(цитохром р450)-монооксигеназы

(цитохром р450)-монооксигеназы

Реферат

 

Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано в селекции растений. Трансформация растительной клетки или ткани молекулой ДНК, кодирующей монооксигненазу, которая катализирует превращение альдоксима в нитрил и этого нитрила в соответствующий циангидрин, позволяет получить растение с измененным уровнем экспрессии цианогенных гликозидов. Уровень экспрессии этих веществ влияет на питательную ценность растения или их устойчивость к вредителям. 5 н. и 4 з.п. ф-лы.

Настоящее изобретение относится к генетическому конструированию растений с помощью метода рекомбинантной ДНК и к ферментам, участвующим в биосинтезе цианогенных гликозидов, в частности, к генам, кодирующим эти ферменты. Протеины и гены по изобретению могут применяться для увеличения питательной ценности растений или их устойчивости к вредителям.

Цианогенные гликозиды представляют собой вторичные растительные метаболиты у более чем 2000 видов растений. В некоторых случаях они являются источником HCN, что может приводить к токсичности растений при их употреблении в пищу. Например, клубни цианогенного культурного растения маниока съедобного (Manihot esculenta) являются одним из главных продуктов питания в тропических зонах. Присутствующие в клубнях цианогенные гликозиды могут вызвать отравление цианидом у людей при недостаточной обработке продуктов из маниока. Другие виды растений, в которых ферментативным путем продуцируется HCN и которые обладают потенциальной токсичностью при избыточном потреблении в качестве пищи или при применении в качестве корма для скота, включают белый клевер (Trifolium repens), сорго (Sorghum bicolor), лен обыкновенный (Linum usitatissimum), триостренник (Triglochin maritima), фасоль лима (Phaseolus lunatus), миндаль (Amygdalus) и косточки абрикоса (р. Primus), вишен и яблок (р. Malus). Токсичность этих растений может быть уменьшена путем ингибирования биосинтеза цианогенных гликозидов в этих растениях.

Первичные предшественники встречающихся в естественных условиях цианогенных гликозидов ограничены пятью гидрофобными входящими в состав протеинов аминокислотами, такими, как валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин и тирозин, а также одной не входящей в состав протеинов аминокислотой циклопентенглицином. Эти аминокислоты превращаются в результате серий реакций в циангидрины, которые в конечном итоге связываются с остатком сахара. Например, амигдалин содержит O--гентиобиозид и пруназин, т.е. O--гликозид (R)-манделонитрила. Другим примером цианогенных гликозидов, имеющих ароматические агликоны, является эпимерная пара цианогенных гликозидов дхуррин и таксифиллин, которые обнаружены в растениях родов Sorghum и Taxus соответственно. Например, пара-гидроксиманделонитрил превращается в дхуррин (-D-глюкопиранозилокси-(S)-пара-гидроксиманделонитрил) с помощью УДФГ-гликозилтрансферазы. Вероятно, аналогичные гликозилтрансферазы присутствуют в большинстве растений. Вицианин и лукумин представляют собой дополнительные примеры производных дисахаридов, аналогичных амигдалину. Самбунигрин содержит (S)-мaндeлoнитpил в качестве агликона и, следовательно, представляет собой эпимер пруназина. Примерами цианогенных гликозидов, имеющих алифатические агликоны, являются линамарин и лотаустралин, обнаруженные в клевере, льне, маниоке и фасоли. Подробный обзор цианогенных гликозидов и путей их биосинтеза приведен в работе Conn, Naturwissenschaften 66: 28-34, 1979, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Путь биосинтеза цианогенного глюкозида дхуррина, являющегося производным тирозина, хорошо изучен (Halkier и др., "Cyanogenic glucosides: the biosynthetic pathway and the enzyme system" в "Cyanogenic compounds in biology", Wiley Chichester (Ciba Foundation Symposium 140), стр. 49-66, 1988; Halkier и Moller, Plant Physiol. 90: 1552-1559, 1989; Halkier и др., The J. of Biol. Chem. 264: 19487-19494, 1989; Halkier и Moller, Plant Physiol. 96: 10-17, 1990; Halkier и Moller, The J. of Biol. Chem. 265: 21114-21121, 1990; Halkier и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 487-491, 1991; Sibbesen и др., "Biochemistry and Biophysics of cytochrom P450. Structure and Function, Biotechnological and Ecological Aspects", под ред. Archakov A.I., 1991; Koch и др., Материалы 8-й Международной конференции по цитохрому P450 (8th Int. Conf. on Cytochrome P450), реферат PII.053; Sibbesen и др., Материалы 8-й Международной конференции по цитохрому P450 (8th Int. Conf. on Cytochrome P450), реферат PII.016). L-тирозин превращается в пара-гидроксиманделонитрил (предшественник дхуррина), при этом N-гидрокситирозин, N,N-дигидрокситирозин, (Е)- и (Z)-пара-гидроксифенилацетальдегидоксим и пара-гидроксифенилацетонитрил являются промежуточными продуктами. В этот путь метаболизма включены два типа (цитохром Р450)-монооксигеназ. У маниока аналогичный путь метаболизма, включающий P450-зависимые монооксигеназы, используется для синтеза линамарина и лотаустралина из валина и изолейцина соответственно (Koch и др., Archives of Biochemistry and Biophysics, 292: 141-150, 1992). Как установлено для Sorghum bicolor, для сложного пути превращения L-тирозина в пара-гидроксиманделонитрил необходимы только две многофункциональные P450-зависимые монооксигеназы. Первый фермент, обозначенный как P450_TYR, превращает тирозин в пара-гидроксифенилацетальдегидоксим. Второй фермент, обозначенный как Р450_ox, превращает альдоксим в пара-гидроксиманделонитрил. С точки зрения сходства путей биосинтеза цианогенных глюкозидов в различных растениях, как правило, считается, что указанные пути метаболизма включают две многофункциональные P450-зависимые монооксигеназы Р450_I и Р450_II, которые превращают аминокислоту, являющуюся предшественником, в соответствующий альдоксим, а альдоксим в соответствующий циангидрин соответственно. Р450_I представляет собой определенный фермент, который обладает субстратной специфичностью и вследствие этого участвует в пути метаболизма гликозида определенного типа, в то время как Р450_II, вероятно, является менее специфичным и осуществляет превращение широкого диапазона различных по строению альдоксимов в соответствующий циангидрин.

