Полинуклеотид с укороченной цепью и способ его получения

Полинуклеотид с укороченной цепью и способ его получения

Реферат

 

В настоящем изобретении предлагается полинуклеотид со средней длиной цепи от 0,1 до 1 тыс. оснований, в котором доля 2’-5’ фосфодиэфирных связей составляет от 0,1 до 3% от общего числа фосфодиэфирных связей, или его соль. Полинуклеотид представляет собой полиинозиновую кислоту (поли(I)), полицитидиловую кислоту (поли(С)), полиадениловую кислоту (поли(А)) или полиуридиловую кислоту (поли(U)). Способ получения полинуклеотида включает гидролиз в растворе при pH от 7 до 10 и температуре от 20 до 110С или обработку фосфодиэстеразой при pH от 4 до 9 и температуре от 20 до 60С. Также изобретение относится к фармацевтической композиции, представляющей собой интерферон-индуцирующий агент, иммуноактивирующий агент и др., включающей указанный полинуклеотид. 5 с. и 3 з.п. ф-лы, 8 табл.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к полинуклеотиду с укороченной цепью, в частности, применимому в качестве лекарственного средства, а также к способу его получения. Более конкретно, настоящее изобретение относится к синтетическому полинуклеотиду с укороченной цепью или его солям, в которых доля 2'-5' фосфодиэфирной связи составляет до 3% от всех сложных фосфодиэфирных связей, т.е. количество фосфатных групп, перегруппированных из положения 3' в положение 2', в отношении ко всем фосфатным группам сложных фосфодиэфирных связей (степень перегруппировки фосфатов) составляет до 3%, а также к способу его получения.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Полинуклеотиды, типичными представителями которых является полиинозиновая - полицитидиловая кислота, т.е. поли(I)-поли(С), хорошо известны в данной области; также была исследована возможность их применения в качестве лекарственного средства для лечения гепатита или рака в связи с их интерферон-индуцирующим действием, иммуноактивирующим действием и т.п.

Фармакологическое действие данных полинуклеотидов имеет высокую корреляцию с длиной цепи: чем длиннее цепь, тем сильнее интерферон-индуцирующее действие и т.п. С другой стороны, чем длиннее цепь, тем сильнее проявляемая токсичность.

В последнее время для снижения токсичности и сохранения при этом полезного фармакологического действия полинуклеотида применялся способ, в соответствии с которым синтетический полинуклеотид, имеющий относительно короткую цепь, получаемую в результате гидролиза полинуклеотида, заключен в носителе, таком как катионная липосома, эффективно вводящем лекарственный препарат в клетку (например, РСТ WО 99/20283, РСТ WО 99/48531).

Известно, что при гидролизе полинукдеотида с целью укорачивания длины цепи, как описано выше, некоторые фосфатные группы вызывают внутримолекулярную перегруппировку из положения 3' в положение 2' в результате действия механизма, называемого "псевдоротацией", с одновременным укорачиванием цепи (см., например, "Protein Nucleic acid Enzyme", Vol. 40, No.10, pp. 1323 to 1332 (1995)). В результате часть 3'-5' фосфодиэфирных связей в молекуле полинуклеотида с укороченной цепью оказываются замещенными 2'-5' фосфодиэфирными связями. До сих пор было неизвестно, оказывает ли подобное явление перегруппировки фосфата влияние на фармакологическое действие,

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является разработка, во-первых, полинуклеотида с укороченной цепью или его соли, а также двухнитевого полинуклеотида с укороченной цепью или его соли, которые являются безопасными и эффективными лекарственными средствами".

Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования и обнаружили, что вышеуказанные проблемы могут быть решены путем применения полинуклеотида с укороченной цепью, который содержит 2'-5' фосфодиэфирную связь, получаемую главным образом в результате реакции укорочения цепи, причем только в определенной пропорции (доле от общего числа таких связей) или менее, или его соли, осуществив тем самым настоящее изобретение.

В одном из аспектов настоящего изобретения раскрывается полинуклеотид с укороченной цепью, содержащий 2'-5' фосфодиэфирную связь в количестве, составляющем 3% и менее, предпочтительно 2% и менее от всех фосфодиэфирных связей, либо его соль.

