бис-акриламида.
2. Полифункциональный биосовместимый гидрогель по п.1, отличающийся тем, что указанный полиакриламид содержит следующее соотношение компонентов, мас.%:
Акриламид 65,0-80,0
Метакриламид 18,0-30,0
2-Гидроксиэтил метакрилата 0,1-4,0
N,N'- Метилен-бис-акриламид 0,2-6,0
3. Полифункциональный биосовместимый гидрогель по п.1, отличающийся тем, что он содержит указанного полиакриламида от 3,0 до 10,0 % от общей массы биосовместимого гидрогеля.
4. Полифункциональный биосовместимый гидрогель по п.1, отличающийся тем, что он содержит следующее соотношение компонентов, мас.%:
Акриламид 1,95-8,0
Метакриламид 0,54-3,0
2-Гидроксиэтил метакрилата 0,003-0,4
N,N'- Метилен-бис-акриламид 0,006-0,6
Вода До 100
5. Полифункциональный биосовместимый гидрогель по п.4, отличающийся тем, что в качестве воды он содержит бидистиллированную апирогенную воду.
6. Полифункциональный биосовместимый гидрогель по п.5, отличающийся тем, что он имеет рН 3,5-4,5.
7. Полифункциональный биосовместимый гидрогель по п.1, отличающийся тем, что он пригоден для инъецирования.
8. Полифункциональный биосовместимый гидрогель по п.1, отличающийся тем, что он пригоден для образования капсулы в тканях животных и человека.
9. Полифункциональный биосовместимый гидрогель по п.1, отличающийся тем, что он пригоден для культивирования гетерогенных (аллогенных или ксеногенных) или аутогенных клеток.
10. Полифункциональный биосовместимый гидрогель по п.7, отличающийся тем, что он расфасован в шприцы.
11. Способ получения полифункционального биосовместимого гидрогеля путем сополимеризации мономеров и сшивающих агентов в водной среде в присутствии пероксидного инициатора полимеризации в несколько стадий, отличающийся тем, что в качестве мономеров берут акриламид и метакриламид, в качестве сшивающих агентов берут 2-гидроксиэтил метакрилат и N,N'-метилен-бис-акриламид при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Акриламид 1,95-8,0
Метакриламид 0,54-3,0
2-Гидроксиэтил метакрилата 0,003-0,4
N,N'- Метилен-бис-акриламид 0,006-0,6
Вода До 100
сополимеризацию проводят в три стадии: первую стадию - при температуре 20-30С в течение 12-24 ч, вторую стадию - путем -облучения в дозе 0,4-1,0 Мрад и третью стадию – при температуре 100-130С и давлении 0-1,2 атм. в течение 20-40 мин.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный гидрогель после первой стадии сополимеризации промывают в горячей воде, имеющей температуру 70-110С, в течение по меньшей мере 3 ч при давлении 0-1,2 атм. и массовом соотношении гидрогеля и воды 1:8-10.
13. Способ по п.11, отличающийся тем, что в качестве инициатора сополимеризации берут перекись водорода и/или персульфат аммония в количестве не более 0,33 % от суммарного веса исходных компонентов.
14. Способ по п.11, отличающийся тем, что в качестве водной среды берут бидистиллированную апирогенную воду.
15. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный гидрогель фасуют в шприцы.
РИСУНКИРисунок 1, Рисунок 2