Глюкозинолаты представляют собой гидрофильные нелетучие тиогликозиды, обнаруженные в нескольких отрядах двудольных покрытосеменных растений (Cronquist, "The Evolution and Classification of Flowering Plants", New York Botanical Garden, Bronx, 1988). Встречаемость цианогенных глюкозинолатов и глюкозидов является взаимно исключающей. Наибольшее экономическое значение имеет наличие глюкозинолатов во всех представителях сем. Brassicaceae (каперсовые, порядок Capparales), многие сорта которых в течение многих столетий являются для человечества источником приправ, закусок, салатных культур и овощей, а также фуражных и кормовых культур. В настоящее время рапс (особенно Brassica napus и Brassica campestris) стал основной коммерческой масличной культурой. Известно примерно 100 различных глюкозинолатов, имеющих одинаковое общее строение, но отличающихся природой боковой цепи. Глюкозинолаты образуются из входящих в состав протеинов аминокислот либо непосредственно, либо после одного или после многократного удлинения цепи (Underbill и др., Biochem. Soc. Symp. 38: 303-326, 1973). N-гидроксиаминокислоты и альдоксимы, которые были выявлены в качестве промежуточных продуктов биосинтеза цианогенных гликозидов, также служат в качестве эффективных предшественников биосинтеза глюкозинолатов (Kindl и др., Phytochemistry 7: 745-756, 1968; Matsuo и др., Phytochemistry 11: 697-701, 1972; Underbill Eur. J. Biochem. 2: 61-63, 1967). Таким образом, цитохром Р450_I, который участвует в синтезе цианогенных гликозидов, функционирует практически так же, как и соответствующий фермент биосинтеза глюкозинолатов, и, вероятно, является представителем этого же семейства Р450-ферментов. Так, авторами изобретения был выделен клон кДНК из Sinapis alba (горчица белая), кодирующий фермент Р450 (SEQ ID NO: 17), который на 54% идентичен Р450_TYR (CYP79) и который катализирует первую стадию биосинтеза глюкозинолатов, в процессе которой из исходной аминокислоты образуется альдоксим. Этот клон кДНК оказался примерно на 90% идентичен последовательности EST Arabidopsis (T42902), что с высокой долей вероятности свидетельствует о том, что фермент цитохром Р450 является высоко консервативным у видов, содержащих глюкозинолаты.

Сведение описанного выше сложного пути биосинтеза циангидринов к каталитической активности только двух ферментов, цитохромов P450_I и Р450_II, позволяет управлять путем биосинтеза цианогенных глюкозидов в растениях. Путем трансфекции генных конструкций, кодирующих одну или обе монооксигеназы, путь биосинтеза цианогенных глюкозидов может быть либо модифицирован, либо восстановлен, либо вновь создан.