В качестве варианта осуществления настоящее изобретение также включает двухнитевой полинуклеотид с укороченной цепью или его соль, образуемый двумя полинуклеотидами с укороченной цепью или их солями, способными образовывать двойную нить, которые включены в число вышеописанных полинуклеотидов с укороченной цепью, содержащих 2'-5' фосфодиэфирную связь в количестве, составляющем 3% и менее, предпочтительно 2% и менее, от всех фосфодиэфирных связей. Далее, настоящее изобретение также включает композицию, содержащую комплекс, образуемый носителем, эффективно вводящим лекарственный препарат в клетку, и вышеописанным полинуклеотидом с укороченной цепью или его солью, в которых содержание 2'-5' фосфодиэфирной связи составляет 3% и менее от всех фосфодиэфирных связей, либо двухнитевым полинуклеотидом с укороченной цепью или его солью, образуемым двумя полинуклеотидами с укороченной цепью или их солями, способными образовывать двойную нить, в качестве существенного ингредиента.

Полинуклеотид, применяемый в соответствии с данным изобретением, представляет собой соединение, включающее по меньшей мере около 20 нуклеотидов, образуемое в результате линейной полимеризации через фосфодиэфирную связь, и включает синтетические и натуральные соединения. Конкретные примеры включают полиинозиновую кислоту (обозначаемую поли(I)) или ее аналог, полицитидиловую кислоту (обозначаемую поли(С)) или ее аналог, полиадениловую кислоту (обозначаемую поли(А)) или ее аналог и полиуридиловую кислоту (обозначаемую поли(и) или ее аналог.

Аналогом полиинозиновой кислоты является гомополимер, в котором вся инозиновая кислота или ее часть химически модифицированы, либо сополимер инозиновой кислоты с другим нуклеотидом, например, поли(7-деазаинозиновая кислота) и поли(2-азидоинозиновая кислота). Аналогом полицитидиловой кислоты является гомополимер, в котором вся цитидиловая кислота или ее часть химически модифицированы, либо сополимер цитидиловой кислоты с другим нуклеотидом, например, поли(5-бромцитидиловая кислота), поли(2-тиоцитидиловая кислота), поли(цитидин-5'-тиофосфорная кислота), поли(цитидиловая кислота, уридиловая кислота), поли(цитидиловая кислота, 4-тиоуридиловая кислота) и поли(1-винилцитидиловая кислота). Аналоги полиадениловой и полиуридиловой кислот имеют такие же определения. Среди них применимы в данном изобретении полиинозиновая и полицитидиловая кислоты.

Средняя длина цепи полинуклеотида с укороченной цепью в соответствии с настоящим изобретением составляет от 0,1 до 1 тысячи оснований. Термин "основание" означает количество оснований, а "1 тысяча оснований" означает 1000 оснований; в дальнейшем "основание(я)" обозначаются сокращением "осн.". Средняя длина цепи предпочтительно составляет от 200 до 800 осн., более предпочтительно от 300 до 600 осн. Средняя длина цепи может быть легко определена, например, гель-проникающей хроматографией (в дальнейшем обозначаемой "GPC"), как описано ниже в эксперименте 5.

В полинуклеотиде с укороченной цепью в соответствии с настоящим изобретением степень перегруппировки фосфатов составляет 3% и менее, предпочтительно 2% и менее, или от 0,1 до 2%, более предпочтительно 1% и менее или от 0,1 до 1%.

Перегруппировка фосфатной группы из положения 3' в положение 2' в полинуклеотиде может быть легко подтверждена, например, способом, описанным в эксперименте 6. А именно, полинуклеотид разлагают нуклеазой P₁, которая избирательно гидролизует 3'-5' фосфодиэфирную связь до уровня нуклеозида, нуклетида и олигонуклеотида, а затем обрабатывают щелочной фосфатазой, избирательно гидролизующей концевую фосфатную группу, превращая целые нуклеотиды в нуклеозиды. С другой стороны, олигонуклеотид, имеющий 2'-5' фосфодиэфирную связь, которая не гидролизуется нуклеазой P₁, не разлагается до нуклеозида даже в результате обработки щелочной фосфатазой, потому что внутримолекулярная 2'-5' фосфодиэфирная связь не гидролизуется. Степень перегруппировки фосфатов может быть рассчитана в результате определения нуклеозидов и олигонуклеотидов (большую часть из них составляют димеры) жидкостной хроматографией и т.п.