Модификация или интродукция пути биосинтеза цианогенных гликозидов в растениях известными в данной области методами представляет большой интерес, поскольку цианогенные гликозиды могут обладать токсичностью для насекомых, клещей и нематод. Таким образом, модификация, интродукция или восстановление пути биосинтеза цианогенных гликозидов в растениях или в определенных тканях растения должны сделать растения несъедобными для насекомых, клещей или нематод и, следовательно, способствовать уменьшению повреждения культурного растения вредителями. В комбинации с другими инсектицидными агентами, такими, как эндотоксины Bacillus thurigiensis, повреждение культурного растения вредителями может быть дополнительно уменьшено.

В альтернативном варианте последовательности генов, кодирующих монооксигеназы по изобретению, могут применяться для создания плазмидных ДНК, которые при трансфекции в растение, содержащее цианогенные гликозиды, такое, как маниок, сорго или ячмень, устраняют цианогенные гликозиды, обычно продуцируемые растениями дикого типа. Реализовать это можно путем экспрессии антисмысловой либо смысловой РНК или рибозимов согласно методу, описанному в ЕР-458367-А1, ЕР-240208-А2, US 5231020, WO 89/05852 и WO 90/11682, что позволяет ингибировать экспрессию монооксигеназ по изобретению. Разработка такого подхода представляет большой интерес, поскольку несмотря на многочисленные попытки методами традиционной селекции растений не удалось полностью удалить цианогенные гликозиды, например, из маниока или сорго. С другой стороны, установлено, что увеличенные количества цианогенных гликозидов в эпидермальных клетках разных культиваров ячменя обусловливают повышенную чувствительность к грибам Erysiphe graminis, являющимся возбудителями мучнистой росы (Pourmohensi, PhD thesis, 1989; Ibenthal и др., Angew. Bot. 67: 97-106, 1993). Аналогичное действие было обнаружено для цианогенного каучуконосного дерева гевеи (Hevea brasiliensis) в отношении поражения грибом Microcyclus ulei (Lieberei и др., Plant Phys. 90: 3-36, 1993) и для льна в отношении поражения грибом Colletotrichum lini (Ludtke и др., Biochem. Z. 324: 433-442, 1953). В этих примерах уровень устойчивости указанных выше растений и других растений, у которых цианогенные гликозиды обусловливают повышенную чувствительность к поражению микроорганизмами, может быть увеличен путем предупреждения образования цианогенных гликозидов в таких растениях. У ячменя цианогенные гликозиды локализованы в эпидермальных клетках. Таким образом, экспрессия антисмысловых, смысловых или рибозимных конструкций предпочтительно, но не обязательно, находится под контролем специфичного для эпидермиса промотора.

Присутствие даже минорных количеств цианогенных гликозидов в растениях также может создавать проблемы, связанные с их питательной ценностью, из-за образования нежелательных канцерогенов, что известно для ячменя. Ячменный солод, например, содержит небольшие количества цианогенного глюкозида эпигетеродендрина, который в процессе получения спиртов из зерна может превращаться в этилкарбамат, который считается канцерогеном. Вследствие этого делаются попытки ввести обязательное нормирование предельно допустимых концентраций этилкарбамата в сбраживаемом корме, напитках и спиртах (Food Chemicals News 29: 33.35, 1988).

В WO 95/16041 предложена молекула ДНК, кодирующая (цитохром Р450_I)-монооксигеназу, которая катализирует превращение аминокислоты в соответствующую N-гидроксиаминокислоту, N,N-дигидроксиаминокислоту и превращение N,N-дигидроксиаминокислоты в соответствующий альдоксим. Аминокислоту-предшественника выбирают из группы, включающей тирозин, фенилаланин, триптофан, валин, лейцин, изолейцин и циклопентенилглицин.

Молекулы ДНК либо соответствуют встречающимся в естественных условиях генам, либо их функциональным гомологам, которые являются результатом мутации, делеции, усечения и т.д., но еще сохраняют способность кодировать (цитохром Р450_I)-монооксигеназу, способную катализировать более одной реакции пути биосинтеза цианогенных гликозидов. Монооксигеназы предпочтительно содержат один каталитический центр.

Кроме того, в WO 95/16041 предложены молекулы ДНК, кодирующие (цитохром Р450_II)-монооксигеназы, такие, как Р450_ox растения Sorghum bicolor (L.) Moench. Они катализируют превращение альдоксима в нитрил и превращение нитрила в соответствующий циангидрин. Катализ превращения тирозина в пара-гидроксифенилацетонитрил двумя многофункциональными ферментами Р450 объясняет, почему путь метаболизма всех промежуточных продуктов, участвующих в этом превращении, кроме (Z)-пара-гидроксифенила-цетальдоксима, происходит в определенном направлении.