Примеры пары полинуклеотидов с укороченной цепью, способной образовывать двойную нить в соответствии с настоящим изобретением, включают полиинозиновую и полицитидиловую кислоты, полиадениловую и полиуридиловую кислоты, аналог полиинозиновой кислоты и полицитидиловую кислоту, полиинозиновую кислоту и аналог полицитидиловой кислоты, аналоги полиинозиновой и полицитидиловой кислот, аналог полиадениловой кислоты и полиуридиловую кислоту, полиадениловую кислоту и аналог полиуридиловой кислоты, а также аналоги полиадениловой и полиуридиловой кислот. Следовательно, примеры двухнитевого полинуклеотида с укороченной цепью, образуемого между двумя полинуклеотидами с укороченной цепью, способными образовывать двойную нить, включают полиинозиновую-полицитидиловую кислоту, полиадениловую-полиуридиловую кислоту, полиинозиновый аналог - полицитидиловую кислоту, аналог полиинозиновой-полицитидиловой кислот, полиинозиновый аналог - аналог полицитидидовой кислоты, полиадениловый аналог - полиуридиловую кислоту, аналог полиадениловой-полиуридиловой кислот, а также полиадениловый аналог - аналог полиуридиловой кислоты. Для целей настоящего изобретения полиинозиновая-полицитидиловая кислота является предпочтительным двухнитевым полинуклеотидом с укороченной цепью.

Разумно считать, что средняя длина цепи вышеописанного двухнитевого полинуклеотида с укороченной цепью соответствует средней длине цепи целых полинуклеотидов с укороченной цепью. Соответственно, последняя может быть использована как показатель кажущейся средней длины цепи двухнитевого полинуклеотида с укороченной цепью, выраженной через количество пар оснований. Следовательно, средняя длина цепи вышеописанного двухнитевого полинуклеотида с укороченной цепью составляет от 0,1 до 1 тыс. пар осн. Термин "пары оснований" означает количество пар оснований, а "1 тыс. пар оснований" соответствует 1000 пар оснований.

Средняя длина цепи двухнитевого полинуклеотида предпочтительно составляет от 200 до 800 пар осн., более предпочтительно от 300 до 600 пар осн.

Соль полинуклеотида с укороченной цепью и соль двухнитевого полинуклеотида с укороченной цепью в соответствии с настоящим изобретением конкретно не ограничены, если только они являются фармацевтически приемлемыми, и их примеры включают соли натрия и калия.

Примерами носителей, эффективно вводящих лекарственный препарат в клетку, являются носители, имеющие положительный заряд; их конкретные примеры включают катионные полимеры, такие как и поли-L-лизин, катионные липосомы, такие как Lipofectin®, Lipofectamine®, Lipofectace®, DMRIE-C® и т.д., а также носители такого вида, как и носители, описанные в РСТ WО 94/19314. Носители для переноса лекарственного препарата получают, например, из 2-О-(2-диэтиламиноэтил)карбамоил-1,3-О-диолеоилглицерина формулы (I):

и фосфолипида (например, фосфатидилхолин, фосфатидил-этаноламин, лецитин желтка, лецитин соевых бобов, их гидрированные фосфолипиды) в качестве существенных структурных компонентов.

Полагают, что вышеописанная катионная липосома имеет положительный заряд и образует электростатический комплекс с отрицательно заряженным полинуклеотидом или олигонуклеотидом. Когда полученный комплекс сливается с клеточной мембраной, то одновременно в клетку вводится полинуклеотид или олигонуклеотид. Такой комплекс иногда называют "липоплекс".

Способ получения полинуклеотида с укороченной цепью в соответствии с настоящим изобретением далее описан подробно. Полинуклеотид с укороченной цепью в соответствии с настоящим изобретением может быть получен, например, путем гидролиза исходного полинуклеотида в растворе при рН в подходящем интервале и нагревании в подходящем температурном интервале. Подходящий рН водного раствора в данной процедуре является основным, т.е. рН составляет 7 и более, предпочтительно от 7 до 10. Учитывая скорость реакции по укорачиванию цепи и устойчивость остатка основания, более предпочтительным рН раствора является рН между 8 и 9. Подходящая температура реакции составляет от 20 до 110С, предпочтительно от 40 до 100С, с точки зрения устойчивости основания. Однако с учетом достаточной скорости гидролиза и устойчивости остатка основания более предпочтительной температурой реакции является температура между 50 и 90С.

Более конкретно, например, полинуклеотид растворяют в воде, такой как вода для инъекций, дистиллированная вода для инъекций или физиологический раствор, при перемешивании и рН раствора доводят до 8-9 буфером или регулятором рН. Если гидролиз осуществляют, нагревая раствор при температуре реакции от 50 до 90С в течение 0,5-60 часов, контролируя среднюю длину цепи и степень перегруппировки фосфата, то может быть получен полинуклеотид с укороченной цепью, содержащий меньше перегруппированных фосфатных групп и имеющий среднюю длину цепи между 0,1 и 1 тыс. осн.

Для регулировки рН могут быть использованы фармацевтически приемлемые добавки, такие как буфер или регулятор рН. Конкретные примеры включают такие буферы и регуляторы рН, как аминоуксусная кислота (синоним: глицин), трис(гидроксиметил)аминометан (синоним: трис), карбонат натрия, двууглекислый натрий (синоним: бикарбонат натрия), гидроокись натрия, диэтаноламин, триэтаноламин и т.п. Вид, сочетание, концентрация и т.п. указанных добавок не ограничены.

Мономеры и ненужные соли, примеси, побочные продукты, получаемые во время реакции по сокращению цепи, и т.п. могут быть удалены из системы посредством диализа или обработки реакционного раствора активированным углем.

Полинуклеотид с укороченной цепью в соответствии с настоящим изобретением может быть также получен путем обработки исходного полинуклеотида в растворе фосфодиэстеразой в подходящем интервале рН при нагревании в подходящем интервале температур. Подходящий рН водного раствора в данной процедуре составляет между 4 и 9, предпочтительно между 5 и 8. С учетом перегруппировки фосфата во время реакции по укорачиванию цепи, более предпочтительный рН раствора составляет между 6 и 7. Подходящая температура реакции находится в интервале от 20 до 60С, предпочтительно от 25 до 50С, с точки зрения характеристик фермента. Однако более предпочтительной температурой реакции является температура между 30 и 40С, с учетом необходимости достаточной скорости гидролиза, избежания влияния неферментного гидролиза, такого как гидролиз под действием тепла, и предотвращения перегруппировки фосфатных групп.

Более конкретно, например, полинуклеотид растворяют в воде, такой как вода для инъекций, дистиллированная вода для инъекций или физиологический раствор, при перемешивании. рН раствора, необязательно, регулируют, добавляя при необходимости буфер или регулятор рН. К раствору добавляют фосфодиэстеразу, такую как нуклеаза P₁, а полученную смесь подвергают реакции по укорачиванию цепи при температуре от 30 до 40С, контролируя среднюю длину цепи и степень перегруппировки фосфата для получения нуклеотида с укороченной цепью, содержащего меньше перегруппированных фосфатных групп и имеющего среднюю длину цепи от 0,1 до 1 тыс. осн. Концентрация фермента или условия реакции не ограничены.

Мономеры и ненужные соли, примеси, побочные продукты, получаемые во время реакции по укорачиванию цепи, и т.п. могут быть удалены из системы в результате обработки реакционного раствора посредством способа осаждения этанолом, диализа или обработки активированным углем.

Полинуклеотид с укороченной цепью может быть очищен подходящим способом разделения с мембраной. Например, для фракционирования полинуклеотидов, имеющих среднюю длину цепи от 0,1 до 1 тыс. осн. в соответствии с настоящим изобретением, может быть использована сверхтонкая мембранная фильтрация. Качество материала или размер пор мембраны не ограничены.

В качестве исходного материала могут быть использованы любые полинуклеотиды, независимо от их происхождения, например, натуральные или синтетические, вида соли или длины цепи. Примерами натуральных полинуклеотидов являются т РНК и полиадениловая кислота. С другой стороны, синтетические полинуклеотиды могут быть получены из синтетазы РНК, например полинуклеотидной фосфорилазы или ее иммобилизованных ферментов. Кроме того, в качестве исходных материалов могут быть также использованы натрий полиинозинат, натрий полицитидилат и т.д., выпускаемые промышленностью как интерферон-индуцирующие реагенты.

Двухнитевой полинуклеотид с укороченной цепью, в соответствии с настоящим изобретением может быть получен путем смешивания в подходящем растворе (например, буфер из 10 мМ трис-соляной кислоты (буфер трис-HCl, рН 7), содержащий 0,15 М NaCl) двух полинуклеотидов с укороченной цепью, способных образовывать двойную нить среди полинуклеотидов с укороченной цепью, содержащих меньше перегруппированных фосфатных групп, как описано выше, либо, альтернативно, путем предоставления им возможности гибридизироваться обычным образом. В качестве способа гибридизации, например, может быть использован способ, в соответствии с которым раствор, содержащий два полинуклеотида с укороченной цепью, способных образовывать двойную нить, нагревают до 70-80°С, а затем постепенно охлаждают.