Предлагаемая для выделения Р450 стратегия основана на применении методик, предложенных для выделения Р450_TYR (CYP79, Sibbesen и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9740-9744, 1994) из сорго. При использовании этого метода ионообменную колонку с ионообменником типа сефарозы с диэтиламиноэтилом (ДЭАЭ) применяют для связывания ферментов Р450, при этом желтые пигменты в образце не связываются. Удаление пигментов служит двум целям. Это является необходимым условием для связывания ферментов Р450 со следующими колонками и позволяет определить содержание Р450 спектрометрически (с использованием окиси углерода (СО) и связывания с субстратом). В отличие от этого согласно настоящему изобретению Р450_ox обладает низким сродством к связыванию с ДЭАЭ-колонкой и практически полностью извлекается из фракций погона и промывочных фракций. С целью разделения активности Р450_ox и желтых пигментов применяют процедуру распределения фаз с использованием Тритона Х-114. Установлено, что при использовании предпочтительно от 0,6 до 1% Тритона Х-114 Р450_ox распределяется в обеих фазах, в отличие от Р450_TYR, который переходит в верхнюю фазу с высоким содержанием детергента. При увеличении концентрации Тритона Х-114 до 6% основная часть Р450_ox извлекается из нижней фазы с низким содержанием детергента, в то время как желтые пигменты находятся в верхней фазе. Недостатком применения 6%-ного Тритона Х-114 является повышение превращения Р450_ox в его денатурированную форму Р420. Эти данные используют в настоящем изобретении прежде всего для очистки Р450_II-монооксигеназ, таких, как Р450_ox, с целью клонирования генов, кодирующих монооксигеназы, и для стабильной трансформации растений генами, кодирующими монооксигеназы. Выделение Р450_ox и определение частей аминокислотных последовательностей способствует созданию олигонуклеотидных зондов и выделению кДНК, кодирующей Р450. Однако в этом случае клонирование проводят с использованием независимого подхода.

Изобретение прежде всего относится к молекулам ДНК, кодирующим (цитохром Р450_II)-монооксигеназы, которые катализируют превращение альдоксима в нитрил и превращение этого нитрила в соответствующий циангидрин. Предпочтительно альдоксим представляет собой продукт превращения аминокислоты, выбранной из группы, включающей тирозин, фенилаланин, триптофан, валин, лейцин, изолейцин и циклопентенилглицин, или аминокислоты, выбранной из группы, включающей L-тирозин, L-валин и L-изолейцин, катализируемого Р450_I-монооксигеназой, как описано в WO 95/16041. Молекулы ДНК по изобретению либо соответствуют встречающимся в естественных условиях генам, либо их гомологам, полученным в результате мутации, делеции, усечения и т.д., но еще сохраняющим способность кодировать (цитохром Р450_II)-монооксигеназу, которая катализирует превращение альдоксима в нитрил и последующее превращение этого нитрила в соответствующий циангидрин. Монооксигеназы по изобретению катализируют более одной реакции пути биосинтеза цианогенных гликозидов и предпочтительно содержат один каталитический центр.

Ферменты системы цитохрома Р450_II могут присутствовать в большинстве живых организмов. Молекулы ДНК по настоящему изобретению, кодирующие Р450_II-монооксигеназы, структурно и функционально подобны молекулам ДНК, которые могут быть получены из различных растений, продуцирующих цианогенные гликозиды. В предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулы ДНК гибридизуются с фрагментом молекулы ДНК, имеющим нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1. Этот фрагмент имеет длину более 10 нуклеотидов и предпочтительно более 15, 20, 25, 30 или 50 нуклеотидов. Факторы, которые влияют на стабильность гибридов, определяют строгость условий гибридизации и могут быть определены на основе данных о температуре плавления (t_пл) получаемых гибридов. Метод расчета t_пл описан в нескольких руководствах. Например, у Keller и др. в "DNA Probes: Background, Applications, Procedures", Macmillan Publishers Ltd, 1993, на стр. 8-10 описаны факторы, которые следует учитывать при расчете значений t_пл для реакций гибридизации. Молекулы ДНК по настоящему изобретению гибридизуются с фрагментом, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, при температуре на 30С ниже рассчитанного значения t_пл гибрида, который должен быть получен. Предпочтительно они гибридизуются при температурах на 25, 20, 15, 10 или 5С ниже рассчитанного значения t_пл.