Полинуклеотид с укороченной цепью, содержащий меньше перегруппированных фосфатных групп, или двухнитевой полинуклеотид с укороченной цепью, содержащий меньше перегруппированных фосфатных групп, полученный как описано выше, может быть подвергнут лиофилизации с получением лиофилизированного продукта, который может храниться в течение длительного времени. Лиофилизация может быть осуществлена известным способом. Например, лиофилизированный продукт может быть получен следующим образом: раствор полинуклеотида с укороченной цепью, полученного в вышеуказанных условиях, стерилизуют фильтрацией, затем фильтрат выливают на металлическую подкладку, предварительно стерилизованную сухим теплом, предварительное замораживание осуществляют при полочной температуре от -40 до -20°С в течение около 1-4 часов, а первичную сушку проводят перед вторичной сушкой, осуществляемой при пониженном давлении и полочной температуре от 15 до 30°С (в течение приблизительно от 10 до 50 часов). В целом, такой лиофилизированный продукт может быть использован после восстановления (повторного растворения) добавлением соответствующего раствора, такого как вода для инъекций, дистиллированная вода для инъекций, физиологический раствор, раствор мальтозы, раствор глюкозы и т.п.

Композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть получена способом, подобным обычно применяемым для получения липосомы способом, при этом указанная композиция включает комплекс (в дальнейшем называемый данный комплекс), образуемый носителем, эффективно вводящим лекарственный препарат в клетку, и двумя полинуклеотидами с укороченной цепью, содержащим 2'-5' фосфодиэфирные связи в количестве 3% и менее от всех фосфодиэфирных связей, и способным образовывать двойную нить, или двухнитевым полинуклеотидом с укороченной цепью, образуемым между двумя указанными полинуклеотидами с укороченной цепью, способными образовывать двойную нить, в качестве существенного ингредиента. Конкретно, композиция для инъекций в соответствии с настоящим изобретением может быть получена в результате проведения следующих стадий, включающих добавление воды (вода для инъекций, дистиллированная вода для инъекций, физиологический раствор и т.п.) к носителю, эффективно вводящему лекарственный препарат в клетку, например, катионной липосоме или ее исходному материалу (к примеру, производное глицерина, такое как 2-О-(2-диэтиламиноэтил)карбамоил-1,3-О-диолеоилглицерин и т.п., и фосфолипид); перемешивание смеси; обработку смеси в подходящем устройстве для диспергирования, например, в гомосмесителе, гомогенизаторе, ультразвуковом устройстве для диспергирования, ультразвуковом гомогенизаторе, устройстве для диспергирования и эмульгирования под высоким давлением, Microfluidizer (торговое название), Nanomizer (торговое название), De Bee 2000 (торговое название), Ultimizer (торговое название) или гомогенизаторе высокого давления типа Manton-Gaulin; добавление полинуклеотида с укороченной цепью или двухнитевого полинуклеотида с укороченной цепью в соответствии с настоящим изобретением к полученной липидной дисперсии; повторное диспергирование смеси путем ее обработки в подходящем диспергирующем устройстве; и затем стерилизация полученной композиции фильтрацией и т.п. В процессе получения на соответствующей стадии могут быть добавлены любые другие добавки без каких-либо конкретных ограничений. Альтернативно, композиция в соответствии с настоящим изобретением, содержащая данный комплекс, может бить получена следующим образом. Таким образом, вначале получают смесь носителя, эффективно вводящего лекарственный препарат в клетку, например, катионной липосомы или ее исходных материалов (к примеру, производное глицерина, такое как 2-О-(2-диэтиламиноэтил)карбамоил-1,3-О-диолеоилглицерин и т.п., и фосфолипид) и полинуклеотида с укороченной цепью или двухнитевого полинуклеотида с укороченной цепью в соответствии с настоящим изобретением. К предварительно приготовленной смеси добавляют воду, одновременно проводя обработку дисперсии. Кроме того, композиция в соответствии с настоящим изобретением также может быть получена с проведением стадии диспергирования подходящего сырья во время осуществления вышеописанных способов.

Полученная композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть лиофилизирована, при этом получают лиофилизированный препарат композиции в соответствии с настоящим изобретением, имеющий длительный период хранения. Лиофилизация может быть осуществлена с применением известного способа. Например, во флакон помещают определенное количество композиции в соответствии с настоящим изобретением, полученной в результате вышеупомянутого диспергирования и стерилизации фильтрованием. Лиофилизацию осуществляют, подвергая флакон предварительному замораживанию при температуре приблизительно от -40 до -20С в течение приблизительно 2-3 часов, предварительной сушке при температуре приблизительно от 0 до 10С при пониженном давлении, и вторичной сушке при температуре приблизительно от 15 до 25С при пониженном давлении. В целом, после заполнения внутреннего пространства инертным газом, таким как азот, пробирку закупоривают, получая лиофилизированный препарат композиции в соответствии с настоящим изобретением.

Лиофилизированный препарат композиции в соответствии с настоящим изобретением может быть использован после восстановления добавлением соответствующего раствора перед его применением. Примеры такого раствора для восстановления включают воду для инъекций, дистиллированную воду для инъекций, физиологический раствор, раствор мальтозы, раствор глюкозы, другие общие инфузионные растворы и т.п.

Композиция в соответствии с настоящим изобретением и ее лиофилизированный препарат могут быть использованы в форме фармацевтического препарата в качестве лекарственного средства. Композиция в соответствии с настоящим изобретением и лиофилизированный препарат в качестве лекарственного средства проявляют фармакологическую активность благодаря активному полинуклеотиду. Конкретные примеры лекарственного средства включают интерферон-индуцирующие агенты, иммуноактивирующие агены, внутриклеточные нуклеазоактивирующие агенты, средства для лечения или предупреждения рака и гепатита.

НАИЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следующие примеры и эксперименты далее подробно иллюстрируют настоящее изобретение. Настоящее изобретение никоим образом не ограничивается данными примерами и экспериментами.

СПРАВОЧНЫЙ ПРИМЕР 1

К 8 г тринатрий инозин-5'-дифосфата и 1 г хлорида магния добавляют 500 мл 0,1 М буфера глицин-гидроокись натрия, и смесь перемешивают до их растворения. Доведя рН до 9,3 добавлением 6 н. гидроокиси натрия, смеси дают возможность отстояться в течение 1 часа при 38С. К смеси добавляют 1 мл раствора полинуклеотид-фосфорилазы, и реакцию проводят при 38С в течение 18 часов. Погасив реакцию добавлением 25 мл 0,2 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК), добавляют 10 мл насыщенного солевого раствора и 500 мл абсолютного этанола для осаждения полиинозиновой кислоты (1973 осн.).

СПРАВОЧНЫЙ ПРИМЕР 2

К 10 г тринатрий цитидин-5'-дифосфата и 3 г хлорида марганца добавляют около 1 л 0,2 М буфера бикарбонат натрия-гидроокись натрия, и смесь перемешивают до растворения. Доведя рН до 9,8 добавлением 6 н. гидроокиси натрия, смеси дают возможность отстояться в течение 1 часа при 36С. К смеси добавляют 2 мл очищенного раствора полинуклеотид-фосфорилазы, и реакцию проводят при 36С в течение 24 часов. Реакцию гасят, добавляя 50 мл 0,2 М ЭДТА. Затем к смеси добавляют 20 мл насыщенного солевого раствора и 1 л абсолютного этанола для осаждения полицитидиловой кислоты (3300 осн.).

ПРИМЕР 1

Полиинозиновую кислоту, полученную в ссылочном примере 1, отделяют центрифугированием. Осадок повторно растворяют в 500 мл воды для инъекций и подвергают диализу. После диализа внутренний раствор обрабатывают активированным углем и фильтруют с целью удаления последнего. К фильтрату добавляют 6 н гидроокись натрия, доводя рН до 8,5. Гидролиз осуществляют нагреванием при 70°С в течение 8 часов с целью укорачивания цепи полиинозиновой кислоты. Полученный раствор полинуклеотида с укороченной цепью обрабатывают активированным углем, фильтруют, удаляя последний, и подвергают диализу. Внутренний раствор после диализа стерилизуют фильтрацией. Фильтрат подвергают лиофилизации обычным способом, получая 1,9 г лиофилизированного продукта, а именно полинуклеотида с укороченной цепью (полиинозинат, натриевая соль) в соответствии с настоящим изобретением с меньшим количеством перегруппированных фосфатных групп (степень перегруппировки фосфата: 0,2%, средняя длина цепи: 360 осн.).

ПРИМЕР 2

Полицитидиловую кислоту, полученную в ссылочном примере 2, отделяют центрифугованием. Осадок повторно растворяют в 500 мл воды для инъекций и подвергают диализу. Внутренний раствор после диализа обрабатывают активированным углем и фильтруют, удаляя последний. К фильтрату добавляют 6 н. гидроокись натрия, доводя рН до 9,0. Гидролиз осуществляют нагреванием при 80С в течение 4 часов с целью укорачивания цепи полицитидиловой кислоты. Полученный раствор полинуклеотида с укороченной цепью обрабатывают активированным углем, фильтруют, удаляя последний, и подвергают раствор диализу. Внутренний раствор после диализа стерилизуют фильтрацией. Фильтрат подвергают лиофилизации обычным способом, получая 2,7 г лиофилизированного продукта полинуклеотида с укороченной цепью (полицитидилат, натриевая соль) в соответствии с настоящим изобретением с меньшим количеством перегруппированных фосфатных групп (степень перегруппировки фосфата: 0,1%, средняя длина цепи: 318 осн.).