Для целей манипуляции с генами с помощью метода рекомбинантной ДНК молекула ДНК по изобретению может в дополнение к гену, кодирующему монооксигеназу, включать ДНК, которая позволяет, например, осуществлять репликацию и отбор ДНК по изобретению в микроорганизмах, таких, как Е. Coli, Bacillus, Agrobacterium, Streptomyces или дрожжи. Она также может включать ДНК, которая позволяет осуществлять экспрессию и отбор генов монооксигеназ в гомологичных или в гетерологичных растениях. Такие последовательности включают (но не ограничены ими) гены, наиболее часто встречающиеся кодоны которых адаптированы к наиболее часто встречающемуся кодону гетерологичного растения, как описано в WO 93/07278, гены, обусловливающие устойчивость к неомицину, канамицину, метотрексату, гигромицину, блеомицину, стрептомицину или гентамицину, к аминоэтилцистеину, глиофосфату, сульфонилмочевинам или фосфинотрицину, пригодные для осуществления скрининга гены-маркеры, такие, как галактозидаза, их природные промоторы и сигналы терминации транскрипции, элементы промоторов, таких, как промоторы 35S и 19S CaMV, или тканеспецифичные растительные промоторы, такие, как промоторы, специфичные для корня (например, описанные в ЕР-452269-А2, WO 91/13992, US 5023179), специфичные для зеленых листьев, такие, как фосфоенолпируваткарбоксилаза (ФЕПК) кукурузы, для сердцевины или пыльцы (например, описанные в WO 93/07278), или индуцибельные растительные промоторы (ЕР-332104), и гетерологичные сигналы терминации транскрипции.

Настоящее изобретение также относится к Р450_II-монооксигеназам, которые катализируют превращение альдоксима в нитрил и превращение этого нитрила в соответствующий циангидрин. В предпочтительном варианте осуществления изобретения монооксигеназы очищают, и они могут использоваться для создания моноклональных или поликлональных антител, которые специфично связываются с монооксигеназами. В частности, цитохром Р450_ox, имеющий молекулярную массу 55 кДа, что установлено с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ), выделяют из Sorghum bicolor (L.) Moench. Его аминокислотная последовательность приведена в SEQ ID NO: 2.

Каталитические особенности Р450_ox сходны с активностью цитохрома Р450, выявленной в микросомах печени крысы (DeMaster и др., J.Org.Chem. 5074-5075, 1992). Характерной особенностью цитохрома Р450_ox и других представителей, принадлежащих к семейству цитохромов Р450_ox, является то, что дегидратация альдоксима с получением соответствующего нитрила зависит от присутствия восстановленного никотинамид-аденин-динуклеотидфосфата (NADPH), но эта зависимость в некоторых случаях может быть преодолена добавлением дитионита натрия или других восстановителей.

Установлено, что из всех известных последовательностей ферментов системы цитохрома Р450 аминокислотная последовательность цитохрома Р450_ox наиболее высоко идентична (44%) аминокислотной последовательности фермента CYP71A1 авокадо, а ее идентичность с аминокислотной последовательностью всех остальных представителей семейства CYP71 составляет менее 40%. Растения авокадо не продуцируют цианогенные гликозиды, а CYP71A1 не катализирует превращение альдоксима в нитрил и превращение этого нитрила в соответствующий циангидрин. Таким образом, согласно настоящему изобретению семейство (цитохром Р450_II)-монооксигеназ может быть ограничено представителями, которые катализируют превращение альдоксима в соответствующий циангидрин и аминокислотные последовательности которых на 40% или более идентичны аминокислотной последовательности цитохрома Р450_ox. Предпочтительно аминокислотная последовательность идентична аминокислотной последовательности цитохрома Р450^ более чем на 50% или более чем на 55%.

Можно предположить, что Р450_ox является первым представителем нового подсемейства CYP71 (CYP71E1), поскольку он входит в один кластер с другими последовательностями CYP71 на дендрограммах, представляющих собой графическое изображение первичной структуры множества последовательностей. В целом, согласно положению Комитета по номенклатуре для того, чтобы цитохром Р450 был отнесен к новому семейству CYP, необходимо, чтобы на уровне аминокислотной последовательности идентичность составляла менее 40%, а при идентичности более чем 55% его относят к этому же подсемейству. При проведении сравнительного анализа множества последовательностей рассматривают не только идентичность последовательностей, но и сходство последовательностей, такое, как одинаковый чистый заряд или сопоставимая гидрофобность/гидрофильность отдельных аминокислот. При таких сравнительных анализах первичной структуры последовательностей Р450_ox группируется с другими последовательностями CYP71 и поэтому должен быть включен в семейство CYP71, несмотря на тот факт, что он идентичен менее чем на 40% всем другим представителям семейства CYP71, за исключением CYP71A1 авокадо. Поскольку он имеет низкую идентичность последовательности с другими представителями, его следует отнести к новому подсемейству. Все другие представители семейства CYP71 выделены из видов, в которых не продуцируются цианогенные соединения, и их функция остается неизвестной. Каталитические особенности ранее выделенных цитохромов Р450, принадлежащих к семейству CYP71, остаются неясными. Вероятно, они участвуют в гидроксилировании терпена. Предполагается, что ни один из них не использует оксимы в качестве субстратов и не способен к многофункциональному превращению альдоксимов в нитрилы и циангидрины.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения кДНК, кодирующей (цитохром Р450_II)-монооксигеназу, которая катализирует превращение альдоксима в нитрил и превращение этого нитрила в соответствующий циангидрин. Этот способ включает:

(а) выделение и солюбилизацию микросом из растительной ткани, продуцирующей цианогенные гликозиды,

(б) очистку (цитохром Р450)-монооксигеназы,

(в) выработку антител против очищенной монооксигеназы,

(г) зондирование библиотеки экспрессии кДНК растительной ткани, продуцирующей цианогенные гликозиды, с помощью указанного антитела и

(д) выделение клонов, которые экспрессируют монооксигеназу.

Микросомы могут быть выделены из растительных тканей, в которых установлена высокая активность ферментной системы, ответственной за биосинтез цианогенных гликозидов. Эти ткани могут варьироваться от одних видов растений к другим. Предпочтительным источником микросом является свежевыделенные проростки, собранные через 1-20 дней, предпочтительно через 2-10 дней и наиболее предпочтительно через 2-4 дня после прорастания. Предпочтительными являются этиолированные проростки растений, продуцирующих цианогенные гликозиды, но можно использовать и проростки, выращенные на свету. После выделения микросомы солюбилизируют в буфере, содержащем один или несколько детергентов. Предпочтительными детергентами являются RENEX 690 (фирма J.Lorentzen A/S, Kvistgard, Дания), восстановленный Тритон Х-100 (RTX-100), Тритон Х-114 и CHAPS.

(Цитохром Р450)-монооксигеназы могут быть очищены с использованием стандартных методов очистки протеинов, таких, как ультрацентрифугирование, фракционированное осаждение, диализ, электрофорез в ДСН-ПААГ и хроматография на колонках. Пригодные колонки включают (но не ограничены ими) ионообменные колонки с таким носителем, как ДЭАЭ-сефароза, колонки с реакционноспособным красителем, таким, как агароза с Cibacron желтым 3 (Cibacron- yellow 3 agarose), агароза с Cibacron голубым (Cibacron-blue agarose) и агароза с реакционноспособным красным 120 (Reactive red 120 agarose), и колонки для гель-фильтрации, такие, как Sephacryl S-1000. Содержание цитохрома Р450 в отдельных фракциях может быть определено на основе дифференциального спектра окиси углерода (СО-спектр). Определенная трудность при выделении Р450_ox, которая также возникает при количественной оценке Р450_ox, заключается в его совместной миграции с желтыми пигментами во время начальных стадий очистки, вместо связывания с ионообменной колонкой, которую, как правило, применяют для очистки ферментов Р450, таких, как, например, Р450_TYR. Присутствие желтых пигментов создает помехи связыванию Р450_ox с целым рядом различных носителей колонки и, таким образом, является основным препятствием для дальнейшей очистки. Кроме того, отделение Р450_ox от желтых пигментов можно осуществлять индуцируемым температурой распределением фаз с помощью Тритона Х-114. Этот способ был оптимизирован применительно к выделению Р450_ox и удалению желтых пигментов путем увеличения количества Тритона Х-114. При концентрации Тритона Х-114 6%, что в 6-10 раз превышает концентрацию, применяемую для других цитохромов Р450_ox, примерно 80% активности Р450_ox в результате распределения может быть обнаружено в прозрачной нижней фазе. Помимо удаления желтых пигментов, на этой стадии очистки также происходит некоторая очистка Р450. Однако, когда содержащую Р450_ox нижнюю фазу вносят на колонку с красителем Cibacron голубой, элюция в градиенте соли позволяет получить практически гомогенный Р450_ox, что подтверждается наличием основной полосы, окрашенной кумасси бриллиантовым голубым, с точной молекулярной массой 55 кДа в тех фракциях, которые при восстановлении проявили Р450_ox-активность.