ПРИМЕР 3

К 1 г полиаденилата натрия (S_20'w (константа седиментации): 7,2, Seikagaku Corporation) добавляют 200 мл 0,1 М буфера трис-HCl (рН 8,0) и смесь перемешивают до растворения. Гидролиз осуществляют нагреванием при 60С в течение 48 часов с целью укорачивания цепи полиадениловой кислоты, контролируя среднюю длину цепи в соответствии со способом, описанным в эксперименте 5. Раствор полинуклеотида с укороченной цепью подвергают диализу. Внутренний раствор после диализа подвергают лиофилизации обычным способом, получая 0,3 г лиофилизированного продукта полинуклеотида с укороченной цепью (полиаденилат, натриевая соль) в соответствии с настоящим изобретением с меньшим количеством перегруппированных фосфатных групп (степень перегруппировки фосфата: 1,9%, средняя длина цепи: 154 осн.).

ПРИМЕР 4

К 1 г полиуридилата натрия (S_20'w (константа седиментации): 6,5, Seikagaku Corporation) добавляют 200 мл 0,2 М буфера глицин-NaOH (рН 9,0) и смесь перемешивают до растворения. Гидролиз осуществляют нагреванием при 60С в течение 25 часов с целью укорачивания цепи полиадениловой кислоты, контролируя среднюю длину цепи в соответствии со способом, описанным в эксперименте 5. Полученный раствор полинуклеотида с укороченной цепью подвергают диализу. Внутренний раствор после диализа подвергают лиофилизации обычным способом, получая 0,2 г лиофилизированного продукта полинуклеотида с укороченной цепью (полиуридилат, натриевая соль) в соответствии с настоящим изобретением с меньшим количеством перегруппированных фосфатных групп (степень перегруппировки фосфата: 1,2%, средняя длина цепи: 108 осн.).

ПРИМЕР 5

К 250 мг полиинозината натрия (S_20'w (константа седиментации): 8,8, Yamasa Corporation) добавляют 50 мл 0,1 М буфера трис-HCl (рН 8,0) и смесь перемешивают до растворения. Раствор нагревают при температуре от 50 до 120С, подходящей для укорачивания цепи. Отбирают пробы подиинозиновых кислот, имеющих произвольную длину цепи, контролируя среднюю молекулярную длину способом, описанным в эксперименте 5. Результаты представлены в таблице 1.

Полученные растворы образцов подвергают диализу и лиофилизируют обычным способом, получая лиофилизированные продукты.

ПРИМЕР 6

К 250 мг полицитидилата натрия (S°_20'w (константа седиментации): 8,6, Yamasa Corporation) добавляют 50 мл 0,1 М буфера трис-HCl (рН 9,0) и смесь перемешивают до растворения. Раствор нагревают при температуре от 55 до 120°С, подходящей для укорачивания цепи. Отбирают пробы полицитидиловых кислот, имеющих произвольную длину цепи, контролируя среднюю молекулярную длину способом, описанным в эксперименте 5. Результаты представлены в таблице 2. Полученные растворы образцов подвергают диализу и лиофилизируют обычным способом, получая лиофилизированные продукты.

Из результатов, полученных в примерах 5 и 6, очевидно, что в процессе по укорачиванию цепи выпускаемых промышленностью полиинозината или полицитидилата натрия достаточный гидролиз не может быть осуществлен при укорачивании цепи при 55°С и ниже. В результате этого средняя длина цепи превышает 1 тыс. осн. даже после реакции по укорачиванию цепи продолжительностью около 50 часов. С другой стороны, в образцах, в которых укорачивание цепи проводится при 120 или 90°С, контроль над укорачиванием цепи трудноосуществим из-за слишком высокой скорости гидролиза. В частности, в образце, укорачивание цепи которого осуществляют при 120°С, цепь слишком укорачивается почти до уровня олигонуклеотида, даже после 1-1,5 часов укорачивания цепи. В данном образце степень перегруппировки фосфата является высокой, а также наблюдается разложение остатка основания.

ПРИМЕР 7

100 мг полиаденилата натрия (S_20'w (константа седиментации): 7,2, Seikagaku Corporation) растворяют в 100 мл 0,1 М буфера трис-НСl (рН 7,0). К раствору добавляют нуклеазу P₁ (получена из Penicillium citrinum, Seikagaku Corporation). Смесь инкубируют при 25С в течение 3 часов, контролируя среднюю длину цепи в соответствии со способом, описанным в эксперименте 5, чтобы укоротить цепь полиадениловой кислоты (степень перегруппировки фосфата: 0,1%, средняя длина цепи: 287 осн.).

ПРИМЕР 8

К 1 г тринатрий уридин-5'-дифосфата и 0,3 г хлорида магния добавляют 100 мл 0,2 М буфера бикарбонат натрия-гидроокись натрия и смесь перемешивают до растворения. Доведя рН до 9,5 1 н. гидроокисью натрия, добавляют 0,2 мл фосфорилазы полинуклеотида. Затем смеси дают возможность взаимодействовать в течение 10 часов при 25С, контролируя среднюю длину цепи в соответствии со способом, описанным в эксперименте 5. После гашения реакции добавлением 5 мл 0,2 М ЭДТК добавляют 2 мл насыщенного солевого раствора и 100 мл этанола с целью осаждения полиуридиловой кислоты (549 осн.) Полиуридиловую кислоту отделяют на центрифуге. Осадок повторно растворяют в 50 мл воды для инъекций и подвергают диализу. рН внутреннего раствора диализа доводят до 8,5 1 н. гидроокисью натрия и подвергают его гидролизу при 80С в течение 30 минут, регулируя тем самым длину цепи полиуридиловой кислоты. Полученный раствор полинуклеотида с укороченной цепью подвергают мембранному разделению сверхтонкой фильтрацией, регулируя распределение длины цепи, а также удаляя ненужную соль, побочные продукты во время реакции по укорачиванию цепи и т.п. (степень перегруппировки фосфата: 0,1%, средняя длина цепи: 485 осн.).

ПРИМЕР 9

К 1 г 2-О-(2-диэтиламиноэтил)карбамоил-1,3-О-диолеоил-глицерина и 2 г очищенного лецитина из желтка добавляют 40 г мальтозы, растворенной в 100 мл воды для инъекций. Смесь перемешивают и диспергируют в течение 5 минут с помощью гомогенизатора, получая сырую дисперсию катионной липосомы (носитель). Сырую дисперсию далее диспергируют в течение 1 часа при помощи небольшого лабораторного эмульгирующего и диспергирующего устройства, получая раствор катионных липосом. К данному раствору постепенно при перемешивании добавляют около 50 мл водного раствора, содержащего по 200 мг полиинозината и полицитидилата натрия с укороченной цепью, каждый из которых содержит меньше перегруппированных фосфатных групп, полученных в примерах 1 и 2. Затем смесь обрабатывают в небольшом лабораторном эмульгирующем и диспергирующем устройстве в течение еще 2 часов и наконец ее объем доводят до 400 мл, добавляя воду для инъекций и получая композицию, содержащую данный комплекс. Композицию, содержащую данный комплекс, стерилизуют фильтрацией, помещают в виде 1-мл аликвотных частей в пробирку и превращают в лиофилизированный препарат известным способом. После восстановления лиофилизированного препарата добавлением воды для инъекций до объема, составляющего 1 мл, средний размер частиц данного комплекса составляет 133 нм при определении методом фотонной корреляции.

ПРИМЕР 10

К 50 г 2-О-(2-диэтиламиноэтил)карбамоил-1,3-О-диолеоил-глицерина и 25 г лецитина соевых бобов добавляют 1 кг сахарозы, растворенной в 3 л воды для инъекций. Смесь перемешивают и диспергируют в течение 30 минут в гомогенизаторе высокого давления типа Manton-Gaulin и ее объем доводят до 5 л водой для инъекций, получая дисперсию катионной липосомы (носитель). К дисперсии носителя добавляют при перемешивании около 2 л водного раствора, содержащего по 1 г полиинозината и полицитидилата натрия с укороченной цепью, полученных в примерах 1 и 2, каждый из которых содержит меньше перегруппированных фосфатных групп. рН дисперсии доводят до 5,5 1 н. соляной кислотой и диспергируют в гомогенизаторе высокого давления типа Manton-Gaulin в течение еще 1 часа, и наконец объем доводят до 10 л водой для инъекций, получая композицию, содержащую данный комплекс. Указанную композицию затем помещают в виде 20-мл аликвотных частей во флакон и превращают в лиофилизированный препарат известным способом. После восстановления лиофилизированного препарата добавлением воды для инъекций до объема, составляющего 20 мл, средний диаметр частиц данного комплекса составляет 158 нм при определении методом фотонной корреляции.

ПРИМЕР 11

К 1 г 2-О-(2-диэтиламиноэтил)карбамоил-1,3-О-диолеоил-глицерина и 2 г фосфатида желтка добавляют 40 г глюкозы, растворенной в 100 мл воды для инъекций. Смесь перемешивают и диспергируют в течение 5 минут гомогенизатором, а объем доводят