Выделенный Р450_ox давал СО-спектр с пиком абсорбции при 450 нм, но относительно большая часть выделенного фермента присутствовала в денатурированной форме Р420. Количественному определению общего содержания и удельной активности Р450_ox на различных стадиях процесса выделения препятствовало постоянное превращение Р450_ox в денатурированную форму Р420. Кроме того, удельная активность Р450 зависит от ингибирующих воздействий различных применяемых детергентов. Таким образом, метод определения общего содержания Р450 во фракциях может рассматриваться как полуколичественный.

Очищенные протеины могут применяться для выработки антител, например, у мышей, коз, овец, кроликов или цыплят, в ответ на их инъекцию.

От 5 до 50 мкг протеина вводят несколько раз путем инъекции примерно с 14-дневными интервалами. В предпочтительном варианте осуществления изобретения инъецируют от 10 до 20 мкг 2-6 раз с 14-дневными интервалами. Инъекции могут быть сделаны с использованием адъювантов или без них. Иммуноглобулины, очищенные от антисывортки и селезенки, могут использоваться для слияния с гибридомой согласно методу, описанному в работе Hariow и Lane в "Antibodies A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988, включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Специфическое связывание антител с (цитохром Р450_II)-монооксигеназой может также использоваться при селекции растений с целью выявления растений, продуцирующих измененные количества (цитохром Р450)-монооксигеназ и, как следствие, измененные количества цианогенных гликозидов.

Методы получения библиотек кДНК растительной ткани подробно описаны у Sambrook и др. в "Molecular cloning: A Laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, при этом основные разделы этого руководства, касающиеся получения библиотек кДНК, включены в настоящее описание в качестве ссылки. Поли-(А+)-РНК выделяют из растительной ткани, которая обладает высокой активностью ферментной системы, ответственной за биосинтез цианогенных гликозидов. Эти ткани могут изменяться от одного вида растения к другому. Предпочтительной тканью для выделения поли-(А+)-РНК является ткань, выделенная из свежих проростков, собранных через 1-20 дней, предпочтительно через 2-10 дней и наиболее предпочтительно через 2-4 дня после прорастания. Полученные библиотеки кДНК могут зондироваться с помощью антител, специфически связывающихся с (цитохром Р450_II)-монооксигеназой, и могут быть выделены клоны, экспрессирующие монооксигеназу.

Альтернативный способ получения кДНК, кодирующей (цитохром Р450_II)-монооксигеназу, включает:

(а) выделение и солюбилизацию микросом из растительной ткани, продуцирующей цианогенные гликозиды,

(б) очистку (цитохром Р450_II)-монооксигеназы,

(в) получение полной или частичной последовательности протеина монооксигеназы,

(г) создание олигонуклеотидной последовательности специфичной ДНК, кодирующей 4-15 аминокислот указанной последовательности протеина монооксигеназы,

(д) зондирование указанными олигонуклеотидами или молекулами ДНК, полученными с помощью ПЦР-амплификации кДНК с использованием указанных олигонуклеотидов, библиотеки кДНК растительной ткани, продуцирующей цианогенные гликозиды, и

(е) выделение клонов, которые кодируют (цитохром Р450_II)-монооксигеназу.

Аминокислотные последовательности внутренних пептидов, которые образуются в результате расщепления протеазой, могут быть получены стандартными методами, такими, как расщепление по Эдману. Олигонуклеотиды, специфичные для ДНК, которая кодирует частичные последовательности протеинов монооксигеназ по изобретению, получают с помощью обратной относительно генетического кода трансляции частей последовательности протеина. Для обратной трансляции предпочтительны последовательности протеинов, кодируемые последовательностями ДНК, являющимися маловырожденными. Их длина состоавляет от 4 до 15, предпочтительно от 5 до 10 аминокислот. При необходимости кодоны, использующиеся в олигонуклеотидах, могут быть адаптированы к наиболее часто встречающемуся кодону растительного источника (Murray и др., Nucleic Acids Research 17: 477-498, 1989). Полученные нуклеотиды могут использоваться для зондирования библиотек кДНК согласно методу, описанному у Sambrook и др. ("Molecular cloning: A Laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), для клонов, которые способны образовывать парные основания с указанными олигонуклеотидами. В альтернативном варианте олигонуклеотиды могут использоваться в полимеразной цепной реакции (ПЦР), методология которой хорошо известна в данной области, с использованием растительной кДНК в качестве матрицы для амплификации. В этом случае полученные продукты амплификации используют для зондирования библиотек кДНК. Выделяют клоны, кодирующие (цитохром Р450_II)-монооксигеназы.

Альтернативный метод клонирования генов основан на конструировании библиотеки генов, состоящей из векторов экспрессии. Согласно этому методу, аналогично описанным выше методам, сначала из клетки или ткани, способной экспрессировать Р450_II-монооксигеназу, выделяют геномную ДНК, предпочтительно, однако, кДНК, а затем осуществляют сплайсинг в пригодном векторе экспрессии. Полученные таким путем библиотеки генов могут быть подвергнуты скринингу с использованием соответствующих методов, например, с помощью антител. Отбирают клоны, которые включают в качестве вставки требуемый ген или по крайней мере часть гена.

В альтернативном варианте молекулы кДНК, кодирующие (цитохром Р450)-монооксигеназу, которая катализирует превращение альдоксима в нитрил и превращение этого нитрила в соответствующий циангидрин, могут быть получены путем

(а) создания вырожденных олигонуклеоидов, соответствующих 3-10 аминокислотам консервативных областей цитохромов типа А,

(б) использования вырожденных олигонуклеотидов для амплификации одного или нескольких специфичных для цитохрома фрагментов ДНК с помощью полимеразной цепной реакции,

(в) скрининга библиотеки кДНК с помощью специфичных для цитохрома фрагментов с получением полноразмерной кДНК,

(г) экспрессии полноразмерной кДНК в микроорганизме-хозяине,

(д) идентификации хозяев, экспрессирующих (цитохром Р450)-монооксигеназу, которая катализирует превращение альдоксима в нитрил и превращение этого нитрила в соответствующий циангидрин, и

(е) выделения клонированной ДНК из хозяина.

Общая ДНК из библиотеки ДНК, предпочтительно из библиотеки кДНК, может использоваться в качестве матрицы в ПЦР с одним или с несколькими праймерами, характерными для консервативных областей цитохромов типа А (Durst и др., Grug Metabolism and Drug Interactions 12: 189-206, 1995), которые, вероятно, являются производными общего для растительного цитохрома Р450 прародителя. На основе сравнительного анализа множества последовательностей цитохромов Р450 типа А на аминокислотном уровне могут быть выделены три высококонсервативные области: область 1 (V/I)KEX(L/F)R, область 2 FXPERF и область 3 PFGXGRRXCXG. Могут быть созданы вырожденные инозин (I)-содержащие праймеры, каждый из которых перекрывает от 3 до 10, предпочтительно примерно 5 или 6 аминокислот, двух областей соответственно. ПЦР проводят, например, в виде трех последовательных серий реакций. В первой серии реакций с помощью праймера, перекрывающего консенсусную область FXPERF, и стандартного праймера фага Т7, перекрывающего промотор Т7, в библиотеке векторов амплифицируют кДНК, происходящие из мРНК, кодирующих цитохромы Р450 типа А. Во второй серии ПЦР с помощью праймеров, перекрывающих две консенсусные области, и с использованием в качестве матрицы амплифицированной ДНК, полученной в первой серии ПЦР, предпочтительно амплифицируют фрагмент размером 100 пар оснований, который затем встраивают в pBluescript и секвенируют. Специфичные для гена праймеры создают на основе полученной последовательности ДНК. Их используют в третьей серии ПЦР в комбинации с поли-А-хвостом (праймер dT+V) и ДНК, полученной в первой серии ПЦР, в качестве матрицы для амплификации фрагмента ДНК размером примерно 500 пар оснований, который может применяться в качестве специфичного для гена зонда для выделения полноразмерных кДНК. Этот подход, основанный на использовании серий ПЦР, не является уникальным для выделения Р450_ox, а он является общим для выделения цитохромов Р450 типа А. Полученные цитохромы Р450 типа А необходимо подвергать гетерологичной экспрессии для определения их функции.

Клоны кДНК или ПЦР-продукты, полученные согласно описанному выше способу, или их фрагменты могут использоваться в качестве зонда для гибридизации в процессе идентификации дополнительных последовательностей ДНК, кодирующих продукт, представляющий собой протеин, обладающий активностью Р450_II-зависимой монооксигеназы, из гомологичного или гетерологичного организма-источника, такого, как грибы или гетерологичные растения. Пригодным источником является ткань растений, содержащих цианогенные гликозиды.

Такие клоны или ПЦР-продукты также могут применяться в качестве RFLP-маркеров для определения, например, локализации гена (цитохром Р450)-монооксигеназы либо близко сцепленного с ним признака в растительном геноме или для селекции с помощью маркеров (ЕР-А-306139, WO 89/07647).

С помощью описанных выше методов возможно выделять различные гены, которые кодируют Р450_II-монооксигеназу. Эти гены могут применяться в способе получения очищенной рекомбинантной (цитохром Р450_II)-монооксигеназы, которая катализирует превращение альдоксима в нитрил и превращение этого нитрила в соответствующий циангид